Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte. Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%). In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys. Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren. Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte. Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war. Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen. Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen. Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei. Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.:Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VIII Abkürzungsverzeichnis XI 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Theoretische Grundlagen 3 2.1 Lysozym 3 2.1.1 Wirkmechanismen des Lysozyms 4 2.1.2 Anwendungsmöglichkeiten von Lysozym 7 2.1.3 Modifizierung des Lysozyms 8 2.1.3.1 Fibrillen und amyloide Strukturen von HEWL 9 2.1.3.2 Neue biologische Funktionen durch Konformationsänderung 13 2.1.4 Evolutionäre Entwicklung und Verwandtschaft zu α-Lactalbumin 14 2.2 Die enzymatische Vernetzung 15 2.2.1 Mikrobielle Transglutaminase 15 2.2.1.1 TGase katalysierte Reaktionen und Reaktionsmechanismus 17 2.2.1.2 Analytische Aspekte 19 2.2.1.3 Einsatz in der Lebensmittelindustrie 19 2.3 Nicht-enzymatische Vernetzung 21 2.3.1 Thermisch induzierte Vernetzung 21 2.3.2 In-Vacuo Zero-Length Cross-Linking 23 2.3.3 Anwendungsmöglichkeiten nicht-enzymatisch vernetzter Proteine 23 2.4 Wirkung hoher hydrostatischer Drücke auf Proteine 24 2.4.1 Wirkung von Hochdruck auf Hühnereiweiß-Lysozym 26 2.4.2 Wirkung von Hochdruck auf die mikrobielle Transglutaminase 27 3 Experimenteller Teil 29 3.1 Chemikalien, Materialien, Geräte und Software 29 3.1.1 Chemikalien 29 3.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien 31 3.1.3 Untersuchungsmaterialien 33 3.1.4 Software 33 3.2 Erzeugung modifizierter Proteine 34 3.2.1 Enzymatische Vernetzung von Proteinen 34 3.2.1.1 Erzeugung von Protein-Oligomeren unter Hochdruck 34 3.2.1.2 Reinigung mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) 35 3.2.1.3 Konzentrierung durch Ammoniumsulfatfällung 35 3.2.2 Thermisches und Vakuum-induziertes Zero-length Cross-linking 36 3.3 Erzeugung von HEWL-Fibrillen 38 3.4 Isolierung von α-Lactalbumin 38 3.5 Dialyse der Proteinlösungen 39 3.6 Aktivität der Transglutaminase 39 3.7 Analytische Verfahren zur Strukturuntersuchung und Charakterisierung der Proteinproben 41 3.7.1 Restwasserbestimmung mittels Karl-Fischer-Titration 41 3.7.2 Proteinbestimmung mittels Lowry 42 3.7.3 Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 44 3.7.4 Aminosäureanalytik (ASA) 47 3.7.4.1 Saure Hydrolyse 49 3.7.4.2 Enzymatische Hydrolyse 49 3.7.5 Hochdruckflüssigchromatographie mit anschließender Massenspektroskopie (RP-HPLC/ESI-TOF-MS) 51 3.7.5.1 Probenvorbereitung - Tryptischer Verdau 51 3.7.5.2 RP-HPLC/ESI-TOF-MS-Messung 51 3.7.6 Aktivitätsbestimmung für HEWL und HEWL-haltige Proben 52 3.7.6.1 Klassische Methode - Trübungsassay 52 3.7.6.2 Modifizierte Methode der Aktivitätsermittlung mit Blue-ML 53 3.7.7 Methode zur Oberflächenhydrophobitätsermittlung 54 3.7.8 Bestimmung der Sekundär- und Tertiärstruktur mittels Zirkulardichroismus Spektroskopie (CD-Spektroskopie) 56 3.7.9 Charakterisierung der HEWL-Fibrillen 57 3.7.9.1 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure-Assay (ANS-Assay) 57 3.7.9.2 Kongorot-Assay 58 3.7.9.3 Thioflavin-T-Assay 59 3.7.9.4 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 61 3.7.10 Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit 62 3.7.10.1 Agardiffusionstest 62 3.7.10.2 Bakterieller Hemmtest 63 4 Ergebnisse und Diskussion 64 4.1 Enzymatische Vernetzung von HEWL mittels mTGase und Einfluss verschiedener Reaktionsparameter 64 4.1.1 Geeignete Puffersysteme und pH-Werte 67 4.1.2 Einfluss variierender Inkubationsdauer und unterschiedlicher Drücke 68 4.1.3 Einfluss der Lysozymkonzentration 70 4.1.4 Einfluss der mTGase-Aktivität 71 4.1.5 Temperatur 73 4.1.6 Optimierte Parameter für den höchstmöglichen Vernetzungsgrad 74 4.2 Analytik der Isopeptide 76 4.2.1 Identifizierung des N-ε-(γ-L-Glutamyl)-L-Lysin-Isopeptids (Glu_Lys) 76 4.2.2 Beurteilung einer intra- und intermolekularen Vernetzung 79 4.2.3 Lokalisierung der reaktiven Lysin- und Glutaminreste mittels HPLC/MS 80 4.2.4 Strukturvorschlag 88 4.3 Isolierung und Konzentrierung enzymatisch vernetzter Lysozym-Oligomere 89 4.3.1 Ammoniumsulfatfällung 89 4.3.2 Ergebnisse der Gelpermeationschromatographie 91 4.4 Funktionelle Charakterisierung der LMW-, MMW- und HMW-Proben des HEWL 96 4.4.1 Vergleichende Untersuchungen der verbleibenden Enzymaktivität 97 4.4.2 Beurteilung der Oberflächenhydrophobität 100 4.4.3 Veränderung der Sekundär- und Tertiärstruktur 104 4.4.4 Fibrillbildung und -eigenschaften von HEWL 109 4.4.4.1 Etablierung der Charakterisierungmethoden für HEWL-Fibrillen 110 4.4.4.2 Fibrillinduktion an HEWL-Präparaten ausgewählter Vernetzungsgrade 118 4.4.5 Antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen 126 4.5 Vergleichende Untersuchungen an dem strukturanalogen Protein α-Lactalbumin 137 4.6 Orientierende Untersuchungen zur nicht-enzymatischen In-Vakuo-Thermo-Vernetzung von HEWL und ausgesuchten Proteinen 142 4.6.1 Einfluss verschiedener Reaktionsparameter auf die Vernetzung von HEWL 143 4.6.2 Identifizierung der gebildeten Isopeptide 145 4.6.3 Vergleich der nicht-enzymatischen und enzymatischen Vernetzung von HEWL 146 4.6.4 Vergleich der In-Vakuo-Thermo-Vernetzung an HEWL mit β-Casein und erste Untersuchungen an einem Molkenproteinisolat 149 4.7 Fazit der Untersuchungen zur enzymatischen und der nicht-enzymatischen Vernetzung verschiedener Proteine 152 5 Zusammenfassung 154 6 Literaturverzeichnis 157 Veröffentlichungen 172 Danksagung 173 Versicherung 174

To investigate the influence of the internal micellar structure on the course of enzymatic cross-linking especially in the initial phase of the reaction, casein micelles isolated from raw milk via ultracentrifugation were incubated with microbial transglutaminase (mTG) in comparison with non-micellar sodium caseinate. Reactive lysine and glutamine residues were identified using a label-free approach, based on the identification of isopeptides within tryptic hydrolysates by targeted HRMS as well as manual monitoring of fragmentation spectra. Identified reactive sites were furthermore weighted by tracking the formation of isopeptides over an incubation time of 15, 30, 45 and 60 min, respectively. Fifteen isopeptides formed in the early stage of mTG cross-linking of caseins were identified and further specified concerning the position of lysine and glutamine residues involved in the reaction. The results revealed lysine K176 and glutamine Q175 of β-casein as the most reactive residues, which might be located in a highly flexible region of the molecule based on different possible reaction partners identified in this study. Except for the isopeptide αₛ₁ K34–αₛ₂ Q101 in sodium caseinate (SC), all reactive sites were detected in micellar and in non-micellar casein, indicating that the initial phase of enzymatic cross-linking is not affected by micellar aggregation of caseins.

Tyrimo objektas. Celiakija yra labai dažna virškinimo trakto liga. Jos paplitimas Europoje ir Šiaurės Amerikoje 1 iš 100-300 suaugusių ir vaikų. Lietuvoje duomenų apie celiakijos paplitimą nėra, ši liga diagnozuojama tik pavieniais atvejais [29]. Sergantieji imumoglobulino A (IgA) deficitu 10 kartų dažniau serga celiakija negu sveikieji. Viršutinių kvėpavimo takų ir virškinimo trakto infekcijos, autoimuninės ligos ir onkologiniai susirgimai taip pat dažnesni sergantiesiems IgA deficitu [143, 163-168]. Lietuvoje duomenų apie IgA deficito paplitimą nėra [29]. Darbo tikslas. Nustatyti Vilniaus miesto 11-13 m. vaikų celiakijos ir IgA deficito paplitimą. Tyrimo medžiaga ir metodai. Gavus Lietuvos bioetikos komiteto leidimą nuo 2009 metų sausio mėnesio iki 2010 metų kovo mėnesio ištirta 1000 vaikų nuo 11 iki 13 metų amžiaus, kurie mokėsi šešiose lietuviškose Vilniaus miesto mokyklose. Mokyklos pasirinktos atsitiktiniu atrankos būdu. Jose buvo išdalintos asmens informavimo formos (tėvams priedas nr. 1 ir vaikams priedas nr. 2), kuriose buvo aprašytas biomedicininis tyrimas, jo eiga ir nauda. Vaikams, kurių tėvai sutiko atlikti celiakijos tyrimą, buvo nustatomi audinių transgliutaminazės IgA klasės (aTG IgA) antikūnai ir bendras IgA kiekis kapiliarinio kraujo laše. Tyrimo metu buvo naudojami Biocard TM celiakijos testai (Ani Biotech OY, Suomija). Tyrimo atsakymas buvo gaunamas ir įvertinamas po 5 min. Nustačius aTG IgA klasės antikūnus, vaikai buvo nukreipti į Vilniaus universitetinę... [toliau žr. visą tekstą] / Object. Coeliac disease is one of the most prevalent gastrointestinal disorder. It‘s prevalence in Europe and North America is 1 of 150-300 adults and children. In Lithuania there are no data on prevalence of coeliac disease but it‘s seems that there is hypodiagnosis [29]. IgA-deficient individuals have a tenfold risk for coeliac disease compared with the general population. Patients with IgA deficiency have a tendency to develop recurrent sinopulmonary and gastrointestinal infections, allergies, autoimmune diseases and malignancies [148-154]. There are no data on the prevalence of IgA deficiency in Lithuania [29]. The aim. To determine the prevalence of coeliac disease and IgA deficiency among 11-13 years children in Vilnius. Material and methods. From January 2009 to March 2010 we investigated 1000 children (11-13 years of age) for coeliac disease and immunoglobulin A (IgA) deficiency from six Vilnius secondary schools. We examined capillary blood for tissue transglutaminase IgA class antibodies (tTG IgA) and total IgA with Biocard TM test (Ani Biotech OY, Finland) for children whose parents agreed to do this test. The results were evaluated after 5 min. Children with positive test results (tTG IgA positive or total IgA deficiency) underwent small bowel endoscopy with biopsies at Vilnius University Children Hospital to confirm or deny the diagnosis of coeliac disease. We get permission for this study from Lithuanian Bioethics Committee. Results. Two of 1000 children were... [to full text]

Zöliakie ist eine immunologisch vermittelte Erkrankung bei der die Dünndarm-schleimhaut durch das in zahlreichen Getreidesorten vorkommende Klebereiweiß Gliadin geschädigt wird. Dabei wird die typische Architektur der Mukosa zerstört und imponiert histologisch als Zottenatrophie. In Folge dessen zeigen Betroffene Mangelerscheinungen und Verdauungsbeschwerden sowie zahlreiche extra-intestinale, atypische Symptome. Bei Kindern können zusätzlich gravierende Wachstums- und Entwicklungsstörungen auftreten. Die Therapie besteht in einer lebenslangen glutenfreien Diät. Die Diagnostik der Erkrankung basiert auf vier Säulen: Neben der Beurteilung der klinischen Symptomatik werden zöliakie-typische Antikörper nachgewiesen, welche bei hoher Konzentration die Indikation zur Biopsie darstellen. Die bioptische Untersuchung mit anschließendem histolo-gischem Nachweis der Zottenatrophie stellt den Goldstandard der Diagnostik dar und wird durch die Besserung der klinischen Symptomatik unter glutenfreier Diät gestützt. Bei der serologischen Untersuchung haben Antikörper gegen natives Gliadin auf Grund niedriger diagnostischer Genauigkeit an Bedeutung verloren. Sie wurden durch die Bestimmung von Autoantikörpern gegen die Gewebstransglutaminase abgelöst, die eine höhere Sensitivität und Spezifität aufweisen. Im Jahr 2000 konn-te jedoch gezeigt werden, dass sich Antikörper von Zöliakiepatienten an Gliadin-peptide besser nach selektiver Deamidierung (Austausch der Aminosäure Glutamin durch Glutaminsäure) binden. Darauf aufbauend entwickelte die Firma INOVA Diagnostics im Jahr 2006 erst-mals einen ELISA zur Zöliakiediagnostik mit synthetisch hergestellten, deamidier-ten Gliadinpeptiden (DGP) als Antigen. Zu Beginn unserer Arbeit existierten keine Veröffentlichungen zur diagnostischen Genauigkeit dieser Tests bei Kindern und nur eine Veröffentlichung, die zwei der ELISA an Seren von erwachsenen Patienten untersuchte. Bei Kindern ist es jedoch besonders wichtig, durch die Antikörperbestimmung eine hohe Diagnosesicher-heit zu erlangen, weil für sie die Biopsie eine große Belastung darstellt und eine nicht erkannte Zöliakieerkrankung zu schwerwiegenden Entwicklungsstörungen führen kann. Aus diesem Grund soll die vorliegende Studie den Nutzen dieser neuen ELISA in der Diagnostik der Zöliakie im Kindesalter evaluieren. Es wurden dazu insgesamt 340 Seren von bioptisch bestätigten Zöliakiepatienten und Kontrollen, bei denen die Erkrankung histologisch ausgeschlossen wurde, gesammelt, verblindet und retrospektiv analysiert. Dabei wurden vier verschiede-ne ELISA der Firma INOVA Diagnostics eingesetzt: drei ELISA mit DGP als An-tigen sowie ein weiterer ELISA, in dem DGP mit Gewebstransglutaminase kombiniert war. Es wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: 1. Alle vier ELISA eignen sich zur Diagnostik von Zöliakie bei Kindern und weisen eine hohe Trennschärfe auf. Die Fläche unter der Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve ist für alle vier Tests größer als 0,96. Mit den Tests kann somit die Indikation zur bioptischen Untersuchung mit großer Sicherheit gestellt werden. 2. Die Bestimmung der Antikörper gegen DGP ist der Antikörperbestimmung gegen natives Gliadin überlegen. Die DGP-Tests weisen eine signifikant größe-re Fläche unter der ROC-Kurve als die Tests auf Antikörper gegen natives Gli-adin auf. Die Bestimmung der Antikörper gegen DGP ist der Bestimmung von Antikörpern gegen Gewebstransglutaminase nicht unterlegen. Die Flächen un-ter den ROC-Kurven unterscheiden sich nicht signifikant voneinander. 3. Überraschenderweise zeigt die IgG-Klasse der DGP eine signifikant höhere diagnostische Genauigkeit als die IgA-Klasse. Somit ist auch bei Patienten mit IgA-Mangel eine sichere Diagnosestellung gegeben und es kann auf die gene-relle Bestimmung des Gesamt-IgA verzichtet werden. 4. Der DGP-IgG-Test weist von den vier validierten Antikörpertests bei einer Sensitivität von 100 % die höchste Spezifität (90 %) und bei einer Spezifität von 100 % die höchste Sensitivität (64 %) auf. 5. Durch den kombinierten Test mit zwei Antigenen und den gleichzeitigen Nachweis von IgA und IgG in einem ELISA (tTG/DGP-Screen-Test) lassen sich Kosten und Zeit sparen. Dieser kombinierte Test weist die höchste diagnosti-sche Genauigkeit der untersuchten DGP-Tests auf. 6. Durch Angabe von Likelihood Ratios und mittels grafischer Darstellung der Posttest-Wahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der Antikörperkonzentration und Prävalenz können den behandelnden Ärzten wertvolle Informationen zur Di-agnosesicherheit eines einzelnen Testergebnisses vermittelt werden. Mit den evaluierten DGP-Tests stehen neue und zuverlässige ELISA zur Diagnos-tik der Zöliakie im Kindesalter zur Verfügung. Sie weisen eine hohe diagnostische Sicherheit auf und unterscheiden sicher zwischen Gesunden und Zöliakiepatien-ten. Die Indikation für eine Dünndarmbiopsie kann mit Hilfe der DGP-Tests sehr sicher gestellt werden. Ob darüber hinaus auf der Basis sehr hoher Antikörper-konzentrationen ohne histologische Untersuchung die Diagnose Zöliakie ausrei-chend sicher gestellt werden kann oder bei sehr niedrigen Konzentrationen auf einen bioptischen Ausschluss verzichtet werden kann, soll in einer weiteren be-reits in Planung befindlichen prospektiven Studie geklärt werden. Zusätzlich sollte die Diagnosestellung durch DGP-Tests bei besonders jungen Kindern in prospektiven Studien untersucht werden. Die vorliegende Arbeit legt gemeinsam mit anderen Untersuchungen den Grundstein dafür.

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Desta forma, vários aditivos têm sido usados para melhorar a qualidade dos pães feitos com farinha de arroz, dentre eles enzimas, gomas ou hidrocolóides, amidos modificados e outras fontes proteicas. Para aumentar o teor proteico e melhorar a qualidade nutricional dos pães, várias fontes proteicas podem ser usadas. A alga Spirulina platensis é muito estudada para uso na alimentação humana por apresentar um bom perfil nutricional, tornando-a ideal como suplemento alimentar, pois combina diversos constituintes como proteínas, vitaminas e minerais de maneira equilibrada. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da adição da metilcelulose, enzima transglutaminase e Spirulina na qualidade tecnológica e nutricional de pães de farinha de arroz. Para isso foi utilizado um delineamento central composto rotacional (DCCR) a fim de avaliar os efeitos tecnológicos da adição de metilcelulose, transglutaminase e Spirulina nos pães de farinha de arroz. As respostas do planejamento possibilitaram definir concentrações adequadas destes aditivos para a obtenção dos pães A, B e C com boas características tecnológicas, que foram avaliados pela composição proximal e sensorialmente por teste de preferência. A avaliação sensorial dos pães de farinha de arroz mostrou que a preferência dos consumidores independe da quantidade de Spirulina adicionada ao pão. A enzima transglutaminase teve maior eficiência na formação de ligações cruzadas na massa fermentada dos pães de farinha de arroz quando foi utilizada a concentração de 0,6% (em base à farinha de arroz), mas a proteína da Spirulina não aumentou a formação de “rede”. Através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) das massas fermentadas dos pães foi verificado que a transglutaminase torna a microestrutura da massa mais compactada, enquanto que a proteína da Spirulina forma estruturas fibrosas na massa. A avaliação nutricional do pão de arroz com Spirulina através de ensaio biológico utilizando ratos Wistar mostrou que a adição de Spirulina (4% em base de farinha) não provocou aumento do valor proteico, mas o valor de coeficiente de eficiência alimentar (CEA) não diferiu da dieta controle com caseína. / Celiac disease is an illness caused by intolerance to gluten which is a protein substance found in wheat and its derivatives. The control of this disease is made by complete restriction to gluten, in other words, celiac people cannot eat any food containing wheat flour. Rice flour is a good substitute for wheat in the preparation of gluten free breads, however, the rice flour produces low volume breads once it does not have the same technological characteristics of gluten, especially for the preparation of breads. Thus, various additives have been used to improve the quality of rice flour breads, including enzymes, hydrocolloids or gums, modified starches and other protein sources. To increase the protein content and improve the nutritional quality for the breads, various protein sources may be used. The alga Spirulina platensis is widely studied for the use as food for human because it has a good nutritional profile so it becomes an ideal feed supplement, since it combines various constituents such as protein, vitamins and minerals in a balanced way. The objective of this study is to evaluate the effect of adding methylcellulose, Spirulina and transglutaminase enzyme on technological and nutritional quality of rice flour breads. The Rotational Central Composite Design (RCCD) method was used to assess the technological effects of adding methylcellulose, transglutaminase and Spirulina in rice flour breads. Responses from planning made it possible to define appropriate concentrations of these additives to obtain the A, B and C breads with good technological characteristics that were evaluated by proximate composition and sensory by means of preference test. The sensory evaluation of rice flour breads showed that consumers' preference is independent of the amount of Spirulina added to bread. The transglutaminase enzyme was more efficient at the crosslinking established in the sourdough of rice flour breads when the concentration of 0.6% (rice flour based) was used, but the Spirulina protein did not increase the network formation. By scanning electron microscopy (SEM) of the fermented dough of breads was found out that the mass microstructure becomes more compacted due to the transglutaminase enzyme while the Spirulina protein forms fibrous structures in the mass. The nutritional evaluation of the Spirulina based rice bread made through a biological test using rats showed that the addition of Spirulina (4% on flour basis) resulted in no increase for the protein value, but the amount of Food Efficiency Ratio (FER) did not differ from the control diet.

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T11:45:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vuolo_MilenaMorandi_M.pdf: 1172548 bytes, checksum: 0065404d0770c2d788c07526e0f82ae8 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O leite bovino contém proteínas que são consideradas antigênicas e capazes de induzir algum tipo de resposta imunológica, dentre elas destaca-se a ß-lactoglobulina (ß-Lg). A utilização da enzima transglutaminase (TG), que catalisa reações de ligação e-(?-glutamina)lisil inter ou intramoleculares, incorporação de aminas e desaminação tem demonstrado eficiência em alterar o potencial antigênico de alimentos. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da reação de polimerização induzida pela TG na atividade antigênica da ß-Lg e sua digestibilidade, na presença dos agentes redutores glutationa (GSH) e ácido ascórbico (AA). As modificações da ß-Lg com a TG na presença dos agentes redutores foram realizadas através de experimentos fatoriais 22 nos quais as variáveis independentes foram a relação enzima:substrato (E/S) (0 ¿ 51,6 U TG g -1 de proteína) e concentração dos agentes redutores, [GSH] (0 - 0,67 mmol/L) ou [AA] (0- 0,02 mol/L) e as variáveis dependentes foram grau de polimerização e concentração de IgE. A polimerização foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), e grau de polimerização (GP) através da determinação de lisinas livres. A avaliação da antigenicidade foi feita por ELISA, utilizando soro de camundongos BALB/c sensibilizados com ß-Lg na forma nativa. A resistência das amostras à ação da pepsina foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e tricina (SDSPAGE/Tricina). Os tratamentos realizados com TG e GSH apresentaram polímeros de alta massa molar (MM > 97,4 kDa), exceto para a condição do ensaio 5 (0,34 mmol/L GSH), que não utilizou TG. Os tratamentos com TG e AA também apresentaram polímeros de alta massa molar (MM > 97,4 kDa), exceto para a condição do ensaio 2 (44,1 U de TG g -1 e 0,003 mol/L de AA) e ensaio 5 (0,01 mol/L AA, que não utilizou TG). O GP foi maior para as amostras tratadas com TG na presença de agentes redutores, quando comparadas às amostras tratadas somente com TG ou agente redutor. Os resultados mostraram que a presença dos agentes redutores levou ao aumento da polimerização pela TG ao desnaturar a proteína levando à maior exposição dos aminoácidos lisina e glutamina. Não houve diminuição na antigenicidade da ß-Lg tratada com TG na presença de GSH ou AA, porém houve aumento da antigenicidade de algumas amostras obtidas sob algumas das condições dos ensaios realizados com os agentes redutores quando comparadas à ß-Lg. Os tratamentos realizados com TG na presença dos agentes redutores não aumentaram a digestibilidade da ß-Lg pela pepsina. Os digeridos das amostras obtidas sob as condições relativas aos níveis extremos do planejamento experimental (±1,41) e o ponto central, foram avaliados quanto à sua antigenicidade. Os resultados mostraram que não houve diminuição da antigenicidade da ß-Lg tratada com TG e GSH ou TG e AA., quando comparadas à ß-Lg. A polimerização com TG na presença de agentes redutores GSH e AA não foi capaz de modificar a antigenicidade das amostras digeridas, sugerindo que não houve modificações na proteína capazes de aumentar sua digestibilidade pela pepsina ou modificar regiões de epítopos / Abstract: Cow¿s milk contains proteins which are considered antigenic and able to lead to immune response, among them ß-lactoglobulin (ß-Lg) is the most important. The transglutaminase (TG) is the only enzyme commercially used that catalyses inter or intramolecular cross linking reaction in various proteins and demonstrates efficiency to alter the antigenic potential of food. The current work aimed at studying the effect of the reaction of induced polymerization by TG in presence of the reducing agents glutathione (GSH) as well as ascorbic acid (AA) in the antigenic activity of ß-Lg and its digestibility. The modifications in ß-Lg induced by TG in presence of reducing agents were carried out using factorial experiments 22, in which the independent variables were the enzyme:substrate ratio (E/S) (0 ¿ 51,6 U TG g -1) and concentration of reducing agents, [GSH] (0 - 0,67 mmol/L) or [AA] (0- 0,02 mol/L), and the dependent variables were the polymerization degree and concentration of IgE. Polymerization was assessed by electrophoresis in polyacrylamide gel (SDSPAGE), and the polymerization degree (PD) was determined by the free lysine content. The assessment of antigenicity was by ELISA assay, using serum of BALB/c mice sensitized with native ß-Lg. The resistance of the samples to the action of pepsin was evaluated by electrophoresis in polyacrylamide gel in presence of SDS and tricine (SDSPAGE/Tricine). The treatments using TG and GSH showed high molecular weight polymers (MM > 97,4kDa), except for a test condition 5 (0,34 mmol/L GSH), where TG was not used. The treatments with TG and AA also showed polymers of high molecular weight (MM > 97,4kDa), except for the test condition 2 (44,1 U TG g -1 and 0,003 mol/L of AA) and test 5 (0,01 mol/L AA, without TG). The PD was higher in the samples treated with TG in presence of reducing agents, when compared to samples treated only with TG or reducing agents. The results showed that the presence of reducing agents led to the increase of polymerization by TG since they denature the protein, leading to increased exposure of the amino acids glutamine and lysine, substrate for TG. The results showed that there was no reduction in the antigenicity of ß-Lg treated with TG in presence of GSH or AA, however an increase in the antigenicity of some modified samples was observed when compared to the native ß-Lg. . The treatments carried out with TG and reducing agents did not increase the digestibility of the ß-Lg by pepsin. The antigenicity of the digested from the samples obtained under the conditions of the extreme levels of experimental planning (±1,41) and at the central point were assessed. The results showed that after digestion with pepsin there was no decrease of the antigenicity of ß-Lg treated with TG in the presence of GSH or AA as compared to digested ß-Lg. Polymerization with TG in the presence of reducing agents was not able to alter the antigenicity of the samples, which suggests that there were no modifications in the protein that would be able to increase its digestibility by pepsin as well as the epitopes regions of the ß-Lg / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientadores: Flavia Maria Netto, Ricardo de Lima Zollner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T22:30:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Morais_JanainaMadruga_M.pdf: 1775595 bytes, checksum: 5ee1d5b4bacec45d3dfff615d49f7ca8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O leite bovino contém várias proteínas capazes de induzir resposta alérgica, sendo que a ß-lactoglobulina (ß-Lg) e a a-lactalbumina (a-La), proteínas mais abundantes do soro, estão entre as principais proteínas antigênicas. A homogeneização à alta pressão (HAP) é uma tecnologia emergente que pode alterar a estrutura das proteínas do soro de leite (IPS) e, portanto, seu caráter alergênico. Estudos anteriores apontam que a polimerização com a enzima transglutaminase (TG) reduziu o potencial antigênico da ß-Lg. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da HAP associada à polimerização por TG na suscetibilidade à digestão gástrica e gastrointestinal e na resposta antigênica da ß-Lg e a-La antes e após a digestão gástrica. Soluções de IPS (1% m/v), tratadas termicamente (72 °C/22 min) ou não, foram homogeneizadas a diferentes níveis de pressão (0, 100, 180 MPa) ou multiprocessadas por 3 ciclos consecutivos a 180 MPa. As amostras foram caracterizadas por turbidez, pelo teor de grupos sulfidrila reativos e livres e por eletroforese em sistema nativo e em SDS-PAGE em condições redutoras e não-redutoras. As amostras processadas foram polimerizadas com TG (25 U g-1 de proteína) e caracterizadas por eletroforese SDS-PAGE em sistema redutor e densitometria dos géis. Foi avaliada a suscetibilidade da ß-Lg e da a-La à digestão gástrica e gastrointestinal após tratamento térmico, HAP e polimerização, associados ou não. As condições de digestão foram: 182 U de pepsina g-1 de proteína e a relação 1:25 (enzima:proteína) para a pancreatina. A caracterização dos digeridos foi realizada por eletroforese SDS-PAGE/Tricina e cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (CLAE-FR). A antigenicidade das proteínas foi avaliada pelo método ELISA, utilizando soro anti-ß-Lg ou anti-a-La de camundongos BALB/c imunizados com as proteínas nativas. A homogeneização das soluções de IPS, previamente tratadas termicamente ou não, resultou na diminuição da turbidez e do teor de grupos sulfidrila reativos e livres com o aumento dos níveis de pressão. A polimerização com TG resultou na formação de polímeros com massa molecular (MM) acima de 97,4 kDa, principalmente nas amostras tratadas termicamente e homogeneizadas a 180 MPa por 1 e 3 ciclos, alcançando aproximadamente 20% de polímeros de alta MM. As amostras pré-tratadas e polimerizadas foram mais suscetíveis à digestão gástrica e gastrointestinal, resultando em menor residual de proteína intacta em relação às amostras homogeneizadas pré-tratadas termicamente ou não. Foi observado aumento (P< 0,05) da capacidade de ligação à IgE anti-a-La para a amostra de IPS tratado termicamente e homogeneizado a 180 MPa (IPS-TT-180, 27,88 µg IgE mL-1), em relação ao IPS nativo (IPS-N, 12,80 µg IgE mL-1), sugerindo que a associação do tratamento térmico e HAP aumentou a exposição de seus epítopos. Após a digestão gástrica, não foi observada redução da atividade antigênica da a-La em nenhuma das amostras analisadas. Já para a ß-Lg verificou-se que após a digestão gástrica a amostra de IPS tratado termicamente, homogeneizado a 180 MPa e polimerizado (IPS-TT-180 TG) apresentou diminuição (P< 0,05) da resposta antigênica para IgE anti-ß-Lg (13,59 µg IgE mL-1) em relação ao IPS-N (34,21 µg IgE mL-1). Em conclusão, os tratamentos utilizados alteraram a estrutura das principais proteínas do IPS, resultando na diminuição moderada da resposta antigênica da ß-Lg e no aumento da antigenicidade da a-La / Abstract: Bovine milk contains several proteins, which can induce allergic response. The most abundant whey proteins, â-lactoglobulin (â-Lg) and á-lactalbumin (á-La) are among the major antigenic proteins of cow¿s milk. High pressure homogenization (HPH) is an emergent technology which can alter whey proteins (WPI) structures and possibly WPI antigenicity. Previous studies indicated that polymerization with transglutaminase enzyme (TG) reduced the antigenic potential of â-Lg. The objective of the present study was to evaluate the effect of HPH associated to polymerization by TG on the susceptibility to simulated gastric and gastrointestinal digestion and on antigenic response of â-Lg and á-La before and after gastric digestion. Solutions of WPI (1% w/v) previously heat treated (72 °C/22 min) or without heat treatment were homogenized at several pressure levels (0, 100 and 180 MPa) or at 180 MPa for three consecutive cycles. The samples were characterized by turbidity, content of exposed and free sulfhydryl groups and by electrophoresis on native system and SDS-PAGE under non-reducing and reducing conditions. The processed samples were polymerized with TG enzyme (25 U g-1 of protein) and characterized by SDS-PAGE under reducing conditions followed by densitometry of gels. The susceptibility of â-Lg and á-La to gastric and gastrointestinal digestion was evaluated after heat treatment, HPH and polymerization, associated or not with each other. The digestion conditions were: 182 U pepsin g-1 protein and pancreatin:protein ratio of 1:25. Characterization of the digests was carried out by SDS-PAGE/Tricine and reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Protein antigenicity was evaluated by ELISA assay, using serum from BALB/c mouse immunized with native â-Lg and á-La. The homogenization of the WPI solutions, previously heat treated or without heat treatment, resulted in reducing both turbidity and exposed and free sulfhydryl group content as the pressure levels increased. The polymerization with TG enzyme resulted in polymers with molecular mass (MM) above 97.4 kDa, mainly in the samples heat treated and homogenized at 180 MPa for 1 or 3 cycles, forming around 20% of high MM polymers. Either polymerized samples previously treated with heat and/or HPH were more susceptible to gastric and gastrointestinal digestion, resulting in less residual intact protein as compared to the homogenized samples previously heat treated or without heat treatment. It was observed higher (P< 0.05) binding capacity to anti-á-La IgE for the sample heat treated and homogenized at 180 MPa WPI (WPI-TT-180, 27.88 ìg IgE mL-1) than for native WPI (WPI-N, 12.80 ìg IgE mL-1) suggesting that the association of heat treatment and HPH increased the exposition of á-La epitopes. After gastric digestion it was not observed a reduction of á-La antigenic activity. In relation to â-Lg antigenicity, after gastric digestion, the WPI sample heat treated, homogenized at 180 MPa and polymerized (WPI-TT-180 TG) showed reduction (P< 0.05) of anti-â-Lg IgE response (13.59 ìg IgE mL-1) as compared to WPI-N (34.21 ìg IgE mL-1). In conclusion, the treatments studied altered the structure of major protein of WPI, resulting in moderate reduction of â-Lg antigenic response and increased á-La antigenicity / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestra em Alimentos e Nutrição

Le développement des technologies de recombinaison en biologie moléculaire fut un point tournant pour les sciences biologiques. Depuis cette découverte, diverses avancées extraordinaires qui ont un impact direct sur les humains ont pu être accomplies dans les domaines de recherches qui découlent de cette technologie. L’étude des enzymes produites en utilisant cette technique est le fondement de leurs applications éventuellement accessibles. À cet effet, la biocatalyse est un sous-domaine de l’enzymologie en développement continuel. Les chimistes et ingénieurs utilisent les composantes de systèmes biologiques ou même des systèmes complets afin de complémenter ou remplacer des méthodologies existantes. Cette thèse étudie la famille d’enzymes transglutaminase (TGase) comme biocatalyseur afin d’explorer et d’étendre l’ubiquité et les innovations rendues possibles grâce aux enzymes. Les TGases sont des enzymes versatiles. Leur homologue bactérien, la transglutaminase bactérienne (MTG), est couramment utilisé à l’échelle industrielle pour la transformation alimentaire. Depuis une dizaines d’années, de nombreux efforts ont été faits afin de trouver de nouvelles applications des TGases. En premier lieu, une revue des accomplissements, progrès et défis reliés au développement des TGases sera décrite. Les TGases sont intrinsèquement des catalyseurs de la formation de lien isopeptidiques entre une glutamine et une lysine. Par ce fait, elles ont été initialement testées dans cette thèse pour la synthèse de peptides. Une forme de l’enzyme TGase de mammifères fut en mesure de générer les composés dipeptidiques Gly-Xaa et D-Ala-Gly avec une faible conversion. La MTG possède plusieurs caractéristiques qui font de cette enzyme un candidat intéressant pour le développement de biotechnologies. Elle est stable, non dépendante d’un cofacteur et connait peu de compétition pour sa réaction catalytique inverse. La majeure partie de cette thèse porte exclusivement sur l’utilisation de la MTG. Nous avons développé et caractérisé une réaction chimio-enzymatique en un seul pot pour la conjugaison de peptides et protéines. La présence de glutathion en quantité suffisante permet de contourner l’incompatibilité de la MTG avec le cuivre et ouvre la porte à l’utilisation de la réaction de cycloaddition entre un alcyne et un azoture catalysée par le cuivre, afin d’effectuer le marquage fluorescent de protéines. L’utilisation d’autres méthodes de chimie « click » sans métaux fut aussi étudiée afin d’incorporer divers substrats protéiques. Le marquage de protéines avec la MTG fut investigué de manière combinatoire. Précisément, la ligation de Staudinger, la cycloaddition azoture-alcyne promue par la tension de cycle, ainsi que la ligation de tetrazine (TL) ont été testées. Différents niveaux de conversion ont été atteints, le plus prometteur étant celui obtenu avec la TL. Une étude par cristallographie a été effectuée afin d’élucider comment les substrats contenant une glutamine interagissent avec la MTG. Une méthode de purification alternative de la MTG a été développée afin d’atteindre ce but. Une discussion sur les stratégies et défis est présentée. Finalement, la conjugaison entre un système contenant la MTG comme biocatalyseur de marquage, le domaine B1 de la protéine G (GB1) comme substrat et d’un fluorophore contenant une amine comme sonde fut étudié. Comme deux des constituants de ce système sont des protéines, l’ingénierie d’enzyme peut être entreprise afin d’améliorer leurs propriétés. Une banque de 24 variantes de GB1 fut construite grâce à une approche semi-rationnelle afin d’investiguer quels facteurs sont déterminants pour la sélectivité de la MTG envers la glutamine. Chaque variante étudiée comportait une seule glutamine à une position variable afin d’évaluer l’impact des éléments de structure secondaire où se retrouve la glutamine. L’efficacité pour le marquage a pu être améliorée d’au moins un ordre de grandeur pour huit des substitutions étudiées. Comme chacune des structures secondaires fut marquée, il fut démontré que la MTG n’en préfère pas une en particulier. De plus, la réactivité de la MTG envers la variante I6Q-GB1 fut augmentée en créant des mutations dans son site actif. Ces résultats permettent de comprendre d’avantage la sélectivité de la MTG envers la glutamine, tout en démontrant le potentiel de cette enzyme à être modifiée afin d’être améliorée. / The development of recombinant molecular biology technologies was a turning point for the biological sciences, which has since evolved into dozens upon dozens of different subfields and contributed to extraordinary advances for humans. At the core of many of these advances are the enzymes produced by these techniques, with efforts to understand their form and function laying the groundwork for their application. One of these continuously advancing subfields rooted in enzymology is biocatalysis, in which chemists and engineers embrace biological components and systems to complement, or even replace, existing methodologies. This thesis seeks to further contribute to the advancement and ubiquity of enzymes to be incorporated into future innovations. To this end, transglutaminase (TGase) is the biocatalyst selected for study. TGases are versatile enzymes, with the bacterial homolog, microbial transglutaminase (MTG) being readily used in industrial processes for years, particularly for food processing. An abundance of efforts seeking to apply TGases to other processes have been made within the last decade. We commence by reviewing the accomplishments, progress, and challenges to developing TGase towards new goals. TGase naturally catalyzes the formation of isopeptide bonds utilizing a glutamine and lysine substrates, and one of its first unconventional applications we investigated was for peptide synthesis. We determined the ability and specificity of one form of TGase for various amino acid-derived substrates, observing the formation of Gly-Xaa and D-Ala-Gly dipeptide products, albeit at a low conversion. MTG exhibits several characteristics that make it an appealing candidate for biotechnological development, such as its independence from a cofactor, little competition for its reverse catalytic reaction, and increased stability relative to mammalian TGases. Therefore, the remainder of this thesis pertains exclusively to MTG. We developed and extensively characterized a one-pot chemoenzymatic peptide and protein conjugation scheme. The presence of sufficient glutathione circumvents the incompatibility of the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition with MTG owing to the presence of copper. We ultimately utilized this chemoenzymatic conjugation scheme for fluorescent protein labeling. We continue to expand upon combinatorial methods to undertake protein labeling by investigating to what extent metal-free click chemistries can be utilized in combination with MTG. Specifically, the Staudinger ligation, strain-promoted azide-alkyne cycloaddition, and tetrazine ligation (TL) were assayed on protein substrates to reveal varying levels of effective conjugation, with the TL being the most promising of the three. The details surrounding the manner in which MTG interacts with its glutamine-containing substrate remains unclear. To address this knowledge gap, we sought to pursue crystallography studies, which required the development a modified purification strategy. We discuss the strategies we investigated and the challenges surrounding such efforts. Finally, we present a conjugation system consisting of MTG as the labeling biocatalyst, the B1 domain of Protein G (GB1) as a substrate, and a small-molecule amine belonging to a recently developed class of fluorophores as a probe. As two components of this system are proteins, enzyme engineering can be applied to further improve their properties. A semi-rational approach was used to generate a 24-member GB1 library to probe the structural determinants of MTG’s glutamine selectivity. Each variant contained a single glutamine at varying positions covering all secondary structure elements, and assayed for reactivity. Eight substitutions resulting in an increased labeling efficiency of at least an order of magnitude were distributed throughout all secondary structure elements, indicating that MTG does not favor one preferentially. In addition, introducing point mutations within MTG’s active site also resulted in increased reactivity towards variant I6Q-GB1. Our results contribute further to understanding the nature of MTG’s glutamine selectivity, while simultaneously demonstrating the potential enzyme engineering has to improve and adjust this system.

Orientador: Yoon Kil Chang / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-22T11:08:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jaekel_LeandraZafalon_D.pdf: 6646939 bytes, checksum: 22f384ec4204fdfd6cd400a411696f70 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O interesse dos consumidores por alimentos com características funcionais tem aumentado nos últimos anos. A farinha de trigo de grão inteiro (FTGI) contém constituintes com efeitos benéficos a saúde (fibras, minerais, vitaminas, antioxidantes e aminoácidos). O amido resistente (AR) também tem sua contribuição à saúde, atuando como fibra alimentar. Massas alimentícias, cuja produção brasileira cresce a cada ano, constituem uma excelente forma de aplicação dessas matérias-primas. Contudo, a FTGI e o AR podem trazer prejuízos tecnológicos. A enzima transglutaminase (TG) mostra-se como alternativa a esse problema, pode atuar formando ligações cruzadas com a glutenina e a gliadina. O objetivo geral foi estudar o efeito de diferentes fontes de fibras (FTGI ou AR) e da transglutaminase nas características tecnológicas, estruturais e sensoriais de massas alimentícias tipo espaguete. O estudo foi desenvolvido em quatro artigos: 1°) estudar a influência da adição de FTGI (51 a 100 %) e TG (0 a 0,5 %) nas características reológicas, de cozimento, textura e solubilidade de proteínas dos espaguetes, através de um delineamento composto central rotacional (DCCR); 2°) estudar o efeito da TG (0,5 %) nas características de cozimento e textura, estruturais e sensoriais de espaguetes adicionados de 58 % de FTGI; 3°) estudar o efeito da adição de AR (0 a 20 %) e TG (0,2 a 1,0 %) nas características (citadas no 1°artigo) dos espaguetes, através de um DCCR; 4°) estudar o efeito da TG (1,0 %) nas características (citadas no 2° artigo) de espaguetes adicionados de 14 % de AR. No 1°) observou-se que a adição de FTGI e TG foi estatisticamente significativa (p<0,10) para o tempo de desenvolvimento da massa, índice de tolerância à mistura e cor (L*). Os produtos constituem fontes de fibras, pois contêm mais de 3 % de fibra alimentar no produto pronto para o consumo (Portaria SVS/MS nº 27, 13/01/1998). No 2°) verificou-se que a TG aumentou (p<0,05) a firmeza e a temperatura final de gelatinização; também observou-se seu efeito na estrutura do produto por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A avaliação sensorial mostrou que o produto adicionado ou não de TG não diferiu estatisticamente (p<0,05) do controle quanto à textura e sabor, e a aparência foi melhor. Nos testes de aceitação e intenção de compra, a média dos espaguetes foi 7 e 4, que correspondem a "gostei moderadamente" e "provavelmente compraria", respectivamente. Além disso, as massas com adição de 58 % de FTGI são consideradas fonte de fibras e produtos e baixo índice glicêmico (aproximadamente 65 %). No 3°) AR e TG foram estatisticamente significativos (p<0,10) para cor, tempo ótimo de cozimento, aumento de peso, elasticidade e o teor de AR. Alguns dos produtos desenvolvidos foram fontes de fibra. No 4°) TG aumentou significativamente (p<0,05) a firmeza e elasticidade. A solubilidade proteica foi inferior no produto com TG para um tipo de solvente. O efeito da TG também foi observado através de MEV. Na avaliação sensorial, os espaguetes com ou sem TG não apresentaram diferença estatística para os parâmetros analisados através do teste de comparação múltipla, na aceitação e intenção de compra. A adição de 14 % de AR, além de caracterizar os produtos como fonte de fibras e de baixo índice glicêmico, possibilita a obtenção de produtos de qualidade tecnológica semelhante aos existentes no mercado / Abstract: The consumer interest in foods with better nutritional and functional characteristics is increasing in recent years. Whole-grain wheat flour (WGWF) contains many constituents with beneficial health effects (fiber, minerals, vitamins, natural antioxidants and amino acids). The resistant starch (RS) also contributes to human health once it presents similar effect of dietary fiber. Pasta, whose Brazilian production is increasing every year, consists of an excellent way of applying these raw materials. However, WGWF and RS may produce harmful effects during production process, since these components dilute the proteins forming the gluten in the product. The transglutaminase enzyme (TG) can act by forming cross links with the glutenin and gliadin, showing up as an alternative to this problem. The general objective was to develop spaghetti and study the effect of different sources of fiber (WGWF or RS) and transglutaminase on the technological, structural and sensory characteristics of the pasta. The study was conducted in four article: 1) the influence of adding WGWF and TG on texture, cooking characteristics and protein solubility of pasta using a randomized central composite design (RCCD), where the independent variables were WGWF (51 to 100%) and TG (0 to 0.5); 2) the effect of TG (0.5%) in texture, cooking, sensory and structural characteristics of pasta added 58% WGWF; 3) the effect of adding RS and TG on texture, cooking characteristics and protein solubility of pasta using a RCCD, where the independent variables were RS (0 to 20%) and TG (0.2 to 1.0); 4) the effect of TG (1.0%) on texture, cooking, structural and sensory characteristics of pasta containing 14% of RS. 1) The addition of TG and WGWF was statistically significant (p <0.10) in the dough development time, mixing tolerance index and color (L *). All formulations can be considered sources of fiber, since they contain more than 3% total dietary fiber. 2) We found that the addition of TG significantly increased (p <0.05) firmness and final gelatinization temperature and this effect was also observed in scanning electron microscopy (SEM). The sensory evaluationbased on the multiple comparison test showed that either pasta with TG addition orwithout the enzyme was not statistically different (p <0.05) than control sample with respect to texture and flavor. The appearance of these products was considered better than the control sample and did not differ from each other. Regarding the acceptance test and purchase intention, the average scores was 7 and 4, which correspond to "like moderately" and "probably buy" respectively. In addition, astacontaining 58% WGWF is considered source of fiber and low glycemic index food (about 65%). 3) RS and TG influenced the product quality, being statistically significant (p<0.10) for the color (L *, a *, b * and _E) optimum cooking time, increase weight, elasticity and RS content. It is worth mentioning any of the pasta developed in this study is source of dietary fiber. 4) We observed a significant effect (p <0.05) of TG on the characteristics of texture (firmness and resilience), once the product with added TG showed higher values than the product without TG addition. A significant effect was also observed on protein solubility, which was lower in the product containing TG when using a mixture of solvent. The effect of TG was also observed in scanning electron microscopy. In sensory evaluation, pasta with TG added or without the enzyme showed no statistical difference for theparameters studied by multiple comparison test, acceptance test and purchase intention. Besides characterizing the products as a source of fiber and low glycemic index, adding 14% of RS allows for obtaining competitive high-quality products / Doutorado / Tecnologia de Alimentos / Doutora em Tecnologia de Alimentos

Background Mass screening for celiac disease (CD) as a public health intervention is controversial. Before implementation, a suitable screening strategy should be outlined, and the acceptability of the screening scrutinized. Also, the benefits of early detection and possible negative consequences should be explored and compared. The overall aim of this thesis was to evaluate different strategies for finding 12-year-olds with undiagnosed CD in the general population, and to explore the experiences of those receiving the diagnosis in a mass screening. Methods A school-based CD screening of 12-year-olds was conducted in five study sites across Sweden. Out of 10041 children who were invited, 7208 had a blood sample analyzed for CD-marker tissue transglutaminase of isotype IgA (tTG-IgA) and 7161 for total serum IgA (s-IgA). If the s-IgA value was low, tTG-IgG was also measured. Additional analysis of endomysial antibodies (EMA) was performed if borderline values of tTG were found. In total, 192 had elevated CD-markers, 184 underwent a small intestinal biopsy and 153 eventually had CD diagnosed. Before receiving knowledge about their CD status, children and their parents filled in questionnaires regarding symptoms and CD-associated conditions. Questionnaires were returned by 7054 children (98%) and 6294 parents (88%). Later, all adolescents who had been diagnosed with CD more than one year ago (n=145), and their parents, were invited to a mixed-method follow-up study in which they shared their experiences in questionnaires, written narratives and focus group discussions. In total, we have information on 117 (81%) of these adolescents, either from the adolescents themselves (n=101) and/or from their parent/s (n=125). Data were analyzed using a combination of descriptive and analytical quantitative and qualitative methodologies. Results We found that information on symptoms and CD-associated conditions were poor predictors for finding undiagnosed CD in the study population. Questionnaire-based case-finding by asking for CD-associated symptoms and conditions would have identified 52 cases (38% of all cases) at a cost of blood-sampling 2282 children (37% of the study population). The tTG-IgA test had an excellent diagnostic accuracy with the area under the receiver operating characteristic curve of 0.988. If using the recommended cut-off for tTG-IgA (&gt;5 U/mL) 151 had fulfilled biopsy criteria and 134 CD cases had been identified. The strategy of lowering the cut-off to tTG-IgA&gt;4 U/mL, and adding the EMA analysis in those with tTG-IgA between 2-4 U/mL, identified another 17 cases (a 12% increase) at the cost of performing 32 additional biopsies. Measuring total s-IgA in 7161 children discovered only two additional cases at the cost of performing 5 additional biopsies. The positive predictive value of our screening strategy was 80%.  Results from the follow-up study of the screening-detected CD cases illustrated that 54% reported health improvement after initiated treatment, but also that these health benefits had to be balanced against social sacrifices. We also found that although the screening-detected diagnosis was met with surprise and anxiety, the adolescents and their parents were grateful for being made aware of the diagnosis. A majority of parents (92%) welcomed a future screening, but both adolescents and parents suggested that it should be conducted earlier in life. Conclusion Obtaining information on symptoms and CD-associated conditions was not a useful step in finding undiagnosed CD cases in a general population. The serological marker tTG-IgA, however, had excellent diagnostic accuracy also when lowering the cut-off. The diagnosis had varying impact on adolescents’ quality of life, and their perceived change in health had to be balanced against the social sacrifices resulting from the diagnosis. Overall, CD mass screening seemed acceptable to most of those who were diagnosed and their parents.