La plupart des processus dans notre vie quotidienne sont des processus hors équilibre. Un exemple de système hors équilibre est la cellule biologique et le transport qui a lieu dedans. Dans cette thèse ce transport intracellulaire est modélisé par des processus stochastiques. Pour cela deux approches différentes ont été utilisées : d’une part une modélisation explicite de particules actives avec des degrés de liberté internes obtenus expérimentalement, d’autre part une description phénoménologique des effets collectifs, qui est réalisée au moyen de processus d’exclusion.Un des résultats principaux pour le modèle explicite est qu’il est crucial de prendre en compte les fluctuations des forces pour reproduire les caractéristiques principales du mou- vement. Un autre élément important est la prise en considération de l’environnement cellu- laire, qui peut produire des effets non-triviaux, comme par exemple une inversion du sens de déplacement moyen. Pour étudier les effets collectifs il est possible de représenter le mou- vement des particules d’une manière simplifiée, en utilisant un processus d’exclusion avec des particules ayant des états internes. Le désordre sur les taux de saut qui en résulte peut provoquer une condensation dépendant de la densité.Un autre modèle étudié est un processus d’exclusion sur un réseau à deux voies. On suppose que deux types de particules se déplacent dans une géométrie tubulaire, inspirée par les champignons filamenteux. Ces hypothèses définissent un modèle minimal qui présente une transition de phase d’une phase de basse densité vers une phase pulsante caractérisée par des oscillations de densité. / Most processes in our daily life are far from equilibrium. The prime example is a cell and the transport occurring within. In this thesis intracellular transport is modeled by means of stochastic processes. For this, two different approaches are applied: the explicit mod- eling of active particles with internal degrees of freedom with characteristics as they were determined experimentally. And secondly, the collective effects occurring in many particle systems are studied in a phenomenological way by means of exclusion processes.In the explicit model one important result is given by the fact that force fluctuations are essential to capture the relevant motion characteristics. Further, the influence of the cellular environment creates counter-intuitive effects, like a possible inversion of the bias. The motion characteristics can be represented in a coarse-grained manner as an exclusion process for particles with internal states. Due to the resulting disorder in the hopping rates a density-dependent condensation occurs.In a second part, a two-lane exclusion model is studied. Two species in a tubular geometry inspired by filamentous fungi are considered.This can be seen as a minimal model exhibiting a phase transition from a low density phase to an intriguing phase with periodically changing particle densities.

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est une maladie génétique rénale qui se manifeste par le développement de kystes au rein. Elle résulte de mutations dans le gène PKD1/polycystine-1 (PC-1), contenant un motif coiled-coil et dans le gène PKD2/PC-2 dont les fonctions restent à élucider. À partir d’un chromosome artificiel bactérien, le gène Pkd1 murin (BAC-Pkd1) a été modifié afin de générer 4 lignées de souris transgéniques délété du motif coiled-coil Pkd1Δcoiled-coil et 3 lignées contrôles Pkd1TAG possédant 1-35 copies du transgène. Ces 2 transgènes ont un profil d’expression identique à l’endogène et le niveau dépend du nombre de copies. Alors que les souris Pkd1TAG développent la PKRAD de sévérité proportionnelle au niveau d’expression, les lignées Pkd1Δcoiled-coil en sont épargnées. Ces résultats démontrent l’importance du motif coiled-coil dans la maladie. Les souris Pkd1Δcoiled-coil croisées par Pkd1-/- (létale à la naissance), Pkd1-/- ; Pkd1Δcoiled-coil survivent après la naissance et permettent d’analyser in vivo les interactions, la signalisation et le rôle physiologique du motif coiled-coil. Ces souris Pkd1-/- ; Pkd1Δcoiled-coil avec une copie du transgène présentent des kystes rénaux et meurent ~2 semaines alors que celles à hautes copies n’ont aucun phénotype comme les Pkd1TAG. Les résultats génétiques et biochimiques démontrent que Pc-1Δcoiled-coil est hypomorphe. Bien que Pc-1Δcoiled-coil subit son clivage autoprotéolytique, l’analyse du transport intracellulaire de Pc1Δcoiled-coil montre un délai de maturation. Alors qu’in vitro le trafic Pc-1/Pc-2 dépend du motif coiled-coil pour leur interaction, in vivo une interaction Pc-1Δcoiled-coil/Pc-2 est détectée, suggérant un site d’interaction distinct. Nos études in vivo démontrent que le motif coiled-coil de Pc-1 joue un rôle clé dans sa maturation et l’existence d’un nouveau partenaire de Pc-1 pour son transport intracellulaire. / Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is the most prevalent genetic disorder that is characterize by the formation of bilateral renal cysts and leads to kidney failure. It results from mutations in the PKD1/polycystin-1(PC-1) gene, containing a coiled-coil motif, and in the PKD2/PC-2 gene, the functions of which remain to be elucidated. From a bacterial artificial chromosome, the murine Pkd1 gene (Pkd1-BAC) was modified in order to obtain 4 transgenic mouse lines deleted from it coiled-coil motif (Pkd1Δcoiled-coil) and 3 Pkd1TAG control lines possessing 1-35 copies of the transgene. These two transgenes have an expression profile identical to the endogenous gene and their expression depends on the number of copies. While Pkd1TAG mice develop ADPKD with a severity proportional to the level of expression, the Pkd1Δcoiled-coil lines are spared. These results demonstrate the importance of the coiled-coil motif in the disease. Pkd1Δcoiled-coil mice crossed by Pkd1-/- (lethal by birth), Pkd1-/-; Pkd1Δcoiled-coil survive after birth and allow the interactions, signaling and physiological role of the coiled-coil motif to be analyzed in vivo. These Pkd1-/-; Pkd1Δcoiled-coil mice with one copy of the transgene show kidney cysts and die ~ 2-weeks while high-copy ones have no phenotype as opposed to Pkd1-/-; Pkd1TAG who eventually develop cyst after 1 year. The genetic and biochemical results demonstrate that Pc-1Δcoiled-coil is hypomorphic. Although Pc-1Δcoiled-coil undergoes its autoproteolytic cleavage, analysis of the intracellular transport of Pc-1Δcoiled-coil shows a delay in maturation. While Pc-1 and Pc-2 appear to interact in vitro through their coiled-coil motif and co-transport, a Pc-1Δcoiled-coil -Pc-2 interaction is conserved in the kidney, suggesting a distinct mechanism of interactions in vivo. Thus, our results show that the coiled-coil motif of Pc-1 in vivo is involved in the maturation independently of Pc-2, highlighting the existence of a critical partner in intracellular transport.

Le virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) affecte la majorité de la population mondiale. HSV 1 cause de multiples symptômes délétères dont les plus communs sont les lésions orofaciales usuellement appelées feux sauvages. Le virus peut aussi causer des effets plus sérieux comme la cécité ou des troubles neurologiques. Le virus réside de façon permanente dans le corps de son hôte. Malgré l’existence de nombreux traitements pour atténuer les symptômes causés par HSV 1, aucun médicament ne peut éliminer le virus. Dans le but d’améliorer les connaissances concernant le cycle viral de HSV 1, ce projet cible l’étude du transport du virus dans la cellule hôte. Ce projet aura permis la collecte d’informations concernant le modus operandi de HSV 1 pour sortir des compartiments cellulaires où il séjourne. Les différentes expérimentations ont permis de publier 3 articles dont un article qui a été choisi parmi les meilleurs papiers par les éditeurs de « Journal of Virology » ainsi qu’un 4e article qui a été soumis. Premièrement, un essai in vitro reproduisant la sortie de HSV 1 du noyau a été mis sur pied, via l’isolation de noyaux issus de cellules infectées. Nous avons démontré que tout comme dans les cellules entières, les capsides s’évadent des noyaux isolés dans l’essai in vitro en bourgeonnant avec la membrane nucléaire interne, puis en s’accumulant sous forme de capsides enveloppées entre les deux membranes nucléaires pour finalement être relâchées dans le cytoplasme exclusivement sous une forme non enveloppée. Ces observations appuient le modèle de transport de dé-enveloppement/ré-enveloppement. Deuxièmement, dans le but d’identifier des joueurs clefs viraux impliqués dans la sortie nucléaire du virus, les protéines virales associées aux capsides relâchées par le noyau ont été examinées. La morphologie multicouche du virus HSV 1 comprend un génome d’ADN, une capside, le tégument et une enveloppe. Le tégument est un ensemble de protéines virales qui sont ajoutées séquentiellement sur la particule virale. La séquence d’ajout des téguments de même que les sites intracellulaires où a lieu la tégumentation sont l’objet d’intenses recherches. L’essai in vitro a été utilisé pour étudier cette tégumentation. Les données recueillies suggèrent un processus séquentiel qui implique l’acquisition des protéines UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 et possiblement ICP4 sur les capsides relâchées par le noyau. Troisièmement, pour obtenir davantage d’informations concernant la sortie de HSV 1 des compartiments membranaires de la cellule hôte, la sortie de HSV 1 du réseau trans golgien (TGN) a aussi été étudiée. L’étude a révélé l’implication de la protéine kinase D cellulaire (PKD) dans le transport post-TGN de HSV 1. PKD est connue pour réguler le transport de petits cargos et son implication dans le transport de HSV 1 met en lumière l’utilisation d’une machinerie commune pour le transport des petits et gros cargos en aval du TGN. Le TGN n’est donc pas seulement une station de triage, mais est aussi un point de rencontre pour différentes voies de transport intracellulaire. Tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation du virus HSV 1, ce qui pourrait mener au développement de meilleurs traitements pour combattre le virus. Les données amassées concernant le virus HSV 1 pourraient aussi être appliquées à d’autres virus. En plus de leur pertinence dans le domaine de la virologie, les découvertes issues de ce projet apportent également de nouveaux détails au niveau du transport intracellulaire. / Herpes simplex virus type 1 (HSV 1) affects the majority of the world population. HSV 1 causes various deleterious symptoms with the most common being facial mucosal lesions usually named cold sores. The virus can also contribute to more serious effects such as corneal blindness and neurological problems. The virus is permanently residing in the host body. Despite the existence of several treatments against HSV 1 symptoms, no drug is able to eliminate the virus. In order to improve knowledge of the viral cycle of HSV 1, this project focuses on the transport of the virus in the host cell. During this project we collect data to detail the modus operandi used by HSV 1 to leave cellular compartments such as the nucleus and the TGN. The different experimentations achieved during this PhD allowed the publication of three articles, including one selected as worthy of note by the editors of “Journal of virology” and a fourth article that has been submitted. Firstly, an in vitro assay that reproduces the exit of HSV 1 virus from nuclei was established via the isolation of nuclei from infected cells. We found that, as in intact cells, capsids escaped the isolated nuclei in the in vitro assay by budding through the inner nuclear membrane, accumulated as enveloped capsids between the two nuclear membranes, and were released in cytoplasm exclusively as unenveloped capsids. These observations support the de-envelopment / re-envelopment model of transport. Secondly, to identify viral players implicated in the nuclear egress of HSV 1, viral proteins associated with nuclear released capsids were investigated. HSV 1 has a multilayered morphology that includes a DNA genome, a capsid, a tegument and an envelope. The tegument represents viral proteins added sequentially on the viral particle. The sequential order and intracellular compartments where the tegument is added are the subject of intense research. The in vitro assay was used to investigate this tegumentation process. The acquired data suggest a sequential process that involved the acquisition of viral proteins UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 and possibly ICP4 on capsids released by the nucleus. Thirdly, to obtain information regarding another process of egress of HSV 1 from a membranous cellular organelle, the egress of HSV 1 from the TGN was also studied. The study revealed the implication of the cellular protein kinase D (PKD) in HSV 1 post-TGN transport. The involvement of this kinase, known to regulate the transport of small cargos, highlights the post TGN trafficking of both small and large entities (such as HSV 1) by a common machinery, in sharp contrast to earlier steps of transport. This indicates that the TGN is not only a sorting station but also a meeting point where different intracellular routes can meet. All these outcomes contribute to a better understanding of the complex maturation process of HSV 1 that could lead to the development of better tools to fight the virus. Results acquired concerning HSV 1 could also be applied to other viruses. Besides their relevance in the virology field, findings provided by this project also supply new details about cellular biology concerning intracellular transport.

Les vecteurs viraux dérivés du virus adéno-associé (AAV) apparaissent depuis deux décennies, comme des outils efficaces pour le transfert de gène in vivo. Cependant, malgré une faible immunogénicité et une absence de toxicité in vivo, leur optimisation requiert encore un effort important vers une meilleure compréhension de leur biologie et, en particulier, de leur interaction avec le système immunitaire. Au cours de ce travail de thèse, nous avons utilisé une méthode de sélection dirigée in vitro dans le but d’obtenir un variant de capside capable de transduire efficacement un type cellulaire non-permissif aux vecteurs AAV : les cellules dendritiques (DC). En effet, ces cellules jouent un rôle primordial dans l’établissement de la réponse immunitaire et, par conséquent, dans la persistance de l’expression du transgène in vivo. Cette technologie, très répandue dans la communauté AAV, a permis de sélectionner un variant de capside aux propriétés très intéressantes. La mutation sélectionnée, caractérisée in vitro comme induisant une instabilité de la capside, a permis d’identifier et de surmonter un point de blocage majeur dans le processus de transduction des DC par les vecteurs AAV consistant dans l’étape de décapsidation du génome du vecteur dans le noyau cellulaire. De manière intéressante, le variant obtenu exhibe un avantage en terme de transduction non seulement dans les DC mais aussi dans différents modèles de cellules primaires humaines (e.g. HUVEC) ou animales (OBC), peu ou pas permissive à l’AAV. De plus, des expériences de transfert de gène in vivo réalisées dans un modèle murin, indiquent que le variant sélectionné conduit à une meilleure expression du transgène, possiblement due à la mise en place d’un processus de tolérisation. Les propriétés remarquables de ce variant de capside, font de lui un candidat intéressant pour des applications médicales. / Vectors derived from the Adeno-associated virus (AAV) have emerged as an efficient system for in vivo gene transfer. However, despite their low immunogenicity and good tolerance in vivo, a better characterization of the host-AAV interaction is required to be able to fully exploit AAV’s potential fora gene therapy or gene vaccination. In this PhD project, we have used an in vitro directed evolution strategy to select an AAV capsid variant able to transduce human dendritic cell (DC), a non-permissive cell type which plays a critical role in the initiation of immune responses and, consequently, on the persistence of the expression of transgene in vivo. This procedure allowed us to identify an AAV variant characterized by a decreased stability of the capsid in vitro. The use of this mutant as a vector to transduce human DC resulted in an improved uncoating of the vector genome in the cell nucleus, thus identifying this step as major barrier toward DC transduction. Interestingly, the selected variant also displayed an increased transduction efficiency not only in DC but also in different primary human and animal cell types, poorly or non-permissive to AAV. Finally, when injected in mice, this AAV variant resulted in a higher expression of the transgene, associated to a low level of immune responses, suggesting the induction of tolerant state. The remarkable features suggest that our selected variant capsid is a promising candidate for medical applications.

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Le virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) affecte la majorité de la population mondiale. HSV 1 cause de multiples symptômes délétères dont les plus communs sont les lésions orofaciales usuellement appelées feux sauvages. Le virus peut aussi causer des effets plus sérieux comme la cécité ou des troubles neurologiques. Le virus réside de façon permanente dans le corps de son hôte. Malgré l’existence de nombreux traitements pour atténuer les symptômes causés par HSV 1, aucun médicament ne peut éliminer le virus. Dans le but d’améliorer les connaissances concernant le cycle viral de HSV 1, ce projet cible l’étude du transport du virus dans la cellule hôte. Ce projet aura permis la collecte d’informations concernant le modus operandi de HSV 1 pour sortir des compartiments cellulaires où il séjourne. Les différentes expérimentations ont permis de publier 3 articles dont un article qui a été choisi parmi les meilleurs papiers par les éditeurs de « Journal of Virology » ainsi qu’un 4e article qui a été soumis. Premièrement, un essai in vitro reproduisant la sortie de HSV 1 du noyau a été mis sur pied, via l’isolation de noyaux issus de cellules infectées. Nous avons démontré que tout comme dans les cellules entières, les capsides s’évadent des noyaux isolés dans l’essai in vitro en bourgeonnant avec la membrane nucléaire interne, puis en s’accumulant sous forme de capsides enveloppées entre les deux membranes nucléaires pour finalement être relâchées dans le cytoplasme exclusivement sous une forme non enveloppée. Ces observations appuient le modèle de transport de dé-enveloppement/ré-enveloppement. Deuxièmement, dans le but d’identifier des joueurs clefs viraux impliqués dans la sortie nucléaire du virus, les protéines virales associées aux capsides relâchées par le noyau ont été examinées. La morphologie multicouche du virus HSV 1 comprend un génome d’ADN, une capside, le tégument et une enveloppe. Le tégument est un ensemble de protéines virales qui sont ajoutées séquentiellement sur la particule virale. La séquence d’ajout des téguments de même que les sites intracellulaires où a lieu la tégumentation sont l’objet d’intenses recherches. L’essai in vitro a été utilisé pour étudier cette tégumentation. Les données recueillies suggèrent un processus séquentiel qui implique l’acquisition des protéines UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 et possiblement ICP4 sur les capsides relâchées par le noyau. Troisièmement, pour obtenir davantage d’informations concernant la sortie de HSV 1 des compartiments membranaires de la cellule hôte, la sortie de HSV 1 du réseau trans golgien (TGN) a aussi été étudiée. L’étude a révélé l’implication de la protéine kinase D cellulaire (PKD) dans le transport post-TGN de HSV 1. PKD est connue pour réguler le transport de petits cargos et son implication dans le transport de HSV 1 met en lumière l’utilisation d’une machinerie commune pour le transport des petits et gros cargos en aval du TGN. Le TGN n’est donc pas seulement une station de triage, mais est aussi un point de rencontre pour différentes voies de transport intracellulaire. Tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation du virus HSV 1, ce qui pourrait mener au développement de meilleurs traitements pour combattre le virus. Les données amassées concernant le virus HSV 1 pourraient aussi être appliquées à d’autres virus. En plus de leur pertinence dans le domaine de la virologie, les découvertes issues de ce projet apportent également de nouveaux détails au niveau du transport intracellulaire. / Herpes simplex virus type 1 (HSV 1) affects the majority of the world population. HSV 1 causes various deleterious symptoms with the most common being facial mucosal lesions usually named cold sores. The virus can also contribute to more serious effects such as corneal blindness and neurological problems. The virus is permanently residing in the host body. Despite the existence of several treatments against HSV 1 symptoms, no drug is able to eliminate the virus. In order to improve knowledge of the viral cycle of HSV 1, this project focuses on the transport of the virus in the host cell. During this project we collect data to detail the modus operandi used by HSV 1 to leave cellular compartments such as the nucleus and the TGN. The different experimentations achieved during this PhD allowed the publication of three articles, including one selected as worthy of note by the editors of “Journal of virology” and a fourth article that has been submitted. Firstly, an in vitro assay that reproduces the exit of HSV 1 virus from nuclei was established via the isolation of nuclei from infected cells. We found that, as in intact cells, capsids escaped the isolated nuclei in the in vitro assay by budding through the inner nuclear membrane, accumulated as enveloped capsids between the two nuclear membranes, and were released in cytoplasm exclusively as unenveloped capsids. These observations support the de-envelopment / re-envelopment model of transport. Secondly, to identify viral players implicated in the nuclear egress of HSV 1, viral proteins associated with nuclear released capsids were investigated. HSV 1 has a multilayered morphology that includes a DNA genome, a capsid, a tegument and an envelope. The tegument represents viral proteins added sequentially on the viral particle. The sequential order and intracellular compartments where the tegument is added are the subject of intense research. The in vitro assay was used to investigate this tegumentation process. The acquired data suggest a sequential process that involved the acquisition of viral proteins UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 and possibly ICP4 on capsids released by the nucleus. Thirdly, to obtain information regarding another process of egress of HSV 1 from a membranous cellular organelle, the egress of HSV 1 from the TGN was also studied. The study revealed the implication of the cellular protein kinase D (PKD) in HSV 1 post-TGN transport. The involvement of this kinase, known to regulate the transport of small cargos, highlights the post TGN trafficking of both small and large entities (such as HSV 1) by a common machinery, in sharp contrast to earlier steps of transport. This indicates that the TGN is not only a sorting station but also a meeting point where different intracellular routes can meet. All these outcomes contribute to a better understanding of the complex maturation process of HSV 1 that could lead to the development of better tools to fight the virus. Results acquired concerning HSV 1 could also be applied to other viruses. Besides their relevance in the virology field, findings provided by this project also supply new details about cellular biology concerning intracellular transport.