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Editing and Modification of Threonyl-tRNAs in KinetoplastidsGaston, Kirk W. 11 September 2009 (has links)
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Development of Trypanosoma cruzi in cell cultures, with studies on the nature of the surface charge and the fine structure of the trypomastigote and epimastigote forms /Al-Abbassy, Sabah Naji January 1973 (has links)
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Zinco: Caracterização fenotípica de linfócitos T, e células T reguladoras durante a prenhez de ratas Wistar infectadas pela cepa Y de Trypanosoma cruzi / Zinc: Phenotypic characterization of T lymphocytes and regulatory T cells during pregnancy of Wistar rats infected with Y strain of Trypanosoma cruziCosta, Cássia Mariana Bronzon da 11 May 2017 (has links)
A doença de Chagas ou tripanossomíase americana é uma doença zoonótica, transmitida pelas fezes do inseto triatomíneo, pertencente à família Reduviidae, subfamília Triatominae. Estima-se que 8 milhões de pessoas estejam infectas por T. cruzi em todo o mundo e 25 milhões de pessoas estejam sob o risco de infecção. Durante a prenhez, a demanda de zinco no organismo é aumentada, razão pela qual as mulheres grávidas são mais suscetíveis a apresentarem déficit deste micronutriente. O zinco é um oligoelemento com função essencial no crescimento, desenvolvimento, diferenciação celular e sistema imunológico. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência do zinco na ativação de diferentes compartimentos do sistema imune em ratas Wistar prenhas infectadas pela cepa Y de T. cruzi. Foram utilizados 4 grupos experimentais: prenhas infectadas sem tratamento (PI), prenhas infectadas tratadas com sulfato de zinco (PIZ), prenhas controles sem tratamento (PC), prenhas controles tratadas com sulfato de zinco (PCZ). Fêmeas do grupo infectado foram acasaladas trinta dias após a infecção e o tratamento com zinco (20 mg/kg/dia) foi efetuado durante 18 dias. Os animais foram eutanasiados no 18° dia da prenhez (48°dia da infecção). Foram avaliados os seguintes parâmetros: população de macrófagos, produção de nitrito e expressão de RT1B (MHC II) no lavado peritoneal; proliferação de linfócitos (CFSE), perfil apoptótico (anexina V e iodeto de propídeo), expressão fenotípica de linfócitos CD161+, CD3+CD161+, TCD3+CD4+, TCD3+CD8+, expressão de CD11a+, CD28+, células apresentadoras de antígenos CD11b/c+, moléculas coestimulatórias, CD80+,CD86+, linfócito B (CD45RA), células T reguladoras TCD3+CD4+CD25+Foxp3high, perfil de memória CD62L/CD44high. Também foram avaliadas citocinas intracelulares produzidas por linfócitos esplênicos (IL-4, IL- 10, IFN-?, TNF-? e quimiocina MCP-1), citocinas do soro (IL- 2, IL- 4, IL- 6, IL- 10, IL- 12, IL- 17, TGF- ?, INF-? e TNF-?), corticosterona plasmática, zinco sérico, e análise molecular de amostras fixadas (coração, placenta e fetos) para detecção de DNA ii genômico de T. cruzi. Nossos resultados mostraram que o tratamento com zinco aumentou as concentrações de nitrito e expressão de RT1B em macrófagos. Por outro lado, observou-se uma diminuição no perfil de proliferação de esplenócitos e no percentual de células em apoptose. Em relação às populações de linfócitos, o tratamento com zinco diminuiu o percentual de células NKT+, TCD4+, TCD8+ e Treg. Foi possível observar ainda, uma diminuição na produção de TNF-? e IFN-?, e aumento de IL-17 e TGF-?. Desta forma, os resultados mostraram que o zinco exerce papel modulador nos diferentes parâmetros imunológicos em ratas prenhas infectadas com T. cruzi / Chagas disease or American trypanosomiasis is a zoonotic disease, transmitted by the feces of the triatomine insect, belonging to the Reduviidae family, Triatominae subfamily. It is estimated that 8 million people worldwide are infected with T. cruzi and 25 million people are under risk of infection. During pregnancy, an increased demand for zinc is observed, reason why pregnant women are more likely to have a deficit in this micronutrient. Zinc is a trace element which plays an essential function during growth, development, cellular differentiation and immune response. Thus, the goal of this study was to evaluate the influence of zinc on the activation of different compartments of the immune system in pregnant Wistar rats infected with T. cruzi Y strain. Four experimental groups were used: infected pregnant without treatment (PI) and infected pregnant treated with zinc sulfate (PIZ), pregnant controls without treatment (PC), pregnant controls treated with zinc sulfate (PCZ). Females from infected group were mated 30 days post infection and treatment with zinc (20mg/kg/day) was performed for 18 days. Animals were euthanized on the 18th day of pregnancy (48th day of infection). The following parameters were evaluated: macrophages subsets, nitrite production and RT1B (MHC II) expression in the peritoneal exudate; Lymphocyte proliferation (CFSE), apoptotic profile (annexin V and propidium iodide), phenotype expression of CD161+ lymphocytes, CD3+ CD161+, TCD3+ CD4+, TCD3+ CD8+, CD11a+, CD28+, CD11b/c+, CD45RA, TCD3+ CD4+ CD25+ Foxp3high regulatory T cells, CD62L/CD44high memory profile. Intracellular cytokines produced by splenic lymphocytes (IL-4, IL-10, IFN-?, TNF-? and MCP- 1 chemokine), serum cytokines (IL-2, IL-4, IL- 10, IL-12, IL-17, TGF-?, INF-? and TNF-?), plasma corticosterone, serum zinc, and molecular analysis of fixed samples (heart, placenta and fetuses) for detection of T. cruzi genomic DNA. Our results demonstrated that zinc treatment increased nitrite concentrations and RT1B expression in macrophages. On the other hand, there was a decrease in splenocytes proliferation and in the percentage of apoptosis. Furthermore, zinc therapy decreased the percentage of NKT+, TCD4+, TCD8+ and Treg cells. Besides, zinc treatment decreases TNF-? and IFN-? and increase IL-17 and TGF-? production. Indeed, our results demonstrated that actually zinc exerts a modulatory role on the different immune responses as well as cellular subsets from T. cruzi infected and pregnant rats.
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Estudos biofísicos da proteína P21 de Trypanosoma cruzi / Biophysical studies on protein P21 of Trypanosoma cruziTeixeira, Francesco Brugnera 19 March 2019 (has links)
Segundo a Organização Mundial da Saúde, em 2018, entre 6 e 7 milhões de pessoas estavam infectadas pelo parasita Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas. Dentre as piores consequências para os chagásicos estão os problemas cardíacos causados pela infecção, os quais afetam cerca de 25% dos pacientes na fase crônica da doença. Na busca por biomoléculas envolvidas no processo de invasão celular pelo parasita, uma proteína produzida por ele, denominada P21, foi encontrada. Ensaios biológicos mostraram que a proteína P21 de T. cruzi interage com o receptor de quimiocinas CXCR4 e desencadeia diversos processos bioquímicos, como: indução de fagocitose por macrófagos, indução da polimerização de actina e inibição de angiogênese. Os dados sugerem que a P21 também pode desempenhar um papel na cardiomiopatia induzida pelo parasita. Visando contribuir com a caracterização biofísica e estrutural da proteína P21, foi desenvolvido um protocolo para sua obtenção a partir de corpos de inclusão e reenovelamento, o qual forneceu quantidades necessárias da proteína para os experimentos. Espectros de ressonância Magnética Nuclear (RMN) permitiram avaliar de forma precisa a qualidade estrutural da amostra reenovelada frente a proteína P21 produzida de forma solúvel. Resultados de RMN mostraram também que a proteína possui cinco hélices-α em sua estrutura secundária, uma grande porção desestruturada, além de duas populações conformacionais em equilíbrio. Ainda, corroborando com os dados biológicos encontrados na literatura, um ensaio de interação in vitro indicou que a P21 interage com o receptor CXCR4, sendo a porção N-terminal deste receptor a região envolvida em tal processo. / According to the World Health Organization, in 2018, between 6 and 7 million people were still infected by the parasite Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. One of the worst aggravations for chagasics is heart disorder caused by the infection, which affects about 25% of patients in the chronic phase of the disease. Searching for biomolecules involved in the parasitic invasion of human cells, a T. cruzi protein called P21 was found. It has a high probability of being secreted or anchored to the membrane. Biological assays have shown that T. cruzi P21 interacts with the CXCR4 chemokine receptor and mediates several biochemical processes, such as: induction of phagocytosis by macrophages, induction of actin polymerization and inhibition of angiogenesis. The data suggests that P21 may also play a role in cardiomyopathy induced by parasite. In order to contribute to the biophysical and structural characterization of P21, a refolding protocol was developed to obtain P21 from inclusion bodies. The protocol provided the necessary amounts of protein required for the experiments. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectra allowed to accurately evaluate the structural quality of the refolded sample in comparison to the produced soluble P21 protein. NMR spectra also showed five α-helices in the P21 secondary structure, a large unstructured portion and two ensembles of structures in equilibrium. Furthermore, corroborating with the biological data found in the literature, an in vitro interaction assay indicated that P21 interacts with CXCR4 via the N-terminal portion of the receptor.
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Grelina: possíveis efeitos cardioprotetores e imunomoduladores na doença de Chagas experimental aguda / Ghrelin: possible cardioprotective and immunomodulatory effects in acute experimental phase of Chaga\'s diseaseSilva, Ferdinando de Paula 28 April 2017 (has links)
A doença de Chagas, causada por um protozoário flagelado denominado Trypanosoma cruzi, acomete milhares de pessoas ao redor do mundo. O tratamento continua parcialmente ineficaz, envolvendo terapias específicas dirigidas ao parasita assim como terapias adjuvantes em conduta para as manifestações clínicas. No Brasil, o benzonidazol (N-benzil-2-nitroimidazol-1-acetamida) vem sendo o único medicamento disponível para o tratamento etiológico da doença, porém pode causar efeitos colaterais aos pacientes infectados. Há emergente necessidade de avaliar o potencial de novas drogas para modular o sistema imune em resposta a agressão parasitária. A grelina tem demonstrado, em estudos recentes, ser uma importante substância com função cardioprotetora, vasodilatadora, anti-apoptótica e antioxidativa. No entanto, pouco se sabe da ação imunomoduladora da grelina na doença de Chagas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos cardioprotetores e imunomoduladores da grelina em ratos Wistar machos infectados pela cepa Y de T. cruzi. Foram analisados os seguintes parâmetros: quantificação dos parasitas sanguíneos e teciduais, análise de marcadores celulares (CD3+, CD4+, CD8+, NK, NKT, CD45RA+, macrophage e RT1B+) e produção de óxido nítrico. Além disso, outros parâmetros foram analisados, entre eles, os ensaios de linfoproliferação, apoptose de esplenócitos e avaliação de registros eletrocardiográficos. A grelina por si só não ocasionou uma diminuição da parasitemia sanguínea, tecidual ou na quantificação de óxido nítrico, porém exerceu com maestria sua ação anti-apoptótica e antiinflamatória conferindo redução do processo inflamatório cardíaco e da destruição tecidual. A associação com benzonidazol não proporcionou uma potencialização da resposta imune / Chaga\'s disease, caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, affects thousands of people around the world. The treatment remains partially ineffective, involving targeted therapies directed to the parasite as well as adjuvant therapies for the clinical manifestations. In Brazil, the benzonidazole (N-benzyl-2-nitroimidazol-1- acetamide) is the only drug available for the etiological treatment of the disease, with several side effects. There is an emerging need to evaluate potential new drugs to modulate the immune system against the parasitic aggression. Ghrelin a peptide hormone has been pointed as a substance with important cardioprotective, vasodilatory, anti-apoptotic and anti-oxidative functions. The lack of literature concerning to the immunomodulatory action of ghrelin in Chagas\' disease, turns this work inedit. For that, the objectives of this study was to evaluate the cardioprotective and immunomodulatory effects of ghrelin in male Wistar rats infected with the Y strain of T. cruzi. The following parameters were analyzed: quantification of blood and tissue parasites, analysis of cell markers (CD3+, CD4+, CD8+, NK, NKT, CD45RA+, macrophage and RT1B+), nitric oxide production, lymphoproliferation assays, splenocyte apoptosis and evaluation electrocardiographic records. Ghrelin alone did not exert any action in reducing blood or tissue parasitemia, as well as the nitric oxide quantification, but it exerted with mastery its anti-apoptotic and antiinflammatory actions triggering a reduction of the cardiac inflammatory process and tissue destruction. The combination with benzonidazole did not provide a synergic action of the immune response
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Investigação da reatividade de complexos metálicos com ligantes bases de Schiff frente a infecções parasitárias / Investigations on the reactivity of metal complexes with Schiff-base ligands towards parasite infectionsSabino, Gustavo Levendoski 19 November 2014 (has links)
Ligantes oxindolimínicos foram sintetizados através de procedimentos já desenvolvidos em nosso laboratório, a partir do 2,3-dioxindol (isatina) e aminas ou diaminas selecionadas, e em seguida metalados. Foram investigados dois complexos de cobre(II) com os ligantes isaepy, preparado a partir de 2-(2-aminoetilpiridina) e isapn, a partir de 1,2-diaminoetano, e os correspondentes complexos de zinco(II). Após caracterização por diversas técnicas, sua reatividade com relação a biomoléculas (HSA e DNA) foi verificada, através de medidas de fluorescência e dicroísmo circular. Posteriormente, sua reatividade antiparasitária frente a T. cruzi foi testada. Todos eles apresentaram atividade tóxica frente às formas tripomastigota e amastigota do parasita, com índices de seletividade bastante promissores, quando comparados à droga atualmente em uso (benzonidazol) e outras alternativas descritas na literatura. Anteriormente estes complexos já haviam demonstrado atividade pró-apoptótica frente a diversas células tumorais, baseado em sua capacidade de gerar espécies reativas (EROs) e de inibir proteínas específicas, como a topoisomerase humana IB. Os resultados aqui obtidos deram origem a um pedido de patente (BR10 2013 026558-6, depositado junto ao INPI em 15/outubro/2013) visando o possível desenvolvimento de novos fármacos para a doença de Chagas. / Oxindolimine ligands were synthesized by procedures previously developed in our laboratory, from 2,3-dioxoindole(isatin) and amines or selected diamines, by condensation reactions, followed by metallation. Two copper(II) complexes with isaepy and isapn ligands, prepared from 2-(2-aminoethylpiridine) and 1,2-diaminoethane respectively, and their corresponding complexes of zinc(II) were investigated. After characterization by various techniques, their reactivity with respect to biomolecules (HSA and DNA) was verified, through measurements of fluorescence and circular dichroism. Subsequently, their antiparasitary reactivity against T. cruzi was tested. All complexes tested presents toxic activity against trypomastigote and amastigote forms of the parasite, with promising selectivity index, compared to drugs currently in use (benznidazole) and other alternative compounds described in literature. Previously, these complexes had shown pro-apoptotic activity against several tumor cells, based on their ability to generate reactive species and inhibit specific proteins, such as topoisomerases. The results obtained here gave rise to a patent application (BR10 2013 026558-6, deposited on INPI in October 15th, 2013), looking for a possible development of new drugs for Chagas disease.
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Ações imunomoduladoras da prolactina durante a fase aguda da Doença de Chagas experimental / The immunomodulatory effects of prolactin during the acute phase of experimental Chagas\' diseaseFilipin, Marina Del Vecchio 26 April 2013 (has links)
Durante a infecção por Trypanosoma cruzi, o sistema endócrino exerce importante influência no direcionamento da resposta imune do hospedeiro. A prolactina é um dos diversos hormônios envolvidos em uma série de complexas interações com o sistema imunológico, participando diretamente do processo de imunorregulação. As pesquisas relacionadas com a administração de hormônios em modelos experimentais infectados por T. cruzi visam comprovar a modulação dos mecanismos de defesa por estas substâncias e contribuem para a busca de novas terapias auxiliares e melhorias no tratamento convencional da Doença de Chagas. O objetivo deste trabalho foi elucidar o papel da prolactina na modulação do sistema imune durante a fase aguda da doença de Chagas experimental, através da administração desta substância em ratos Wistar jovens infectados com a cepa Y de T.cruzi. O envolvimento e o perfil de ativação das células de defesa durante a infecção aguda foram analisados, utilizando-se ensaios de linfoproliferação, apoptose de linfócitos e análise de marcadores celulares. Além disso, outros parâmetros imunológicos também foram avaliados, entre eles, citocinas intracelulares IFN-?, TNF-?, IL-4 e IL-10, quimiocina MCP-1 e óxido nítrico. Os animais submetidos ao tratamento com prolactina apresentaram redução significativa na parasitemia sanguínea, bem como diminuição na apoptose celular e elevados percentuais de células essenciais na resposta imune do hospedeiro frente ao parasita. Desta forma, os dados obtidos neste trabalho demonstram os efeitos estimulatórios da prolactina e corroboram a ideia da utilização de substâncias imunomoduladoras no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, que possam promover o equilíbrio da resposta imune do hospedeiro frente à infecção, prevenindo os possíveis danos teciduais observados tanto na fase aguda como crônica da doença de Chagas. / During the course of infection by Trypanosoma cruzi, the host immune system is involved in distinct, complex interactions with the endocrine system, and prolactin (PRL) is one of several hormones involved in immunoregulation. Numerous studies have demonstrated that the modulation of the immune system with the administration of regulatory hormones in different experimental models infected with T. cruzi, are very important inciting the investigation of new therapies for Chagas\' disease. The role of PRL as a possible factor in the modulation of the immune response was the target of this study using as animal model young rats infected with the Y strain of T. cruzi, in the attempt to demonstrate the relationship between the neuroendocrine system and the immune response involved in the acute phase of the experimental Chagas\' disease. For this purpose, some immune parameters were analyzed: dosages of cytokines IFN-?, TNF-?, IL-4, IL-10 and chemokine MCP-1, phenotypic analysis of cell subsets by flow cytometry, production of nitric oxide, lymphoproliferation and apoptosis of splenocytes. Therapy with PRL caused a significant decrease in parasitemia during the acute phase. PRL also triggered an increase in the percentage of cells of the innate and adaptive immune response and decreased apoptosis. Thus, the data obtained in this study corroborate the idea of using substances such as PRL in the development of new therapeutic strategies that can modulate the inflammatory response, contributing to the balance of the host body against infection, preventing the possible tissue damage observed in both acute and chronic Chagas\' disease.
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Papel da asparagina em diferentes processos na biologia de Trypanosoma cruzi. / The asparagine role in different biological processes in the Trypanosoma cruzi.Araujo, Rosana Beatriz Duque 11 June 2014 (has links)
Chagas disease, is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. The available chemotherapy is restricted to two compounds: Nifurtimox and Benzonidazol. The T. cruzi life cycle occurs among invertebrate and vertebrate hosts and its survival strongly depends on its ability to catabolise both, carbohydrates and amino acids to obtain energy. The amino acids have an important role in several biological processes in this parasite. In this context, we studied the L-asparagine (Asn) relevance in the metabolism, differentiation and stress resistance of the T cruzi. Our results have shown that epimastigotes use Asn as carbon source, and contributes with the resistance to nutritional and oxidative stress. The Asn also showed a positive influence in metacyclogenesis and supported the ATP synthesis. Finally, the absence of Asn interfered with the proliferation of the replicative forms of T. cruzi. Taken together, our results suggest the involvement of the Asn metabolism in the protection of T. cruzi when submitted to different stress conditions. / Chagas disease, is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. The available chemotherapy is restricted to two compounds: Nifurtimox and Benzonidazol. The T. cruzi life cycle occurs among invertebrate and vertebrate hosts and its survival strongly depends on its ability to catabolise both, carbohydrates and amino acids to obtain energy. The amino acids have an important role in several biological processes in this parasite. In this context, we studied the L-asparagine (Asn) relevance in the metabolism, differentiation and stress resistance of the T cruzi. Our results have shown that epimastigotes use Asn as carbon source, and contributes with the resistance to nutritional and oxidative stress. The Asn also showed a positive influence in metacyclogenesis and supported the ATP synthesis. Finally, the absence of Asn interfered with the proliferation of the replicative forms of T. cruzi. Taken together, our results suggest the involvement of the Asn metabolism in the protection of T. cruzi when submitted to different stress conditions.
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Síntese de derivados do fator de agregação plaquetária imobilizados em resina e identificação do correspondente receptor em Trypanosoma Cruzi / Resin-immobilized synthesis of platelet agregation factor analogs and identification of Trypanosoma cruzi correlative receptorKawano, Daniel Fabio 27 September 2010 (has links)
Buscando sintetizar análogos de PAF imobilizados em resina para isolamento dos correspondentes receptores T. cruzi, foi adotada uma estratégia de síntese convergente que implicava no acoplamento à resina de uma cadeia hidrofóbica análoga à presente no fosfolipídio. Através de modificação sequencial do reagente comercial D-Manitol para sua ligação à resina, os análogos seriam sintetizados em um total de 12 etapas. Após a obtenção com sucesso do primeiro intermediário e de dificuldades na obtenção do segundo intermediário, a preparação de derivados de PAF a partir de D-Manitol foi abandonada já que revisão da literatura demonstrou ser possível a síntese destes mesmos análogos em apenas cinco etapas. A nova rota sintética adotada teve como ponto de partida a fosfatidilcolina extraída de gemas de ovos e, através desta nova abordagem, foram sintetizados com sucesso três intermediários. Devido a dificuldades na adaptação de protocolos sintéticos clássicos a compostos carregados como os fosfolipídios, não foi possível a obtenção dos derivados de PAF inicialmente propostos. Os estudos de bioinformática, os quais visaram localizar a sequencia deste provável receptor de PAF no proteoma do parasita, sugerem a existência de proteínas com características de receptores de membrana acoplados à proteína G (GPCRs) e entre estas, possivelmente receptores de PAF a serem explorados na terapia da doença de Chagas. / In order to synthesize resin-immobilized PAF analogs to further promote the isolation of the T.cruzi correlative receptor, we adopted a convergent synthesis strategy. The strategy implied the coupling between the resin and a hydrophobic chain resembling PAF, in which resin-immobilized PAF analogs would be synthesized by means of sequencial 12 step modification of commercially available reagent D-manitol. Despite successful achievement of the first intermediary, the synthesis of the second intermediary was accompanied by difficulties which led to an extensive literature review and subsequent change of synthetic route. The preffered route was a 5 step approach with egg phosphatidilcholine as the starting material, which rendered the successful synthesis of three intermediates. However, due to difficulties to adapt classical synthetic protocols to charged compounds as phospholipids, we could not obtain the initially proposed PAF analogs. Bioinformatic studies were conducted in order to locate the aminoacid sequence of the probable PAF receptor in T.cruzi proteome. Our data suggest the existence of a receptor resembling G protein coupled membrane receptors (GPCRs), which probably include PAF receptors, which, in turn, might be a potential target to the treatment of Chagas disease.
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Expressão diferencial de genes em cepas de Trypanosoma cruzi pela técnica de microarranjos de DNA / Differential gene expression in Trypanosoma cruzi strains by microarrays DNA technologyBaptista, Cassio da Silva 10 September 2004 (has links)
Com o objetivo de analisar a expressão diferencial de genes em cepas de Trypanosoma cruzi pela técnica de microarranjos de DNA, construímos um protótipo de lâminas contendo 710 etiquetas de seqüências transcritas (ESTs) de epimastigotas de CL Brener e 20 genes de várias cepas do parasita. A seqüência nucleotídica estava disponível para 576 ESTs. Desta forma, seqüenciamos as 134 ESTs restantes e sua seqüência foi depositada no dbEST do GenBank. O agrupamento das sondas indicou que a lâmina continha 665 seqüências únicas. Inicialmente, avaliamos o microarranjo para a análise de genômica comparativa entre as cepas CL Brener (T. cruzi II) e Silvio (T. cruzi I). Um total de 4 hibridizações foram realizadas. Verificamos, com uma significância estatística (P≤ 0,01 no teste-t) que 31 seqüências do microarranjo (4,3%) apresentaram maior sinal de hibridização com o DNA de CL Brener, enquanto 37 sondas (5,0%) apresentaram situação inversa. Esse resultado sugere diferenças no número de cópias gênicas e/ou variação na similaridade das seqüências. Várias sondas com hibridização diferencial foram confirmadas em experimentos de Southern blot com DNA genômico dos dois isolados. Em seguida, o microarranjo foi avaliado para a análise da expressão diferencial de genes. Para isto, a lâmina foi hibridizada com cDNA de formas epimastigotas (fase midlog de crescimento) de CL Brener e Silvio. Um total de 8 experimentos de hibridização foi realizado com preparações de RNA obtidas de três cultivos independentes. Identificamos, com uma significância estatística (P≤ 0,01), 84 sondas (84/730; 11,5%) diferencialmente expressas: 35 sondas mais expressas em Silvio e 49 sondas mais expressas em CL Brener. Algumas destas sondas foram confirmadas por Northern blot. A comparação dos dados dos experimentos de hibridização do microarranjo com DNA e cDNA das duas cepas permitiu concluir que não há uma correlação direta entre a abundância de determinado ene e seu nível de expressão. Em alguns casos, observamos que seqüências com maior hibridização com o DNA de uma cepa são mais expressas na outra. Visando iniciar os estudos de expressão diferencial de genes em cepas isoladas de pacientes chagásicos, escolhemos as cepas Famema e Hem 179 (T. cruzi II), isoladas, respectivamente, de um paciente com a forma indeterminada da doença de Chagas e de um paciente com alterações cardíacas e digestivas. Observamos que aproximadamente 2,5% (18/730) das sondas apresentaram expressão diferencial nas formas epimastigotas das duas cepas e que 9,0% (65/730) das sondas mostraram razões de hibridização diferente nas formas infectantes (tripomastigotas metacíclicos). Algumas destas sondas foram confirmadas por Northern blot. Entre as sondas mais expressas em Hem 179, está a seqüência que codifica a subunidade 7 da NADH desidrogenase (ND7). O conjunto de dados permitiu concluir que microarranjos contendo predominantemente ESTs de CL Brener são uma ferramenta útil para estudos de genômica comparativa, análise de expressão gênica em isolados de T. cruzi, bem como para a descoberta de novos genes. Além disto, este estudo indicou uma regulação pós-transcricional intensa dos níveis de RNA em T. cruzi. Ampliamos os estudos para um maior número de cepas e construímos outro microarranjo contendo 710 ESTs de CL Brener (forma epimastigota), 45 ESTs da cepa Tulahuen (forma amastigota) e 32 genes de várias cepas do parasita. As 787 seqüências representam 714 seqüências únicas. O RNA total foi isolado de formas epimastigotas de cepas de três pacientes com a forma cardíaca (cepas 115, B13 e 147), e de três pacientes assintomáticos (cepas VL10, Famema e Berenice 62). Cinco da seis cepas são de regiões endêmicas de Minas Gerais (exceto Famema que é do estado de São Paulo). Após hibridização competitiva, a análise estatística dos dados indicou expressão diferencial de 14 sondas (14/787; 17,7%) entre os dois grupos de cepas. Destas, 9 sondas estão induzidas em todas as cepas isoladas de pacientes cardíacos e 4 sondas estão reprimidas em todas as cepas de cardíacos quando comparadas com as cepas de assintomáticos. Dentre as sondas mais expressa em cepas de cardíacos estão: as ESTs que codificam a subunidade 7 da NADH desidrogenase (ND7), a aspartato aminotransferase, enzima importante no processo de regeneração de metionina, e a triparedoxina peroxidase de T. cruzi, envolvida na resistência a peróxidos exógenos. Também foram reveladas 8 ESTs que não apresentam similaridade em bancos de dados. Parte destas sondas foi confirmada por Northern blot com RNA total de todas as cepas. Em alguns casos, identificamos diferenças do tamanho de transcritos entre as cepas. Em resumo, a análise da expressão diferencial de genes em cepas de pacientes com a forma cardíaca e indeterminada da doença de Chagas permitiu identificar alguns genes que podem estar relacionados à patogênese e/ou serem usados como alvo para o prognóstico da evolução doença. Posteriormente, realizamos um experimentos-piloto para investigar a resposta transcricional de fibroblastos humanos em cultura à infecção com duas cepas de T. cruzi: VL10 (isolada de indivíduo assintomático) e 147 (isolada de indivíduo com cardiopatia severa). Após 24 horas de infecção, os RNAs das monocamadas foram extraídos. No mesmo período, RNA foi extraído de fibroblastos humanos não infectados e usado como referência. Experimentos de hibridização competitiva foram realizados em lâminas de microarranjo contendo oligonucleotídios derivados de 24.000 genes humanos, construídas o Laboratório de Tecnologia Molecular do Instituto Nacional do Câncer do NIH, em Frederick, EUA chefiado pelo Dr. David Munroe. Identificamos 28 sondas diferencialmente transcritas nas células infectadas com a cepa 147 (paciente cardíaco). Destas, 27 sondas (27/28; 96,4%) estão com expressão reduzida nas células infectadas. Por outro lado, apenas uma sonda, correspondente ao gene da \"heme oxigenase (decycling) 1\", apresentou indução nas células infectadas com 147. Na infecção de células com a cepa VL10, encontramos 17 sondas diferencialmente transcritas. Destas, 16 sondas (16/17; 94,1 %) estão com expressão aumentada nas células infectadas (dentre elas, a heme oxigenase), enquanto que apenas uma sonda (proteína 5 ligante do fator de crescimento do tipo insulina) mostra situação inversa. Concluímos que as diferenças de resposta da mesma célula hospedeira à infecção pelas duas cepas são marcantes, o que determina um estudo temporal ao longo da infecção para a confirmação das observações acima. Comprovamos por PCR em tempo real o aumento da expressão da heme oxigenase na infecção pelas duas cepas e repressão da expressão da proteína 5 ligante do fator de crescimento do tipo insulina apenas em células infectadas por VL10. / To investigate differential gene expression in Trypanosoma cruzi strains by microarray DNA technology, we have constructed a prototype slide that contains 710 expression sequence tags (ESTs) of CL Brener epimastigotes and 20 genes of various parasite strains. The nucleotide sequence was available for 576 ESTs. Therefore, we have sequenced 134 additional ESTs and the sequences have been deposited in dbEST of GenBank. Clustering of these probes indicated that slide contains 665 unique sequences. Initially, we have evaluated the microarray for comparative genomic analysis between CL Brener (T. cruzi II) and Silvio (T. cruzi I) strains. Four independent experiments were performed. We verified that 31 probes (4.3%) showed statistical significant (P≤, 0.01 in t-test) higher hybridization with CL Brener DNA, whereas 37 probes (5.0%) showed the inverse situation. This suggests differences in the abundance of the genes in the genomes of the strains and/or variation in sequence similarity. Some of these probes were confirmed by Southern blot with genomic DNA of both strains. Next, we evaluated the microarray for the analysis of differential gene expression. For this purpose, the slide with hybridized with cDNA obtained from epimastigote forms in mid-log growth phase of CL Brener and Silvio strains. A total of eight hybridization experiments were perfonned with RNA preparations obtained from three independent parasite harvests. We identified 84 probes (841730; 11.5%) that showed statistically significant changes (P≤, 0.01 in t-test) in expression: 35 probes up regulated in Silvio and 49 probes up regulated in CL Brener. Some of these probes were confirmed by Northern blot. When we compared the data of the hybridization of the microarray with genomic DNA and cDNA of CL Brener and Silvio, we verified no correlation between the putative abundance of a particular gene and its expression level. In a few cases, we noticed that sequences with higher hybridization with genomic DNA of one strain were more expressed in the other. In an initial attempt of investigate differential gene expression in human T. cruzi isolates, we selected the strains Famema and Hem 179 (both T. cruz II), obtained, respectively, from an asymptomatic individual and from a patient with severe cardiopathy and digestive disorders. Differential expression of 2.5% (181730) and 9.0% (651730) of the probes was observed, respectively, in epimastigotes and metacyclic trypomastigotes of the two strains. Some of the probes were confirmed by Northern blot. Among the probes more expressed in Hem 179 is the gene encoding subunit 7 of theNADH dehydrogenase (ND7). We concluded that microarrays, containing predominantly ESTs of CL Brener, are a powerful tool for comparative genomics and gene expression analyses in T. cruzi as well as for discovery of new genes. In addition, this study has provided further evidence for a high level of post-transcriptional regulation of RNA abundance in T. cruzi. We have extended the analysis to a larger number of strains and constructed a new set of microarray slides, which contain 710 ESTs of CL Brener epimastigotes, 45 ESTs Tulahuen strain amastigotes and 32 characterized genes of various strains. These probes represent 714 unique sequences. Total RNA was extracted from mid-log phase epimastigotes of three strains isolated from patients with cardiac disorders (115, B13 and 147) and three strains from asymptomatic patients (VL10, Famema and Berenice 62). Five of these strains are from endemic areas of Minas Gerais (except Famema that is from the state of São Paulo). After competitive hybridization with the microarray, statistical analysis of the data indicated differential expression of 14 probes (14/787, 17.7%) between the two groups of strains. Among these sequences, 9 probes are up regulated in all the strains from cardiac patients and 4 probes are down regulated in all these strains as compared with all the strains isolated from asymptomatic individuals. Among the probes up regulated in the strains from cardiac patients there are ESTs encoding subunit 7 of the NADH dehydrogenase (ND7); aspartate aminotransferase, key enzyme in the methionine regeneration process; and T. cruzi tryparedoxin peroxidase, an important enzyme for resistance to exogenous peroxides. Eight ESTs with no similarity matches in databases were also disclosed. Some of these probes were confirmed by Northern blot assays with RNA of all the strains. In some cases, we noticed differences of the molecular size of the transcripts among the strains. In summary, the analysis of differential gene expression in strains isolated from human chagasic patients with the cardiac and indeterminate forms allowed the identification of some potential genes that may be related to pathogenesis and/or may be used as targets for prognosis of the evolution of Chagas disease. Subsequently, we performed a pilot experiment to investigate the transcriptional response of human fibroblasts in culture to the infection by two T. cruzi strains: VL10 (isolated from an asymptomatic patient) and 147 (isolated from a patient with severe cardiomyopathy). After 24 hours of infection, total RNA was extracted from the infected monolayers. In the same period, RNA was extracted from not infected human fibroblasts, and used as a control. Competitive hybridization experiments were performed in microarray slides containing oligonucleotides representing 24,000 human genes, constructed in the Laboratory of Molecular Technology of the National Institute of Cancer of N1H, in Frederick, EUA headed by Dr. David Munroe. We identified 28 probes differentially transcribed in cells infected with 147 strain. Of these, 27 probes (27/28; 96.4%) were down regulated in the infected celIs, and only one probe, corresponding to the heme oxygenase (decycling) 1 gene, showed up regulation. For the fibroblast infected with VL 10 strain, we found 17 probes differentially transcribed. Of these, 16 probes (16/17; 94.1%) were up regulated (among these probes there is the heme oxigenase sequence), and only one probe (insulin-like growth factor binding protein 5) showed the inverse situation. We concluded that there are drastic differences in the response of the same cell line to the infection by two parasite stmins. This determines that a temporal analysis of gene expression during the infection process should be performed to corroborate the above observations. The increase of heme oxigenase transcripts in fibroblasts infected by the two strains was comrrmed by real time-PCR This methodology also confirmed down-regulation of the insulin-like growth factor binding protein 5 rnRNA in fibroblasts infected with VL 10 strain.
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