Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La SLA est une maladie neurodégénérative se caractérisant par la perte progressive et sélective des neurones moteurs. une mutation dans le gène codant pour VAPB a été associée avec la SLA. VAPB est une protéine du réticulum endoplasmique (RE) qui jouerait un rôle dans le transport de protéines et dans la réponse du RE aux protéines mal repliées. J'ai utilisé la technique de transfert viral de gène pour induire l'expression de VAPB humaine (hVAP-Bwt et hVAP-BP56S) dans les neurones moteurs in vitro. Nous avons observé que hVAPBP56S forme des agrégats cytoplasmiques et que la surexpression de hVAPBwt et hVAPBp56s induit la mort des neurones via un mécanisme dépendant du RE et du calcium. Dans les cellules Cos-7, l'expression de hVAP-Bwt et hVAP-Bp(-s bloque l'activité du protéasome via l'activation d'un stress du RE et la séquestration de la sous-unité 20S. Enfin, nous avons développé des souris transgéniques hVAPBp56s mais elles ne développent aucun phénotype moteur / ALS is a neurodegenerative disease characterized by a selective loss of motor neurons. A mutation in VAPB protein has been associated with ALS. VAPB, an endoplamic reticulum (ER) resident protein is proposed to play a role in protein transport and in the unfolded protein response. To manipulate VAPB (hVAPBwt and hVAPBp56s) expression in motor neurons in vitro, I used the viral gene transfer technology. hVAPBp56s induces selective motor neuron death which involved an ER-related pathway dependent on calcium signals. Studies on Cos-7 cells showed that hVAPBwt and hVAPBp56s impair the proteasome activity through the activation of ER stress and the sequestration of the 20S subnit. Moreover, we developed transgenic mice overxpressing hVAPBp56s which do not display any motor disorder.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La dystrophine est une protéine cytoplasmique qui lie physiquement le cytosquelette à la matrice extracellulaire par le biais du complexe dystrophine-protéines associées (DAPC), assurant ainsi la stabilité du sarcolemme. Des mutations dans le gène DMD codant pour la dystrophine, conduisant à l’absence de la protéine, sont à l’origine de la dystrophie musculaire de Duchenne qui est une maladie liée au chromosome X. Pour mes travaux de thèse, j’ai généré et caractérisé un nouveau modèle de souris transgéniques rapportrices, dénommé DmdEGFP, qui exprime une protéine dystrophine endogène fusionnée avec la protéine fluorescente EGFP. La protéine dystrophine est liée dans sa région C-terminale qui est présente dans la majorité des isoformes. Dans le modèle, une expression forte et naturelle de l’EGFP était observée dans les muscles squelettiques, lisses, le cœur, le cerveau et l’œil, ce qui suggère un étiquetage correct de tous les isoformes de la dystrophine. La fluorescence de l’EGFP co-localisait exactement avec la dystrophine dans tous les sites. Dans le muscle squelettique, la dystrophine ainsi que d’autres protéines de la DAPC étaient exprimées dans des quantités normales et dans la bonne localisation subsarcolemmale. L’architecture du tissu musculaire squelettique était normale, suggérant que la fonction de la protéine de fusion était maintenue. In vitro, l’EGFP est également exprimée dans les fibres musculaires isolées, ainsi que dans les myotubes dérivés des cellules satellites. Par conséquent, cette nouvelle souris rapportrice de la dystrophine devient un outil important pour la visualisation directe et in vivo de l’expression de la dystrophine. / Dystrophin is a rod-shaped cytoplasmic protein that physically links the cytoskeleton to the ECM through the dystrophin-associated protein complex (DAPC), thereby providing sarcolemmal stability. Mutations in the dystrophin encoding DMD gene cause the severe X-linked disorder Duchenne muscular dystrophy. In this work a novel DmdEGFP reporter mouse that expresses a fluorescently labelled endogenous dystrophin – EGFP fusion protein was generated and characterized. The protein was tagged at the C-terminus that is present in the most dystrophin isoforms. To date, no dystrophin reporter mice exist, thus imaging is only possible by indirect antibody-mediated processing ex vivo. In DmdEGFP mice strong natural EGFP expression was observed in skeletal, smooth muscles, heart, brain and the eye and EGFP fluorescence co-localized with dystrophin at all sites suggesting proper tagging of the major dystrophin isoforms. In skeletal muscle, dystrophin as well as other proteins of the DAPC were expressed in normal quantity at correct sarcolemmal/subsarcolemmal localization. Skeletal muscle maintained normal tissue architecture, suggesting a correct function of the fusion protein. Isolated myofibers as well as satellite-cell derived myotubes expressed EGFP in vitro. Thus, the novel dystrophin reporter mouse provides a valuable tool for direct visualization of dystrophin expression.

Au Mexique et au niveau mondial, la protection de la diversité biologique et la défense de la diversité culturelle se sont constituées en enjeu de société ces trente dernières années, au moment où les biotechnologies s'imposaient comme une avancée technoscientifique à même de bouleverser notre rapport au vivant et de générer un important débouché commercial. Les controverses autour de la bioprospection et du maïs transgéniques, dans le contexte d'un pays qui présente une biodiversité exceptionnelle et la plus importante population indigène du continent américain, nous permettent de mettre en lumière comment, à travers elles, se confrontent des conceptions et des pratiques antagonistes de la connaissance, de la propriété, de l'agriculture, du développement, de la globalisation ou encore de l'environnement. Ces controverses sont donc globales au sens où, en arrière-plan des questions spécifiques et techniques qu'elles soulèvent, elles cristallisent toute une série de grands enjeux sociaux et environnementaux contemporains, dans un espace qui s'étire du local au mondial. Au-delà même des croisements de tous ces enjeux, les controverses semblent révéler un conflit beaucoup plus fondamental quant aux évolutions d'une modernité travaillée par le processus de globalisation et la remise en cause du clivage entre nature et société. L'opposition aux biotechnologies marque en effet une forme de résistance au processus hyper-moderne de marchandisation généralisée et de technification radicale de l'espace socio-environnementale. Si cette résistance est essentiellement critique, elle fait néanmoins émerger des formes encore en gestation de modernités alternatives.

Ce mémoire de maîtrise traite de la responsabilité et de la réparation pour les dommages liés aux innovations technologiques dans le cas des cultures transgéniques au Québec. Nous y étudions le rôle du droit dans le contexte interdisciplinaire propre aux sciences de l'environnement, en interrogeant la capacité du droit québécois de la responsabilité de permettre la réparation des dommages liés aux cultures transgéniques -voire de contribuer à l'internalisation des coûts liés à ces cultures -et de favoriser une attitude de précaution dans un contexte d'incertitude scientifique. Cette question n'avait jusqu'alors pas été étudiée dans le contexte du droit québécois. Elle est abordée à l'aide d'un cadre conceptuel qui, centré sur la notion de responsabilité, fait le pont entre la théorie juridique de la responsabilité, l'éthique de la responsabilité et l'approche sociologique des risques technologiques. .Après avoir documenté l'état des connaissances quant aux risques de dommages écologiques, sanitaires et socio-économiques liés aux cultures transgéniques, nous analysons comment les recours du Code civil du Québec et de la Loi sur la qualité de l'environnement s'appliqueraient à ces dommages. Pour ce faire, nous utilisons la méthode analytique propre aux sciences juridiques, en nous basant sur les textes législatifs, les règles d'interprétation, la jurisprudence et les textes de doctrine. Certaines difficultés d'application de ces recours sont soulignées, notamment la preuve d'une faute dans les cas de contamination génétique en l'absence de règles de coexistence des cultures, la preuve du lien de causalité dans les cas de dommages à la santé en l'absence d'étiquetage et de traçabilité des OGM, la preuve de la faute (ou l'exemption de responsabilité) lorsque les risques technologiques font l'objet d'incertitudes ou ont été insuffisamment étudiés, de même que la prise en charge des dommages diffus, graduels, graves ou irréversibles. Par la suite, nous analysons le droit existant dans une perspective critique et interdisciplinaire, afin de déterminer s'il est adéquat eu égard aux types de risques liés aux cultures transgéniques. Nous constatons que la pollution génétique pose non seulement des problèmes de coexistence entre les différents types de cultures, mais qu'elle doit également être analysée en tenant compte du caractère hégémonique qu'elle confère aux OGM brevetés et du caractère potentiellement irréversible de leur présence dans l'environnement et l'alimentation. Compte tenu de l'ensemble de ces risques, nous soulignons qu'il serait souhaitable de questionner le brevetage du vivant ou, minimalement, d'adopter des dispositions visant à protéger les agriculteurs contre les poursuites pour violation de brevet. Nous proposons également des mesures, inspirées de dispositions adoptées ou proposées à l'étranger, visant à prévenir la contamination génétique et à favoriser la réparation des dommages qui y sont liés. Nous abordons ensuite la responsabilité dans un contexte d'incertitude ou d'insuffisance des connaissances scientifiques. Nous constatons que la possibilité de dommages graves ou irréversibles affectant les générations futures appelle à l'application du principe de précaution. À l'aide du droit comparé, nous identifions les principales caractéristiques d'un régime de responsabilité favorisant une attitude de précaution en présence d'incertitude scientifique et permettant l'internalisation des coûts dans le respect du principe d'équité intra/intergénérationnelle. Nous soulignons enfin que l'adoption d'un tel régime n'est pas suffisante et que la précaution qui s'impose se doit d'être une responsabilité exercée a priori, collectivement et de manière démocratique, par la mise en place de politiques globales intégrant les exigences sociales et environnementales. L'attitude de précaution devrait également permettre de questionner la pertinence des cultures transgéniques en comparant leurs impacts avec ceux des autres options possibles de manière à faire des choix maximisant les bénéfices pour la santé, l'environnement et la société. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Responsabilité civile, Responsabilité environnementale, Principe de précaution, OGM, Cultures transgéniques, Dommages, Risque, Incertitude.

L'objet de ce mémoire est d'étudier les politiques internationales en matière de droits de propriété intellectuelle comme éléments de stratégie de contrôle du marché mondial de l'agriculture par les pays et les industries du centre impérialiste capitaliste. Pour arriver à cette fin, nous avons fait nôtre la théorie de Samir Amin sur la violente polarisation du système-monde capitaliste entre les pays du centre impérialiste et les pays de la périphérie. Nous avons dressé un historique des droits de propriété intellectuelle, plus particulièrement des brevets, afin d'en dégager les arguments historiquement avancés pour légitimer les régimes des brevets. La théorie de Jean-Pierre Berlan sur la guerre historique entre les sélectionneurs végétaux et les agriculteurs ou paysans nous a permis d'établir les liens entre les brevets, les accords et conventions internationales sur la propriété intellectuelle, et le marché de l'agriculture. Notre hypothèse générale de recherche est que la Convention de l'UPOV, la CDB et l'Accord sur les ADPIC de l'OMC sont des éléments de stratégies des pays du centre impérialiste capitaliste et de leurs firmes transnationales ayant comme objectif premier et fondamental le contrôle hégémonique mondial de l'agriculture et, par conséquent, des agriculteurs, des paysans et de la chaîne alimentaire humaine. Afin de vérifier notre hypothèse, nous avons analysé à l'aide de la méthode de l'analyse de contenu ces trois textes juridiques internationaux, ainsi que 74 documents d'information élaborés par le Secrétariat du GATT, entre les années 1987 et 1990, lors des négociations qui ont mené à la rédaction et à l'adoption de l'Accord sur les ADPIC. L'analyse de ces documents nous a permis de constater que ces accords constituent des éléments de stratégie de contrôle du marché mondial de l'agriculture des pays du centre capitaliste. En globalisant les brevets, puis en instaurant un système mondial des droits de propriété intellectuelle sur la base des normes de ces pays, la mise sur le marché des organismes génétiquement modifiés devient un outil d'appropriation de la diversité biologique, du contrôle de l'agriculture et de la pratique millénaire et ontologique de l'agriculteur consistant à utiliser les grains récoltés comme semence pour les récoltes ultérieures, d'hyperconcentration des brevets dans le domaine de l'agriculture dans les firmes transnationales des pays du centre capitaliste et d'accroissement gigantesque des profits de ces firmes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Propriété intellectuelle, Brevets, Brevetabilité, Agriculture, Contrôle, Domination, Centre, Périphéries.

Le suivi des flux calciques dans le cerveau de l’animal en mouvement nécessite de nouvellessondes. Nous utilisons la bioluminescence observée chez la méduse Aequorea victoria etimpliquant la protéine aequorine. Une fusion entre l’aequorine et la protéine fluorescente GFP(GA) permet d’obtenir un senseur calcique bioluminescent dont la stabilité et les propriétésspectrales sont adéquates pour de nombreuses applications. L’émission de bioluminescencepermet de suivre la propagation de l’information nerveuse de cellule en cellule, en temps réeldans des réseaux de neurones.Nous avons tout d’abord montré au moyen de construction de lignées transgéniques murinesque la protéine chimère GA peut être exprimée dans des microdomaines cellulaires pouranalyser l’activité neuronale. Nos résultats montrent pour la première fois qu’il est possibled’enregistrer in vivo et de manière non invasive dans l’animal en mouvement deschangements dans la concentration de calcium mitochondrial. Nous avons ensuite réalisé unciblage post synaptique du senseur par fusion à la protéine PSD95. Ce ciblage permet dedétecter l'entrée de calcium au niveau du récepteur NMDA.Parallèlement, nous avons cherché à améliorer les propriétés du senseur GA pour détécterl’activité calcique dans l’animal in toto. Nous identifié un nouvel analogue de lacoelenterazine conduisant à un décalage du spectre de bioluminescence de l’aequorine vers lerouge. Et par ailleurs, nous avons testé l’activité de l’aequorine en fusion avec diversesprotéines fluorescentes. Nous disposons avec ce travail de nouveaux senseurs bioluminescentspour le suivi de l’activité cérébrales dans des études comportementales. / Monitoring calcium fluxes in the brain of freely moving animals requires the development ofnew probes. We use the bioluminescence of the protein aequorin observed in the jellyfishAequorea victoria. A fusion between aequorin and GFP fluorescent protein (GA) provides abioluminescent calcium sensor whose stability and spectral properties are adequate for manyapplications. The emission of bioluminescence is suitable to track in real-time the propagationof nervous impulses from cell to cell in neural networks.We first showed by transgenic murine lines construction that the chimeric protein GA can beexpressed in cell microdomains to analyze neuronal activity. Our results show for the firsttime it is possible to record in vivo and non-invasively in the moving animal, changes in theconcentration of mitochondrial calcium. We then performed a post synaptic targeting of thesensor by fusion with the protein PSD95. This permits to detect the entry of calcium next tothe NMDA receptor.Meanwhile, we tried to improve the properties of the GA sensor to detect calcium activity inthe animal in toto and mor specifically through the skull. We identified a new analogue ofcoelenterazine leading to a shift in the spectrum of aequorin bioluminescence to red. We thentested the activity of aequorin fused with different fluorescent proteins. This leads to newbioluminescent sensors for monitoring the brain activity in behavioral studies.

La tolérance immunitaire dépend de la distinction entre le soi et le non soi par le système immunitaire. Un bris dans la tolérance immunitaire mène à l'auto-immunité, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du système nerveux central. Le diabète auto-immun, également connu sous le nom diabète juvénile et diabète de type 1, résulte d'une attaque auto-immune sur les cellules β pancréatiques sécrétrices d’insuline, localisées au niveau des îlots de Langerhans du pancréas. Bien que le diabète auto-immun soit traitable par une combinaison d’injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, de régime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limitées à, la cécité, les maladies cardiovasculaires, l’insuffisance rénale et l'amputation. En raison des nombreuses complications liées au diabète auto-immun à long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqués dans la progression de la maladie dans le but de développer de nouvelles thérapies qui empêcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rôle primordial dans la génération et l'entretien de la tolérance immunitaire a été attribué au nombre et à la fonction des sous-populations de cellules régulatrices. Une de ces populations est constituée de cellules T CD4-CD8- (double négatives, DN), qui ont été étudiées chez la souris et l'humain pour leur contribution à la tolérance périphérique, à la prévention des maladies et pour leur potentiel associé à la thérapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intérêt thérapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorégulateur antigène-spécifique dans divers cadres expérimentaux, y compris la prévention du diabète auto-immun. D’ailleurs, en utilisant un système transgénique, nous avons démontré que les souris prédisposées au diabète auto-immun présentent peu de cellules T DN, et que ce phénotype contribue à la susceptibilité au diabète auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empêcher la progression vers le diabète chez les souris prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats suggèrent que les cellules T DN puissent présenter un intérêt thérapeutique pour les patients diabétiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces résultats en utilisant un modèle non-transgénique, qui est plus physiologiquement comparable à l'humain. L'objectif principal de cette thèse est de définir la fonction immunorégulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thérapeutique de celles-ci dans la prévention du diabète auto-immun chez un modèle non-transgénique. Dans cette thèse, on démontre que les souris résistantes au diabète auto-immun présentent une proportion et nombre absolu plus élevés de cellules T DN non-transgéniques, lorsque comparées aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilité à la maladie. On observe que les cellules T DN éliminent les cellules B activées in vitro par une voie dépendante de la voie perforine et granzyme, où la fonction des cellules T DN est équivalente entre les souris résistantes et prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats confirment que l'association au diabète auto-immun est due à une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutôt qu’à une déficience fonctionnelle. On démontre que les cellules T DN non-transgéniques éliminent des cellules B chargées avec des antigènes d'îlots, mais pas des cellules B chargées avec un antigène non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on établit que le transfert des cellules T DN activées peut empêcher le développement du diabète auto-immun dans un modèle de souris non-transgénique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux îlots pancréatiques, et subissent une activation et une prolifération préférentielles au niveau des ganglions pancréatiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entraîne une diminution d'auto-anticorps spécifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les îlots, ce qui corrèle avec les résultats décrits ci-dessus. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de démontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel lié à la thérapie cellulaire pour le diabète auto-immun. / Immune tolerance is dependent on the immune system discriminating between self and non-self. A break in immune tolerance results in autoimmunity, which can lead to the destruction of healthy organs, glands, joints or the central nervous system. Any disease that results from such an aberrant immune response is termed an autoimmune disease. Autoimmune diabetes, which is also referred to as juvenile diabetes and type 1 diabetes, results from an autoimmune attack on the insulin-producing β cells located within the islets of Langerhans of the pancreas. Although autoimmune diabetes is treatable through a combination of insulin therapy, diet and exercise, many chronic complications may arise in patients, including, but not limited to, blindness, cardiovascular disease, kidney failure and amputation. Due to the many complications associated with long-term autoimmune diabetes, research continues to better understand all the factors implicated in disease progression in order to develop new therapies that will prevent, reverse and/or cure this disease. A prominent role in the generation and maintenance of immune tolerance has been attributed to the number and function of regulatory cell subsets. One of these regulatory cell populations, namely CD4-CD8- (double negative, DN) T cells, have been studied in both mice and humans for their contribution to peripheral tolerance, disease prevention and their potential for use in cellular therapy. DN T cells are of particular therapeutic interest because they exhibit an antigen-specific immunoregulatory potential in various experimental settings, including the prevention of autoimmune diabetes. Indeed, using a transgenic system, we have shown that autoimmune diabetes-prone mice carry fewer DN T cells and that this phenotype contributes to autoimmune diabetes susceptibility, where a single transfer of DN T cells is sufficient to prevent diabetes progression in otherwise autoimmune diabetes-prone mice. These results suggest that DN T cells may be of therapeutic interest for diabetic patients. However, we must first validate these results using a non-transgenic setting, which is more physiologically relevant to humans. The main objective of this thesis is to determine the immunoregulatory function of the DN T cells as well as the therapeutic potential of these cells in the prevention of autoimmune diabetes in the non-transgenic setting. Here, we show that diabetes-resistant mice present with a higher proportion and cell number of DN T cells than diabetes-susceptible mice in the non-transgenic setting, which associates a deficiency in DN T cell number with disease susceptibility. We determine that DN T cells eliminate activated B cells in vitro via a perforin/granzyme-dependent pathway, where the function of DN T cells is equal between the diabetes-resistant and -susceptible mice, demonstrating that the association to autoimmune diabetes is due to a deficiency in DN T cell number rather than function. Interestingly, we show that non-transgenic DN T cells eliminate B cells loaded with islet antigen, but not B cells loaded with an irrelevant antigen, in vitro. Importantly, we establish that the transfer of activated DN T cells could prevent autoimmune diabetes development in the non-transgenic setting. Interestingly, we reveal that DN T cells migrate to the pancreatic islets and undergo preferential activation and proliferation within the pancreatic lymph nodes. Moreover, the transfer of DN T cells results in a decrease in both germinal center B cells directly within the pancreatic islets as well serum insulin autoantibody levels, which correlates with the aforementioned findings. Altogether, the results presented in this thesis have allowed us to enhance our understanding of the function of DN T cells both in vitro and in vivo as well as demonstrate the therapeutic potential for DN T cells as a novel cellular therapeutic for autoimmune diabetes.