Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-15T20:36:09Z No. of bitstreams: 1 2016_AnaLuisaPereiraMarques.pdf: 5793977 bytes, checksum: a015d6912df7b0099292e7fdc10328ec (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-02T13:51:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AnaLuisaPereiraMarques.pdf: 5793977 bytes, checksum: a015d6912df7b0099292e7fdc10328ec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T13:51:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AnaLuisaPereiraMarques.pdf: 5793977 bytes, checksum: a015d6912df7b0099292e7fdc10328ec (MD5) / As infecções pelo Trypanosoma cruzi são um sério problema de saúde pública na América Latina, com alta morbidade e mortalidade. Cerca de oito a dez milhões de pessoas estão infectadas pelo parasito em todo o mundo e um terço irá desenvolver os sintomas da doença de Chagas. Para o diagnóstico dessa infecção, são usados principalmente métodos sorológicos que se baseiam em anticorpos específicos contra o parasito. Esses exames apresentam resultados duvidosos ou falsos positivos devido à reação cruzada com antígenos de outros microorganismos. A evolução na área da biologia molecular vem modificando e aperfeiçoando o diagnóstico da doença de Chagas, representando uma boa alternativa para complementar ou estabelecer o diagnóstico das infecções pelo T. cruzi. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi realizar uma investigação teórica-experimental de protocolos de qPCR utilizados para o diagnóstico de infecções pelo T. cruzi. A revisão sistemática da literatura permitiu a identificação das condições experimentais (métodos de extração, iniciadores, enzimas amplificadoras, entre outros) mais utilizadas nos artigos científicos selecionados e a observação de que ainda não existe um procedimento padrão estabelecido. Assim, diferentes protocolos de qPCR para identificação do T. cruzi foram avaliados experimentalmente. Foram utilizados marcadores específicos para DNA nuclear (nDNA) e para minicírculos e maxicírculos de kDNA de T. cruzi. A população do estudo foi separada em três categorias - grupos positivo, negativo e duvidoso - de acordo com os testes sorológicos apresentados pelos indivíduos. Os resultados comparativos dos métodos sorológicos e moleculares apresentaram discordâncias peculiares, notadamente quando se utilizou marcadores para minicírculos de kDNA, fato que pode estar associado à integração dessas moléculas no genoma hospedeiro. Estabeleceu-se que a melhor escolha diagnóstica para identificação de infeção ativa pelo T. cruzi se dá com marcadores moleculares específicos para nDNA, o qual foi capaz de determinar a infecção em casos inconclusivos na análise sorológica. Os achados deste estudo reforçam a necessidade de um diagnóstico mais efetivo que possa ser utilizado como padrão-ouro para identificação das infecções pelo T. cruzi. / Trypanosoma cruzi infection is a serious public health problem in Latin America, with high morbidity and mortality. About eight to ten million people are infected with the parasite worldwide and one-third will develop the symptoms of Chagas disease. Its diagnosis is mainly based on serological methods that recognize specific antibodies against the parasite. Often, these tests have inconclusive results or false positives due to cross-reaction with antigens from other microorganisms. Development in molecular biology has been changing and improving the diagnosis of Chagas' disease, representing a good alternative to supplement or establish the diagnosis of T. cruzi infection. Thereby, the objective of the current study was to evaluate theoretically and experimentally qPCR protocols used for Chagas disease diagnosis. A systematic review of the literature allowed the identification of experimental conditions (extraction methods, primers, amplifying enzymes, etc) commonly used in scientific articles and the observation that there is no standard procedure established. Thus, different qPCR protocols for T. cruzi identification were experimentally assessed. Specific primers were used for nuclear DNA (nDNA), and mitochondrial DNA (minicircles and maxicircles). The study population was divided into three categories - positive, negative and doubtful groups - according to the serologic tests. Comparison between serologic and molecular results showed peculiar disagreements, especially when using primers for kDNA minicircle, which may be associated with the integration of these molecules into the host genome. It was established that the best choice for diagnosis T. cruzi active infection is by specific molecular markers to nDNA, which was able to establish infection in inconclusive serological analysis. Our findings reinforce the need of an effective diagnosis that can be used as the gold standard for identification of T. cruzi infection.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-14T18:42:15Z No. of bitstreams: 1 2016_RafaelRochadeAndrade.pdf: 2696423 bytes, checksum: 51029fe9cdf947ddbd961f4a6a5a2830 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-28T17:55:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RafaelRochadeAndrade.pdf: 2696423 bytes, checksum: 51029fe9cdf947ddbd961f4a6a5a2830 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T17:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RafaelRochadeAndrade.pdf: 2696423 bytes, checksum: 51029fe9cdf947ddbd961f4a6a5a2830 (MD5) / A doença de Chagas subsequente à infecção pelo Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é endêmica na América do Sul. O tratamento disponível para a doença clinicamente manifesta é insatisfatório. Neste estudo foram conduzidos experimentos independentes em grupos formados por cinco aves nascidas de ovos inoculados ou não com T. cruzi. A integração de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma das aves singênicas e a herança do kDNA integrado nas progênies foram anteriormente descritas, e a correlação das alterações genômicas com a doença autoimune do coração foi demonstrada. O presente estudo documenta a cardiomiopatia autoimune de origem genética nas aves kDNA+ a partir de exames de ecocardiograma e aponta a evolução desta patologia nas aves após receberem o transplante de medula óssea. As aves com o genoma modificado pela presença de mutações de kDNA (kDNA+), tiveram a medula óssea destruída com drogas, e receberam, dois dias após, transplante de medula óssea de ave controle (kDNA-) da mesma linhagem. Os resultados demonstram que as aves que tiveram seu genoma modificado pela integração das mutações de kDNA apresentaram a miocardiopatia inflamatória de natureza autoimune. Por outro lado, as aves inicialmente sadias que receberam medula óssea proveniente de aves kDNA+ (grupo de indução da patologia), apresentou substancial decréscimo da fração de ejeção e também na fração de encurtamento. No grupo das aves kDNA+ que receberam medula óssea de animais kDNA- (grupo inibição da patologia) não houve melhora significativa dos principais parâmetros de função miocárdica (fração de ejeção, fração de encurtamento e diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole) logo nos 3 primeiros meses. Porém, houve uma tendência de melhora da função miocárdica na análise aos 10 meses pós-transplante, indicando uma recuperação de parâmetros da função miocárdica das aves deste grupo tratado com medula óssea sadia. Outros estudos de monitoramento cardíaco mais prolongados são necessários, e devem ser realizados para esclarecer o prognóstico das aves após o tratamento com transplante de medula óssea. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi infection is endemic in South America. The treatment available for the clinically manifested disease is considered unsatisfactory. In this study, we carried out groups of five chickens hatched from the T. cruzi inoculated eggs. The integration of the kDNA minicircle sequences in the chicken genome and their inheritance by progeny was documented and the role played by these genome alterations in the disease pathogenesis was demonstrated. The present study showed the autoimmune cardyopathy in chickens with the T. cruzi (kDNA+) mutations, which were monitored by the echocardiogram. The chickens with the genome altered by the kDNA mutations (kDNA+) had the bone marrow destroyed with antimetabolic and cytostatic. The transplantation of chicken control bone marrow, without kDNA mutations (kDNA-), was carried out two days thereafter. The results translated the changes of the cardiophathy after bone-marrow transplantation. It was shown that the control healthy chickens (kDNA-) that received bone-marrow from kDNA+ mutated sick chickens (induction of pathology group), showed significant decrease of shortening and ejection fraction. In the group of kDNA+ chickens that received bone-marrow from healthy (kDNA-) chickens (inhibition of pathology group), there where a significant decrease of the heart function parameters, such as reduction of shortening and ejection fraction of the left ventricle during three months after transplantation. However, it was noticed a sustainable improvement of these heart function parameters (shortening fraction, ejection fraction and internal diameter of left ventricle) in the following ten monts after bone-marrow transplantation. This finding suggest a recovery of the heart function in the kDNA+ chickens that had the bone- marrrow destroyed with drugs and that received healthy (kDNA-) bone-marrow transplantation.Further long run studies of cardiac function monitoring are required to determine the prognosis of the sick kDNA+ chickens after the healthy bone-marrow transplantation.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-29T16:56:24Z No. of bitstreams: 1 2015_AndersonRodriguesAraujoVieira_Parcial.pdf: 1220203 bytes, checksum: 626e7d5292fa357bfb78c37564af99bc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-07-20T13:22:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AndersonRodriguesAraujoVieira_Parcial.pdf: 1220203 bytes, checksum: 626e7d5292fa357bfb78c37564af99bc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-20T13:22:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AndersonRodriguesAraujoVieira_Parcial.pdf: 1220203 bytes, checksum: 626e7d5292fa357bfb78c37564af99bc (MD5) / A tripanossomíase americana ou doença de Chagas (DC) é uma doença que afeta principalmente a população pobre de países latino americanos. Estima-se que 7-8 milhões de pessoas estão infectadas com Trypanosoma cruzi na América Latina, sendo que cerca de 2 a 3 milhões de pessoas são portadoras da forma crônica no Brasil. Apesar da realização do controle da transmissão vetorial da DC em regiões endêmicas, formas alternativas de transmissão tornaram-se evidentes como a transmissão oral. A transmissão oral ocorre principalmente pela ingestão acidental de triatomíneos infectados ou de alimentos contaminados com dejetos desses triatomíneos ou secreções de animais silvestres infectados com T.cruzi. O suco do açaí produzido artesanalmente é tido hoje como o principal responsável por surtos da DC no Norte do Brasil, pequenos surtos da DC já foram registrados após grupo de pessoas ingerirem a bebida contaminada com T.cruzi nos estados do Amapá, Amazonas e Pará. O objetivo desse trabalho é desenvolver e validar uma metodologia para detectar contaminação por T. cruzi em pasta e bebida de açaí (Euterpe oleracea). Para isto, 10 mL de polpa de açaí foram inoculados com 107 células de formas epimastigotas ou tripomastigotas de T.cruzi, que foram posteriormente isoladas por flutuação em sulfato de zinco, seguido de extração de DNA e análise por PCR. Para a detecção, foram amplificadas as regiões repetitivas do DNA nuclear (TCZ) e o gene ribossomal 28Sα (rDNA 28Sα). Também foram avaliadas a sensibilidade e a especificidade dos primers. A extração de DNA pelo método clorofórmio/álcool isoamílico foi testada após amostras serem isoladas por flutuação em Sulfato de zinco. O limite mínimo de detecção utilizando o gene ribossomal rDNA 28Sα foi observado na ordem de 20 pg de DNA de T. cruzi, enquanto que para as regiões repetitivas nuclear TCZ foi de 20 fg. Os números mínimos detectados de células em 10 mL de polpa de açaí foram: 170.000 tripomastigotas para rDNA 28Sα e 1,7 tripomastigotas para o TCZ. O limite de detecção para a amplificação do gene rDNA 28Sα foi de 400 fg em PCR em tempo real (qPCR) e o número de células detectadas foram 10.000. A metodologia de isolamento de T. cruzi pela flutuação em sulfato de zinco, juntamente com a amplificação de regiões repetitivas do DNA nuclear (TCZ) e do gene ribossomal (rDNA 28Sα) por PCR qualitativa e qPCR, demonstraram ser uma ferramenta aplicável para a detecção de açaí contaminado com T. cruzi. A utilização desta metodologia pode ser apropriada em casos de surtos de transmissão de doença de Chagas por via oral. / The American trypanosomiasis or disease of Wounds (DC) is a disease that affects mainly the poor population of Latin American countries. It is estimated that 7-8 million persons are infected with Trypanosoma cruzi in the Latin America and around 2 to 3 million persons have the chronic form in Brazil. Despite the accomplishment of the control of the vector transmission for DC in endemic regions, the alternative forms of transmission became evident like the oral transmission. The oral transmission occurs by accidental ingestion of infected triatomines, foods contaminated with feces of these triatomines or secretions of wild animals infected with T. cruzi. The craftily produced açaí (Euterpe oleracea) juice is considered the main responsible for outbreaks of the DC in the North of Brazil. Small outbreaks of the DC were already registered after groups of persons ingested the juice contaminated with T. cruzi in the states of Amapá, Amazon and Pará. The main objective of this work is to develop and to validate a methodology to detect T. cruzi contaminations in açaí-based foods and beverages. For this, 10 mL of açaí pulp were inoculated with 107 T. cruzi epimastigote or trypomastigote cells, which were subsequently isolated by flotation in zinc sulfate. Next, the extraction of DNA and PCR analysis were conducted. For PCR detection, the repetitive regions of the nuclear DNA (TCZ) and the ribosomal gene 28S α (rDNA 28S α) were amplified. Moreover, the especificity and sensibility of the primers were determined. The method using chloroform/isoamyl alcohol was chosen for T. cruzi DNA extraction from açaí samples. The minimum detection limit for the ribosomal gene rDNA 28Sα was observed in the order of 20 pg of T. cruzi DNA, while for the nuclear repetitive regions TCZ it was 20 fg. The minimum number of cells detected in 10 mL of açaí pulp were 170,000 trypomastigotes for rDNA 28Sα and 1.7 trypomastigotes for TCZ. The detection limit for the amplification of the rDNA 28Sα gene was 400 fg by real time PCR (qPCR) and the number of detected cells were 10,000. The methodology of T. cruzi isolation by flotation in zinc sulfate followed by the amplification of repetitive regions of the nuclear DNA (TCZ) and the ribosomal gene (rDNA 28S α) by qualitative PCR and qPCR, demonstrated to be an applicable strategy to detect T. cruzi contaminations in açaí-based foods and beverages. The application of this methodology can be appropriated in cases of outbreaks of Chagas disease transmission by oral route.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Zoologia, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-21T21:41:37Z No. of bitstreams: 1 2018_FilipeCarneiroReis.pdf: 4085955 bytes, checksum: 6c302ff5b3fbd0285483d8febfe30065 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-27T21:50:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_FilipeCarneiroReis.pdf: 4085955 bytes, checksum: 6c302ff5b3fbd0285483d8febfe30065 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-27T21:50:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_FilipeCarneiroReis.pdf: 4085955 bytes, checksum: 6c302ff5b3fbd0285483d8febfe30065 (MD5) Previous issue date: 2018-08-21 / Os zoológicos exercem um importante papel nos programas conservacionistas. Para que estes projetos tenham êxito, é necessário que as populações cativas sejam geneticamente manejadas, sendo necessárias translocações entre instituições para evitar depressões endo e exogâmicas. Entretanto, estas movimentações de indivíduos podem acarretar no transporte de patógenos entre instituições como também com o ambiente natural, sendo que os indivíduos participantes podem tanto carregar parasitos quanto se infectar ao longo do processo. Dentre várias doenças que devem ser consideradas, podemos destacar aquelas causadas por tripanossomatídeos como Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas e Leishmania spp., agente etiológico das leishmanioses. Este estudo teve como objetivo monitorar a ocorrência de insetos vetores (triatomíneos e flebotomíneos) e investigar a infecção por tripanossomatídeos nestes insetos e nos mamíferos silvestres cativos do Zoológico de Brasília, localizado no Distrito Federal. Para tanto, foram realizadas buscas ativas bimestrais por triatomíneos entre 2016 e 2017, com auxílio de lanternas e pinças, sendo encontrada uma colônia com 17 adultos, duas ninfas e 32 ovos de Panstrongylus megistus no recinto do ouriço-caixeiro. Testes de microscopia e qPCR confirmaram a infecção por T. cruzi em 25% desses insetos. Também foram instaladas armadilhas HP e Shannon com objetivo de capturar flebotomíneos. Após esforço amostral de 7.392 horas, foram capturados 17 flebotomíneos, sendo encontrado indivíduos de Nyssomyia whitmani (principal vetor de L. brasiliensis) e Lutzomyia longipalpis (vetor de L. infantum). Foi realizado qPCR nestes vetores, mas nenhum foi positivo para Leishmania. Foi realizada coleta de sangue de 74 mamíferos silvestres da instituição de cinco diferentes ordens. Testes de qPCR com utilização dos primers TCZ3 e TCZ4 identificaram 50 espécimes positivos para T. cruzi em 24 espécies, sendo possivelmente o primeiro relato para Lagothrix cana, Ateles marginatus, Chiropotes satanas, Speothos venaticus, Lontra longicaudis, Tremarctos ornatus, Leopardus tigrinus, Leopardus colocolo e Puma yagouaroundi. Para Leishmania, qPCR com primers de kDNA identificou 15 espécies positivas, com um total de 23 indivíduos. No total, 18 indivíduos foram diagnosticados com dupla infecção, sendo positivos em ambos os exames. Esses resultados indicam ocorrência de transmissão vetorial de tripanossomatídeos no Zoológico de Brasília. Uma nova colônia de triatomíneos detectada no local indica que a infestação de recintos é um evento recorrente e a presença de espécimes infectados indica que o risco de transmissão de T. cruzi para os mamíferos cativos persiste. Os resultados ampliam a lista de espécies de primatas infectados por T. cruzi no Zoológico de Brasília e ainda mostram outros grupos de mamíferos infectados. O registro de espécies de flebotomíneos, entre elas Lu. longipalpis e Ny. whitmani, potenciais vetoras de L. infantum e L. braziliensis, e de mamíferos infectados nascidos no local, indica que há transmissão autóctone de Leishmania no Zoológico de Brasília. Recomenda-se a aplicação de medidas preventivas com objetivo de evitar novas infecções por T. cruzi e Leishmania. As futuras movimentações de animais silvestres do Zoológico de Brasília devem levar em consideração a presença desses tripanossomatídeos, evitando a disseminação destas zoonoses. / Zoos play a key role in conservation projects. For these projects to succeed, it is necessary the genetic management of the captive populations and the translocations between institutions to avoid both endo and exogamous depressions. However, these transits of individuals can lead to a transport of pathogens between institutions and the natural environment, and the individuals involved can both carry parasites or become infected throughout the process. Among several diseases that must be considered, we can highlight those caused by trypanosomatids like Trypanosoma cruzi, aethiological agent of Chagas disease and Leishmania, aethiological agent of leishmaniasis. The objective of this study was to monitor the occurrence of insect vectors (triatomines and sandflies) and to investigate trypanosomatid infection in these insects and in captive wild mammals of the Brasilia Zoo, located in Distrito Federal, Brasil. A bimonthly active search for triatomines was carried out using lanterns and tweezers between 2016 and 2017. A colony with 17 adults, 2 nymphs and 32 Panstrongylus megistus eggs was found in the hedgehog enclosure. Microscopy and qPCR tests confirmed T. cruzi infection in 25% of these insects. Twenty-two HP and two Shannon traps were installed to capture sandflies. After sampling effort of 7,392 hours, 17 sandflies were captured, and individuals of Nyssomyia whitmani (main vector of L. brasiliensis) and Lutzomyia longipalpis (vector of L. infantum) were found. qPCR was performed, but none were positive for Leishmania. Blood samples were collected from 74 wild mammals of six different orders from the institution. qPCR testing with use of primers TCZ4 and TCZ3 identified 50 specimens positive for T. cruzi in 24 species, possibly being the first report in Lagothrix cana, Ateles marginatus, Chiropotes satanas, Speothos venaticus, Lontra longicaudis, Tremarctos ornatus, Leopardus tigrinus, Leopardus colocolo e Puma yagouaroundi. For Leishmania, qPCR with kDNA primers identified 15 positive species, being a total of 23 individuals. In total, 18 individuals were diagnosed with dual infection, being positive in both examinations. These results indicate the occurrence of vector transmission of trypanosomatids in the Brasília Zoo. The new colony of triatomines detected at the site indicates that infestation of enclosures is a recurrent event and the presence of infected specimens indicates that the risk of T. cruzi transmission to captive mammals persists. The results broaden the list of primate species infected by T. cruzi at the Brasilia Zoo and show other groups of infected mammals. The record of sandflies species, among them Lu. longipalpis and Ny. whitmani, that are the potential vectors of L. infantum and L. braziliensis, and infected local mammals with Leishmania, indicate that transmission of Leishmania was autochthonous at the Brasilia Zoo. It is recommended the application of preventive measures to avoid new infections by T. cruzi and Leishmania. The future translocations of wild animals of the Brasilia Zoo should consider the movement of these trypanosomatids, avoiding the introduction of the zoonoses.

Plasmodium spp. and Trypanosoma brucei spp. are protozoan parasites with complex lifecycles, each having to adapt to the diverse environments of their insect vector and mammalian host. Each has multiple developmental forms that differ in their morphology and metabolism. Differentiation between these forms is a tightly regulated and often synchronised process in response to changes in the parasite's environment. The molecular mechanisms by which they perceive and respond to such environmental changes are largely unknown. The Plasmodium and T. brucei genomes encode a homologue of the phylogenetically widespread GPR89 family of putative receptors or channels. The mammalian GPR89 homologue has been implicated in the regulation of Golgo acidification, whilst in plants it has been shown to be involved in G protein signally pathways. This study set out to characterise the Plasmodium and T. brucei GPR89 proteins in order to assess their potential role as environmental sensors. Bioinformatic analyses demonstrated that the GPR89 proteins are a highly divergent family of multi-transmembrane domain proteins that may perform a channel or transporter function. Several expression strategies were employed to evaluate the role of the GPR89 proteins. Functional insight was gained from the ectopic expression of both the T. brucei and Arabidopsis thaliana GPR89 proteins in T. Brucei cells. Over-expression of TbGPR98 causes premature stumpy formation in pleomorphic T. brucei cells. This phenotype was replicated by over-expression of a A. thaliana homologue in T. brucei despite signigicatnt sequence divergence. Furthermore, both were demonstrated to act on the same pathway as the putatuve RNA binding protein, RBP7 that was receontly identified in a genome-wide screen for components of the stumpy differentiation pathway. Hence, TbGPR89 is likely a compnent of the slender to stumpy differentiation pathway in bloodstream form trypanosomes and there appears to be functional complementarity between T. brucei and A. thaliana GPR89 proteins.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Ciencias Animales / En la actualidad, la enfermedad de Chagas (ECh), es considerada una de las “enfermedades desatendidas” más importantes del mundo y debido a sus implicancias médicas, sociales y económicas constituye uno de los principales problemas de salud pública de Latinoamérica. Se estima que 28 millones de personas de la región están expuestos a la infección y que la ECh es causa de muerte a 14.000 personas cada año, mucho más que otras parasitosis en la región, incluida malaria. La ECh causa discapacidad prematura, con un costo anual de 667.000 años de vida ajustados por discapacidad. Desde el punto de vista diagnóstico, la detección del parásito ha mejorado en forma considerable desde la aplicación de la Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR). No obstante, la modalidad convencional (PCR Tiempo final), sólo permite detectar la presencia de ADN de Trypanosoma cruzi circulante, mientras que la aplicación de PCR Tiempo Real (qPCR), modalidad cuantitativa de PCR, permite obtener información sobre la carga parasitaria de T. cruzi circulante. El objetivo de esta tesis fue cuantificar la carga de T. cruzi mediante qPCR en sangre (qPCR-S) y deyecciones de triatominos alimentados mediante XD (qPCR-XD) en 90 personas con ECh crónica, clasificados según presencia o ausencia de cardiopatía. Todos proceden de áreas endémicas de Chile y participaron en el estudio bajo Consentimiento Informado. La curva estándar de qPCR se elaboró a partir de una concentración conocida de ADN de T. cruzi, realizando diluciones seriadas (1/10) en sangre de paciente sin ECh con un rango dinámico entre 106 a 10-1 parásitos equivalentes/ml (par.eq/ml.) Todos los cálculos se estimaron considerando que cada célula de T. cruzi posee 200 fg de material genético. Se aplicó el sistema de detección TaqMan®, en un termociclador Mx3000P™ Stratagene (AgilentTecnologies, USA) con los primers satelitales cruzi 1 y cruzi 2. En los grupos de cardiópatas con XD (+) o XD (-) fue posible establecer mediante qPCR-S, que el 57.1% y el 39.5%, respectivamente, presenta cargas parasitarias entre 0.1-1 par. eq./ml. Al aplicar qPCR-XD en los mismos grupos, se observó que el 57.1% de los casos XD (+) tenía entre 1-10 par. eq./ml y el 34.21% de los casos XD (-) entre 0.01-0.1 par. eq./ml. La positividad de qPCR-S y qPCR-XD en el grupo XD (+) fue del 100%, con rangos de parasitemia diferentes, mientras que en el grupo XD (-), la positividad de qPCR-XD fue del 55.27%. En el grupo de no cardiópatas XD (+), fue posible determinar mediante qPCR-S que el 77.8% de los casos tuvieron una carga parasitaria entre 0.1-1 par. eq./ml, mientras que en los casos XD (-), el 52.8% tuvo cargas entre 0.01-0.1 par. eq./ml. En el 36.1% de los casos de este último grupo, qPCR-S no detectó T. cruzi. Al aplicar qPCR-XD en el grupo de no cardiópatas XD (+) se estableció que el 44.4% tuvo cargas parasitarias entre 10-100 par. eq./ml, mientras que en los casos XD (-) el 50% de los casos tenía entre 0.01-0.1 par.eq./ml. La positividad de qPCR-XD en XD (-) fue del 72.2%. La mediana de carga parasitaria de T. cruzi determinada mediante qPCR-S para el grupo cardiópata fue de 0.07 par.eq./ml y en el grupo de no cardiópatas de 0.02 par.eq./ml. Por otra parte, la mediana de parasitemia de T. cruzi qPCR-XD para el grupo de cardiópatas fue de 0.017 par.eq./ml y en el grupo de no cardiópatas de 0.055 par.eq./ml. La prueba de diferencias de Mann-Whitney para las medianas, no encontró diferencias entre las cargas parasitarias entre cardiópatas y no cardiópatas. / Financiamiento: proyecto Fondecyt 1120382-1161485.

Submitted by ÁGHATA REGINA DE OLIVEIRA ALVES PALMEIRA null (gataegu@yahoo.com.br) on 2018-03-28T17:41:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertação mestrado - Aghata R O A Palmeira.pdf: 2700462 bytes, checksum: b24495d6d208f380437b17f49034841c (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-03-29T17:36:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 palmeira_aroa_me_bot.pdf: 2700462 bytes, checksum: b24495d6d208f380437b17f49034841c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-29T17:36:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 palmeira_aroa_me_bot.pdf: 2700462 bytes, checksum: b24495d6d208f380437b17f49034841c (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A família Trypanosomatidae é constituída por diversas espécies de protozoários que causam doenças em humanos e outros animais. Destacam-se os protozoários Leishmania spp. causadores das leishmanioses e Trypanosoma spp. causadores da doença de Chagas. O cão doméstico é considerado o principal reservatório da leishmaniose no meio urbano, porém o homem e animais silvestres também podem ser infectados atuando como reservatórios de tripanossomatídeos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de Leishmania spp. e Trypanosoma spp. em amostras provenientes de animais silvestres atropelados, procedentes do estado de Santa Catarina pela técnica molecular de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), a fim de mapear e identificar áreas de risco para a infecção humana. Foram coletadas 1063 amostras de tecido pulmão, fígado, baço, pele e coração de 297 animais silvestres. Utilizou-se primers LITST/L5.8S e LITSV/L5.8SR para triagem da família Trypanosomatidae, onde 12 amostras de sete roedores foram positivas. Na pesquisa de L. infantum e T. cruzi foram utilizados primers específicos, LCS1/LCS3 e TCZ1/TCZ2 respectivamente, sendo todas as amostras foram negativas. O sequenciamento foi realizado a partir das amostras positivas e nove amostras apresentaram similaridade entre 79% a 100% com Trypanosoma brucei (GenBank KX700175.1), Trypanosoma brucei gambiense (GenBank XM_011780373.1), Trypanosoma vivax (GenBank HE573020.1), Trypanosoma rangeli (GenBank KJ742907.1) e com o gênero Trypanosoma. Os animais foram, Oxymycterus sp. (rato do brejo), Scapteromys sp. (rato d’ àgua), Nectomys squamipes (rato d’ àgua) e dois Oligoryzomys sp. (rato do mato). Verifica-se que a localização dos animais positivos foi próxima as atividades de indústria, comércio e lazer, permitindo o contato entre animais e homem, facilitando a manutenção de agentes infecciosos de caráter zoonótico. Os resultados aqui obtidos mostram a problemática da larga ocorrência de animais silvestres atropelados em nossas estradas, ao mesmo tempo em que enfatiza sobre o aproveitamento deste importante recurso biológico para o estudo da ocorrência ambiental de patógenos. / The family Trypanosomatidae consists several species of protozoans that cause diseases in humans and other animals. Leishmania spp. is responsible to cause leishmaniasis diseases and Trypanosoma cruzi cause Chagas disease. The domestic dog is considered the main reservoir of leishmaniasis, although wild animals can also be acting as reservoirs of trypanosomatids. The objective of the present study was to evaluate the occurrence of the Leishmania spp. and Trypanosoma spp in samples from wild animals from Santa Catarina State, using the molecular technique Polymerase Chain Reaction (PCR), in order to map and identify risk areas for human infection. A total of 1,063 tissue samples of lung, liver, spleen, skin and heart of 297 wild animals. Primers (LITST / L5.8S and LITSV / L5.8SR) were used for screening of Trypanosomatidae family, with samples from seven rodents were positive. In the research of L. infantum and T. cruzi specific primers were used, where all the samples were used, LCS1 / LCS3 and TCZ1 / TCZ2 respectively, all of which were negative. Sequencing was performed from the positive samples and nine samples from five animals showed similarity between 79% to 100% with Trypanosoma brucei (GenBank KX700175.1), Trypanosoma brucei gambiense (GenBank XM_011780373.1), Trypanosoma vivax (GenBank HE573020.1), Trypanosoma rangeli (GenBank KJ742907.1) and the genus Trypanosoma spp. The animals were, Oxymycterus sp. (marsh rat), Scapteromys sp. (water rat), Nectomys squamipes (water rat) and two Oligoryzomys sp. (bush rat). It is found that the location of the positive animals were near to the activities of industry, market and recreation, allowing the contact between animals and man, facilitating the maintenance of agents of infectious zoonotic diseases. The results obtained here show the problem of the frequent occurrence of road-killed wild animals in our roads, while emphasizing the use of this important biological resource to study the environmental occurrence of pathogens. It is found that the location of the positive animals. / Fapesp: 2015/17519-4

Orientador: João Aristeu da Rosa / Banca: Mara Cristina Pinto / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Resumo: Os membros da subfamília Triatominae são vetores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. Eles compreendem 144 espécies agrupadas em 18 gêneros e são encontrados principalmente nas Américas, desde o sul dos Estados Unidos ao sul da Argentina e Chile. Essencialmente a identificação desses insetos tem sido baseada na descrição comparativa da morfologia de indivíduos adultos incluindo as estruturas da genitália masculina e feminina, aspectos gerais do corpo como cabeça, tórax, antena e coloração, entre outros. Entretanto a distinção por critérios morfológicos apresenta limitações para caracterização de espécies do gênero Rhodnius devido às semelhança entre elas, especialmente entre R. prolixus, R. domesticus, R. robustus, R. neglectus, and R. nasutus, espécies conhecidas como "grupo prolixus". Nesse estudo as técnicas de biologia molecular, sequenciamento do gene 16S e PCR-RFLP, foram utilizados para caracterização de sete espécies de Rhodnius. Os produtos do sequenciamento do gene 16S das espécies R. brethesi; R. nasutus, R. nasutus, R. neglectus, R. pictipes; R. prolixus, R. robustus, e R. sp geraram alinhamento de 380 pares de bases com 48 sítios polimórficos. A visualização das bandas geradas pelas enzimas de restrição BstUI, HhaI, RsaI and Mbol com as sete amostras de Rhodnius possibilitou distingui-las com exceção de R. prolixus, R. neglectus e R.robustus. Os dois métodos feitos para as mesmas amostras confirmaram a validade da utilização do método PCR-RFLP para identificação de R. brethesi, R. nasutus, R. pictipes e R. sp, uma vez que o gene 16S já é um marcador estabelecido para as espécies de Rhodnius e as duas metodologias apresentaram os mesmos resultados, confirmaram também o trabalho realizado por Naegele et al. 2006 em que a técnica de PCR-RFLP distinguiu R. stale, R. pictipes, R. Prolixus and R. domesticus / Abstract: The members of the subfamily Triatominae are vectors of the protozoan Trypanosoma cruzi, which is the etiologic agent of Chagas disease. They consist of 144 species grouped into 18 genera and are found mainly in the Americas, from the southern United States to southern Argentina and Chile. Essentialy, the identification of these insects has been based on the comparative description of the morphology of adult specimens, including the structures of both the male and female genitalia, general body features like head, thorax, antennae and color, among others. However, this method is not particularly useful in the characterization of species belonging to the genus Rhodnius because they are very similar morphologically, specially R. prolixus, R. domesticus, R. robustus, R. neglectus, and R. nasutus, which are known as "prolixus complex". In this study molecular biology techniques, such as sequencing of 16S gene and PCR-RFLP, was used to contribute to the characterization of seven species of Rhodnius. The products of the sequencing of the 16S species R. brethesi; R. nasutus, R. nasutus, R. neglectus, R. pictipes; R. prolixus, R. robustus, and R. sp generated a alingment of 380bp with 48 polymorphic sites. The visualization of the bands arising from the use of restriction enzymes BstUI, HhaI, RsaI and Mbol with samples of seven species of Rhodnius possible to distinguish them except for R. prolixus, R. neglectus and R.robustus. The two methods performed in parallel for the same samples confirmed the validity of using the enzymatic method for specific identification of R. brethesi, R. nasutus, R. pictipes e R. sp, since the 16S gene is already an established marker for it and the two methods showed the same results, confirmed too the work performed by Naegele et al.2006 that the PCR-RFLP technic distinguished R. stale, R. pictipes, R. Prolixus and R. domesticus / Mestre

In this study the importance of prohibitin1 and prohibitin2 genes for Trypanosoma brucei was examined. RNA interference showed both of them essential for parasites to survive. Knocking down of these genes resulted in altered morphology of the mitochondrion, changes in membrane potential and shut down of mitochondrial translation. No changes were observed in levels of Reactive Oxygen Species and respiration. Both prohibitines are part of big complex present in the mitochondrion.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas, 2014. / Submitted by Eric de Oliveira Sousa (eriol.draven@gmail.com) on 2014-10-10T14:42:59Z No. of bitstreams: 1 2014_AdrianaJesusBenevidesAlmeidaGuimaraes.pdf: 3593637 bytes, checksum: 63d552687595edcf7270bbb18a6eb529 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-10T14:55:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AdrianaJesusBenevidesAlmeidaGuimaraes.pdf: 3593637 bytes, checksum: 63d552687595edcf7270bbb18a6eb529 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-10T14:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AdrianaJesusBenevidesAlmeidaGuimaraes.pdf: 3593637 bytes, checksum: 63d552687595edcf7270bbb18a6eb529 (MD5) / Morbidade e mortalidade em humanos infectados cronicamente com o Trypanosoma cruzi são observados em aproximadamente 30% dos infectados. Os fatores que selecionam esses chagásicos, entre todos os demais infectados, à aquisição da doença crônica são desconhecidos. Estudos de genética molecular demonstraram a transferência de sequências de minicírculos de kDNA do parasito para sítios específicos do genoma do hospedeiro. O sítio de integração identificado com maior frequência foi o retrotransposon LINE-1. Observou-se ainda que o kDNA pôde ser mobilizado para outros sítios do genoma pela atividade do LINE-1. Esses dados sugeriram a possibilidade de associação das variações clínicas da doença com as mutações no genoma. As mutações de kDNA se comportariam como força motriz da patogênese da cardiopatia chagásica. Neste estudo, foram avaliados 95 indivíduos do Pará, 36 voluntários de municípios de Minas Gerais e Goiás e 136 controles do Distrito Federal, com dados do eletrocardiograma, teste ergométrico, holter 24h e ecodopplercardiograma. Foram feitas análises estatísticas visando a associar esses dados clínicos com os achados de integração de kDNA em múltiplos loci na maioria dos cromossomos. Tendo a análise dos exames clínicos revelado que a maioria dos indivíduos da amostragem estava na fase indeterminada da infecção crônica pelo T. cruzi, sem alteração significativa nos exames, sem frequência elevada de alterações nos grupos de risco para desenvolvimento da doença, não foi possível associar qualquer mutação como valor preditivo para desenvolvimento da cardiopatia chagásica. Os resultados indicam o caráter benigno da evolução das infecções crônicas, na fase clinicamente indeterminada. Entretanto, esses achados não excluem a hipótese de associação das mutações com a patogênese da cardiopatia chagásica. Outros estudos clínico-epidemiológicos de médio e longo prazo são necessários para a identificação de fatores preditivos das manifestações cardíacas da doença de Chagas. / Morbidity and mortality in humans chronically infected with Trypanosoma cruzi are observed in approximately 30% among infected people. The factors of selection of chagasic, among the infected population, towards development of the chronic Chagas disease, are unknown. The studies on molecular genetics showed the transfer of the kDNA minicircle sequences from T. cruzi to the human host's genome. The kDNA integration loci were often identified in the LINE-1 retrotransposon. It was also observed that the kDNA mutations could be mobilized by the retrotransposon from the primary to a secondary site at the genome. These findings suggested the possibility of association of Chagas disease clinical manifestations with the kDNA integrations. In this regard, the kDNA mutations could be triggers of the pathogenesis of the chagasic cardiopathy. In this study, we evaluated 95 patients from the State of Para, 36 from counties of Minas Gerais and Goias, and 136 controls patients, from the Federal District, Brazil. The electrocardiogram, ergometric test, 24h recording electrocardiogram, and ecodopplercardiogram were analysed. The statistical analyses, which aimed at the association among the clinical findings with those of the integration of the kDNA at multiple sites at various chromosomes, were carried out. The evaluations of clinical parameters of the heart function showed majority all patients were in the undeterminate phase of the chronic chagasic infection, and no clinical manifestation. This observation explains why, in the absence of statistical differences among the groups of risk-patients, there was no demonstrable association. Therefore, it was not shown any particular loci of mutation as a predictive risk-factor for development of the Chagas cardiopathy. The result indicates the benign feature of the chronic chagasic infections, clinically undetermined. However, the findings in the undeterminate phase of the infection do not exclude the hypothesis of possible association of the kDNA mutations with the pathogenesis of the Chagas’ heart disease. Long range clinic-epidemiologic studies are necessary to identifying predictive factors of the clinic manifestation of the chronic Chagas disease.