Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Se realizó la infección de un grupo de ratones hembras enteras de la cepa BALB/c y de otro grupo de hembras ovariectomizadas con 2000 tripomastigotes sanguíneos del clon Dm28c de Trypanosoma cruzi. Los resultados obtenidos mostraron que el modelo de infección provocó 100% de mortalidad en hembras ovariectomizadas y sólo un 50% en el grupo de hembras enteras transcurridos 90 días post-infección. El nivel máximo de parasitemia se detectó en el grupo de hembras enteras y fue de 2,6 x 105 parásitos/mL, a su vez, el grupo de hembras ovariectomizadas presentó una parasitemia máxima de 1,8 x 105 parásitos/mL. En el estudio histopatológico de corazón y músculo esquelético, en relación a lesiones y número de pseudoquistes, ambos grupos presentaron alteraciones más marcadas en músculo esquelético pero en general las hembras ovariectomizadas presentaron lesiones inflamatorias más graves, mayor daño tisular y la presencia de un mayor número de pseudoquistes. Las diferencias observadas, en cuanto a la mortalidad e intensidad de daño, en los tejidos indicaría que la presencia o ausencia de hormonas ováricas sería un factor importante en la evolución de la infección con T. cruzi, que se ha postulado previamente las diferencias en la susceptibilidad a la infección entre machos y hembras estaría asociada a los niveles de estrógenos, hormona que cumple un importante rol en la regulación del sistema inmune, y actuaría también como un factor clave en la supervivencia de las hembras normales

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Trypanosoma cruzi, es un parásito protozoo, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, patología endémica en Latino América. La transmisión de esta enfermedad es producida por un insecto vector triatomino que, luego de alimentarse de la sangre de un mamífero, deposita sus deyecciones con las formas infectivas del parásito (tripomastigotes) las que ingresan al torrente sanguíneo a través de la lesión cutánea generada por el insecto. Una vez dentro, el parásito invade macrófagos y se divide al adoptar la forma amastigote. Luego de replicarse, los amastigotes retoman nuevamente la forma de tripomastigotes, se liberan del macrófago y por vía sanguínea o linfática invaden corazón, ganglios y otros tejidos. Las drogas usadas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas son efectivas durante la fase aguda de la infección; sin embargo, su efectividad es sólo parcial en la enfermedad crónica y generan diversos efectos secundarios. Para establecer una infección crónica, algunos parásitos resisten el estrés oxidativo y reparan el daño al DNA, generado por especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno (ROS/RNS) producidas por las células del sistema inmune del hospedero. La sobrevida de los parásitos se relacionaría con la capacidad de reparación del DNA, donde la vía de reparación por escisión de bases (BER) juega un rol fundamental. En el inicio de esta vía participan DNA glicosidasas que reconocen bases nucleotídicas alteradas en el DNA, catalizando la hidrólisis del enlace N-glicosídico, originando un sitio abásico apurínico/apirimidínico. En esta memoria de título se determinó el efecto de la sobreexpresión de las DNA glicosidasas TcNTH1 and TcOGG1 en epimastigotes expuestos a estrés oxidativo. Se crearon dos líneas de epimastigotes de T. cruzi recombinantes para las glicosilasas TcNTH1 y TcOGG1 A diferencia de lo descrito para enzimas ortólogas de humanos, ambas DNA glicosidasas fueron localizadas principalmente en el núcleo del parásito. Por otra parte, no se evidenciaron diferencias significativas en la viabilidad de epimastigotes transfectados y controles expuestos a peróxido de hidrogeno. Nuestros resultados confirman la presencia de la vía BER en T. cruzi. Como ha sido observado en estudios realizados en células de otros organismos eucariontes, la sobrexpresión de DNA glidosidasas no incrementa la viabilidad celular frente a agentes oxidantes. En un futuro cercano se espera purificar y caracterizar ambas DNA glicosidasas, así como estudiar la viabilidad de tripomastigotes transfectados / - FONDECYT 1090124 - FONDECYT 11100053 - Proyecto - Bicentenario Anillo ACT 112

Proyecto de Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Debido a la gran importancia eco-epidemiológica y clínica de los linajes de Trypanosoma cruzi, en este estudio se analizaron 229 muestras de Triatoma infestans (56,3%) y Mepraia spinolai (43,7%) silvestres infectados por este protozoo, provenientes de seis localidades de la zona endémica de Chile. Se utilizó la técnica de DNA blot, para la detección de la región hipervariable de los minicírculos del kDNA a través de sondas específicas marcadas para los linajes TcI, TcII, TcV y TcVI. TcI resultó el linaje más abundante en ambas especies de triatominos y en la mayoría de las localidades, seguido de TcII. El linaje TcV se detectó exclusivamente en T. infestans de la localidad de Calera de Tango. Además, se observó una mayor cantidad y tipos de infecciones mixtas en esta última especie, asociado a un índice de diversidad de Shannon Weaver significativamente mayor. Finalmente, también se encontraron diferencias significativas en la proporción de los linajes TcI, TcV y TcVI según estación del año, siendo todos más frecuentes en verano. Este estudio es la primera descripción de los linajes de T. cruzi circulando en las localidades de El Maqui, El Sobrante y El Atajo. Además muestra por primera vez una mayor diversidad de linajes y proporción de infecciones mixtas en T. infestans por sobre M. spinolai, y se analizan sus posibles causas e impactos. / Fondecyt 1100339 y 1120122

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas constituye un problema de salud pública en el continente americano. De acuerdo a la OMS existirían 18.000.000 personas con esta parasitosis. Brasil con 5.000.000 y Argentina con 2.200.000 infectados, son los países más afectados. En Chile se estiman que existen actualmente 200.000 chagásicos crónicos. Existen características clínicas regionales de la Enfermedad de Chagas, siendo la cardiopatía y las megaformaciones las principales manifestaciones en la etapa crónica. El diagnóstico es abordado desde el punto de vista clínico-epidemiológico y se orienta en función de la etapa de la infección. En los casos agudos, debido a la elevada parasitemia, los métodos de elección son parasitológicos y en la etapa crónica, por las fluctuantes y bajas parasitemias, la detección de T. cruzi es más compleja. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en sangre periférica de individuos chagásicos, ha permitido aumentar la sensibilidad diagnóstica. Recientemente, se ha aplicado PCR en deyecciones de triatominos alimentados mediante xenodiagnóstico (XD) en chagásicos crónicos sometidos a tratamiento quimioterapéutico. Con el fin de conocer la sensibilidad y precocidad de la detección de kDNA de T. cruzi en deyecciones de triatominos alimentados mediante XD en pacientes con enfermedad de Chagas crónica, a 25 infectados con XD (+) (Grupo I) y 25 infectados con XD (-) (Grupo II), se aplicó PCR al pool de deyecciones de triatominos incubados durante 30, 60 y 90 días. En todos los casos con XD (+) se detectó la banda específica de 330 pb. Mientras a los 60 días el XD era positivo en el 84% de los casos, PCR tuvo un 100% de positividad. En el Grupo II, de chagásicos con XD (-) a los 30, 60 y 90 días, 9 casos (36%) tuvieron PCR positivo. Los resultados permiten concluir que PCR aplicado en deyecciones de triatominos es una herramienta más precoz para detectar T. cruzi que el XD, ya que a los 30 días, XD y PCR tienen un 44% y un 92% de positividad, respectivamente. El 100% de los casos es pesquisado mediante PCR a los 60 días, mientras que el XD necesita 90 días para obtener el mismo resultado. El XD actúa como un medio de cultivo biológico para amplificar T. cruzi, lo que permite aplicar PCR en las deyecciones, por esta razón, ambas técnicas son complementarias / Financiamiento: Proyectos DI SAL 03/06-2 y Fondecyt 1040731

Trypanosomen sind Protozoen, die Krankheiten bei Mensch und Tier verursachen, die unbehandelt infaust verlaufen. Die Zellen sind hoch motil, angetrieben von einem einzelständigen Flagellum, welches entlang des Zellkörpers angeheftet ist. Selbst in Zellkultur hören Trypanosomen niemals auf sich zu bewegen und eine Ablation funktioneller Bestandteile des Flagellarapparates ist letal für Blutstromformen. Es wurde gezeigt, dass Motilität notwendig ist für die Zellteilung, Organellenpositionierung und Infektiosität. Dies macht Trypanosomen zu besonders geeigneten Modellorganismen für die Untersuchung der Motilität. Dennoch ist erstaunlich wenig über die Motilität bei Trypanosomen bekannt. Dies gilt auch noch genereller für die Protozoen. Unlängst ist dieses Gebiet allerdings in den Fokus vieler Arbeiten gerückt, was bereits erstaunliche, neue Erkenntnisse hervorgebracht hat. Doch Vieles ist noch nicht abschliessend geklärt, so z.B. wie der Flagellarschlag genau reguliert wird, oder wie sich der Schlag des Flagellums entlang des Zellkörpers ausbreitet. Die vorliegende Arbeit befasst sich besonders mit den Einflüssen, die die Mikroumgebung auf die Motilität von Blutstromform-Trypanosomen ausübt. In ihrem natürlichen Lebensraum finden sich Trypanosomen in einer hoch komplexen Umgebung wieder. Dies gilt sowohl für den Blutkreislauf, als auch für den Gewebezwischenraum in ihrem Säugerwirt. Die hohe Konzentration von Zellen, Gewebeverbänden und extrazellulären Netzwerken könnte man als Ansammlung von Hindernissen für die Fortbewegung auffassen. Diese Arbeit zeigt dagegen, dass der Mechanismus der Bewegung eine Adaptation an genau diese Umweltbedingungen darstellt, so z.B. an die Viskosität von Blut. Es wird auch ein Bewegungsmodell vorgestellt, das erläutert, worin diese Adaption besteht. Dies erklärt auch, warum die Mehrheit der Zellen einer Trypanosomenkultur eine ungerichtete Taumel-Bewegung aufweist in nieder-viskosem Medium, das keine solchen “Hindernisse” enthält. Die Zugabe von Methylcellulose in einer Konzentration von ca. 0,5% (w/v) erwies sich als geeigneter Ersatz von Blut, um optimale Bedingungen für gerichtetes Schwimmen von Blutstromform Trypanosomen zu erreichen. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit unterschiedliche Arten von Hindernissen, wie Mikroperlen (Beads) oder molekulare Netzwerke, sowie artifizielle, geordnete Mikrostrukturen verwendet, um die Interaktion mit einer festen Matrix zu untersuchen. In deren Anwesenheit war sowohl die Schwimmgeschwindigkeit, als auch der Anteil an persistent schwimmenden Trypanosomen erhöht. Zellen, die frei schwimmend in Flüssigkeiten vorkommen (wie Euglena oder Chlamydomonas), werden effizient durch einen planaren Schlag des Flagellums angetrieben. Trypanosomen hingegen mussten sich evolutionär an eine komplexe Umgebung anpassen, die mit einer zu raumgreifenden Welle interferieren würde. Der dreidimensionale Flagellarschlag des, an die Zelloberfläche angehefteten, Flagellums erlaubt den Trypanosomen eine effiziente Fortbewegung durch die Interaktion mit Objekten in jedweder Richtung gleichermassen. Trypanosomen erreichen dies durch eine hydrodynamisch verursachte Rotation ihres Zellkörpers entlang ihrer Längsachse, entgegen dem Uhrzeigersinn. Der Einfluss der Mikroumgebung wurde in früheren Untersuchungen bisher vernachlässigt, ist zum Verständnis der Motilität von T. brucei jedoch unerlässlich. Ein weiterer, bisher nicht untersuchter Aspekt der Beeinflussung der Motilität durch die Umwelt sind hydrodynamische Strömungseffekte, denen Trypanosomen im kardiovaskulären System ausgesetzt sind. Diese wurden in dieser Arbeit mittels Mikrofluidik untersucht. Um unser Verständnis der Motilität von Trypanosomen von 2D, wie üblich in der Motilitätsanalyse mittels Lebend-Zell-Mikroskopie, auf drei Dimensionen auszudehnen, wurde als bildgebendes Verfahren auch die Holographie eingesetzt. Mikrofluidik und Holographie sind beides aufkommende Techniken mit großem Anwendungspotential in der Biologie, die zuvor noch nie für die Motilitätsanalyse von Trypanosomen eingesetzt worden waren. Dies erforderte daher interdisziplinäre Kooperationen. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit auch ein vollständig automatisiertes und Software-gesteuertes Fluoreszenzmikroskopiesystem entwickelt, das in der Lage ist, einzelne Zellen durch entsprechende Steuerung des Mikroskoptisches autonom zu verfolgen und somit eine Bewegungsanalyse in Echtzeit ermöglicht, ohne weitere Benutzerinteraktion. Letztendlich konnte dadurch auch die Bewegung der schlagenden Flagelle und des gesamten Zellkörpers mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung mittels Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie aufgeklärt werden. / Trypanosomes are protozoa causing fatal diseases in livestock and man. The cells show vivid motility, driven by a single flagellum that runs along the cell body, attached to the cell surface. Even in cell culture, trypanosomes never stop moving and ablation of functional components of the flagellum is lethal for bloodstream-forms. Motility has been shown to be essential for cell division, organelle positioning and infectivity. This renders trypanosomes valuable model organisms for studying motility. But, surprisingly little is known about motility in trypanosomes, as well as in protozoa, in general. Recently, motility of trypanosomes therefore has gotten into the spotlight of interest which brought some new insights, but many essential points are still a matter of debate, for example how the flagellar beat is regulated or how it is propagated along the cell body. In this work, the effects of the micro-environment of blood-stream form trypanosomes on motility were investigated. In their natural habitat, trypanosomes find themselves in a crowded environment. This is not only the case in the blood circulatory system, but also in extra-tissue space. The high concentration of cells and extra-cellular networks might be regarded as a kind of obstacle to cellular motion. This work shows that the mode of motility of bloodstream form trypanosomes instead is adapted to the viscosity of blood. Also a mechanistic model is presented which elucidates how this adaptation works. This also explains why most trypanosomes are tumbling in low-viscous cell culture medium, lacking other cellular components. Addition of Methylcellulose at a concentration of about 0.5% (w/v) was found to be a potent substitute for blood, providing optimal conditions for trypanosome motility. Also different types of obstacles like beads and molecular networks, as well as arranged pillar microstructures were used as a tool to mimic interaction with a solid matrix. In presence of these, the swimming speed as well as the percentage of persistent swimming cells was increased. Cells inhabiting an open-ranged environment (like Euglena or Chlamydomonas) are efficiently propelled by a planar flagellar wave. Trypanosomes in contrast, had to evolutionary adapt to a crowded environment, which would infer with any extensive planar wave. The three-dimensional flagellar beat of the attached flagellum allows trypanosomes to harness any rigid matrix for effective propulsion, in all directions equally. Trypanosomes achieve this by a rotational counter-clockwise motion of their whole cell body. Another environmental aspect for trypanosome motility that had not been studied before is the influence of hydrodynamic flow, which trypanosomes are subjected to, when swimming in the blood circulatory system. For studying this, in this work, the motilty of trypanosomes was analyzed in microfluidic devices. To extend our understanding of trypanosomal motility from 2D, like in standard microscopy based live-cell imaging analysis, to 3D, a imaging technique known as holography was used, in addition. Microfluidics as well as Holography both are emerging, high-potential techniques in biology, which had not been used for the motility analysis of trypanosomes before and establishing this therefore only got possible due to interdisciplinary collaborations. In addition, a custom fully automated, software-controlled, fluorescence microscopic system was developed in this work, which is able to track and follow single cells for motility analysis in real-time without the need for user input. The motion of the flagellar beat and the cell itself was investigated at high spatio-temporal resolution using highspeed fluorescence microscopy.

Glicoconjugados são abundantes na superfície de Trypanosoma cruzi e têm sido bastante estudados por diferentes grupos. A degradação dessas moléculas, no entanto, tem sido alvo de pouco interesse. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade de alfa-L-fucosidase em T.cruzi uma vez que trabalhos anteriores haviam concluído que várias hidrolases, entre elas a alfa-L-fucosidase estavam ausentes em epimastigota (AVILA, et al., 1979). Empregando-se p-nitrofenilfucopiranosídeo como substrato e extrato de formas epimastigotas, verificou-se que a enzima apresenta praticamente a mesma atividade em um intervalo de pH entre 6,0 e 7,5, caindo drasticamente em pHs mais ácidos. A incubação prévia da enzima a 28°C em pH 7,0 leva à perda de aproximadamente 30% de sua atividade após 1h 30mim e à perda de 100% após 4 horas de incubação. O efeito de íons na atividade da enzima foi estudado,verificando-se que Zn +2 inibe 90% sua atividade, enquanto que outros, como o Ca +2 praticamente não tem efeito. A enzima é parcialmente encontrada na fração particulada, podendo ser solubilizada parcialmente com 1% de Triton X-100 ou com NaCl 1 M. As tentativas feitas de purificar a enzima foram infrutíferas, uma vez que não se encontraram condições para manter a proteína ativa por longos períodos de tempo. A alfa-L-fucosidase está presente não só em pimastigotas, mas também em tripomastigotas, embora parentemente com diferentes atividades específicas, sendo maior em epimastigotas. Mesmo nos epimastigotas, grandes variações de atividade específica foram detectadas ao longo deste trabalho (de 0,03 a 0,23 unidades). Anticorpos preparados contra alfa-L-fucosidase comercial de epidídimo bovino imunoprecipitaram de extratos de epimastigotas previamente marcados com 35 S-metionina, um polipeptídeo em torno de 50 kDa após eletroforese em gel desnaturante e uma banda de 130-150 kDa em gel não desnaturante, sugerindo que a enzima em T.cruzi pode ser dimérica, a exemplo de outras alfa-L-fucosidases descritas na literatura. A imunoprecipitação de extrato de epimastigotas marcados com 35 S-metionina na presença de tunicamicina, com o anticorpo anti-alfa-L-fucosidase revelou um polipeptídeo de 45 kDa, mostrando que a enzima é glicosilada. A glicosilação daenzima também foi observada pelo emprego de corantes comerciais. Além disso, os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase imunoprecipitam moléculas com atividade de alfa-L-fucosidase,embora não se tenha observado aumento da atividade, possivelmente devido à perda de atividade da enzima nas condições empregadas durante a imunoprecipitação. Os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase reconhecem, por imunofluorescência indireta, tanto as formas epimastigotas como tripomastigotas de cultura de tecido. A análise por microscopia de transmissão mostra a reatividade intensa do anticorpo com uma região membranar localizada na região posterior do epimastigota. No caso do tripomastigota, a reatividade é menos pronunciada mostrando uma leve marcação no interior do parasita. / Alpha-L-fucose is a component of glycoproteins, inc1uding glycoproteins isolated from Tcruzi. a-L fucosidases have been isolated from different sources, but earlier studies were unable to detect this enzyme in T. cruzi epimastigotes (AVILA et al., 1979). In this work immunocytochemical and biochemical techniques have been used to localize and characterize a membrane-associated, neutral-pH-optimum alpha-L fucosidase from Trypanosoma cruzi epimastigotes. Light and electron microscopy specifically localized the alpha-L fucosidase on membranes in the posterior region of the epimastigotes and on the parasite surface. Immunoreactivity for alpha-L-fucosidase, a1though less intense, was also detected on the surface of trypomastigotes. Fractionation of epimastigotes homogenates indicated that over 50% of the a-Lfucosidase activity was associated with the 80 000 g pellet. This pellet-associated activity could be solubilized with 1 M NaCl or with 1% Triton X-I 00, suggesting that alpha-L-fucosidase is peripherally associated with membranes. Analysis of alpha-L-fucosidase on epimastigote extracts indicated that the enzyme had a pH-activity curve (with an optimum near 7) which was comparable to other alpha-L-fucosidases reported in the literature. A higher specific activity (in units/mg) was found in epimastigotes as compared to the other differentiation stages of the parasite: 0.028 for epimastigotes, 0.002 for metacyc1ic trypomastigotes and 0.015 for tissue - cultured trypomastigotes. SDS/PAGE and Westem blotting analysis indicated that epimastigotes have a protein band of 50 kDa which was immunoreactive with anti-alpha-L-fucosidase antibodies.

O T. cruzi, é o agente causador da doença de Chagas. O estado redox NAD+/NADH intracelular é fundamental na manutenção do metabolismo celular. A GAPDH apresenta a função de proteção do telômero em mamíferos contra degradação, isto por causa de ligar se ao telômero. Aqui, mostramos que a GAPDH recombinante de T. cruzi (rTcGAPDH) interage com o DNA telomérico. A rTcGAPDH liga ao DNA de simples fita. Mostramos que a GAPDH liga ao DNA telomérico in vivo em células epimastigotas, onde a [NADH] é maior que [NAD+], mas a adição de NAD+ exógeno bloqueia esta interação. Corroborando a hipótese de que o equilíbrio NAD+/NADH determina a interação GAPDH-telômero, vimos que o tripomastigota tem maior [NAD+] intracelular que a [NADH] e a GAPDH não é capaz de ligar se ao DNA telomérico. Além disso, o NADH exógeno resgata a interação GAPDH-telómero nesta fase. É importante o equilíbrio NAD+/NADH desta interação em tripanosomas, sugerindo que a proteção do telômero do parasita pode ser regulada pelo estado metabólico das células. / The T. cruzi, is the causative agent of Chagas disease. The redox state of NAD+/NADH intracellular is critical in the maintenance of cellular metabolism. The GAPDH has the protection function of the telomere in mammals against degradation, because it is connecting to the telomere. Here we show the recombinant GAPDH of T. cruzi (rTcGAPDH) interacts with telomeric DNA. The rTcGAPDH binds to single-stranded DNA. We show GAPDH to bind to telomeric DNA in vivo epimastigotes cells, where [NADH] is greater than [NAD+], but the addition of exogenous NAD+ blocks this interaction. Corroborating the hypothesis that the NAD+/NADH balance determines the GAPDH-telomere interaction, we saw that the trypomastigote has higher [NAD+] that intracellular [NADH] and GAPDH is not able to connect to telomeric DNA. In addition, the exogenous NADH recovers the GAPDH-telomere interaction at this stage. It is important the NAD+/NADH balance this interaction in trypanosomes, suggesting that the protection of the telomere of the parasite can be regulated by the metabolic state of the cells.

Doctor en Bioquímica / El cáncer, una de las causas más frecuentes de muerte en el mundo, es un gran desafío para el desarrollo de terapias específicas anti-tumores o de sus metástasis. Ya sea la inmunoterapia anti-tumoral ó la terapia anti-angiogénica, son estrategias con un muy buen potencial en la lucha contra el cáncer. La primera busca activar la respuesta de linfocitos T tumor-específicos, mientras que la segunda bloquea o retarda el crecimiento del tumor al interferir con el abastecimiento adecuado de nutrientes y oxígeno y con la remoción de productos catabólicos tóxicos. La inmunoterapia requiere de la identificación de Antígenos Asociados Tumores (TAA) que se expresen preferencialmente en tejidos con alto nivel proliferativo, como los tumores. Un TAA adecuado para este tipo de terapia debe ser esencial para la mantención de la viabilidad del tumor y ser blanco de linfocitos T citotóxicos. Survivina (Surv), cumple con estos requisitos. Por otra parte, en vertebrados, Calreticulina (CRT), proteína altamente pleiotrópica, además de su participación en procesos de presentación antigénica en células presentadoras de antígeno (APCs), puede translocarse a la membrana externa e interactuar con C1 del complemento. A pesar de la enorme distancia evolutiva entre el Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, y los mamíferos, CRT del parásito (TcCRT) comparte una gran cantidad de características estructurales y funcionales con sus homólogos vertebrados. Recientemente, hemos propuesto que el efecto anti-neoplásico asociado a la infección por T. cruzi, se debería, al menos parcialmente, a la capacidad anti-angiogénica de TcCRT, al interactuar con células endoteliales, interfiriendo con su multiplicación, movilidad y capacidad morfogénica capilar. En estas actividades, la proteína parasitaria es más efectiva que su contraparte humana. Por estas razones, nuestra Hipótesis de Trabajo propuso que, la inmunización genética con Surv y la administración concomitante de TcCRT, genera una actividad anti-tumoral mayor que con solo uno de estos productos. Los principales resultados obtenidos señalan que: i) De acuerdo a lo esperado, rTcCRT no afecta la proliferación in vitro de células de un melanoma murino B16-F10, ii) la inmunización genética con pSurv, en conjunto con rTcCRT (ó su dominio R), retrasa el crecimiento del tumor, iii) aumentando la sobrevida de los animales tratados. iv) El tratamiento combinado pSurv-rTcCRT inhibe la angiogénesis tumoral. v) rTcCRT se une a los melanocitos, promueve la incorporación de C1q humano y la fagocitosis macrofágica y, vi) La combinación de la inmunización con pSurv y pSec-Surv, más la inoculación i.v. con rTcCRT, inhibe sinérgicamente la metástasis pulmonar. Es probable que una secuencia de eventos se desencadene primariamente por la actividad anti-angiogénica de TcCRT, en el tumor, generando una respuesta al estrés derivado, siendo translocada CRT de la célula tumoral a la membrana externa, donde captura C1, evento que promueve la fagocitosis de la célula tumoral, por parte de las APCs. La presentación de péptidos derivados de antígenos TAA debiera ocurrir (Surv incluida), con la consiguiente inducción de actividad inmune anti-tumor. Independientemente, Surv podría también mediar actividad inmune anti-células endoteliales. En consecuencia, el retardo en el crecimiento tumoral y aumento en la sobrevida de los animales tratados con pSurv-rTcCRT se debería a la combinación de efectos sobre distintos blancos moleculares, colaborando y potenciando el efecto final. / Cancer, the most frequent cause of death worldwide, is a great challenge for the development of specific anti-tumor and metastasis treatment. Either immune anti-tumor or anti-angiogenic therapies, are potentially promising in the struggle against cancer. Immune therapy seeks to activate the response of antigen-specific T lymphocytes, thus allowing selective elimination of tumor cells, while anti-angiogenesis blocks or delays tumor growth by interfering with nutrient or oxygen supply and with the removal of catabolic toxic products. Immune therapy for cancer treatment requires the identification of Tumor Associated Antigens (TAA), specifically expressed in tissues with high proliferative levels, such as tumors. A TAA useful for this therapy must be essential for tumor liability and also serve as a target for cytotoxic T lymphocytes. Survivin (Surv), fulfills these requirements. On the other hand, in vertebrates, Calreticulin (CRT), a highly pleiotropic protein, besides its participation in antigen presenting cells (APCs), can translocate to the external membrane and interact with complement C1. In spite of the great evolutionary distance between Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas´ disease, and mammals, parasite CRT (TcCRT) shares many structural and functional properties with its vertebrate counterparts. Recently, we have proposed that the anti-tumor effect associated to T. cruzi infection is at least partially due to the TcCRT anti-angiogenic capacity. Thus, upon interacting with endothelial cells, TcCRT interferes with their multiplication, mobility and capacity to generate capillaries. In all these activities, the parasite protein is more effective than its human counterpart. For these reasons, the Working Hypothesis proposes that genetic immunization with Surv and concomitant TcCRT administration, generates a greater anti-tumor activity than each of these products, administered separately. The principal results obtained indicate that: i) As expected, while rTcCRT does not affect the in vitro proliferation of B16-F10 tumor cells, ii) genetic immunization with pSurv, together with rTcCRT (or its R domain), slows the growth of the B16-F10 murine melanoma iii) increasing survival of treated animal. iv) pSurv-rTcCRT treatment inhibits tumor angiogenesis. v) rTcCRT binds to B16-F10 melanocytes, promotes the incorporation of human C1q and consequent macrophage phagocytosis and, vi) The combination of immunization with pSurv and pSecSurv plus rTcCRT i.v. inoculation, synergistically inhibits lung metastasis. Perhaps, a sequence of events is primarily unleashed by the TcCRT anti-angiogenic activity in the tumor. As a response to derived stress, tumor cell CRT is translocated to the external membrane, where it captures C1, an event that promotes tumor phagocytosis by APCs. TAA-derived antigen presentation (Surv included) should follow, with the induction of anti-tumor immune activity. Independently, Surv could also mediate anti-endothelial cell immune activity. Consequently, the slower tumor growth and increased survival of the animals treated with pSurv-rTcCRT is due to the combined effects on different molecular targets, collaborating and enhancing the overall effect. / Fondap

Genomes are constantly challenged by agents that promote DNA damage, with interstrand crosslinks (ICLs) representing a particularly dangerous lesion. Ongoing work in the Wilkinson laboratory aimed at identifying novel agents that target Trypanosoma brucei, the causative agent of African trypanosomiasis, identified several prodrugs that once activated form ICLs in this protozoan parasite. To understand the complexity of ICL repair systems that T. brucei employs to resolve such damage, a variety of null mutant lines were generated that lack activities postulated to fix such lesions. Phenotypic screens using various DNA damaging agents revealed that TbMRE11, TbEXO1, TbCSB, TbCHL1, TbFAN1, TbBRCA2 and TbRAD51 all help to resolve ICLs, implicating components of the homologous recombination, nucleotide excision repair and mismatch repair pathways in resolving this form of damage: This approach demonstrated that components of the translesion synthesis pathway (TbREV2 and TbREV3) do not play a significant role in ICL repair. In many organisms, nucleases belonging to the SNM1/PSO2 family play a key and specific role in the repair of ICLs with this property extending to the T. brucei homologue, TbSNM1. To assess whether there is a functional linkage between the DNA repair factors noted above and TbSNM1, a series of double null mutants were constructed and the susceptibility of these lines to ICL inducing agents determined. Identification of their epistatic/non-epistatic interactions revealed that T. brucei expresses at least two ICL repair systems with one pathway involving the concerted activities of TbSNM1/TbCSB/TbEXO1, that we postulate functions to repair ICLs encountered by the transcriptional machinery, while the other is centred upon TbMRE11/TbFAN1/TbEXO1 that may help resolve lesions which cause stalling of DNA replication forks. By unravelling how T. brucei repairs ICLs, specific inhibitors against key components of these pathways could be developed and used in combination with DNA damaging agents to target trypanosomal infections.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-11Bitstream added on 2014-06-13T19:07:43Z : No. of bitstreams: 1 kohatsu_aan_me_arafcf.pdf: 1504236 bytes, checksum: 9c5b88c167195f46b5fed183a5266203 (MD5) / No momento há apenas dois fármacos disponíveis para o tratamento da doença de Chagas, nifurtimox e benzonidazol, ambos de ações limitadas. Assim, a compreensão dos mecanismos utilizados por T. cruzi para diminuir os efeitos citotóxicos de fármacos e a busca de potenciais moléculas para quimioterapia, bem como os alvos para elas, são de extrema importância. O aumento na produção de certas enzimas do metabolismo oxidativo seria responsável pela resistência das cepas do parasito ao benzonidazol (BZ). Tais enzimas são: triparedoxina peroxidase (mTcTXNPx) que catalisa a redução de peróxidos, superóxido dismutase (mTcSOD) que realiza a dismutação do ânion superóxido e old yellow enzyme (cTcOYE) que está envolvida na redução de substâncias tripanossomicidas, como naftoquinonas e compostos nitroheterocíclicos. Estudos demonstram que a atividade antimalarial da cloroquina foi aumentada com a adição de ferroceno. Neste trabalho, foram avaliadas as diferenças de suscetibilidade entre seis cepas de T. cruzi (Y, Bolívia, SI1, SIGR3, SI8 e QMII) em relação a três estruturas derivadas de diaminas do ferroceno e a expressão das proteínas antioxidativas. A substância AAC09 mostrou maior citotoxicidade, com CI50 de 2,21 μM para a cepa menos resistente (cepa Y) e 15,20 μM (cepa QMII) para a mais resistente, enquanto que para BZ foi 27,28 μM (cepa SI1) e 105,28 μM (cepa SIGR3), respectivamente. Após tratamento, a expressão das enzimas mTcTXNP (25,5 kDa) e cTcOYE (43 kDa) não aumentaram em cepas mais resistentes aos derivados de diaminas do ferroceno e BZ. Por outro lado, somente ocorreu aumento de expressão de mTcTXNPx na cepa Y tratada com BZ. Os resultados obtidos mostraram que cada cepa apresenta distinta suscetibilidade a um agente oxidativo e as cepas mais resistentes não aumentaram a expressão das... / At the moment there are only two drugs available for the treatment of Chagas disease, nifurtimox and benznidazole, both of use restricted. Understanding the mechanisms used by T. cruzi to reduce de cytotoxic effects of drugs and finding potential molecules for chemotherapy, as well as targets for them, are extremely important. Resistance to benznidazole (BZ) in T. cruzi strains may be caused by increased production of enzymes that act on oxidative metabolism. Such enzymes are: tryparedoxin peroxidase (mTcTXNPx), which catalyzes the reduction of peroxides, superoxide dismutase (mTcSOD), which performs the dismutation of superoxide anion and old yellow enzyme (cTcOYE), which is related to the reduction of trypanocidal substances, such as naphthoquinones and nitroheterocyclic compounds. Studies showed that the antimalarial activity of chloroquine was increased with the addition of ferroceno. Herein the susceptibilities in six T. cruzi strains (Y, Bolivia, SI1, SIGR3, SI8 and QMII) were analyzed in relation to three structures of ferrocene diamine derivatives and the expression of antioxidant proteins. The AAC09 substance showed higher cytotoxicity, with IC50 of 2.21 μM for the less resistant strain (Y strain) and 15.20 μM (QMII strain) for more resistant, whereas to BZ was 27.28 μM (strain SI1) and 105.28 μM (SIGR3), respectively. After treatment, the expression of the enzymes mTcTXNP (25.5 kDa) and cTcOYE (43 kDa) did not increase in more resistant strains to ferrocene diamine derivatives and BZ. However, there was increased expression of mTcTXNPx only in the Y strain treated with BZ. The results showed that each strain exhibited different susceptibility to oxidative agent and the most resistant strains did not enhance expression of these enzymes. Based on these findings, probably other mechanisms may be... (Complete abstract click electronic access below)