Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo liberado: resumo/abstract. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-18T18:45:40Z No. of bitstreams: 1 2016_ThaísTâmaraCastroeSouzaMinuzzi_Parcial.pdf: 3601274 bytes, checksum: 9befef0356375dfb586a6c49fc449ac1 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-27T12:35:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_ThaísTâmaraCastroeSouzaMinuzzi_Parcial.pdf: 3601274 bytes, checksum: 9befef0356375dfb586a6c49fc449ac1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T12:35:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_ThaísTâmaraCastroeSouzaMinuzzi_Parcial.pdf: 3601274 bytes, checksum: 9befef0356375dfb586a6c49fc449ac1 (MD5) / O conhecimento atualizado da distribuição e infecção natural de triatomíneos sinantrópicos é fundamental para vigilância e controle da doença de Chagas. No Brasil, a detecção de Trypanosoma cruzi em triatomíneos é realizada por microscopia óptica (MO) do conteúdo intestinal, que pode apresentar diversas limitações quanto à sua sensibilidade e especificidade. Objetivos: Analisar a ocorrência de triatomíneos e suas taxas de infecção natural por T. cruzi e outros tripanossomatídeos no estado de Goiás (GO) e Distrito Federal (DF), estimar a sensibilidade da MO para detecção de T. cruzi em triatomíneos e analisar a transmissão de T. cruzi em ambientes onde colônias de triatomíneos infectados forem detectadas. Métodos: Os espécimes (adultos e ninfas) capturados no intra e peridomicílio e resultados dos exames parasitológicos a fresco e lâminas coradas foram obtidos por meio do LACEN/SES/GO e DIVAL/DF. O DNA foi extraído de amostras do intestino para realização das PCRs (cPCR e qPCR) utilizando quatro marcadores moleculares (TCZ, kDNA, rDNA 18S e rDNA24sα). Também, foi avaliada a infecção por T. cruzi em colônia de P. megistus (nestedcPCR) e em amostras sanguíneas provenientes de primatas neotropicais não-humanos (nestedqPCR) encontrados no Zoológico de Brasília (ZooB). Resultados: Foram analisados 2715 triatomíneos provenientes de 12/30 regiões administrativas do DF e 95/246 municípios de GO. Houve predomínio de T. sordida em GO e no DF P. megistus foi mais frequente, com taxas de infecção por flagelados similares a T. cruzi de 4,6% e 1,6%, respectivamente. A MO revelou 144/841 triatomíneos positivos para tripanossomatídeos, resultando em uma taxa de infecção de 17,1%. A qPCR, específica para T. cruzi, revelou 347 positivos (41,2%). A sensibilidade da MO para T. cruzi, tendo como referência a TCZ qPCR, foi estimada em 23,6% e a da rDNA24sα cPCR foi estimada em 58,5%. Blastocrithidiatriatomae e T. rangeli foram detectadas nos triatomíneos assim como infecções mistas por T. cruzi e B. triatomae. As taxas de infecção por T. cruzi nas espécies de triatomíneos variaram de 19 a 67% sendo maiores para T. pseudomaculata e em triatomíneos vivos e frescos. O sequenciamento revelou TcI em P. megistus e T. sordida e TcII em P. megistus e T. pseudomaculata. No ZooBT. cruzi foi encontrado em P. megistus (44/50) e em primatas (17/26) de seis gêneros e oito espécies, sendo que um Mico chrysoleucus e um Saguinusniger apresentaram alta parasitemia. Discussão e Conclusão:Os resultados mostram uma baixa sensibilidade da MO para a detecção de tripanosomatídeos em triatomíneos e infecções por pelo menos três espécies de tripanossomatídeos, o que reforça a necessidade de métodos de alta especificidade para o desenvolvimento de estratégias de vigilância adequadas dos vetores da doença de Chagas. O método de TCZ qPCR pode ser considerado um padrão referência para detecção de T. cruziem triatomíneos. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The current knowledge of the distribution and natural infection of synanthropictriatomines is essential for surveillance and control of Chagas disease. In Brazil, optical microscopy (OM) has been used to detect Trypanosoma cruzi in triatomines, but this technique can present several limitations in terms of sensitivity and specificity. Objectives: Analyze the occurrence of triatomines and their natural infection rates for Trypanosoma cruzi in state of Goiás (GO) and the Federal District (DF),estimate the sensitivity of OM to detect T. cruzi in triatomines, and analyze T. cruzi transmission foci in environments where infected triatomine colonies were detected. Methods: The specimens (adults and nymphs) captured in the intra and peridomicile and results of parasitological fresh and stained slides were obtained from LACEN/SES/GO and DIVAL/DF. DNA was extracted from the intestine samples for the PCRs (cPCR and qPCR) using four molecular markers (TCZ, kDNA, 18S and rDNA24sα). Also, T. cruzi infections were assessed in a Panstrongylusmegistuscolony and from blood samples of nonhuman primates found in the Brasilia Zoo (ZooB). Results:2715 triatomines were analyzed from 12/30 administrative regions of the DF and 95/246 municipalities of GO. In GO, T. sordida predominate while in the DF P. megistus was more frequent, with infection rates by flagellates similar to T. cruzi of 4.6% and 1.6%, respectively. OM revealed 144/841 trypanosomatid-positive triatomines, resulting in a 17.1% infection rate. The T. cruzi TCZ qPCR, showed 347 positive (41.2%). The sensitivity of T. cruzi-OM with reference to TCZ qPCR was estimated at 23.6% and rDNA24sα cPCR was estimated at 58.5%. Triatomines were infected by Blastocrithidiatriatomae and T. rangeli. However, mixed infections with T. cruzi and B. triatomae were found. Infection rates by T. cruzi in triatomine species ranged 19-67% and were higher for T. pseudomaculata and alive and fresh triatomines. The sequencing of some samples confirmed the identification of B. triatomae and revealed TcI in P. megistus and T. sordida, and TcII in P. megistus and T. pseudomaculata. In ZooB, T. cruzi was found in 44/50 P. megistus and 17/26 primates (six genera and eight species); one Micochrysoleucus and one Saguinusniger showed high parasitaemia. Discussion and Conclusion: The results show a low sensitivity of OM for trypanosomatids detection in triatomines and infections for at least three trypanosomatid species, which reinforces the need for highly specific methods for the development of appropriate surveillance strategies of the vectors of Chagas disease. It also suggests that the TCZ qPCR method could be considered as a reference standard for detection of T. cruziin triatomines.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T16:56:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 274888.pdf: 2762357 bytes, checksum: 1bc3459f95132c9e903cdaa20d8a4261 (MD5) / O presente estudo realizou a identificação e análise de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNP) no gene do mini-exon (spliced leader) e na região intergênica do gene da histona H2A, e de sequências repetitivas (microssatélites) em formas epimastigotas e tripomastigotas das cepas SC-58 e Choachí de T. rangeli. Para a análise de microssatélites três abordagens foram utilizadas: a pesquisa em bibliotecas de EST/ORESTES (Expressed Sequence Tags/Expressed Sequence Tags), a pesquisa em bibliotecas genômicas geradas pela metodologia PIMA e a amplificação via PCR de loci previamente identificados em outras espécies. Os microssatélites identificados foram avaliados quanto à abundância, frequência e viabilidade como marcadores genéticos. Os loci identificados por PCR foram avaliados através da genotipagem de 20 cepas e dois clones de T. rangeli. A ocorrência de SNP foi investigada através da clonagem e sequenciamento do produto de amplificação do gene do spliced leader e da região intergênica do gene da histona H2A de formas epimastigotas de diferentes cepas de T. rangeli. Os resultados obtidos com estes marcadores permitiram o estudo da estrutura populacional do T. rangeli, gerando análises filogenéticas consistentes. Os resultados demonstram que o T. rangeli, assim como o T. cruzi, apresenta uma estrutura populacional predominantemente clonal, e a subdivisão populacional pode ser em parte explicada pela classificação nas linhagens KP1+ e KP1-. Uma subdivisão da população KP1- foi detectada e confirmada utilizando os marcadores microssatélites identificados, sugerindo eventos recentes de evolução, provavelmente influenciados pela troca de hospedeiros durante o ciclo de vida, pela localização geográfica e/ou por uma co-evolução do parasito com suas espécies vetores simpátricas. Novas sequências tipo EST (Expressed Sequence Tags), ORESTES (Open Reading Frame EST) e GSS (Genome Survey Sequences) do T. rangeli foram geradas no âmbito do presente estudo. A análise destas sequências, assim como a análise dos microssatélites e de SNP, trará novas perspectivas para compreensão do desconhecido ciclo do parasito em seus hospedeiros mamiferos, assim como para o diagnóstico específico de infecções causadas por T. cruzi e/ou T. rangeli.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T00:26:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 277022.pdf: 4321942 bytes, checksum: 61f110123aa6e16130d34cb59a61133a (MD5) / DNA topoisomerases são enzimas que participam de diversos processos celulares tais como: replicação, transcrição, recombinação e segregação dos cromossomos. Atuando na clivagem transitória de uma fita (tipo I) ou ambas as fitas (tipo II) da molécula de DNA, as topoisomerases são alvos de agentes bactericidas e de drogas antitumorais e podem ser um importante alvo para quimioterapia de doenças causadas por parasitos. Neste estudo, descrevemos e caracterizamos os genes que codificam as topoisomerases tipo II de Trypanosoma rangeli (TrTop2). Os genes TrTop2 apresentaram um quadro aberto de leitura com 3.696 (TrTop2mt) e 4.368 pares de bases (TrTop2?), codificando polipeptídios preditos de 1.232 (138,8 kDa) e 1.456 (164,1 kDa) aminoácidos, respectivamente. Ambos os genes apresentaram uma alta similaridade da sequência protéica com topoisomerases ortólogas de outros tripanosomatídeos, sobretudo com T. cruzi (96% e 85%). Entre os dois genes a similaridade a nível de aminoácidos foi de 56%, sendo ambos de cópia única no genoma do T. rangeli. Anticorpos dirigidos a fragmentos protéicos de ambas as proteínas foram utilizados em ensaios de western blot e revelaram bandas de aproximadamente 130 kDa em extratos protéicos totais de T. rangeli. Embora com tamanho similar, foram identificadas proteínas distintas quando avaliadas por eletroforese 2D (pI 6,4 e 7,6). Através de géis de poliacrilamida em condições não desnaturantes foi possível determinar que ambas as proteínas nativas formam um complexo protéico de alto peso molecular indicando uma possível interação entre proteínas ou subunidades. Ensaios de imunolocalização com os distintos anticorpos contra DNA topoisomerases II apontaram diferentes padrões de localização celular, com reconhecimento no núcleo ou no cinetoplasto em formas epimastigotas e em alguns casos dispersa no citoplasma de formas tripomastigotas. A novobiocina, inibidor de topoisomerases tipo II procarióticas, foi ativo in vitro contra o T. rangeli. Acima de 300 ?g/ml observa-se uma redução no crescimento dos parasitos com alterações morfológicas e estruturais a nível nuclear e do cinetoplasto. Acima de 150 ?g/ml observa-se completa inibição da diferenciação celular in vitro. Utilizando as proteínas mtHSP70, DHLADH e a DNA topoisomerase II mitocondrial (TrTop2mt) como marcadores biológicos, foi observado redução da expressão das mesmas durante a diferenciação do T. rangeli, assim como nos tratamentos com novobiocina. Conclui-se que eventos relacionados as DNA topoisomerases II podem ser essenciais na redução do crescimento e da diferenciação celular do T. rangeli.

Submitted by Isac Macêdo (isac@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-29T13:11:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado - Carolina C B Gruszkowski.pdf: 2705318 bytes, checksum: f07dc28b794bcd1bd613cf1fad937d4a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-29T13:11:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado - Carolina C B Gruszkowski.pdf: 2705318 bytes, checksum: f07dc28b794bcd1bd613cf1fad937d4a (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os métodos de diagnóstico usados hoje para a Doença de Chagas, embora simples e de baixo custo, podem apresentar baixas sensibilidade e especificidade ou reações cruzadas com outros patógenos. Da mesma forma, os medicamentos usados no tratamento apresentam severos efeitos colaterais. Dentre os vários alvos metabólicos sugeridos, as proteases têm sido apontadas como moléculas candidatas devido às suas particularidades.Recentemente o nosso grupo identificou duas aspartil proteases em T. cruzi: uma solúvel (Cruzipsina-Il) e outra membranar (Cruzipsina-I); entretanto, suas funções biológicas permaneceram desconhecidas. Os nossos resultados demonstram, pela 1 a vez, a existência de um complexo proteolítico membranar em T. cruzi com propriedades similares ao complexo y-secretase de outras células eucarióticas. Usando ferramentas de bioinformática localizamos em banco de dados as seqüências primárias de 3 das 4 proteínas do complexo (presenilina, nicastrina e Aph-l). Esta informação foi importante para caracterizarmos através de síntese paralela de peptídeos os epitopos B lineares das 3 proteínas usando soros de pacientes. A presenilina apresentou 10 epitopos majoritários, a nicastrina, 5 e a Aph-l, 10. Alguns epitopos foram selecionados por vários critérios e anticorpos anti-peptídeos obtidos em coelhos. O soro anti-peptídeo PRE-2 de presenelina identificou por immunoblotting a banda de 48 kDa na fração CZP-I como sendo presenelina, enquanto o soro anti-peptideo NIC-l de nicastrina apresentou também uma marcação na mesma posição. A análise por microscopia confocal em epimastigotas localizou as proteínas predominantemente nas regiões anterior e mediana das células. Além disso, as marcações mostraram-se mais fortes em células permeabilizadas, sugerindo a co-localização de ambas as proteínas nas membranas internas da célula. Um teste de ELISA empregando 4 peptídeos sintéticos da presenilina e nicastrina de T. cruzi apresentou sensibilidade e especificidade de 71,59% e 70,53%, respectivamente. Utilizando a extração diferencial com detergente e análise por EGPA-SDS após cromatografia de afinidade, confirmamos na cepa CL Brener de T. cruzi o perfil de bandas presentes na cepa Y, de 240, 56, 48 e 34 kDa na fração CZP-I (detergente) e 56, 52, 37 e 34 kDa na fração CZP-I1 (solúvel). Ensaios enzimáticos usando o inibidor L-685,458 e moduladores alostéricos DAPT e Composto XXIIE da presenilina humana sugeriram que aparentemente o sítio catalítico da presenilina de T. cruti possui uma constituição semelhante. ao da presenilina humana, enquanto diferenças significativas puderam ser observadas no sitio alostérico. O inibidor de sítio ativo L-685,458 foi capaz de inibir 100% da atividade enzimática em 5!-lM, enquanto os moduladores DAPT e Composto XXIIE não apresentaram uma inibição significativa. Portanto, os nossos estudos sugerem que devido as suas funções enzimáticas e localização celular a presenilina do T. cruzi é um bom alvo quirnioterapêutico e imunológico. / The diagnostic methods used today for Chagas disease, although simple and unexpensive, may present low sensitivity and specificity or cross-reactions with other pathogens. Likewise, drugs used nowadays to treat Chagas disease show severe side effects. Among the various metabolic targets suggested, proteases have been identified as candidate molecules due to its particularities. Recently our group identified two aspartyl proteases in T. cruzi: a soluble (Cruzipsin-I1) and a membrane-bound (Cruzipsin-l); however, their biological functions remained unknown. Our results demonstrate for the 1 st time, the existence of a membrane proteolytic complex in T. cruzi with similar properties to the y-secretase complex of other eukaryotic cells. Using bioinformatics tools, the primary sequences of three of four complex proteins (presenilin, nicastrin and Aph-l) where localized at a protein database. This information was important for parallel synthesis of peptides and the identification of linear epitopes of proteins using sera from eight patients. Presenilin presented 10 major epitopes, nicastrina,5 and Aph-l, 10. Some epitopes were selected by different criteria and anti-peptide sera were obtained in rabbits. Serum anti-peptide PRE-2 of presenelin .identified by immunoblotting a 48 kDa band in fraction CZP-I as presenelin, while the anti-peptide NIC-I of nicastrin also presented a marking in the same position. Analysis by confocal microscopy of epimastigotes localized the proteins mainly at anterior and middle portions of the cells. ln addition, the markings were found to be stronger in permeabilized cells, suggesting co- localization of both proteins in the inner membranes of the cell. An ELISA employing four synthetic peptides for T. cruzi presenilin and nicastrin presented sensitivity of 71.59% and specificity and 70.53%. USlng differential detergent extraction and analysis by SDS-PAGE after affinity chromatography confirmed that the profile bands present in the strain CL Brener were like those of strain Y: 240, 56, 48 and 34 kDa in fraction CZP-I (detergent), and 56, 52, 37 and 34 kDa in CZP-I1 fraction (solub1e). Enzyme assays using the inhibitor L-685,458 and allosteric modulators DAPT and Compound XXI/E of human presenilin apparently suggested that the catalytic site of T. cruri presenilin has a constitution similar to the human presenilin, while significant differences were observed in the allosteric site. The active site inhibitor L-685,458 was able to inhibit 100% of enzyme activity at 5 !J.M, while the modulators DAPT and Compound XXI/E showed no significant inhibition. Therefore, our studies suggest that due to their enzymatic functions and cellular localization the presenilin of T. cruzi is a good target for chemotherapeutic and for immune system.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-04T12:15:31Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T12:15:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Atualmente novas abordagens e metodologias de pesquisa nos permitem iniciar projetos de caracterização de um conjunto de proteínas de um determinado organismo em escalas superiores aos realizados há algum tempo. Novas tecnologias para seqüenciamento, clonagem e expressão protéica permitem a geração de uma quantidade grande de novas informações numa fração de tempo relativamente curta. Organismos como o Trypanosoma cruzi, que possuem praticamente metade de seu genoma sem função conhecida, necessitam que estudos sejam realizados para que se consiga atribuir às proteínas de função desconhecida características funcionais. Em um esforço para se conhecer melhor os genes de função desconhecida deste parasita, um grupo de 10 genes foi selecionado com base na sua expressão diferencial durante a metaciclogênese, consistindo de genes anotados como ‘proteína hipotética’ em banco de dados públicos, com domínio identificado pelo banco de famílias protéicas PFAM e com ortólogos em outros organismos. Os 10 genes selecionados foram amplificados e clonados na plataforma de clonagem Gateway e as proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli. Dos 10 genes destinados à expressão protéica, 8 expressaram proteínas insolúveis as quais foram utilizadas para obtenção de soro policlonal. Os soros obtidos foram utilizados em ensaios de Western Blot para averiguação da expressão protéica ao longo da metaciclogênese do parasita e ensaios de localização celular por microscopia ótica e eletrônica. Foram realizados também ensaios de transfecção em T. cruzi para a expressão das proteínas fusionadas com GFP, visando à determinação da localização celular, utilizando um vetor compatível com a plataforma Gateway, e foram realizados ensaios de imunoprecipitação para todas as 8 proteínas expressas. Os resultados obtidos no presente trabalho auxiliam na atribuição de informações experimentais a genes e proteínas anotados como ‘proteína hipotética de função desconhecida’ e avaliam a possibilidade de implementação de um estudo sistemático com este para uma aplicação em média/larga escala / Recent research approaches and methodologies allow us to develop projects for the characterization of proteins of a given organism in scales greater than possible some time ago. New technologies for sequencing, cloning and protein expression allow the generation of large amounts of new information in relatively short time. Organisms such as Trypanosoma cruzi, which have nearly half of its genome with no known function, require studies to assign functions to proteins of unknown function. In an effort to characterize the genes of unknown function of this parasite, a group of 10 genes was selected based on their differential expression during metacyclogenesis. The genes were annotated as 'hypothetical protein' in public databases, with domains identified in the PFAM database and with orthologs in other organisms. The 10 selected genes were amplified and cloned in Gateway cloning platform and the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. Eight of the 10 genes expressed insoluble proteins which were used to obtain polyclonal serum. The sera were used in Western Blot analysis to verify protein expression throughout the parasite metacyclogenesis as well as cellular localization by optical and electron microscopy. To determine cellular localization, transfection experiments were conducted in T. cruzi for the expression of proteins fused with GFP using a vector compatible with the Gateway platform. Immunoprecipitation assays were also performed for the 8 expressed proteins. The results obtained in this work uncover experimental information of genes annotated as 'hypothetical protein of unknown function' and assess the possibility of implementing a systematic approach with this methodology in medium to large scale

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas congénita es causada por el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi que alcanza al feto atravesando la barrera placentaria. Durante la invasión tisular T. cruzi induce destrucción de la matriz extracelular (MEC) mediante secreción de proteasas como Cruzipaína (Cz) e inducción de la expresión y activación de proteasas propias del tejido como las metaloproteinasas de la matriz (MMPs). La posible participación de estas proteasas en placenta humana durante la transmisión congénita no ha sido estudiada. Se analizó la expresión y actividad de las MMP 2 y 9 durante la infección ex vivo de vellosidades coriónicas placentarias humanas con el parásito. Se determinó la participación de estas MMPs y de Cz en la degradación de moléculas glicosiladas y del colágeno tipo I del tejido conectivo fetal. Adicionalmente se evaluó el efecto de inhibidores para ambos tipos de proteasas tanto sobre los efectos tisulares de la invasión parasitaria como sobre su infectividad. Se obtuvieron tripomastigotes de la cepa Dm28c a partir de células Vero infectadas y placentas de término de madres sanas. Se incubaron trozos de tejido placentario (0,5 cm3) durante 24 horas en presencia y ausencia de 105 y 106 tripomastigotes y en presencia y ausencia de inhibidores para Cz (E-64) y para MMP (doxiciclina). La infección placentaria se comprobó mediante detección del parásito por PCR. Las MMP se analizaron mediante Western Blot, Inmunohistoquímica y Zimografía. Las modificaciones estructurales de colágeno I se determinaron histoquímicamente mediante la tinción de picro rojo sirio y las alteraciones de moléculas glicosiladas mediante tinción de ácido periódico de Schiff. La expresión y activación de las MMPs depende de la cantidad de parásitos usados. La inhibición de la actividad proteolítica de Cz y las MMP previene la destrucción de colágeno tipo I y alteraciones de moléculas glicosiladas inducida por T. cruzi. La inhibición de la actividad de las proteasas no previene la infección ex vivo del parásito. Se concluye que tanto proteasas parasitarias así como propias del tejido a infectar constituyen parte de los mecanismos de infección tisular de T. cruzi / Proyectos Bicentenario Anillo 112 y FONDECYT 11080166

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O controle traducional mediado pela fosforilacao da subunidade alfa do fator de inicio de traducao 2 (eIF2a) e um ponto central para programas de expressao genica induzidos por estresse. Tripanossomatideos, importantes patogenos humanos, apresentam processos de diferenciacao desencadeados pelo contato com os distintos ambientes encontrados em seus insetos vetores e hospedeiros mamiferos, provavelmente representando situacoes de estresse. Trypanosoma brucei, o agente causador da tripanossomiase africana, codifica tres potenciais quinases de eIF2α (TbeIF2Kl-K3). Neste trabalho, nos mostramos que TbeIF2K2 e uma glicoproteina associada a membrana, expressa tanto na forma prociclica quanta na sanguinea. 0 dominio catalitico de TbeIF2K2 fosforila eIF2α de levedura e de mamiferos na Ser51. A quinase tambem fosforila a incomum forma de eIF2α encontrada em tripanossomatideos, especificamente no residuo Thr169, que corresponde a Ser51 em outros eucariotos. 0 eIF2α de T brucei, no entanto, nao e um substrato para GCN2 ou PKR in vitro. 0 dominio regulatorio putativo de TbeIF2K2 nao apresenta nenhuma similaridade de sequencia com as quinases de eIF2α conhecidas. Tanto na forma sanguinea quanto na prociclica, TbeIF2K2 esta localizada principalmente na bolsa flagelar, organela que e o local exclusivo de exo e endocitose nesses parasitas. Ela tambem pode ser detectada em compartimentos endociticos, mas nao em lisossomos, sugerindo que a quinase e reciclada entre os endossomos e a bolsa flagelar. A localizacao de TbeIF2K2 sugere que ela possa funcionar como um sensor do transporte de nutrientes ou proteinas em T brucei, um organismo que depende de mecanismos regulatorios pos-transcricionais para controlar a expressao genica em diferentes situacoes. Essa e a primeira quinase de eIF2α associada a membrana descrita em eucariotos unicelulares / Translational control mediated by phosphorylation of the alpha subunit of the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2α) is central to stress-induced programs of gene expression. Trypanosomatids, important human pathogens, display differentiation processes elicited by contact with the distinct physiological milieu found in their insect vectors and mammalian hosts, likely representing stress situations. Trypanosoma brucei, the agent of African trypanosomiasis, encodes three potential eIF2α kinases (TbeIF2K1-K3). We show here that TbeIF2K2 is a transmembrane glycoprotein expressed both in procyclic and bloodstream forms. The catalytic domain of TbeIF2K2 phosphorylates yeast and mammalian eIF2α at Ser51. It also phosphorylates the highly unusual form of eIF2α found in trypanosomatids specifically at residue Thr169, that corresponds to Ser51 in other eukaryotes. T. brucei eIF2α, however, is not a substrate for GCN2 or PKR in vitro. The putative regulatory domain of TbeIF2K2 does not share any sequence similarity with known eIF2α kinases. In both procyclic and bloodstream forms TbeIF2K2 is mainly localized in the membrane of the flagellar pocket, an organelle that is the exclusive site of exo- and endocytosis in these parasites. It can also be detected in endocytic compartments but not in lysosomes, suggesting it is recycled between endosomes and the flagellar pocket. TbeIF2K2 location suggests a relevance in sensing protein or nutrient transport in T. brucei, an organism that relies heavily on posttranscriptional regulatory mechanisms to control gene expression in different environmental conditions. This is the first membrane-associated eIF2α kinase described in unicellular eukaryotes. / FAPESP: 02/13783-9 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os tripomastigotas metacíclicos de Trypanosoma cruz; expressam as glicoproteínas de superfícies GP82 e GP90 de maneira estágio-específica, as quais estão implicadas na invasão da célula hospedeira. Embora as proteínas não sejam expressam e os RNAm GP82 e GP90 fracamente detectáveis em epimastigotas, ensaios de transcrição em núcleos isolados mostraram que eles são transcritos constitutivamente nos dois estágios. Este resultado indica que o acúmulo de transcritos nas formas metacíclicas não é devido a um aumento na transcrição dos genes GP82 e GP90. Para investigar se a estabilidade dos RNAm seria a responsável pelas diferenças nos níveis destes RNAm, parasitas foram tratados com actinomicina D ou cicloheximida. Quando tratados com actinomicina D, as meia-vidas dos transcritos GP82 e GP90 foram maiores que 8 h em tripomastigotas metacíclicos e menor que 0,5 h e 2 h em epimastigotas, respectivamente. Na presença de cicloheximida, os níveis de RNAm GP82 e GP90 caíram levemente, enquanto que em epimastigotas os níveis destes RNAm aumentaram após 8 h de tratamento. Este efeito sugere um mecanismo de estabilização atuando em tripomastigotas metacíclicos e de desestabilização em epimastigotas, os quais parecem ser mediados por elementos presentes na 3' -UTR destes transcritos. Nós mostramos que a 3'-UTR da GP82 gera uma expressão maior do gene repórter GFP em tripomastigotas metacíclicos do que em epimastigotas. Consistente com este achado, análises de "northern blot" mostram que os RNAm GP82 e GP90 são mobilizados para os polissomas e conseqüentemente traduzidos apenas em tripomastigotas metacíclicos. Estes resultados sugerem que a estabilidade destes RNAm envolve interações com elementos regulatórios positivos e negativos na 3' -UTR. Estudos para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na estabilidade dos RNAm GP82 e GP90 estão em progresso em nosso laboratório. / Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes express the developmentally regulated GP82 and GP90 glycoproteins, which are implicated in host cell invasion. Although GP82 and GP90 mRNAs and proteins are not present and the mRNAs barely detectable in epimastigotes, nuclear run-on analysis showed that they are transcribed in both stages. This result indicates that accumulation of transcripts in metacyclic forms is not due to increased transcription of the GP82 and GP90 genes. To investigate whether mRNA stability may be responsible for the differences in the steady-state levels of these mRNAs, parasites were treated with actinomycin D or cycloheximide. When treated with actinomycin D, the half-lives estimated for GP82 and GP90 transcripts were longer than 8 h in metacyclic trypomastigotes and less than 0.5 h and 2 hours in epimastigotes, respectively. In the presence of cycloheximide, the levels of GP90 and GP82 mRNA decayed slightly after 8 h in metacyclic trypomastigotes, whereas in epimastigotes the levels of these mRNAs increased. This effect suggests a stabilizing mechanism acting in metacyclic trypomastigotes and a destabilizing mechanism in epimastigotes which could be mediated by an element present in the 3’-UTR of the transcripts. We show that the 3’-UTR of GP82 causes higher expression of the green fluorescent protein reporter gene in metacyclic trypomastigotes than in epimastigotes. Consistent with this finding, northern blot analysis showed that GP82 and GP90 mRNAs were mobilized to polysomes and consequently translated, but only in metacyclic trypomastigotes. These results suggest that the stability of these mRNAs involves interactions between positive and negative regulatory elements in the 3’-UTR. Work is ongoing to better understanding the mechanisms involved in changes in GP82 and GP90 mRNA stability. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora esteja bem estabelecido, há mais de quinze anos, que linfócitos T CD8+ restritos por moléculas de MHC-Ia são importantes no controle da parasitemia e sobrevivência de camundongos infectados com Trypanosoma cruzi, pouco se sabia da especificidade desses linfócitos. A ausência de epítopos bem definidos impedia o estudo detalhado da cinética da resposta imune e dos mecanismos de controle da imunodominância. Assim, o objetivo inicial desta tese foi a identificação de epítopos reconhecidos pelos linfócitos T CD8+ ativados durante a infecção pelo T. cruzi. Uma vez definidos esses epítopos, estudamos a cinética de ativação dessas células e alguns dos parâmetros que a controlavam. Por fim, estudamos os possíveis mecanismos de imunodominância durante a resposta imune. Durante a infecção experimental com a cepa Y de T. cruzi, nós observamos que os epítopos VNHRFTLV, IYNVGQVSI ou TEWETGQI foram reconhecidos por camundongos infectados C57BL/6, BALB/c ou B10.A, respectivamente. Esses epítopos, expressos por membros da família das trans-sialidases, geraram forte resposta imune medida pela citotoxicidade in vivo ou pela produção de IFN-γ ex vivo (Elispot). A cinética da ativação desses linfócitos T CD8+ se iniciou no pico da parasitemia e dependeu da carga parasitária. Ou seja, quanto mais tempo a parasitemia demorou para atingir o pico, mais lenta foi a aparição das células específicas. Uma vez que a resposta chegou ao máximo, essa se manteve alta por meses e só então começou a declinar lentamente. O fenótipo dos linfócitos T CD8+ específicos de memória é CD62Llow, característico de células de memória efetoras. Tanto a cinética, quanto o fenótipo dessas células diferiram dos achados observados para vírus, bactérias e outros protozoários intracelulares. Em animais previamente vacinados com DNA plasmidial ou proteínas recombinantes, uma significativa aceleração da resposta imune específica foi observada, a qual correlacionou com a imunidade protetora. A fim de estudarmos os fatores que contribuíram para ativação dessas células, nós utilizamos camundongos geneticamente deficientes. Observamos que a deficiência para a produção de IL-12 e Interferon tipo I não causou nenhuma redução na geração das células citotóxicas específicas. O mesmo foi observado em animais deficientes para os receptores do tipo Toll 2, 4 ou 9. Por outro lado, animais geneticamente deficientes que não expressavam as moléculas de MHC-II ou CD4 apresentaram significativa redução na resposta específica de linfócitos T citotóxicos. O estudo dos mecanismos que controlam a imundominância da resposta imune mediada por linfócitos T CD8+ específicos foi feito, inicialmente, pela comparação da resposta imune em camundongos C57BL/6. Observamos que a resposta imune para o epítopo VNHRFTLV foi imunodominante sobre os demais epítopos restritos pelo MHC-Ia H-2Kb . A fim de determinar se essa imunodominância poderia ser exercida sobre epítopos restritos por MHC-Ia H-2Kk (TEWETGQI) ou H- 2Kd (IYNVGQVSI), comparamos as respostas imunes em camundongos infectados homozigotos e heterozigotos. No caso do epítopo VNHRFTLV, nós observamos que a resposta imune se manteve alta em ambas as linhagens de camundongo. Já no caso dos dois outros epítopos restritos por MHC-Ia, H-2Kk ou H-2Kd , observamos uma significativa redução na resposta imune dos animais heterozigotos em relação aos homozigotos. Essa competição não foi dependente do tempo ou da dose de parasitas inoculados. Também não foi observada quando os animais foram imunizados com adenovírus recombinantes contendo esses mesmos epítopos. O mais importante foi observar que a imunodominância pode ser evitada quando duas cepas de parasitas, contendo epítopos imundominantes distintos, foram utilizadas simultaneamente para infecção, sugerindo que há uma competição pelas células apresentadoras de antígenos durante o “priming”. Esse mecanismo de imundominância reduz a magnitude e o repertório da resposta imune e pode ser um mecanismo sofisticado de escape do parasita para evitar a eliminação completa pelos mecanismos efetores do hospedeiro. / Although it is well established for more than 15 years that CD8+ lymphocytes restricted by MHC-Ia molecules are important for the control of the parasitemia and survival during rodent infection with Trypanosoma cruzi, little was known about the specificity of these lymphocytes. The lack of well defined epitopes hindered the detailed study of the kinetic of the immune response and the mechanisms of control of the immunodominance. Therefore, the initial objective of this thesis, was to identify epitopes recognized by CD8+ T lymphocytes activated during the T. cruzi infection. Once we defined these epitopes, we studied the kinetics of activation of these cells and some of the parameters that controlled it. Finally, it was possible to study the mechanisms of immunodominance during the immune response. During the experimental infection with Y strain of T. cruzi, we observed that the epitopes VNHRFTLV, IYNVGQVSI or TEWETGQI were recognized by C57BL/6, BALB/c or B10.A infected mice, respectively. These epitopes, expressed by members of the trans-sialidase family of surface proteins, generated strong immune response as measured by the in vivo cytotoxicity or by the production of interferon-γ (Elispot). The kinetics of the activation of these CD8+ T cells initiated on the peak of parasitemia and depended on the parasite load. The longer delayed the parasitemia to reach its peak, slower was the appearance of these specific T cells. When the immune response reached the maximum, it was kept high for months and then, it declined slowly. The phenotype of memory CD8+ T lymphocytes was CD62LLow characteristic of effector memory cells. The kinetic one and phenotype of these cells had differed from the findings observed for other intracellular viruses, bacteria and protozoan parasites. In animals previously vaccinated with plasmidial DNA or recombinant proteins, a significant acceleration of the specific immune response was observed that correlated with the protective immunity. To study the factors that contributed for the activation of these cells, we used genetically deficient mice. We observed that deficiency for production of IL-12 and Interferon type I did not cause any reduction in the specific cytotoxic response. The same was observed in animals deficient for the Toll-like receptors 2, 4 or 9. On the other hand, genetically deficient animals that did not express MHC-II or CD4 molecules had significant reduction in the cytotoxic response mediated by CD8+ T cells. Finally, we described that following infection of mice with T. cruzi, an immunodominant CD8+ T cell immune response was developed directed to the epitope VNHRFTLV. To determine whether this immunodominance was exerted over other non H-2Kb -restricted epitopes, we measured during infection of heterozygote mice, immune responses to three distinct epitopes, all expressed by members of the trans-sialidase family, recognized by H-2Kb , H-2Kk (TEWETGQI), or H-2Kd (IYNVGQVSI)- restricted CD8+ T cells. Infected heterozygote or homozygote mice displayed comparably strong immune responses to the H-2Kb -restricted immunodominant epitope. In contrast, H-2Kk or H-2Kd -restricted immune responses were significantly impaired in heterozygote infected mice when compared to homozygote ones. This interference was not dependent on the dose of parasite or the timing of infection. Also, it was not seen in heterozygote mice immunized with recombinant adenoviruses expressing T. cruzi antigens. Finally, we observed that the immunodominance was circumvented by concomitant infection with two T. cruzi strains containing distinct immunodominant epitopes, suggesting that the operating mechanism most likely involves competition of T cells for limiting APCs. This type of interference never described during infection with a human parasite may represent a sophisticated strategy to restrict priming of CD8+ T cells of distinct specificities, avoiding complete pathogen elimination by host effector cells, and thus favoring host parasitism. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As histonas de Trypanosoma cruzi sao bastante divergentes quando comparadas aos demais eucariotos, principalmente na porcao N-terminal, onde ocorrem modificacoes pos traducionais, que sao reconhecidamente essenciais para o controle da expressao genica e da arquitetura da cromatina. Entre estas modificacoes estao as acetilacoes das lisinas 4, 10 e 14 da histona H4 (H4K4ac, H4K10ac e H4K14ac). Nesta tese mostramos que a H4K4ac, que e a modificacao mais abundante, esta enriquecida em areas de cromatina densamente compactada, enquanto H4K10ac e H4K14ac localizam-se em regioes de cromatina menos densa, preferencialmente na interface entre a eucromatina e a heterocromatina. H4K4ac diminui nas formas nao replicativas e H4K14ac H4K14ac aumenta durante G2 e mitose do ciclo de divisao celular das formas replicativas. H4K10ac e H4K14ac aumentam e H4K4ac diminui no reparo de quebras de dupla fita do DNA. Ao mesmo tempo a superexpressao da proteina TcRad51, essencial para o processo de reparo de DNA por recombinacao homologa causa aumento de H4K10ac e H4K14ac. Quando as lisinas 4, 10 e 14 sao substituidas separadamente por argininas (H4K4R, H4K10R e H4K14R) para evitar a acetilacao sao expressas, elas sao incorporadas na cromatina e diminuem os niveis de cada modificacao. A expressao de H4K4R tem uma distribuicao diferente das histonas endogenas e H4K14R causa diminuicao de crescimento, com celulas acumulando na fase de mitose. Os mutantes de H4K10 e H4K14 ainda apresentam maior mortalidade quando submetidos a radiacao ƒ× que causa quebra de dupla fita de DNA. Tambem mostramos que a proteina TcBDF2, uma proteina que contem bromodomineo, reconhece preferencialmente H4K10ac. A funcao da TcBD2 e desconhecida, mas verificamos que ela aumenta apos exposicao dos parasitas a luz UV, sugerindo que esteja participando no reparo de DNA. Esses dados juntos fornecem evidencias de que cada uma das acetilacoes da histona H4 tem um papel distinto no T. cruzi. A acetilacao em K4 estaria envolvida na montagem da xiii cromatina na fase de replicacao. Ja as modificacoes em K10 e K14 estariam envolvidas com processos especificos de remodelagem da cromatina durante os eventos de reparo e eventualmente transcricao do DNA. / The Trypanosoma cruzi histones are very distinct from other eukaryotes, mainly in the N-terminus, where post translational modifications occur, which are essential for gene expression regulation and chromatin architecture. Among these modifications we found that lysines 4, 10 and 14 of H4 histone are acetylated (H4K4ac, and H4K10ac H4K14ac). In this thesis we show that the H4K4ac, which is the most abundant modification, is enriched in densely packed chromatin, while H4K10ac and H4K14ac are located in less dense chromatin, preferentially at the interface between euchromatin and heterochromatin. H4K4ac decreases in trypomastigote, which is the infective and non-dividing form of the parasite whileH4K14ac increases during G2 and mitosis of the cell cycle in replicative forms. H4K10ac and H4K14ac increases during DNA repair of double stranded breaks while H4K4ac decreases after DNA damage. TcRad51, an essential protein in the homologous recombination pathway, when overexpressed, increases the H4K10ac and H4K14ac levels. When the lysines 4, 10 and 14 are individually replaced by arginine (H4K4R, H4K10R and H4K14R) to prevent the acetylation, they are still incorporated into chromatin and decrease the specific modification level. The H4K4R location is different from the endogenous H4K4ac and the H4K14R expression causes growth reduction, with cells accumulating in mitosis. Mutants H4K10R and H4K14R also have high mortality rates after ƒ× irradiation that causes DNA double-stranded breaks. We also showed that TcBDF2 protein contains a bromodomain that recognizes preferentially H4K10ac. Although the TcBD2 function is unknown, it is increased after UV light exposure, suggesting its involvement in DNA repair. These data together provide evidence that each H4 acetylation has a distinct role in T. cruzi. Probably K4 is involved in chromatin assembly during replication while K10 and K14 acetylation appears to be involved in chromatin remodelling during DNA repair and maybe DNA transcription. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações