Orientador: João Aristeu da Rosa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T17:55:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_AlineRimoldi_M.pdf: 8854165 bytes, checksum: dfc09fd67f41d32a061c2b77ca9455b8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo : A doenca de Chagas, assim como seu agente etiologico Trypanosoma cruzi, foram descritos por Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas. T. cruzi e transmitido por hemipteros sendo os generos Panstrongylus, Rhodnius e Triatoma os mais importantes. Com resultados bastante satisfatorios em relacao ao controle do principal vetor, T. infestans, outros triatomineos de importancia secundaria, coletados no peridomicilio, passaram a assumir maior relevancia, dentre essas especies, T. sordida. As populacoes de T. cruzi apresentam grande variabilidade intraespecifica evidenciada por diferencas na morfologia, na virulencia e patogenicidade, na habilidade de evasao a resposta imune do hospedeiro e na constituicao antigenica. Essa diversidade pode estar associada a sua adaptacao e sobrevivencia em diferentes hospedeiros. As diferentes formas de manifestacao clinica da doenca no homem podem ser associadas com cepas especificas ou com marcadores geneticos do hospedeiro, embora ambos possam influenciar o curso da infeccao. Este trabalho objetivou a caracterizacao biologica, morfologica e molecular de tres cepas de T. cruzi (SI5, SI8 e SIGR3) isoladas de T. sordida coletadas em Santo Inacio, Bahia. Desse modo, o estudo biologico indicou que as cepas isoladas de Santo Inacio, pertencem ao Biodema III e Zimodema I. Os resultados das mensuracoes das cepas SI5, SI8 e SIGR3 mostraram polimorfismo das formas tripomastigotas sanguineas, embora com predominancia de formas intermediarias para largura do corpo e curtas para comprimento total do corpo no decurso da infeccao experimental. Foram avaliados para as formas epimastigotas, parametros como comprimento total do corpo, largura e indice nuclear e observamos para as cepas SI5, SI8 e SIGR3 respectivamente, formas intermediaria/intermediaria/baixo, curto/intermediario/baixo e curta/larga/baixo para os parametros descritos acima. O significado geral desse polimorfismo ainda nao foi suficientemente investigado, desconhecendo-se se ele expressa um diferente comportamento biologico das cepas ou se reflete apenas a existencia de um "complexo" morfologico. A caracterizacao molecular das cepas SI5, SI8 e SIGR3, as enquadram no grupo II, o que indica, que nesse local circula uma mesma linhagem de T. cruzi, apesar das mesmas terem sido isoladas de hospedeiros e epocas distintas. / Abstract: Chagas disease and its causative agent Trypanosoma cruzi were described by Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas. T. cruzi is transmitted by blood-sucking hemipterous and Panstrongylus, Rhodnius and Triatoma are the most important genera. Satisfactory results were achieved to the control of the main vector, T. infestans. However, other bugs of secondary importance, like Triatoma sordida collected around the houses began to assume greater epidemiological importance. The populations of T. cruzi show great variability among individuals demonstrated by differences in morphology, virulence and pathogenicity, ability to evade the host immune response and antigenic constitution. Such diversity may be associated with their adaptation and survival in different hosts. The course of the infection in human may be associated with specific strains or host genetic markers, although both can influence. This aim of this study was the biological, morphological and molecular characterization of three strains of T. cruzi (SI5, and SI8 SIGR3) isolated from T. sordida collected in Santo Inacio, Bahia. The biological study indicated that the isolates from Santo Inacio, belong to Biodeme III Zimodeme I. The results of measurements of the strains SI5, SI8 SIGR3 showed polymorphism of blood trypomastigotes, with a predominance of intermediate forms to body width and short length for total body in the course of experimental infection. Parameters such as: total body length, width and nuclear index were evaluated for epimastigotes, and observed for strains SI5, SI8 and SIGR3 respectively, forms na intermediate / middle / low, short / intermediate / low, short / wide / low for the parameters described above. The general meaning of this polymorphism has not been sufficiently investigated. It is not known if such poliymorphism expresses a different biologic behavior of the strains or merely is a result of a "complex" morphology. According to the molecular characterization the strains SI5, SI8 SIGR3 are in group II, which indicates that in this site it occurs the same lineage of T. cruzi, despite their different sources (isolated from different hosts and different times). / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Parasitologia

Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei são os agentes etiológicos da doença de Chagas e da doença do sono, respectivamente. Ambos são tripanossomatídeos, apresentam um ciclo de vida que alterna entre os hospedeiros mamíferos e os hospedeiros invertebrados e apresentam o metabolismo baseado no consumo de aminoácidos e/ou glicose, dependendo da disponibilidade de nutrientes no ambiente. Neste trabalho foi demonstrado a importância da glutamina (Gln) em diferentes aspectos da biologia do T. cruzi e a relevância da Gln e da enzima glutamina sintetase (GS) para formas sanguícolas de T. brucei. A Gln é transportada pelo T. cruzi e pelo T. brucei a partir do meio externo. Em T. cruzi foi demonstrado que esse transporte é realizado por um único sistema, saturável, específico, dependente de ATP e do gradiente de H+ na menbrana do parasita. Também foi demonstrado que a Gln é importante para replicação das formas amastigotas e epimastigotas, além de promover o processo de metaciclogênese. Tratamento com análogos estruturais da Gln dimuiu a proliferação do estágio epimastigota e também a diferenciação para tripomastigota metacíclico. Além do mais células infectadas e tratadas com os análogos apresentaram redução do número de tripomastigotas que eclodiram das células, demonstrando que a Gln também é importante para os estágios intracelulares. Em formas sanguícolas de T. brucei, a enzima GS é ativa, mas é incapaz de suprir a necessidade de Gln do parasita, fazendo com que seja completamente dependente do transporte a partir do meio externo. A Gln é importante para a proliferação formas sanguícolas e correta progressão do ciclo celular. Em meio sem Gln os parasitas são incapazes de manter a proliferação normalmente, sendo que este processo é dependente da concentração de Gln no meio externo. Também foi demonstrado que a Gln participa do processo de modificação pós-traducional de glutamilação da tubulina. Conclui-se portanto que a Gln é um aminoácido fundamental para sobrevivência do T. cruzi e do T. brucei. / Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei are the etiologic agent of Chagas disease and sleeping sickness, respectively. Both parasites are trypanosomatids that have a complex life cycle, which alternates between a mammalian host and insect vector. T. cruzi and T. brucei are able to use carbohydrates and amino acids as energy source, depending on availability of nutrients in the different environments that parasites go through in the life cycle. In this work we demonstrate that glutamine (Gln) is an important metabolite that participates in many biological processes in T. cruzi, and the relevance of the enzyme glutamine synthetase and Gln in bloodstream forms of T. brucei. T. cruzi and T. brucei are able to uptake Gln from the medium. T. cruzi incorporate Gln through a single and saturable transport system. Gln uptake system is dependent on ATP intracellular levels and H+ gradient and is a highly specific system. Also was demonstrated that Gln is important to replicative stages amastigote and epimastigote, and promotes the metacyclogenesis process. The treatment with Gln analogs impared the epimastigote replication and the differentiation from epimastigote to trypomastigote metacyclic. Moreover, analogs treatment in the infected cells decrease the number of trypomastigotes released from the cells, suggesting that Gln is important to intracellular development of T. cruzi. This work also demonstrates that the enzyme glutamine synthetase is active in bloodstream forms from T. brucei, but is not enough to produce the amount of Gln required by the parasite. T. brucei, bloodstream forms are completely dependent of Gln uptake from the medium. The proper proliferation rate and correct cell cycle progress are dependent of Gln concentration in the medium. Moreover Gln participates in the tubulin glutamylation process in bloodstream forms; this is a post translational modification that is important to microtubules dynamics and cytokinesis process. We concluded that Gln is a fundamental amino acid to maintenance of T. cruzi and T. brucei.

The transmission of Trypanosoma brucei, the causative agent of human African trypanosomiasis, depends upon the development in the bloodstream of 'stumpy forms' from non-transmissible 'slender forms'. In stumpy forms many mRNAs are downregulated and translation is generally repressed. However, a small subset of genes escape this repression and are upregulated, presumably as an adaptation for transmission. To understand the basic of this, regulatory sequences within the 3'UTR of a major stumpy-enriched transcript (an ESAG9 gene) have been characterised. This identified a signal responsible for gene silencing in slender forms and gene activation when cells develop to stumpy forms. An investigation was made of upstream open reading frames (uORFs) as a mechanism for the control of stumpy form gene expression. No evidence was found of uORF control, but one gene investigated was found to produce two transcripts through trans-splicing at different sites. These transcripts, which were found to exhibit some differential abundance between life-cycle stages, would generate a long and short form (from an internal ATG) of the encoded protein. Both are predicted to contain a UBA/TS-N (ubiquitin associated) domain, however, the longer form of the protein is also predicted to contain a transmembrane helix and cleavable signal peptide, suggesting a different localisation. However, ectopic expression of either protein form with a Ty epitope tag resulted in the same protein localisation. Additionally, the transcripts of two translational protein homologues, TbeIF4E4 and TbeIF6, were identified as upregulated in stumpy forms. Radiolabelled-methionine experiments and polysome analysis showed that overexpression or RNAi-mediated ablation of TbeIF6 resulted in a decrease in protein synthesis and decrease in translation. Unlike its archaeal homologue, TbeIF6 protein was not induced by coldshock treatment. Finally, to identify which transcripts escape translational repression in stumpy forms an analysis was made of polysome-associated transcripts by RNA-sequencing. This identified potentially interesting genes for further investigation, and showed that many procyclic-enriched transcripts were also enriched in stumpy form polysomeassociated RNA, confirming these cells as preadapted for transmission. Together, this work has characterised a 3’UTR regulatory element in a stumpy-enriched transcript, examined alternative trans-splicing of another transcript, investigated two translational protein homologues and identified transcripts that escape translational repression in the transmissible life-cycle stage of T. brucei.

Le trypanosome est le parasite responsable de la maladie du sommeil chez l’homme et de la Nagana chez le bétail. Afin d’échapper au système immunitaire de son hôte mammifère, il remplace périodiquement la protéine VSG (Variant Surface Glycoprotein) présente en 10 millions d’exemplaires à sa surface. Ce mécanisme a pour nom la variation antigénique. Pour être exprimé, le gène de VSG (VSG) doit se trouver en fin d’un site d’expression (ES) particulier. Cet ES est polycistronique, télomérique et transcrit par une ARN polymérase de type ribosomique (Pol I). 20 à 40 ESs similaires et un millier de VSGs sont recensés dans le génome du trypanosome. Cependant, un seul ES est totalement transcrit (actif) et un seul VSG est exprimé. La variation antigénique est donc possible par deux mécanismes: soit l’activation d’un autre ES, soit le remplacement du VSG dans l’ES actif. La base de ce système est l’activation d’un seul ES à la fois (contrôle monoallélique). Au laboratoire, un modèle a été proposé où la transcription s’initie au niveau de tous les ESs mais n’aboutit au VSG que dans le cas de l’ES actif (Vanhamme et al., 2000). Dans ce cas uniquement, le transcrit primaire subit une maturation correcte (épissage et polyadénylation) et est exporté dans le cytoplasme. Etant donné que des transcrits Pol I subissent une maturation identique à des transcrits Pol II, la régulation s’effectuerait par recrutement d’une machinerie d’élongation/maturation de l’ARN de type Pol II (Pol II « RNA factory »). Cette dernière serait uniquement localisée au niveau de l’ES actif dans le compartiment nucléaire appelé ES body (Navarro and Gull, 2001). Durant cette thèse, diverses stratégies ont été élaborées pour tester la validité du modèle. La première visait à comparer l’état de maturation d’un ES en fonction de son activité. Nos résultats ont appuyé l’idée que les transcrits d’ESs ayant subi une maturation correcte provenaient préférentiellement de l’ES actif mais le(s) facteur(s) en quantité limitante ne permettant cette maturation qu’au niveau de l’ES actif doivent encore être identifiés. Le seconde stratégie analysait l’acétylation des histones ainsi qu’un éventuel attachement différentiel à la matrice nucléaire de l’ES suivant son activité. Le niveau d’acétylation d’un ES lorsqu’il est actif n’a pu être étudié. Des résultats préliminaires en faveur d’une association préférentielle de l’ES à la matrice nucléaire lorsqu’il est actif ont été obtenus. Enfin, nous avons cloné deux homologues d’un facteur général de la transcription appelé TFIIS. Ce dernier permet à la Pol de redémarrer lorsqu’elle est bloquée par un site de pause. Individuellement chacun de ces facteurs ne semble pas être essentiel au trypanosome. Cependant, un retard de croissance a été observé lorsque les deux facteurs sont invalidés dans la même lignée cellulaire. Ce phénotype particulier doit être caractérisé. En parallèle, nous avons envisagé de caractériser le complexe de la Pol I du trypanosome. Cette stratégie constituait la manière la plus simple de mettre en évidence un éventuel contact physique et/ou fonctionnel entre la Pol I transcrivant l’ES et la machinerie d’élongation/maturation de l’ARN de type Pol II « RNA factory ». 5 sous-unités du complexe ont été identifiées, associées à une protéine de fonction inconnue ainsi qu’à des histones. L’identification d’autres protéines associées au complexe constitue notre perspective principale. La phosphorylation de la plus grande sous-unité du complexe a été démontrée mais son rôle doit encore être élucidé.

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Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas es causada por Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Durante la transmisión congénita el parásito alcanza al feto atravesando la barrera placentaria formada por trofoblasto, tejido conectivo fetal y láminas basales. La tasa de transmisión congénita es baja, por lo que podrían existir factores antiparasitarios locales. El trofoblasto, epitelio de revestimiento en contacto con la sangre materna, experimenta proliferación, diferenciación y muerte celular durante su recambio; este proceso es considerado parte de la inmunidad innata. En la presente Memoria de Título, hemos analizado la diferenciación celular del trofoblasto en respuesta al parásito T. cruzi. Para determinar si el recambio epitelial es un mecanismo antiparasitario local, hemos estandarizado la infección con T. cruzi en una línea celular de trofoblasto, BeWo. Así, hemos determinado que las condiciones óptimas de infección son por una parte una incubación de 24 horas y concentraciones de parásitos en una relación 1:0,1 y 1:1. En estas células se analizó la diferenciación celular mediante la determinación de la secreción y expresión de la hormona gonadotrofina coriónica humana mediante espectrofotometría, Western blot e inmunofluorescencia. Adicionalmente se analizó la fusión celular mediante ensayo de fusión de dos colores y re-distribución de desmoplaquina. El parásito induce diferenciación celular en el trofoblasto. Estos resultados, juntos con resultados previos realizados en el mismo laboratorio sugieren que T. cruzi induce aceleramiento del recambio del trofoblasto, lo que podría constituir un mecanismos antiparasitario local de la placenta humana. / Proyectos FONDECYT 1120230 y ANILLO ACT-112

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / A más de cien años de su descripción, la enfermedad de Chagas continúa siendo considerada una enfermedad compleja, con diversas manifestaciones clínicas, las que han sido relacionadas con la variabilidad genética presente en Trypanosoma cruzi. La cardiopatía chagásica corresponde a la forma clínica más grave de la enfermedad en fase crónica, siendo causa principal de muerte y discapacidad en los individuos infectados. Dentro de este contexto, el presente trabajo busca establecer una asociación entre los linajes de T. cruzi y la presencia de patología cardíaca en individuos con enfermedad de Chagas crónica. Para ello se realizó genotipificación mediante la técnica de hibridación con sondas DNA-DNA, a partir de los productos de PCR convencional obtenidos desde muestras de sangre periférica de la población en estudio, correspondientes a 25 individuos chagásicos crónicos con cardiopatía y a 25 individuos chagásicos crónicos sin cardiopatía, procedentes de distintas localidades de la lV Región de Coquimbo, Chile. El 36% (9) de los pacientes no cardiópatas presentaban infección con un solo linaje de T. cruzi, las cuales fueron: Tc l (1 muestra), Tc ll (1 muestra), Tc V (4 muestras) y Tc Vl (3 muestras), mientras que, el 4% corresponde a infecciones mixtas con: Tc ll + Tc V + Tc Vl (1 muestra). El 40% (10) de los pacientes cardiópatas presentaban infección simple por: Tc V (9 muestras) y Tc Vl (1 muestra), mientras que, el 12% (3) de ellos presentó infecciones mixtas, correspondientes a: Tc ll + Tc V + Tc Vl (2 muestras) y Tc l + Tc ll + Tc Vl (1 muestra). Utilizando el test exacto de Fisher se determinó que existe asociación estadísticamente significativa entre la presencia de cardiopatía en pacientes chagásicos crónicos y la infección específica por Tc V (p-value=0,01), mientras que, para Tc l, Tc ll y Tc Vl no fueron significativos (p-value=1,00; p-value=1,00; p-value=0,65, respectivamente). Además, se sugiere que la presencia de cardiopatía en pacientes chagásicos crónicos es independiente (p-value=0,60) del tipo de infección encontrada en estos individuos, sea ésta simple o mixta. En conclusión, la infección menos predominante en ambos grupos en estudio fue la producida por el genotipo Tc l, mientras que, la presencia de cardiopatía chagásica crónica estaría relacionada con la infección específica por T. cruzi V. / Proyecto Fondecyt 1120382

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas congénita es una patología endémica en América Latina, la que se presenta con una menor frecuencia en otros países. Se asocia a partos prematuros, abortos y patología placentaria. Los mecanismos de infección e invasión tisular del parásito Trypanosoma cruzi (T. cruzi) son poco claros. Para estudiar parte de estos mecanismos, se incubaron ex vivo explantes de vellosidades coriónicas humanas sanas con el parásito. La infección exitosa de los explantes de vellosidades coriónicas humanas fue determinada por detección del parásito mediante inmunofluorescencia y PCR. Los efectos de la infección con el parásito se determino mediante métodos inmunohistoquímicos, histoquímicos, bioquímicos y de biología molecular. T. cruzi induce destrucción y desprendimiento del sinciciotrofoblasto, desorganización selectiva de las láminas basales y desorganización del colágeno I del tejido conectivo fetal. Estos resultados sugieren una actividad proteolítica del parásito sobre las láminas basales y tejido conectivo como mecanismo de infección al feto con T. cruzi. Adicionalmente, el parásito induce apoptosis en las vellosidades coriónicas. Los efectos observados son función del número de parásitos utilizados / Financiamiento: Proyectos Biecentenario Anillo ACT 29 y ACT 112 , Bicentenario Redes de Cooperación entre Anillos RED 07, Fondecyt 1180166

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo se infectaron ratones de las cepas ACA, A.Sw y C57BL/6 con 2.000 tripomastigotes sanguíneos del clon Dm 28c de Trypanosoma cruzi. Los animales de la cepa ACA se comportaron como altamente susceptibles a la infección, con un 100 % de mortalidad antes de las tres semanas postinfección. Por el contrario, las cepas A.Sw y C57BL/6 se mostraron como resistentes sobreviviendo el 100 % de los animales, pasados los 6 meses postinfección. Las cepas ACA (H2f ) y A.Sw (H2S) son congénicas, es decir sólo difieren en el cromosoma 17, donde se ubica el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC). Los resultados anteriores implicarían que genes ligados al haplotipo H2S serían importantes en el fenómeno de resistencia a la infección. Algo semejante ocurre con la cepa C57BL/6 que porta el haplotipo H2b y se comporta como resistente al igual que otras cepas descritas como tal, como las cepas B10 y LP también portadoras del haplotipo H2b , pero diferentes en el resto de los cromosomas a la cepa C57BL/6. Todo esto apoyaría la idea que una determinada combinación de genes MHC es importante en la resistencia o susceptibilidad a la infección con T.cruzi, en el modelo murino. Las cepas ACA y A.Sw presentaron los más altos niveles de parasitemia, siendo una cepa susceptible y la otra resistente, lo que estaría de acuerdo con la idea que los niveles de parasitemia no se correlacionan siempre con la resistencia o susceptibilidad a la infección. El estudio histopatológico de tejidos de los animales infectados mostró que el tejido más afectado es miocardio, menos músculo esquelético y prácticamente no se observaron alteraciones importantes en intestino delgado. El mayor número de células parasitadas fue observado en la cepa ACA, que fue la única que mostró correlación positiva entre cantidad de parásitos intracelulares y cantidad de parásitos circulantes

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas es producida por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi, que presenta tres estados morfológicos en su ciclo biológico: amastigote, tripomastigote y epimastigote. Aproximadamente 25 millones de personas en América latina, son afectadas por este parásito. El tratamiento clínico actual se hace con las drogas antichagásicas nifurtimox y benznidazol, que actúan mediante la formación de radicales libres y/o intermediarios electrofílicos durante su metabolismo. Al respecto, el glutatión (GSH) y derivado bis-glutationil-espermidina (tripanotión, T(SH)2) son los principales agentes antiradicalarios con los que cuenta el parásito. Previamente se ha reportado que la susceptibilidad del T. cruzi a la acción de ambas drogas depende del contenido de glutatión libre y conjugado. L-Butionina (S, R) Sulfoximina (BSO) es un inhibidor de la enzima γ-glutamilcisteína sintetasa (γ-GCS), etapa limitante en la síntesis de glutatión y por tanto puede hacer más susceptible al parásito al efecto de nifurtimox y benznidazol. En esta Memoria se estudió el efecto de nifurtimox y benznidazol con o sin BSO, en un modelo in vitro de infección con T. cruzi usando células VERO como hospedero. En este modelo, BSO 25 μM disminuyó el IC50 de nifurtimox y benznidazol (concentración necesaria para disminuir en un 50% el número de amastigotes por cien células VERO o índice endocítico) en cerca del 60%. Estos resultados indican que BSO es capaz de aumentar el efecto tripanocida de las drogas antichagásicas nifurtimox y benznidazol, sobre la forma amastigota de T. cruzi, en todas las cepas estudiadas. Por otra parte, también se estudió el efecto de nifurtimox y benznidazol y su asociación con BSO en un modelo in vivo. Los resultados indican que al usar sólo BSO se obtiene un 100% de sobrevida de los ratones infectados con la cepa Tulahuén de T. cruzi y además, disminuye las parasitemias a niveles indectables más rápidamente de lo que ocurre en el grupo control. Actualmente no se han desarrollado drogas más efectivas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Este estudio sugiere que el uso de BSO en combinación con nifurtimox o benznidazol podría disminuir las dosis clínicas de ambas drogas para obtener resultados similares, o bien acortar la duración del tratamiento, incidiendo posiblemente en una menor tasa de aparición de RAM producidas por estos fármacos / Financiamiento: Proyecto FONDECYT 1020095