This master’s thesis is bent on comparison of four newest method of analog frequency filter design. After the introductory part, a description of properties and internal structure of active elements (Second-Generation Current Conveyor), VG-CCII (Variable Gain Current Conveyor), VCG-CCII (Voltage and current gained second generation current conveyor) a CFTA (Current Follower Transconductance Amplifier) is mentioned. This active elements are used in subsequent design. At the next part, process of frequency filters design by generalized method of filter design flowing from the full admittance network, by extending autonomous circuits, design using the signal flow graphs theory and design with synthetic high-order elements are presented. Thirty nine autonomous circuits are derived from full admittance networks with one and two active elements CFTA. Selected autonomous circuits are used for direct design of frequency filter and for filter design by extending autonomous circuits. Produced structures guarantee the possibility of controlling the quality factor Q0 independently of the characteristic frequency f0. Three frequency filters are designed by method using the signal flow graph theory. Active elements CFTA, VG-CCI and VCG-CCII are used. Full multifunctional frequency filter with conveyors VG-CCII and VCG-CCII guarantee the possibility of controlling the quality factor Q0 and the characteristic frequency f0 independently of the each other. In last part, from 2nd to 5th order low-pass filters by the method using synthetic high-order elements are designed. The behaviour of the selected filters has been verified by simulations in the PSpice program for all of the mentioned methods separately.

Kovalente posttranslationale Modifikationen (PTMs) beeinflussen die Struktur und Funktion von Proteinen. Zu den bedeutendsten PTMs zählt die Proteinphosphorylierung. Labile Phosphorylierungen an Cystein- und Lysinresten, sowie Pyrophosphorylierungen an Serin- und Threoninbausteinen sind vermehrt in den Fokus der Wissenschaft gerückt. Trotz großer Fortschritte auf dem Gebiet der Massenspektrometrie (MS) bleibt die Analyse dieser empfindlichen Modifikationen mittels Tandem-MS eine große Herausforderung. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass Elektronentransferdissoziation (ETD) in Kombination mit zusätzlicher HCD Aktivierung (EThcD) in der Lage ist, Peptide mit labilen Phosphorylierungen in der Seitenkette unter Erhalt der Modifikation zu fragmentieren. In verschiedenen proteomischen Ansätzen wird demonstriert, dass EThcD eine zweifelsfreie Identifizierung natürlich vorkommender Cysteinphosphorylierungen ermöglicht. Darüber hinaus wurde unter dem Gesichtspunkt der Labilität von Lysinphosphorylierungen ein bottom-up-Phosphoproteomikansatz etabliert. Das MS-Verfahren beruht auf der Generierung eines diagnostischen Phospholysinimmoniumions, welches im zweiten Schritt die Erfassung eines zusätzlichen EThcD-Spektrums desselben Precursorions veranlässt (triggert). Darüber hinaus wird im Zuge dieser Arbeit gezeigt, dass sich pyrophosphorylierte Peptide unter CID-Bedingungen in ihrem Neutralverlustmuster von isobaren diphosphorylierten Peptiden unterscheiden. Dieses Verhalten stellt einen Schlüsselschritt in einer neutralverlustgetriggerten EThcD Methode dar, welche die zweifelsfreie Identifizierung von Pyrophosphorylierungen ermöglicht. Darauf basierend konnten in Hefezellen und humanen embryonalen Nierenzellen die ersten Proteinpyrophosphorylierungen, einer neuen endogenen posttranslationalen Modifikation, nachgewiesen werden. / Covalent posttranslational modifications (PTMs) influence the structure and function of proteins. Protein phosphorylations belong to the most important PTMs. Rarely characterized labile phosphorylations, for instance phosphorylations of cysteine and lysine and pyrophosphorylations of serine and threonine residues got into the focus of science. However, the analysis of those delicate modifications via tandem mass spectrometry remains a challenge. In the present work, it is shown that electron-transfer dissociation (ETD) combined with HCD supplemental activation (EThcD) is able to fragment peptides with labile phosphorylations at the side chains without losing the modification. In several bottom-up proteomic approaches, EThcD allowed the reliable identification of a naturally occurring cysteine phosphorylation. Moreover, methods for identification of lysine phosphorylations were developed. For the proteome wide analysis of lysine phosphorylations, considering the lability, a bottom-up phosphoproteomic approach with a highly selective mass spectrometry method was established. The MS-method relies on the generation of diagnostic phospholysine immonium ions during HCD, which trigger in a second step an additional EThcD spectrum of the same precursor ion. This strategy ensures the confident identification of lysine phosphorylated peptides. Furthermore, the present work shows that isobaric pyro- and diphosphorylated peptides differ in their neutral loss pattern during CID. This behavior was a key step in a specific neutral loss triggered EThcD method, which enabled the reliable identification of pyrophosphorylations. This method allowed the identification of the first protein pyrophosphorylations, a new endogenous PTM, in yeast and human embryonic kidney cells.

In dieser Arbeit konnte ein humaner IgG1-Antikörper mittels verschiedener massenspektrometrischer Methoden erfolgreich untersucht und charakterisiert werden. Neben der Bestimmung der molekularen Massen des betrachteten Anti-Interleukin-8-Antikörpers und dessen Fragmenten konnte auch die Bildung von Oligomeren untersucht werden. Es wurden verschiedene Oligomere, bis hin zum Pentamer, massenspektrometrisch gemessen und es konnten auch Erkenntnisse gewonnen werden, dass Konzentrationseffekte maßgeblich zur Oligomerbildung bei diesem Antikörper beitragen. Die Antikörperglykosylierung, eine sehr prominente und hoch diverse Modifikation, wurde bei diesem Antikörper ebenfalls gefunden und neben dem intakten Antikörper auch in dessen Fragmenten und im Dimer gemessen. Neben dieser natürlichen Modifikation wurden auch Derivatisierungen des Antikörpers analysiert, dabei wurden unterschiedliche Metallmarkierungen analysiert. Es konnten verschiedene Markierungsgrade bestimmt werden, auch wenn diese nebeneinander als Mischung vorlagen. Der Nachweis, dass der Antikörper auch weiterhin intakt und bindungsfähig ist, konnte erbracht werden. Die Bildung von Komplexen des Antikörpers mit verschiedenen Proteinen konnte ebenfalls mittels Massenspektrometrie gezeigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es möglich war, eine Quantifizierungsstrategie für Antikörper zu entwickeln. Mit dieser können absolute Quantifizierungen durchgeführt werden, während diese gleichzeitig unabhängig von Art und Struktur des einzusetzenden Standards sind. Damit ist es möglich, die Probleme des Bradford-Assays zu umgehen. Des Weiteren sind nur minimale Kenntnisse über den zu analysierenden Antikörper notwendig, sodass dieses Verfahren auch hervorragend auf bisher nicht charakterisierte Antikörper angewendet werden kann. / The aim of this work is the characterization of an antibody. The used human IgG1-antibody was successfully investigated with various mass spectrometric methods. In addition to the determination of the molecular masses of the analyzed Anti-Interleukin-8 antibody itself and its fragments the formation of oligomers was examined. Different oligomers up to pentamers could be mass spectromatrically measured. Resulting from this, it was possible to find that concentration effects are the main factors for the oligomer formation of this particular antibody. The glycosylation of antibodies, a prominent and high diverse modification, was also found in this antibody and was measured in the intact molecule, in its fragments and also the dimer. Next to this native modification, also a derivatization of the antibody was investigated. Different metal containing modifications were analyzed. Thereby it was possible to determine various tagging degrees, even in a mixture of these metal containing modifications. The important question, whether the tagged antibody is still active and capable for binding, can be answered positively. Furthermore the formation of antibody-protein complexes could be shown via mass spectrometry. It was also successful to develop a quantification strategy for this antibody. With this an absolute quantification was possible, which was independent from the type and the structure of the used standard. With this method it is possible to overcome the problems of the Bradford assay. In addition to this only very little information about the antibody is needed for the quantification, which allows to use this method for non characterized antibodies.

Anhand von theoretischen Untersuchungen wird eine umfassende Beschreibung von kleinen Metalloxidclustern gegeben. Bei den untersuchten Systemen handelt es sich um Aluminium- und Eisenoxid-Ionen sowie entsprechende Oxid-Cluster, die beide Metalle enthalten. Neben der Bestimmung der geometrischen Struktur der Cluster werden auch die allgemeinen elektronischen Eigenschaften der eisenhaltigen Verbindungen untersucht. Alle Vorhersagen werden durch Vergleich mit verfügbaren experimentellen Ergebnissen -- hauptsächlich aus der Infrarot-Photodissoziations- und der Photoelektronenspektroskopie -- überprüft und bewertet. Soweit möglich werden die Bewegungen von Atomen oder kleinen Gruppen innerhalb der Cluster einzelnen experimentellen Signalen zugeordnet. Besondere Aufmerksamkeit wird dem Eisendioxidmolekül und seinem Anion gewidmet. Es wird mit spezialisierten Wellenfunktionsmethoden untersucht, mit denen ab initio Franck-Condon-Simulationen einschließlich nicht-adiabatischer und Spin-Orbit-Kopplungen für die Photoionisation des Anions erstellt werden. Sie liefern Erklärungen für die komplizierte Schwingungsstruktur des experimentellen hochauflösenden Photoelektronenspektrums. / By means of theoretical investigations, a comprehensive description of small metal oxide clusters is given. The studied systems are aluminum and iron oxide ions as well as respective bi-metallic oxide clusters. Besides the determination of the geometrical structure of the clusters, the general electronic properties of the iron-containing compounds are investigated. All predictions are checked and assessed by comparison with available experimental results, mainly infrared photodissociation and photoelectron spectroscopy measurements. As far as possible, motions of atoms or small groups within the clusters are assigned to distinct experimental vibrational features. Particular attention is paid to the iron dioxide molecule and its anion. It is studied with sophisticated wave function methods based on which ab initio Franck-Condon simulations for the photodetachment from the anion, including non-adiabatic and spin-orbit couplings, are generated. They provide explanations for the complicated vibrational structure of the experimental high-resolution photoelectron spectrum.

Verunreinigungen von Fremdelementen können den Wirkungsgrad von Solarzellen schon im Spurenbereich beeinträchtigen. Die Kenntnis der Verunreinigungen in Si ist entscheidend für die Produkt- und Produktionskontrolle neuer Solarzellenmaterialien. In dieser Arbeit wurden Analysenmethoden mit unterschiedlichen Messverfahren unter besonderer Berücksichtigung der Ansprüche der Solarindustrie entwickelt, verbessert, charakterisiert und verglichen. Mit der Sektorfeld-Massenspektrometrie (SFMS) mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP) nach Matrixabtrennung konnten 22 Elemente mit Bestimmungsgrenzen bis zu 120 pg g−1, quantifiziert werden. Das neue Verfahren erlaubte die Bestimmung aller Elemente in einem Analysengang ohne Analytverlust. Dabei wurde ein bisher in der Literatur nicht beschriebener Mechanismus aufgeklärt, welcher die Retention von Bor im Matrixverdampfungsschritt ohne Zusatz von Komplexbildnern erlaubt. Mit der Glimmentladungs-(GD )MS wurden 32 Elemente bis in den sub ng g−1-Bereich bestimmt. Es gelang, relative Empfindlichkeitsfaktoren zur Quantifizierung von B, P, As, Ga, Ge und Fe zu errechnen. Methoden basierend auf der elektrothermischen Verdampfung (ETV), gekoppelt an ICP-MS und ICP-Emissionsspektroskopie (OES) sowie Gleichstrombogen-OES wurden zur Charakterisierung von metallurgischem Si-Pulver mit Gehalten im µg g−1-Bereich verwendet. Die Totalreflexion-Röntgenfluoreszenz wurde als Volumenmessmethode für die Si-Analytik eingesetzt. Komplettiert wird das Methodenspektrum durch Oberflächenanalytik von Wafern mittels Laserablation-(LA)-ICP-MS. Es wurden erstmalig für Silicium Konzepte zur quantitativen Bestimmung der Verunreinigungen auf Si-Wafern über eine Kalibrierung der LA mit eingetrockneten flüssigen Standards erarbeitet und gezeigt, dass sich das Verfahren zum Nachweis typischer metallischer Ausscheidungen eignet. Die Neutronenaktivierungsanalyse wurde als anerkannte Referenzmethode der Halbleiterindustrie zur Validierung der Methoden eingesetzt. / Element impurities can affect the efficiency of solar cells already on the trace level. The knowledge of the impurities in Si is thus crucial for the product and production control of new solar cell materials. In this work, analysis methods based on different measurement principles have been developed, improved, characterized and compared with special consideration of the requirements of the solar industry. Sector field mass spectrometry (SFMS) with inductively coupled plasma (ICP) subsequent to matrix separation has been used to determine 22 elements with limits of determination down to 120 pg g−1 on sample basis. The new, optimized procedure allowed the determination of all analytes in one sweep without analyte loss during the evaporation step. A so-far unexplained mechanism for the retention of boron without use of additional complexing agents was elucidated. Glow discharge (GD)MS was used to measure 32 elements down to the sub-ng g−1 range. Relative sensitivity factors for the quantification of B, P, As, Ga, Ge and Fe have been calculated. Methods based on electrothermal vaporization (ETV) coupled to ICP-MS and ICP emission spectroscopy (OES) as well as direct current arc OES were used for the characterization of metallurgical grade Si powder with concentrations in the µg g−1 range. Total reflection X-ray fluorescence was used as a method for bulk impurity concentration analysis. The spectrum of methods is complemented by surface analysis of silicon wafers by laser ablation (LA)-ICP-MS. New concepts for quantitative analysis of silicon surfaces by the calibration of LA with dried liquid standards were elaborated. It has been demonstrated that this method is suitable for the detection of typical metallic precipitations in silicon like copper silicide. For validation of the methods, instrumental neutron activation analysis was used as the generally accepted reference method in the semiconductor industry.

Die Umsetzung von alpha,beta-ungesättigten Aldehyden und Ketonen mit Wasserstoff über Pd-Modellkatalysatoren wurde anhand von Molekularstrahlmethoden, kombiniert mit Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie (IRAS), Quadrupol-Massenspektrometrie (QMS) und Röntgen-Nahkanten-Absorptions-Spektroskopie (NEXAFS), unter wohldefinierten Ultrahochvakuumbedingungen untersucht. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein atomistisches Verständnis der strukturellen Faktoren zu gewinnen, die die Aktivität und Selektivität eines Pd(111)-Einkristalls und Eisenoxid-geträgerter Pd-Nanopartikel für die Hydrierung der C=C- und C=O-Bindungen bestimmen. Exemplarisch für diese Art von Kohlenwasserstoffen wurden das Aldehyd Acrolein und das Keton Isophoron gewählt. Die NEXAFS- und IRAS-Studien zeigten, dass Isophoron bei niedrigen Bedeckungen auf Pd(111) in einer flachliegenden Geometrie adsorbiert wird. Die Neigungswinkel der C=C- und C=O-Bindungen in Bezug auf die Pd(111)-Ebene nehmen mit zunehmender Oberflächenbedeckung zu. Auf reinem Pd(111) ist die Neigung der C=C-Bindung stärker ausgeprägt, was auf eine Verzerrung des konjugierten pi-Systems hindeutet. Bei Anwesenheit von Wasserstoff wird eine schwächere Bindung von Isophoron an Pd beobachtet. Die selektive partielle Hydrierung über einer Pd(111)-Oberfläche und geträgerten Pd-Nanopartikeln unterschiedlicher Größen wurde unter Verwendung von Acrolein untersucht. Molekularstrahlmethoden wurden mit IRAS- und QMS-Messungen kombiniert, um gleichzeitig die Bildung von Adsorbaten auf der Oberfläche und die der Produkte in der Gasphase verfolgen zu können. Über einem Pd(111)-Kristall wird Propenol mit nahezu 100% Selektivität durch Hydrierung der C=O-Gruppe gebildet, während über Pd-Partikeln Propanal durch selektive Hydrierung der C=C-Gruppe erzeugt wird. IRAS-Untersuchungen zeigten, dass die Propenol-Bildung eine Modifikation der Pd(111)-Oberfläche mit einer dichten Oxopropyl-Monolage voraussetzt. / The conversion of alpha,beta-unsaturated aldehydes and ketones with hydrogen over model Pd catalysts was investigated using molecular beam techniques combined with infrared reflection-absorption spectroscopy (IRAS), quadrupole mass spectrometry (QMS), and near-edge X-ray absorption fine structure (NEXAFS) studies under well-defined ultra-high vacuum conditions. The aim of this work was to gain atomistic-level understanding of structural factors governing the selectivity and activity of a Pd(111) single crystal and iron-oxide-supported Pd nanoparticles for C=C and C=O bond hydrogenation. The ketone isophorone and the aldehyde acrolein were chosen as prototypical alpha,beta-unsaturated carbonyl compounds. NEXAFS and IRAS studies showed that isophorone is adsorbed on Pd(111) in a flat-lying geometry at low coverages. With increasing coverage, both C=C and C=O bonds tilt with respect to the surface plane. The tilting is more pronounced for the C=C bond on pristine Pd(111), indicating a strong distortion of the conjugated pi system upon interaction with Pd. Co-adsorbed hydrogen leads to a conservation of the in-plane geometry of the conjugated pi system, pointing to a much weaker interaction of isophorone with Pd in the presence of hydrogen. The selective partial hydrogenation over a Pd(111) surface and supported Pd nanoparticles with different particle sizes was investigated using acrolein. Molecular beam techniques were combined with IRAS and QMS measurements in order to simultaneously monitor the evolution of surface species and the formation of the final gas-phase products. Over a Pd(111) single crystal, acrolein is hydrogenated at the C=O bond to form propenol with nearly 100% selectivity, while over supported Pd particles, selective conversion of the C=C bond to propanal occurs. IRAS investigations showed that a distinct modification of the Pd(111) surface with a dense overlayer of an oxopropyl species is required for propenol formation.

In dieser Arbeit wird eine umfassende Untersuchung von Clustern vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf dem Einfluss von Quellendruck, Temperatur und Agglomerationszustand auf die erzeugten Cluster liegt. Die neutralen Cluster werden durch Überschallstrahl-Expansion von Ar und CO2 in einem weniger untersuchten Bereich von Quellendrücken und -temperaturen erzeugt und anschließend durch Ultrahoch-Rayleigh-Streuungsmessungen charakterisiert. Die Analyse zeigt, dass das bekannte empirische Skalierungsgesetz möglicherweise nicht genau genug ist, wenn die Clustergrößen in realen Systemen einen breiteren Bereich abdecken. Ein wichtiger Schritt ist der Übergang von Ar als nahezu ideales Gas zu CO2 als reales System. Um zu beurteilen, ob die Werte der mittleren Clustergrößen aussagekräftig sind, wird in dieser Arbeit ein auf den experimentellen Ergebnissen basierendes Modell vorgeschlagen, das eine geeignete Position der Laser-Cluster-Wechselwirkungsregion im kollisionsfreien Bereich des Molekularstrahls bestimmt. Die geringe zeitliche Auflösung des mit dem Oszilloskop erfassten Signals führt zur Anwendung der Photonenzählung, die eine höhere Nachweisempfindlichkeit bietet. Im Falle von Ar-Clustern zeigt diese Methode die Übereinstimmung des Verhaltens mit den bekannten theoretischen Berechnungen. Die Analyse der relativen mittleren CO2-Clustergrößen zeigt dagegen, dass die theoretische Skalierung für Cluster, die sich aus Flüssigkeiten mit hoher Dichte bilden, nicht gut geeignet ist. Die relative mittlere Größe kleiner und besonders großer Cluster ermöglicht die Unterscheidung zwischen Clustern, die durch Expansion von der gasförmigen oder flüssigen Seite des kritischen Punktes erzeugt werden, und einem Zwischenbereich, in dem die Expansion die überkritischen gasförmigen und flüssigen Bereiche passiert. Bei Messungen in der Nähe der Widom-Linie zeigen zwei verschiedene gemessene und berechnete Skalierungsgesetze einen scharfen Übergang beim Überschreiten dieser Linie. / This thesis presents a comprehensive study of clusters with a focus on the influence of the source pressure, temperature, and agglomeration state on the generated clusters. The neutral clusters are generated by supersonic jet expansion of Ar and CO2 applying a less-studied range of source pressures and source temperatures and then characterized by ultra-high Rayleigh scattering measurements. The analysis indicates that the known empirical scaling law may lack sufficient accuracy when cluster sizes cover a broader range in real systems. An important step is moving from Ar as a near-ideal gas to CO2 as a real system. To evaluate whether the values of the mean cluster sizes are meaningful, in this thesis, a model based on the experimental results is proposed, which determines an appropriate position of the laser-cluster interaction region in the collisionless domain of the molecular beam. The low temporal resolution of the detected signal via oscilloscope leads to the application of photon counting that provides a higher detection sensitivity. In the case of Ar clusters, this method reveals the compliance of the behavior with the known theoretical calculations. The analysis of the relative mean CO2 cluster sizes, in contrast, indicate that the theoretical scaling does not suit well for clusters formed from the high-density fluids. The relative mean size of small and extra-large clusters enables the distinction of the clusters generated via expansion from the gas or the liquid side of the critical point and an intermediate regime where the expansion passes the supercritical gas-like and liquid-like regions. In measurements at conditions near the Widom line, two different measured and calculated scaling laws reveal a sharp transition on crossing it.

Immunoassays basieren auf der Anwendung von Antikörpern, welche selektiv den zu messenden Analyten binden. Die Richtigkeit der erhaltenen Ergebnisse hängt maßgeblich von der Selektivität der Antikörper ab und kann durch Interferenzen gestört werden. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, bei der die Probe mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (LC) in Fraktionen aufgetrennt wird und diese Fraktionen anschließend mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) vermessen werden. Dieses Verfahren wurde als LC-ELISA bezeichnet. Das erhaltene Profil aus im ELISA gemessener Analytkonzentration in Abhängigkeit von der Elutionszeit wurde als LC-ELISAgramm bezeichnet und bietet die Möglichkeit, Interferenzen zu erkennen, welche beim ELISA unentdeckt bleiben. Als Modellanalyten für die zu untersuchenden ELISAs dienten Sulfamethoxazol (SMX), Carbamazepin (CBZ) und Estron (E1). Dabei wurden verschiedene Umweltmatrices wie Oberflächenwasser und Abwässer mit dem jeweiligen ELISA vermessen. Es wurde ein Ansatz zur Unterscheidung von spezifischen und unspezifischen Interferenzen in Umweltproben aufgezeigt. Durch diesen Ansatz und Anwendung der sauren Hydrolyse der Probe war es möglich, einen bisher unbekannten SMX-Metaboliten zu detektieren und dessen wahrscheinliche Kreuzreaktivität mit 460 ± 150 % abzuschätzen. Es wurde zudem ein neuer Tracer in einer linearen 13-Stufen-Synthese entwickelt, wobei neuartig die Konjugation der Peroxidase an der N1-Position des SMX erfolgte. / Immunoassays are based on the use of antibodies that selectively bind the analyte. The trueness of the results obtained depends to a great extent on the selectivity of the antibodies and can be affected by interferences. In this study, a method was developed in which the sample is separated into fractions by using high-performance liquid chromatography (LC) and these fractions are measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This method was referred to as LC-ELISA. The profile obtained from the measured analyte concentration by ELISA as a function of the elution time was referred to as LC-ELISAgram and offers the possibility to detect interferences which otherwise remain undetected during the ELISA. Sulfamethoxazole (SMX), carbamazepine (CBZ) and estrone (E1) were used as model analytes for the ELISA and LC-ELISA measurements. Various environmental matrices such as surface water and wastewater were examined for their interference in the respective ELISA. The good quantification properties of the validated LC-ELISA have been used to demonstrate an approach to distinguish between specific and non-specific interferences from environmental samples. By this approach and application of acidic hydrolysis of the sample, it was possible to detect a previously unknown metabolite of SMX and estimate its cross-reactivity to probably 460 ± 150%. Furthermore, a new tracer was developed in a linear 13-step synthesis, which resulted in the novel conjugation of the peroxidase at the N1-position of SMX. The new hapten was also used for the synthesis of a novel immunogen.

Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung neuer chemischer Sonden zur Überwachung der Aktivität von ASM sowohl in vitro als auch in vivo. Darüber hinaus wurde auch die Optimierung der angegebenen Sonden (besser: bereits publizierter Sonden) durchgeführt. Im ersten Teil dieser Studie wurden zwei Eu-Komplexe ausgehend von handelsüblicher Chelidaminsäure synthetisiert und führten zu einer guten Ausbeute mit hoher Reinheit. Die synthetisierten Sonden 4-D+ und 5-D+ wurden zum Nachweis verschiedener Phosphate und Carboxylatspezies verwendet. Sie wurden zur Überwachung der ASM-Aktivität durch den Nachweis des enzymatisch freigesetzten Phosphorylcholins (PC) eingesetzt. Trotz der vielversprechenden Abnahme der Lumineszenz von 4-D+ als Reaktion auf das anorganische PC zusätzlich zur Simulationsreaktion zur Änderung des SM / PC-Verhältnisses wurde in allen enzymatischen homogenen und heterogenen Experimenten ein allgemeiner Löscheffekt beobachtet. Der 5-D+ Komplex könnte zur Überwachung des ATP-hydrolysierenden Apyrase-Enzyms in Echtzeit verwendet werden. Im zweiten Teil dieser Studie wurden verschiedene FRET- und monomarkierte ASM-Sonden entworfen und synthetisiert. Eine neuartige FRET-Sonde mit einem besseren 2P-anregbaren Cumarinderivat zeigte eine etwa 20% Steigerung der Cumarinintensität im Vergleich zum alten Cumarinderivat. Eine neue Generation von ASM-Sonden mit einer quaternären Ammoniumgruppe, die das natürliche Substrat nachahmt, wurde ebenfalls entworfen und synthetisiert. Alle neuen quaternären Sonden wurden als ASM-Substrate nachgewiesen und zeigten unterschiedliche kinetische Parameter. Sie zeigten höhere Umsatz-Kcat-Werte im Vergleich zur nicht quaternären Sonde. Die meisten neuen Sonden zeigten auch höhere Spezifitätskonstanten gegenüber dem ASM-Enzym. / Sphingolipids are a family of bioactive signalling molecules. Besides their role in cellular structure, sphingolipids act as key regulators of many cellular functions including cell proliferation, differentiation, and apoptosis. The acid sphingomyelinase (ASM) catalyses the hydrolysis of sphingomyelin (SM) to ceramide, a metabolic hub of sphingolipid metabolism, and phosphoryl choline. Due to the lack of biochemical analytical tools, the molecular details of acid sphingomyelinase activity are still not fully discovered, and the development of pharmacological inhibitors is also hampered. The scope of this work is to develop new chemical probes for monitoring the activity of ASM both in vitro and in vivo.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Leistungsfähigkeit der Hochleistungsflüssigchromatographie mit Photodiodenarraydetektion (HPLC-DAD) im Rahmen der Systematischen Toxikologischen Analyse (STA) umfassend untersucht, ein besonderer Schwerpunkt lag dabei auf der Aussagesicherheit bei der Substanzidentifizierung. Die Grundlage für diese Untersuchungen bildete die Messung der UV-Spektren und relativen Retentionszeiten (RRT) von 2.682 toxikologisch relevanten Substanzen mit Hilfe moderner Diodenarraydetektoren und unter einheitlichen experimentellen Bedingungen (Eluent: Acetonitril/ Phosphatpuffer pH 2,3; Trennsäule: Lichrospher RP8ec). Die erhaltenen Daten wurden zusammen mit weiteren Substanzinformationen in einer Spektrenbibliothek zusammengefasst, die als Buch und CD-ROM auch der Öffentlichkeit zugänglich gemacht wurde. Bei der Entwicklung eines Konzeptes zur Methodenvalidierung für die STA erwiesen sich insbesondere die Kenngrößen Selektivität und Spezifität als von zentraler Bedeutung. Unter Verwendung eines Fensteransatzes für die RRT und des Similarity Index (SI) für den Spektrenvergleich wurden sämtliche möglichen Substanzpaare aus der Spektrenbibliothek miteinander auf ihre Unterscheidbarkeit hin verglichen, wobei verschiedene RRT-Fensterbreiten und SI-Schwellenwerte zugrundegelegt wurden. Aus den Ergebnissen wurden Selektivitätsparameter wie die Relative Identification Power (RIP), die Discriminating Power (DP) und die Mean List Length (MLL) berechnet. Mit einer RIP von 84,2 %, einer MLL von 1,25 und einer DP von 0,9999 wurden für die Substanzidentifikation anhand von RRT + UV-Spektrum im Literaturvergleich sehr gute Ergebnisse erhalten. Die hohe Grad an Spezifität der UV-Spektren für den Einsatz in der STA wurde einerseits durch Auszählung sämtlicher in der Spektrenbibliothek gefundener Chromophore/Absorptionssysteme belegt: 1.650 verschiedene Absorptionssysteme wurden gefunden, über 60 % der Verbindungen trugen ein in diesem Substanzbestand einzigartiges Absorptionssystem. Andererseits wurde die computergestützte Unterscheidbarkeit zwischen verschiedenen Gruppen jeweils strukturell ähnlicher Wirkstoffe anhand des UV-Spektrums untersucht. Hierfür wurden 487 Substanzen in ein hierarchisches System von Haupt- und Untergruppen eingeteilt, zwischen denen anschließend mit Hilfe der Schrittweisen Diskriminanzanalyse (SDA) unterschieden werden sollte. Die sehr guten Klassifizierungsergebnisse und die Auflösung auch feiner struktureller Unterschiede, oftmals abseits des eigentlichen Absorptionssystems, lassen es grundsätzlich möglich erscheinen, auch Substanzen für die STA zu erschließen, die nicht in der Spektrenbibliothek enthalten sind. Insgesamt erwies sich die HPLC-DAD als hochselektives und -spezifisches Messverfahren, das zu Recht eine der wichtigsten STA-Methoden darstellt. / In this thesis the capability of high-performance liquid chromatography with photodiode array detection in the context of Systematical Toxicological Analysis (STA) was extensively investigated with a special focus on the certainty of substance identification. As the foundation for these investigations, UV spectra and relative retention times (RRT) of 2,682 toxicologically relevant compounds were recorded under uniform experimental conditions (mobile phase: acetonitrile/ phosphate buffer pH 2.3; column: Lichrospher RP8ec) using up-to-date photodiode array detectors. Together with additional substance information these data were built into a spectra library also made available to the public in the form of a book and a CD-ROM. During the development of a concept for the validation of a STA method, selectivity and specificity were found to be of central importance. Using a window approach for the RRT and the Similarity Index (SI) for spectral comparison, all possible substance pairs within the spectra library were examined in terms of their respective distinguishability, based on different RRT windows and SI threshold values. From the results selectivity parameters such as the Relative Identification Power (RIP), the Discriminating Power (DP), and the Mean List Length (MLL) were calculated. As compared to the literature, with a RIP of 84.2 %, a MLL of 1.25, and a DP of 0,9999 excellent results were obtained for the substance identification based on the combination of RRT and UV spectrum. The high degree of specificty of UV spectra for use in the STA was demonstrated on the one hand by counting all different chromophores/ absorption systems found in the spectra library: 1,650 systems were found, more than 60 % of the substances bore absorption systems unique in the dataset. On the other hand the computer-based distinction between different groups of structurally similar compounds on the basis of the UV spectrum was investigated by dividing 487 substances into a hierarchical system of main and subgroups and trying to distinguish between these groups using stepwise discriminant analysis (SDA). The highly satisfying classification results together with the resolution of fine structural differences, often remote from the actual absorption system, make it seem possible to also render substances not included in the spectra library accessible for the STA. In conclusion HPLC-DAD proved to be highly selective and specific, rightfully regarded as one of the most important STA methods.