Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 321859.pdf: 3090323 bytes, checksum: 3479050dc6f220ab0e161e1914293161 (MD5) Previous issue date: 2013 / A crista neural (CN) corresponde a umapopulação de células que se origina na região dorsaldo tubo neural de embriões de vertebrados durante aneurulação. Durante este processo, as células daectoderme sofrem transição do fenótipo epitelial parao mesenquimal, tornando-se migratórias, e sedestinam a povoar vários órgãos e tecidos emdesenvolvimento. As regiões que são povoadas porestas células, ao longo do eixo antero-posterior doembrião, formam subdivisões: cranial, vagal, truncale sacral e produzem uma enorme variedade dederivados, incluindo neurônios e células gliais dosistema nervoso periférico, melanócitos, célulasendócrinas e glandulares além de tecidosesqueléticos e conjuntivo da cabeça, face e pescoço,além das meninges cerebrais. Assim, a CN écomposta de populações de precursores jádeterminados e de células multipotentes. Célulascom características da CN podem também serencontradas em tecidos adultos como, no nervociático, nos gânglios da raiz dorsal, intestino, córnea,coração, medula óssea e pele. Na pele demamíferos, essas células residem em um discretomicroambiente conhecido como a saliência dofolículo piloso (bulge). O destino dos precursoresmultipotentes depende de vários fatores e omicroambiente exerce papel fundamental nesteprocesso. Fatores de crescimento, como o fator decrescimento de fibroblasto tipo 2 (FGF2) e o fator decrescimento epidermal (EGF), têm sido identificadoscomo importantes em direcionar a diferenciação deprogenitores multipotentes da CN. Nesse estudo,verificamos que o FGF2 promove a renovação eproliferação dos precursores mais indiferenciados emultipotentes da CN de embriões de codornamantendo-os indiferenciados. FGF2 promove ainda aautorrenovação do precursor bipotente de glia emúsculo liso, ao mesmo tempo em que estimulaprogramas de diferenciação celular para aslinhagens glial e neuronal em detrimento dadiferenciação melanocítica. No entanto, adiferenciação terminal só ocorre após a remoção deFGF2. Além disso, aperfeiçoamos protocolo deisolamento e cultivo de células semelhantes à CN defolículos pilosos das vibrissas de camundongos.Essas células apresentam morfologia semelhante àCN embrionária e expressam os marcadores de CNPax3, Slug, Snail, Sox10 e p75. O tratamento comFGF2/EGF estimula a proliferação e diferenciaçãodas células folículo piloso para os fenótiposadipogênico, osteogênico, melanocítico, neural emuscular liso quando em condições específicas decultivo. Em conjunto, os resultados sugerem queexistam populações celulares com característicasmultipotentes no folículo piloso murino, dentre elas células semelhante à CN.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-08T04:09:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334171.pdf: 1758264 bytes, checksum: c728206860b0465da5e4a456bda9eb31 (MD5) Previous issue date: 2015 / A diferenciação de células especializadas na secreção de matriz é essencial para a formação dos maxilares e dos tecidos dentais. A maior parte do tecido mesenquimal na região cefálica é formada pelas células da crista neural (CN). Essas células são migratórias, multipotentes, dando origem a uma variedade de tipos celulares e, por isso, são consideradas de alta plasticidade, indicando que contenham progenitores celulares com grande poder de diferenciação, característica de células-tronco. Neste trabalho, foi avaliada a presença de progenitores indiferenciados de células da CN, além de células-tronco mesenquimais com potencial osteoblástico, durante o processo de odontogênese e osteogênese dos maxilares, em ratos. Para esse fim, lâminas histológicas de cabeças de ratos foram coletadas e analisadas por meio de imuno-histoquímica em 2 fases do desenvolvimento: idade fetal de 15 e 17 dias (F15; F17); e 2, 4 e 7 dias após o nascimento (D2; D4; D7). Foi analisada a distribuição dos marcadores de CTM (Osterix) e de CN (Sox-10, HNK-1). Os resultados obtidos demonstram marcação para os anticorpos Osterix e HNK-1 em células ectomesenquimais indiferenciadas ao redor da cartilagem de Meckel e em células da papila dentária e no epitélio do germe dentário; Sox-10 obteve marcação nas mesmas células indiferenciadas apenas em estágios iniciais do desenvolvimento. Houve também positividade para HNK-1 e Osterix nas células ectomesenquimais indiferenciadas adjacentes ao centro de ossificação do palato secundário. Ainda observou-se expressão positiva para HNK-1, Sox-10 e Osterix em células já diferenciadas, como osteoblastos e osteócitos na formação da cripta óssea e ossificação do palato secundário e, também, em ameloblastos e odontoblastos, no período de odontogênese. Em conjunto, os resultados sugerem que o Osterix, HNK-1 e Sox-10 provavelmente participam do processo de diferenciação de osteoblastos, odontoblastos e ameloblastos, sendo importantes para a manutenção do estado indiferenciado destas células em estágios iniciais de secreção de matriz.<br> / Abstract : Differentiation of specialized cells for secretion of mineralized matrix is essential to development of mandibular and dental tissues. Most of mesenchymal tissue in facial area is formed by neural crest cells (NC). These multipotent cells are highly migratory, leading to gives rise to a variety of cells, this way they are considered with a high level of plasticity, indicating that contains progenitor cells, with great power of differentiation, characteristic of stem cells. In this study was evaluate the presence of NC cell progenitors, and mesenchymal stem cells (MSC), during maxillaries osteogenesis and odontogenesis in rats. Histological slides were collected and analyzed by immunohistochemistry in 2 phases of development: fetal age of 15 and 17 days (F15; F17), 2, 4 and 7 days after birth (D2; D4; D7). It was performed immunohistochemistry for MSC markers (Osterix) and NC cells (Sox-10, HNK-1). The results showed positive expression for antibodies Osterix and HNK-1 in undifferentiated ectomesenchymal cells around the Meckel's cartilage and dental papilla cells of the epithelium and tooth germ; Sox-10 was present only in early stages in undifferentiated cells. There was also positive for HNK-1 and Osterix in undifferentiated ectomesenchymal cells adjacent to the ossification center of the palate shelf. Also showed positive expression for all antibodies in differentiated cells, such as osteoblasts and osteocytes, in bone crypt and palate shelf formation and ameloblasts and odontoblasts during odontogenesis. Our results suggest that Osterix, HNK-1 and Sox-10 probably participate in differentiation process of osteoblasts, odontoblasts and ameloblasts, and are important for the maintenance of the indiferenciated status of these cells during secretion of mineralized matrix.

FEITOSA, Neli Patricia Pereira. Imunoexpressão de marcadores de células -tronco, CD44 e CD133, no câncer gástrico primário e metástases linfonodais. 2015. 68 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-29T13:47:51Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_nppfeitosa.pdf: 1566891 bytes, checksum: c867b84a46d19b6c755515c32880e5be (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-29T13:50:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_nppfeitosa.pdf: 1566891 bytes, checksum: c867b84a46d19b6c755515c32880e5be (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T13:50:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_nppfeitosa.pdf: 1566891 bytes, checksum: c867b84a46d19b6c755515c32880e5be (MD5) Previous issue date: 2015 / Gastric cancer is the fourth most common cancer worldwide, accounting for the second leading cause of cancer mortality. Despite treatment with surgery and chemotherapy, the overall five-year survival of patients with gastric cancer remains low. One possible explanation for the ineffectiveness of therapy is the presence of cancer stem cells, a subpopulation of tumor cells that have stem cell characteristics. It has been reported that these, as well as embryonic stem cells, are immortal, can self-renew and to differentiate to be transformed in any cell type in the body. Several markers, including CD44 and CD133, have been reported as stem cell markers in both normal and cancerous cells and have been used to isolate cancer cells from solid tumors. The aim of this study was to evaluate the expression of CD44 and CD133 in primary gastric cancer and lymph node metastases by immunohistochemical and to relate it to clinicopathologic variables as histological type, gender, age, anatomical site, tumor size, angiolymphatic invasion, infiltration perineural, TNM classification (TN) and lymph node involvement. This study was developed from a set of 72 cases of gastric adenocarcinoma, from the Archives of Pathology and Forensic Medicine of the Federal University of Ceará Service (DPML-UFC). Tissue microarray and immunohistochemistry were utilized, with anti-CD44 monoclonal antibody and polyclonal anti-CD133. The cases with one or more cells with cytoplasmic and / or membrane immunostaining were considered positives. It was observed that 30% of the samples were positive for CD44. No statistically significant differences were found between the clinical and pathological variables studied and the immunoreactivity of CD44. Regarding the immunoreactivity of CD133, the present study showed that 24% of samples were positive. The degree of tumor invasion presented data showing a statistically significant trend (p = 0.0505), in reverse. The other variables, we found no statistically significant difference. The immunoreactivity of CD133 in histologically normal mucosa was higher than in the primary tumor and intestinal metaplasia, with statistically significant difference (p = 0.0159 and p = 0.0058, respectively). The CD133 immunostaining in intestinal type gastric carcinoma was significantly higher than in the histologically normal mucosal metaplasia (p = 0.0260). The frequency of expression of these markers is highly variable, and even in the samples considered positive, the stained cells percentage is also variable, and very low overall. / O câncer gástrico é a quarta neoplasia mais comum em todo o mundo, representando a segunda causa de mortalidade por câncer. Apesar do tratamento com cirurgia e quimioterapia, a sobrevida global em cinco anos de pacientes com câncer gástrico permanece baixa. Uma possível explicação para ineficácia da terapia é a presença de células-tronco cancerosas, uma subpopulação de células tumorais que apresentam características de células-tronco. Estas células, assim como as células tronco embrionárias, são consideradas imortais, podem se auto-renovar e se transformar em qualquer célula do corpo. Vários marcadores, incluindo CD44 e CD133, têm sido relatados como marcadores de células-tronco, normais e cancerosas, e utilizados para isolar células cancerosas de tumores sólidos. O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de CD44 e de CD133, no câncer gástrico primário e metástases linfonodais, através de imunohistoquímica, e relacioná-la com as variáveis clínico-patológicas de tipo histológico, sexo, idade, localização anatômica, dimensão do tumor, invasão angiolinfática, infiltração perineural, classificação TNM (TN) e acometimento linfonodal. Este estudo foi desenvolvido a partir de um conjunto de 72 casos de adenocarcinoma gástrico, dos Arquivos do Serviço de Patologia e Medicina Legal da Universidade Federal do Ceará (DPML-UFC). Utilizou-se a técnica de tissue microarray asociada à imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-CD44 e policlonal anti-CD133. Foram considerados positivos os casos que apresentaram uma ou mais células com imunomarcação citoplasmática e/ou membranar. Foi observado que 30% das amostras foram positivas para o CD44. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre as variáveis clínico-patológicas estudadas e a imunoexpressão de CD44. A imunoexpressão do CD133 foi positiva em 24% das amostras. O grau de invasão do tumor apresentou dados com tendência estatisticamente significante (p=0,0505), de forma inversa. Nas demais variáveis, não foi encontrada nenhuma diferença estatisticamente significante. A imunoexpressão de CD133 na mucosa histologicamente normal foi maior do que no tumor primário e na metaplasia intestinal, com diferença estatística significante (p=0,0159 e p=0,0058, respectivamente). A imunoexpressão de CD133 no adenocarcinoma gástrico tipo intestinal foi significativamente maior na mucosa histologicamente normal do que na metaplasia (p=0,0260). A frequência da expressão desses marcadores é muito variável, e mesmo nas amostras consideradas positivas, o percentual de células coradas também é variável, e em geral muito baixo.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-10-24T03:17:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347972.pdf: 3996488 bytes, checksum: 680551325ccd6d683ccb554947b79acf (MD5) Previous issue date: 2017 / A proteína óssea morfogenética tipo 2 (BMP-2) e o ácido retinoico (RA) são fatores osteoindutivos que estimulam os mecanismos de reparo ósseo endógeno e podem ser aplicados no manejo de defeitos ósseos em cirurgias bucais e maxilofaciais. Considerando os resultados controversos do RA na osteogênese e a possibilidade de seu uso para substituir/potencializar os efeitos da BMP-2, esse estudo comparou os efeitos in vitro da BMP-2, do RA e da BMP-2+RA na diferenciação osteogênica de células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASCs) humano e avaliou as vias de sinalização envolvidas no processo de diferenciação. As ASCs foram tratadas a cada dois dias com meio osteogênico básico (OM) sozinho ou suplementado com BMP-2, RA ou BMP-2+RA. A atividade da fosfatase alcalina (ALP) foi determinada usando o método do ?-nitrofenolfosfato. A mineralização da matriz extracelular foi avaliada pela técnica de coloração de Von Kossa e pela quantificação do cálcio. As expressões de osteonectina e osteocalcina mRNA foram determinadas por qPCR. As proteínas Smad1, Smad4, Smad1/5/8 fosforiladas, BMP-4, e BMP-7 foram analisadas por western blotting. As vias de sinalização foram avaliadas pelo programa IPA®. O tratamento com RA resultou em maior atividade de ALP nos dias 7, 14, 21 e 28, enquanto a BMP-2+RA forneceu maior mineralização da matriz extracelular em 12 e 32 dias. As expressões de osteocalcina e osteonectina mRNA, bem como Smad1/5/8 fosforiladas foram maiores no grupo tratado com BMP-2+RA em 7 dias. A associação BMP-2+RA promoveu a maior sinalização da via da BMP em 7 e 14 dias. O RA e a BMP-2+RA demonstraram maior ativação da diferenciação de células formadoras de osso, comparadas com o grupo OM, enquanto a BMP-2 não apresentou essa capacidade. Assim, pode-se concluir que o RA aumentou os efeitos da BMP-2 na diferenciação osteogênica das ASCs. Tendo em vista esse achado, a possibilidade de usar a BMP-2 associada ao RA para melhorar a regeneração óssea em cirurgias orais e maxilofaciais é reforçada. Sendo importante ressaltar que, além de melhorar a osteogênese, o uso da BMP-2 combinada ao RA pode permitir o uso de doses reduzidas de BMP-2, minimizando os efeitos adversos e os custos relacionados à BMP-2.

As células-tronco mesenquimais (MSC) são caracterizadas pelo seu potencial de diferenciação em células de origem mesenquimal como adipócitos, condrócitos e osteócitos; ação parácrina; capacidade imunorregulatória e tropismo por regiões lesionadas e câncer. Estas células já foram isoladas de diferentes órgãos e tecidos e apresentam características bastante similares, mas não idênticas: fato que ressalta a importância da realização de estudos comparativos para determinar a real equivalência das MSC de diferentes origens. Os principais objetivos deste trabalho foram analisar o potencial de transferência gênica mediado por lipofectamine 2000, detectar e quantificar a expressão dos fatores de pluripotência Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, Tcl-1α, Nanog e comparar a eficiência de reprogramação celular em MSC murinas provenientes de medula óssea (moMSC), tecido adiposo (ADSC), rim (rMSC), pulmão (pMSC), veia cava (cMSC) e medula espinhal (meMSC). Estas células também foram classificadas com relação ao tempo de cultivo, sendo subdivididas em: Cultivo Inicial (até passagem 7), Cultivo Intermediário (da passagem 8 a 12) e Cultivo Tardio (a partir da passagem 13). No que se refere à transfecção usando lipofectamine 2000, foi observada maior eficiência em pMSC e rMSC quando comparadas a cMSC, todas em passagem tardia. Neste trabalho é mostrada a expressão de Klf4, Sox2, Lin28 e c- Myc em MSC murinas isoladas de pulmão, rim, tecido adiposo e medula espinhal. Lin28 foi detectado apenas no estágio inicial do cultivo de pMSC e ADSC e intermediário de rMSC. Enquanto que nas meMSC, Lin28 e Sox2 parecem diminuir com o tempo de cultivo chegando a zero no cultivo tardio. Não foi detectada a expressão de Oct4, Nanog ou Tcl-1α. Um dado muito expressivo é a reprogramação de moMSC apenas com OCT4 e SOX2 quando é utilizado o co-cultivo com fibroblastos embrionários 15 murinos (MEF). Aqui também pode ser visto que existe uma relação direta entre eficiência de geração de iPSC e o tempo de substituição das condições de cultivo nos dois tempos testados. Quando o co-cultivo em MEF é substituído por placas recobertas por gelatina e meio mESC induzido, não é observada a reprogramação apenas com dois fatores, sendo obrigatória a adição de c-MYC ou KLF4. pMSC apresentou maior número de iPSC quando comparado aos demais, seguida de moMSC e rMSC. Não detectamos reprogramação em ADSC. Outra variação observada foi que as moMSC reprogramam mais rapidamente (dia 8), sendo seguidas pelas pMSC (dia 10) e pelas rMSC (dia 16). O potencial de utilização das MSC na terapia gênica ex vivo e na reprogramação celular é variável e possivelmente está associado ao local de onde estas células são isoladas, além do estágio de cultivo. Ainda assim, muitos estudos ainda precisam ser realizados para estipular de forma exata a colaboração que cada MSC pode oferecer para o uso clínico. / The Mesenchymal Stem Cells (MSC) are characterized by their potential to differentiate into cells of mesenchymal origin such as adipocytes, chondrocytes and osteocytes; paracrine action; immunoregulatory capacity and tropism for injured regions and cancer. These cells have been isolated from different tissues and organs and exhibit similar characteristics, but are not identical: a fact that highlights the importance of comparative studies to determine the real equivalence of MSC from different sources. The objectives of this study were to analyze the potential of gene transfer mediated by Lipofectamine 2000; detect and quantify the expression of pluripotency factors Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, Tcl-1α, Nanog and compare the efficiency of reprogramming in murine MSC isolated from bone marrow (moMSC), adipose tissue (ADSC), kidney (rMSC), lung (PMSC), vena cava (cMSC) and spinal cord (meMSC). These cells were classified according to time of cultivation, subdivided in: Recent Cultivation (up to passage 7), Cultivation Intermediate (passage 8 to 12) and Late Cultivation (from passage 13). Regarding transfection using Lipofectamine 2000, higher efficiency was achieved in PMSC and rMSC compared to cMSC, all in late passage. In this work we show the expression of Klf4, Sox2, c-Myc and Lin28 in MSC isolated from murine lung, kidney, adipose tissue and spinal cord. Lin28 was detected only in the early stage of cultivation in pMSC and ADSC and intermediate cultivation in rMSC. In meMSC, the expression of Lin28 and Sox2 appears to decrease with time not being detected in late cultivation. We did not detect the expression of Oct4, Nanog or Tcl-1α in any sample studied. A very important finding was the reprogramming of moMSC with only OCT4 and SOX2 when it was co-culture on murine embryonic fibroblasts (MEF). In this study was detected a direct relationship between efficiency of iPSC generation and the time of replacement of culture conditions, considering the times tested; 3 or 5 days post transduction. When the co-cultivation on MEF was replaced by plates coated with gelatin and induced medium is not observed with only two reprogramming factors, being required the addition of KLF4 or c-MYC. Comparing the efficiency of reprogramation between MSC, pMSC showed higher number of iPSC when compared to the others, followed by moMSC and rMSC. There was not detected cell reprogramming in ADSC. Another variation observed was in the reprogramming time. The moMSC reprogram faster (8 days), being followed by the pMSC (day 10) and the rMSC (day 16). The potential use of MSC in ex vivo gene therapy and cellular reprogramming is variable and may be associated with the location from which these cells are isolated, beyond the stage of cultivation. However, further studies are necessary to accurately stipulate the clinical use for each MSC.

O objetivo do estudo foi avaliar, in vitro, a influência da fotobiomodulação (PBM) na, viabilidade e migração, relacionados à acetilação das histonas, e na diferenciação de células-tronco da polpa de dentes permanentes humanos (hDPSCs); e, in vivo, sua influência no reparo radicular de molares de ratos com necrose pulpar e rizogênese incompleta. hDPSCs foram caracterizadas e utilizadas nos experimentos de três artigos científicos. A PBM foi empregada utilizando-se laser diodo InGaAlP (100mW, 660nm, 3J/cm2, energia total por aplicação 1J em 10s). Em todos os experimentos in vitro os grupos foram divididos de acordo com o uso da PBM e os intervalos de irradiação foram de 6 horas. A viabilidade destas células foi avaliada pelo ensaio de MTT e a migração pelo scratch. A acetilação das histonas das hDPSCs foi avaliada por imunofluorescência. Para avaliar o potencial de diferenciação e a deposição de tecido mineralizado, foram utilizados os meios adipogênico, condrogênico e osteogênico, complementado pelo ensaio de atividade ALP, em modelo 3D, em gel de agarose 0,3%. Nos ensaios de diferenciação também foi avaliada a condição nutricional (regular: 10% SFB; ou déficit: 5%SFB). Os resultados do MTT, scratch e da acetilação das histonas foram obtidos em até 24 horas e nos ensaios de diferenciação foram analisados em 7 e 14 dias. Para o experimento in vivo, molares inferiores de ratos Wistar foram expostos ao meio bucal por 3 semanas e, após, tratados com pasta antibiótica por uma semana. A seguir, os canais foram irrigados e divididos em 6 grupos (n=6): MTA; coágulo sanguíneo (CS); hDPSC; MTA+PBM; CS+PBM; hDPSC+PBM. Dois grupos não foram expostos ao meio bucal: Dente hígido+PBM (n=6), Dente hígido (controle positivo, n=3); e um grupo foi mantido exposto durante todo o período experimental: Dente necrótico (controle negativo, n=3). Durante 30 dias as irradiações foram feitas com intervalos de 24 horas. Após, os ratos foram eutanasiados e realizou-se avaliação histológica e imunohistoquímica. Os dados obtidos foram tabulados e analisados estatisticamente. A PBM aumentou a viabilidade das células (P<0.001). No ensaio de scratch o grupo PBM acelerou o fechamento do ferida até 12 horas (P<0.001) e esta fechou em 18 horas, sendo mais rápido que o controle (P<0.05). A PBM aumentou a acetilação das histonas (P<0.001); Após 14 dias, a PBM intensificou a diferenciação nos três meios empregados e na atividade ALP, comparado com os controles (P<0.05). No estudo in vivo, o controle negativo apresentou infiltrado de neutrófilos maior do que os demais grupos (P<0.05). Os grupos Controle negativo, Dente hígido e Dente hígido+PBM apresentaram menos condensação fibrosa (P<0.05). Todos os grupos formaram mais tecido mineralizado que o controle negativo (P<0.05). PBM+MTA, +CS ou +hDPSC formaram mais tecido mineralizado que os grupos não irradiados (P<0.05). MTA+PBM induziu apicificação (P<0.05). A marcação para BSP confirmou os achados histológicos relacionados a formação de tecido mineralizado e as hDPSCs, com e sem PBM, exibiram maior porcentagem de células positivas para BSP. Conclui-se que a PBM desempenhou papel importante, in vitro, aumentando a diferenciação, viabilidade e migração celular que estão relacionados a acetilação das histonas. Além disso, a PBM pode ser uma alternativa de tratamento adjuvante para dentes permanentes com necrose pulpar e rizogênese incompleta favorecendo o reparo radicular. / The aim of this study was to evaluate, in vitro, the influence of photobiomodulation (PBM) on viability and migration, related to histone acetylation, and differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs); and, in vivo, its influence on the root repair of rat molars with pulp necrosis and open apex. The hDPSCs were characterized and used in the experiments of three scientific papers. The PBM was applied using InGaAlP diode laser (100mW, 660nm, 3J / cm2, total energy per application 1J in 10s). In all in vitro experiments, the groups were divided according to the use of PBM, with 6-hour irradiation intervals. The viability of these cells was assessed by MTT assay and migration by scratch. The histone acetylationof hDPSCs was evaluated by immunofluorescence. To evaluate the potential for differentiation and deposition of mineralized tissue, adipogenic, chondrogenic and osteogenic mediums were used, complemented by the ALP activity assay in 3D model, in 0.3% agarose gel. In differentiation assays, the nutritional status was also evaluated (regular: 10% FBS; or deficit: 5% FBS). The MTT, scratch and histone acetylation results were obtained until 24 hours, and the differentiation assays were analyzed at 7 and 14 days. For the in vivo experiment, lower molars of Wistar rats were exposed to oral environment for 3 weeks and then treated with antibiotic paste for one week. Next the root canals were irrigated and divided into 6 groups (n=6): MTA; BC (blood clot); hDPSC; healthy tooth+PBM; MTA+PBM; BC+PBM; hDPSC+PBM. In hDSPC groups, 1% agarose gel scaffold was used for cell support. Two groups were not exposed to the oral environment: healthy tooth+PBM (n=6), healthy tooth (positive control, n=3); and one stayed exposed during the role experimental period: necrotic tooth (negative control, n=3). For 30 days the irradiations were done at 24-hour intervals. Thereafter, the rats were euthanized and histological and immunohistochemical evaluations were performed. Data were tabulated and statistically analyzed. PBM increased cell viability (P<0.001). In the scratch assay, the PBM group accelerated wound closure up to 12 hours (P<0.001) and closed at 18 hours, being faster than the control (P<0.05). PBM increased histone acetylation (P<0.001). After 14 days, PBM improved the differentiation in the three mediums employed and the ALP activity, compared to the controls (P<0.05). In the in vivo study, the negative control had greater neutrophil infiltrate than the other groups (P<0.05). Negative Control, Healthy tooth and Healthy tooth+PBM groups presented less fibrous condensation (P<0.05). All groups formed more mineralized tissue than the negative control (P<0.05). PBM+MTA, +BC or +hDPSC formed more mineralized tissue than non-irradiated groups (P<0.05). MTA+PBM induced inoculation (P<0.05). BSP labeling confirmed the histological findings related to mineralized tissue formation and hDPSCs, with and without PBM, exhibited a higher percentage of BSP-positive cells. It is concluded that PBM played an important role, in vitro, increasing differentiation, viability and cell migration that are related to histone acetylation. Moreover, the PBM may be an adjutant treatment alternative for permanent teeth with pulp necrosis and open apex, favoring root repair.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento / Made available in DSpace on 2012-10-26T10:14:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 310126.pdf: 1850967 bytes, checksum: 67fb92bdbc93e0e23a85bccd9bcc6cb5 (MD5) / A Célula-tronco (CT) é definida pela capacidade de autorrenovação e habilidade de se diferenciar em diversos fenótipos celulares. Nos últimos anos, vários estudos têm buscado a identificação e caracterização de CTs em tecidos adultos e extra-embrionários visando o desenvolvimento de alternativas para regeneração e reparo tecidual. Dentre as fontes de CTs adultas destaca-se a placenta, que além de desempenhar um papel crucial no desenvolvimento fetal, também é um importante reservatório de CTs mesenquimais (CTMs). A diferenciação de CTMs é um fenômeno ainda não totalmente esclarecido e influenciado pela atuação de diversas moléculas e pelo microambiente. Um grupo de proteínas de adesão conservadas evolutivamente que pode estar envolvido neste processo é o da família NEPH. Composta por NEPH1, NEPH2 e NEPH3, estas proteínas fazem parte da superfamília das imunoglobulinas (IgSF) e regulam a morfogênese de diferentes tecidos. Os ortólogos de NEPH têm sido amplamente caracterizados em vertebrados, onde atuam em diversos processos como no desenvolvimento neural, formação de sinapses e fusão de mioblastos. Além disso, vários estudos descrevem a expressão de NEPH1 e NEPH2 em diversos tecidos, o que apoia a hipótese de que tal expressão possa estar envolvida na diferenciação de CTs. Com isso, o enfoque deste trabalho foi comparar os níveis de expressão dos genes NEPH entre CTMs obtidas da placenta humana, no estado indiferenciado assim como após a indução à diferenciação adipogênica. As células da placenta utilizadas neste estudo apresentaram a expressão de marcadores de CTMs, a morfologia fibroblastóide esperada, bem como foram capazes de se diferenciar para o fenótipo adipogênico quando cultivadas em meio indutivo, caracterizando uma população de CTMs. Os resultados obtidos por RT-PCR em tempo real demonstraram que tanto as CTMs indiferenciadas quanto as induzidas para adipogênese apresentaram a expressão dos genes NEPH1 e NEPH2, sendo a expressão do gene NEPH1 75% mais alta nas CTMs induzidas à adipogênese do que nas células indiferenciadas. Com isso, sugerimos um papel do gene NEPH1 no processo de diferenciação das CTMs da placenta humana para adipócito. / The stem cell (SC), by definition, is undifferentiated and has the ability of self-renewal. SCs are also able to differentiate into diverse cell lineages. In recent years, several studies have searching for the characterization of SCs in adult and extra-embryonic tissues that could guide to develop strategies for tissue regeneration and repair. Among these tissues the placenta is an important source of adult SCs, being a reservoir of mesenchymal SCs (MSCs). Several biological signals and the environment influence the differentiation of MSCs, although this phenomenon is not yet fully understood. The NEPH protein family, which includes NEPH1, NEPH2 and NEPH3, is a group of evolutionarily conserved adhesion molecules that may be involved in this MSCs differentiation. These proteins are part of the immunoglobulin superfamily (IgSF) and regulate the morphogenesis of different tissues. The role of NEPH orthologs have been extensively characterized in vertebrates, where they act in neural development, synapse formation and myoblasts fusion. Moreover, several studies have described the expression of NEPH1 and NEPH2 in several tissues, supporting the hypothesis that they might be involved in SCs differentiation. Thus, the objective of this study was to compare the expression of NEPH genes between undifferentiated and differentiated MSCs obtained from human placenta. The placental cells used is this study comprise a population of MSCs, being characterized by the typical fibroblastic morphology, expression of MSCs markers and ability to differentiate into adipocytes when cultured in an inductive medium. Real time RT-PCR analysis demonstrated that both undifferentiated MSCs and MSCs differentiated into adipocytes express NEPH1 and NEPH2 genes. However, the expression of NEPH1 gene was 75% higher in MSCs differentiated into adipocytes than in the undifferentiated cells. In summary, our results suggest that NEPH1 gene may play a role in the differentiation of MSCs into adipocytes.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia / Made available in DSpace on 2012-10-26T10:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 304762.pdf: 556142 bytes, checksum: e9321f8494a89f03afcad3cd6a9ab4a9 (MD5) / A descoberta da presença de células-tronco em tecidos odontológicos abre uma nova frente de trabalho e de estudo aos cirurgiões-dentistas, uma vez que tecidos antes descartados poderão servir de base para a pesquisa científica e futura utilização clínica. Os avanços no conhecimento sobre células-tronco e na engenharia de tecidos têm aberto oportunidades para o estudo de novas estratégias para a regeneração de tecidos lesados ou perdidos na cavidade bucal. OBJETIVOS: Este trabalho teve como objetivos verificar a presença de células-tronco no saco pericoronário de dentes permanentes humanos subjacentes a dentes decíduos em fase final de rizólise e esfoliação, bem como isolar, expandir e caracterizar estas células-tronco. MATERIAL E MÉTODOS: O tecido da região central do saco pericoronário recobrindo a coroa do dente permanente, abaixo do decíduo em esfoliação, foi coletado com o auxílio de uma lâmina de bisturi. Também foi coletada a polpa do dente decíduo correspondente para o isolamento de células-tronco de polpa de dentes decíduos em esfoliação (SHED). As amostras do tecido pulpar e do saco pericoronário coletados foram colocados em cultura e as células-tronco isoladas pela técnica do explant. As células isoladas foram expandidas e submetidas à análise fenotípica por citometria de fluxo. Posteriormente, as mesmas foram avaliadas quanto ao potencial de diferenciação osteogênica, condrogênica e adipogênica. RESULTADOS: Os resultados das análises realizadas confirmaram que foi possível a obtenção de células-tronco a partir do saco pericoronário. As células-tronco do saco pericoronário do dente permanente subjacente ao decíduo em esfoliação (SUED) proliferaram em condições de cultura padrão e foram capazes de se diferenciarem em células de linhagem adipogênica, condrogênica e osteogênica. As células SUEDs e SHEDs tiveram marcação fenotípica semelhante e condizente com as marcações esperadas para células-tronco mesenquimais (MSCs). Foi necessário um tempo menor de cultura entre P0 e P1. nas amostras de saco pericoronário, em relação às amostras de polpa, talvez por permitir um volume tecidual inicial maior. CONCLUSÃO: Pode-se concluir que o saco pericoronário de dentes permanentes subjacentes aos decíduos em esfoliação possuem células-tronco mesenquimais indiferenciadas com capacidade de diferenciação em diversos tecidos, sendo mais uma fonte viável para a obtenção de células-tronco mesenquimais com mínima morbidade. / The discovery of stem cells in dental and oral tissues widens the possibility of work and study for dental surgeons, as tissues that were usually discharged can now be used as basis of scientific research and for future use in clinics. Advances in the knowledge of stem cells and tissue engineering represent opportunities for the study of new strategies to regenerate damaged or missing tissues of the oral cavity. AIMS: to evaluate the presence of stem cells in the pericoronal bag tissue of human permanent teeth underlying deciduous teeth at their final stage of root resorption and exfoliation, as well as to isolate, expand and characterize these stem cells. MATERIAL AND METHODS: Tissue from the central region of the pericoronal bag covering the crown of permanent teeth, underneath exfoliating deciduous teeth, was collected with the aid of a scalpel. Additionally, pulps of the corresponding deciduous teeth were collected for isolation of stem cells from exfoliated deciduous teeth (SHED). Samples of pulp and pericoronal bag tissues were separately put in culture medium and stem cells were isolated through the explant technique. The isolated cells were expanded and underwent both phenotypical and differentiation analyses. RESULTS: It was possible to obtain stem cells from the pericoronal bag of permanent teeth underlying exfoliated deciduous teeth (SUED), which proliferated in standard culture conditions and were able to differentiate in adipogenic, chondrogenic and osteogenic cell types. SUED and SHED cells showed similar phenotypic profiles that matched the expected features of mesenchymal stem cells (MSCs). A shorter time of culture between P0 and P1 was required in samples of pericoronal bag when compared with pulp samples, perhaps because it allows for a larger initial tissue volume. CONCLUSION: It can be concluded that the pericoronal bag of permanent teeth underlying deciduous teeth in exfoliation hold indifferentiatied mesenchymal stem cells in various tissues. Therefore, it is another viable source of mesenchymal stem cells with minimum morbidity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-25T20:17:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 315204.pdf: 3762352 bytes, checksum: 2e50a1c177ecfeca603e388d031c121b (MD5) / As células tronco mesenquimais (CTMs) apresentam características como a multipotencialidade, auto-renovação e rápida expansão in vitro que as colocam numa posição estratégica e promissora para o uso em terapias celulares e na medicina regenerativa. A pele representa uma fonte de CTMs abundante, acessível e menos suscetível a questionamentos éticos. Atualmente, as células tronco mesenquimais da derme humana (CTMDH) tem sido pesquisadas quanto a sua habilidade em agir na cura, regeneração e reparo do tecido lesionado. O comportamento celular está intimamente associado ao complexo microambiente tridimensional presente no tecido nativo. Nesse sentido, scaffolds, feitos de polímeros naturais ou sintéticos, biocompatíveis e biodegradáveis vem sendo desenvolvidos. O hidrogel de carragenana tem atraído grande interesse devido a sua estrutura 3D e biocompatibilidade, conseguindo assim, mimetizar o microambiente encontrado pelas células in vivo. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um modelo para o cultivo de CTMDH, baseado na utilização do hidrogel produzido a partir de carragenana extraída da alga vermelha Kappaphycus alvarezii, cultivada no litoral do estado de Santa Catarina. Para isto, isolamos CTMDH a partir de fragmentos oriundos de cirurgias de lifting facial. Estas células foram cultivadas sob dois modelos: (1) CTMDH foram cultivadas sobre o hidrogel de carragenana; (2) CTMDH foram cultivadas encapsuladas em hidrogéis de carragenanas nativa e comercial (Sigma®). Os resultados do cultivo das CTMDH sobre o hidrogel de carragenana mostraram que nesta condição as células formaram dermo-esferas, as quais permaneceram em suspensão e num estado quiescente, com baixa taxa proliferativa. Devido a este comportamento atípico, as dermo-esferas foram transplantadas para placas de plástico. Nesta condição verificamos que as dermo-esferas conseguiram aderir e proliferar em superfície plástica. Elas também apresentaram marcação positiva para os marcadores de pluripotencialidade e para marcadores de CTMs diferenciadas. Além disso, estas células mantiveram a expressão dos antígenos característicos de CTMs e capacidade de diferenciação nos fenótipos adipogênico e osteogênico. Por outro lado, quando as CTMDH foram encapsuladas nos hidrogéis de carragenanas observou-se que as células apresentaram morfologia arredondada, apresentando pouca interação com gel. O ensaio de viabilidade por MTS e Qtracker demonstrou que no sétimo e oitavo dia há um aumento no número de células viáveis, porém no décimo quarto dia a viabilidade celular decai consideravelmente. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostrou que a microestrutura dos hidrogéis de carragenanas é composta por uma estrutura altamente porosa. Desta forma, concluímos que o modelo de cultivo sobre o hidrogel de carragenana não apresentou desempenho satisfatório para sustentar a adesão, proliferação e sobrevida das CTMDH. Por outro lado, verificamos que foi possível desenvolver um bom modelo 3D com a técnica de encapsulamento das CTMDH em hidrogéis de carragenanas nativa e comercial.<br> / Abstract : Mesenchymal stem cells (MSCs) exhibit features such as multipotentiality, self-renewal and rapid expansion in vitro that place them in a promising and strategic position for use in cell therapy and regenerative medicine. The skin represents an abundant source of MSCs, readily accessible and less susceptible to ethical questions. Currently, mesenchymal stem cells from human dermis (MSCHD) are being researched for its ability to act in healing, regeneration and injured tissue repair. The unique cell behavior is closely related to the complex three-dimensional microenvironment present in native tissue. Thus, scaffolds made of natural or synthetic polymers, biocompatible and biodegradable are being developed. Carrageenan hydrogel has attracted great interest due to its 3D structure and biocompatibility. This study aimed to develop a model for growing MSCHD based on the use of a hydrogel made from carrageenan, a polysaccharide extracted from red seaweed Kappaphycus alvarezii grown on the cost of the state of Santa Catarina. MSCHD were obtained from fragments originated from facial-lifting. These cells were cultured in two models: (1) MSCHD were cultured on carrageenan hydrogel; (2) MSCHD were cultured encapsulated in native and commercial (Sigma®) carrageenan hydrogels. The results revealed that MSCHD cultured on carrageenan hydrogel formed dermo-spheres, which remained in suspension and in a quiescent state, with low proliferative rate. Due to its unusual behavior the dermo-spheres were transplanted to plastic dishes. In this condition we found that the dermo-spheres were able to adhere and proliferate on the plastic surface. Furthermore, dermo-spheres showed positive staining for markers of pluripotency and MSC differentiation. In addition, these cells maintained the expression of characteristic antigens of MSC and the ability to differentiate into osteogenic and adipogenic phenotypes. On the other hand, when MSCHD were encapsulated in native and commercial carrageenan hydrogels, they exhibited a rounded morphology displaying little interaction with the gels. The viability test by MTS and Qtracker demonstrated that in the seventh and eighth day there was an increase in the number of viable cells. However, in the fourteenth day cell viability decreases considerably. Scanning electron microscopic (SEM) revealed that carrageenan hydrogels microstructure is composed of a highly porous structure. Thus, we conclude that the culture of MSCHD on carrageenan hydrogel had not provided satisfactory performance to support adhesion, proliferation and cell survival. On the other hand, we were able to develop a good 3D model using encapsulation technique of MSCHD in native and commercial carrageenan hydrogels.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:05:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 319594.pdf: 1052362 bytes, checksum: 0a20e8a17447a2c7e3f68fb2d8cfd7ad (MD5) / A formação dentária ocorre através de interações sequenciais entre o epitélio oral e o mesênquima facial. O epitélio oral dá origem aos ameloblastos, enquanto a formação da polpa dentária é derivada das células mesenquimais. A maior parte do tecido mesenquimal na região cefálica é formado pelas células da crista neural (CN). A CN compreende uma população de células altamente multipotentes. Células tronco com característica da CN vem sendo encontradas em vários tecidos adultos como na polpa dentária humana de dentes permanentes. As células tronco encontradas na polpa dentária apresentam potencial de utilização para fins terapêuticos em diversas áreas médicas. Neste trabalho, avaliamos o potencial de diferenciação celular da polpa dentária, in vivo e in vitro, durante o desenvolvimento embrionário e em adultos. Para esse fim, lâminas histológicas de dentes de ratos foram analisadas, através de imunohistoquímica, em 3 fases do desenvolvimento: idade fetal de 17 dias (F17), 4 dias após o nascimento (D4) e em idade adulta. As análises ocorreram por imunohistoquímica para os marcadores de pluripotencialidade (Oct4 e Nanog) e de CN (Sox10, HNK1 e p75). Além disso, células da polpa dentária humana obtida de terceiros molares de indivíduos adultos foram analisadas por RT-PCR para os mesmos marcadores de pluripotencialidade e para os marcadores de CN Sox10, p75, Nestina e Snail. Estas células foram ainda cultivadas em meio de cultura padrão (aMEM acrescido de SFB a 10%) e meio indutivo neural (MCTN) e analisadas por imunocitoquímica para os marcadores de pluripotencialidade descritos acima, marcadores neurais (Nestina e ßTubulina III) e marcador mesodermal (aSMA) e ainda para a capacidade de originar Unidades Formadoras de Colônias (UFCs). Os resultados demonstram que as células da PD de ratos expressam os marcadores de pluripotencialidade Oct4 e Nanog, assim como o marcador de CN Sox10, em F17, D4 e no adulto. Marcação para p75 e HNK1 foram observados em D4 e no adulto respectivamente. Os resultados demonstraram ainda que as células da PD adulta de humanos apresentam expressão gênica dos marcadores de pluripotencialidade analisados e de CN Sox10, Snail e Nestina. Após cultivo, a células de apresentam expressão proteica de OCT4, dos marcadores neurais (ectodermais) ßTubulinaIII e Nestina, e de músculo liso (mesodermal) aSMA. Além disso, as células de PD apresentam capacidade clonogênica, originando colônias com potencial ectomesenquimal (com células positivas para aSMA, ßTubulinaIII e Nestina). O cultivo em meio indutivo neural promoveu alterações morfológicas, e diminuição na proporção de células positivas para aSMA. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a PD contém população de células multipotentes, clonogênicas com potencial ectomesenquimal, aparentando estarem presentes desde o início do desenvolvimento até a fase adulta. Ao mesmo tempo, essas células apresentam potencial de diferenciação neural. Desse modo, nossos dados demonstram que as células da PD apresentam um real potencial terapêutico.