Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T06:24:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_StefanieCostaPinto_D.pdf: 63660430 bytes, checksum: 46ba12508eba9cd5aeed590ca748d9cd (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Este trabalho de tese está dividido em dois capítulos. Abaixo descreveremos brevemente os achados de cada um deles. O primeiro capítulo entitulado Desenvolvimento de Drogas Experimentais trata da atividade antimalárica de um composto natural, a violaceína e suas formulações geradas com o auxílio da nanotecnologia. Neste sentido, a violaceína foi eficiente em eliminar in vitro formas sanguíneas de P. falciparum 3D7 e P. falciparum S20, sendo este último isolado resistente à cloroquina. Quando testada in vitro em isolados frescos de P. vivax, a violaceína não foi capaz de inibir o desenvolvimento parasitário. No entanto, acreditamos que novos ensaios são necessários para confirmar este dado, uma vez que o IC50 (concentração inibitória 50%) observado para cloroquina apresentou-se estranhamente elevado. Os experimentos in vivo utilizando camundongos infectados com Plasmodium chabaudi chabaudi AS revelaram uma potente atividade desta droga, inclusive quando o tratamento foi iniciado após o estabelecimento de infecção patente nos animais. Quando administrada em animais infectados com uma cepa murina letal (Plasmodium chabaudi chabaudi AJ), a violaceína protegeu 80% dos animais. Como a violaceína é um composto insolúvel em água, novas formulações com essa molécula foram feitas visando sua solubilidade e também potencializar sua atividade antimalárica. Neste sentido, tanto a violaceína encapsulada com co-polímero de ácido láctico e ácido glicólico quanto as formulações de violaceína com três diferentes nanotubos de carbono também foram capazes de inibir o crescimento parasitário in vitro contra P. falciparum, no entanto esta atividade não foi potencializada. Em síntese, este capítulo nos mostra que a violaceína apresenta capacidade de inibir o crescimento parasitário de Plasmodium sp., no entanto as suas formulações não foram capazes de potencializar a atividade antimalárica. O segundo capítulo entitulado Imunopatogênese na malária vivax trata da capacidade adesiva de eritrócitos infectados por P. vivax (Pv-EI) a diferentes receptores endoteliais e da capacidade deste parasita em formar rosetas. Uma vez que há uma baixa proporção de formas maduras principalmente esquizontes na circulação periférica de pacientes infectados por P. vivax, estabelecemos uma técnica de cultivo in vitro para obtenção destas formas maduras e investigamos a capacidade adesiva destas formas do parasita. Neste sentido, observamos que Pv- EI pós-amadurecimento apresentam maior capacidade adesiva em HLEC (células endoteliais de pulmão humano) que parasitas do mesmo isolado antes do amadurecimento. Quando avaliado os receptores envolvidos antes e após o amadurecimento, ensaios com células transfectadas ou uso de inibidores específicos, revelou a participação de ICAM-1 (molécula de adesão intercelular 1) e CD36 (cluster de diferenciação 36) na citoadesão deste parasita enquanto a participação de CSA (Condroitin Sulfato A) permanece a ser elucidada. Ao passo que ICAM-1 parece estar envolvida na citoadesão de todos os estágios do parasitas, o CD36 parece ser estritamente envolvido na citoadesão de formas maduras, essencialmente esquizontes. Além disso, a citoadesão de Pv-EI em HLEC foi potencializada na presença de soro do próprio paciente, sugerindo a existência no soro dos infectados de mediadores adesivos. Quando investigada a formação de rosetas por Pv-EI verificamos que a porcentagem de rosetas foi maior nas formas amadurecidas e também foi potencializada na presença de soro autólogo. Os dados aqui apresentados abrem perspectivas para novos estudos visando compreender o fenômeno patológico envolvido na malária vivax grave, incluindo a participação de mediadores plasmáticos e a identificação dos receptores celulares e dos ligantes parasitários envolvidos / Abstract: This thesis was divided into two chapters, and below we briefly describe the findings of each one. The first chapter entitled Experimental Drug Development investigates the antimalarial activity of a natural compound, violacein, and its formulations developed by nanotechnology. Violacein effectly killed in vitro blood stages of P. falciparum 3D7 and P. falciparum S20, a chloroquine resistant strain. When tested in vitro against P. vivax fresh isolates, violacein did not inhibit parasite development. However, further experiments are needed to confirm this finding, as chloroquine IC50 (inhibition concentratios 50%) was strangely high. The in vivo experiments using mice infected with Plasmodium chabaudi chabaudi AS revealed a potent activity of this drug, even when treatment was initiated after the establishment of patent infection in animals. When administered to lethal strain (Plasmodium chabaudi chabaudi AJ) infected mice, violacein protected 80% of animals. As violacein is insoluble in water, new formulations were developed to enhance its solubility and also its antimalarial activity. However, violacein encapsulated with PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid)) and violacein formulations with three different carbon nanotubes did not enhanced violacein activity in vitro against P. falciparum. In summary, this chapter shows that violacein has the capacity to inhibit Plasmodium sp. growth; still their formulations were not able to potentiate violacein antimalarial activity. The second chapter entitled Immunopathogenesis of vivax malaria investigates the adhesive capacity of P. vivax infected erythrocytes (Pv-IE) in different endothelial cell receptors and the ability of this parasite to form rosettes. Since there are a low proportion of mature forms, especially schizonts, in peripheral circulation of malaria vivax patients, we established an in vitro technique to obtain these mature forms and investigate their adhesive capacity in endothelial cells. Here we showed that post-maturation Pv-IE presented more adhesive capacity in HLEC (human lung endothelial cells) than the same isolate before maturation. The search for receptors involved in cytoadhesion before and after maturation, using transfected cells or specific inhibitors, showed that ICAM-1 (intracellular adhesion molecule 1) and CD36 (cluster of differentiation 36) were involved in Pv-IE cytoadhesion whereas CSA (chondroitin sulfate A) involvement remains to be elucidated. While ICAM-1 seems to be involved in all stages of Pv-IE cytoadhesion, CD36 seems to be strictly involved in mature forms cytoadhesion, essentially schizonts. Furthermore, Pv-IE cytoadhesion in HLEC was enhanced in patient's serum presence, suggesting the existence of adhesive mediators in Pv-IE infected serum. Rosette formation by Pv- IE was also higher in mature forms and rosette formation was enhanced in autologous serum presence. These data collectively open new perspectives to study the pathological phenomenon involved in severe vivax malaria, including the involvement of plasma mediators and identification of cell receptors and parasite ligands involved in Pv-IE cytoadhesion / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2015-03-03T13:58:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AngelicaMSL_DISSERT.pdf: 779404 bytes, checksum: 28160c948fb7d8a8df206e8b5a2b131e (MD5) Previous issue date: 2011-09-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Violacein is a violet pigment isolated from many gram-negative bacteria, especially from Chromobacterium violaceum, a betaproteobacterium found in the Amazon River in Brazil. It has potential medical applications as an antibacterial, fungicide, anti-tryptanocidal, anti-ulcerogenic and anti-cancer drug, among others. Furthermore, its pro-oxidant activity has been suggested, but only in two specific tumor lineages. Thus, in the present study, the prooxidant effects of violacein were investigated in both normal and tumor cells, seeking to evaluate the cell responses. The evaluation of violacein cytotoxicity using the Trypan blue dye exclusion method indicated that CHO-K1 cells were more resistant than tumor HeLa cells. The oxidative stress induced by violacein was manifested as an increase in intracellular SOD activity in CHO-K1 and MRC-5 cells at a specific concentration range. Nevertheless, a decrease was detected specifically at 6-12 ?M in HeLa and MRC-5 cells. Interestingly, the increase in SOD activity was not followed by a concomitant increase in catalase activity. Regarding to oxidative stress biomarkers, increased protein carbonylation and lipid hydroperoxides levels were detected respectively in CHO-K1 and MRC-5 cells treated with violacein at 1.5-3 ?M and 3 ?M, which may be an evidence that this compound causes oxidative stress specifically in these conditions. Additionally, it is believed that the decline in cell viability observed in MRC-5 cells and HeLa treated with violacein at 6-12 M is due to mechanisms not related to oxidative stress. Moreover, the results suggested that violacein might cause oxidative stress by increasing endogenous levels of O2 -, since the occurrence of an expressive change in SOD activity. In addition, in order to evaluate the antioxidant activity of violacein in the absence of a biological system, the total antioxidant and iron chelating activity were evaluated, so that antioxidant activities were detected at 30 and 60 ?M of violacein. Altogether, the results indicate that although oxidative stress is triggered by incubation with violacein, it did not seem to be high enough to cause serious damage to cell biomolecules in HeLa cells and only at specific concentrations in CHOK-1 and MRC-5 cells. Comparing the results obtained in cell culture and the in vitro antioxidant activity evaluation, the results confirmed that violacein presents opposing oxidant features when in presence or absence of a biological system and the antioxidant character only occurs at high concentrations of the pigment. / A violace?na ? um pigmento violeta isolado de v?rias esp?cies de bact?rias gram-negativas, especialmente da Chromobacterium violaceum, uma betaproteobact?ria encontrada no rio Amazonas, no Brasil. Diversas atividades biol?gicas j? foram descritas para este pigmento e dentre elas destacam-se a antibacteriana, antif?ngica, tripanocida, antileishmaniose, anti-?lcerog?nica, antiviral e antitumoral. Apesar de uma atividade antioxidante in vitro ter sido sugerida, a atividade pr?-oxidante tamb?m j? foi observada especificamente em duas linhagens tumorais e parece ser dependente de mecanismos espec?ficos para cada linhagem. Nesse sentido, os efeitos citot?xicos e pr?oxidantes da violace?na foram investigados em c?lulas normais e tumorais buscando-se avaliar a ocorr?ncia de diferentes respostas celulares. A an?lise da citotoxicidade da violace?na indicou que c?lulas CHO-K1 foram mais resistentes ao composto em rela??o ?s tumorais HeLa. Quanto ?s enzimas do aparato antioxidante, observou-se um aumento significativo na atividade da SOD intracelular nas linhagens CHO-K1 e MRC-5. Por?m, houve uma diminui??o na atividade enzim?tica especificamente nos tratamentos com 6 e 12 M nas linhagens MRC-5 e HeLa. Interessantemente, o aumento na atividade da SOD n?o foi acompanhado pelo aumento concomitante na atividade da catalase. Em rela??o aos biomarcadores de estresse oxidativo, n?veis elevados de prote?nas carboniladas e hidroper?xidos de lip?dio foram observados em c?lulas CHO-K1 e MRC-5 quando tratadas respectivamente com 1,5-3 ?M e 3 ?M de violace?na, indicando que o pigmento apresenta efeitos pr?-oxidantes especificamente nessas concentra??es. Adicionalmente, acredita-se que a acentuada queda na viabilidade celular observada em c?lulas MRC-5 e HeLa tratadas com 6-12 ?M de violace?na se deve a outros mecanismos n?o relacionados ? gera??o de estresse oxidativo propriamente dita. Os resultados obtidos em cultura de c?lulas sugerem tamb?m que a violace?na induz estresse oxidativo por eleva??o dos n?veis end?genos de O2 ??, visto a ocorr?ncia de uma significativa altera??o nos n?veis de atividade de SOD. Em adi??o, com o objetivo de avaliar o car?ter antioxidante in vitro da violace?na na aus?ncia de um sistema biol?gico celular, a capacidade antioxidante total e a atividade de quela??o f?rrica do pigmento foram avaliadas, de forma que atividades antioxidantes foram detectadas a 30 e 60 ?M de violace?na. Frente aos resultados obtidos, apesar do desencadeamento do estresse oxidativo ap?s a incuba??o com violace?na, este parece n?o ser suficiente para causar danos significativos aos componentes e estruturas celulares em c?lulas HeLa e apenas em concentra??es espec?ficas de pigmento para CHO-K1 e MRC-5, dentro das condi??es avaliadas. Por fim, os resultados confirmam que violace?na apresenta car?teres oxidantes opostos quando na presen?a ou aus?ncia de um sistema biol?gico, al?m de que o car?ter antioxidante s? se d? em concentra??es elevadas do pigmento

Chromobacterium violaceum tem sido muito estudada a fim de explorar seu potencial biotecnológico, especialmente, a violaceína. Este trabalho teve por objetivo estabelecer estratégias para obtenção de mutantes. Linhagens mutantes foram obtidas por transposição com o mini-Tn5 e por recombinação homóloga (mutantes vioB e ubiB). O vioB em fase estacionária demonstrou ser mais resistente a UVC e aos sais metálicos FeCl2 e CdCl2. Com H2O2 não houve uma diferença significativa entre as taxas de sobrevivência exibidas pela linhagem vioB. Análise por microscopia demonstrou maior agregação das células do mutante vioB e uma maior formação de biofilme. O mutante ubiB apresentou crescimento deficiente na presença de 0.4 mg/mL de fenol. / Chromobacterium violaceum has been extensively studied for its biotechnological potential, especially what concerns violacein. In this work we have as goal to establish strategies for obtaining mutant strains. Mutant strains were obtained by transposition using mini-Tn5 and employing homologous recombination (mutant vioB and ubiB). vioB was shown to be more resistant in stationary phase to UVC and the metallic salts FeCl2 and CdCl2. With H2O2, there was no significant difference in survival rates exhibited by vioB. Microscopy analyses demonstrated a higher cell aggregation by the vioB mutant and a higher formation of biofilm. ubiB mutant presented growth defects in presence 0.4 mg/mL phenol.

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T13:30:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavagis_AlexandreDonizetiMartins_D.pdf: 4238254 bytes, checksum: af81f06637a0dca49e3ab3fabe00d10d (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O objetivo central deste trabalho foi avaliar a modulação de MAPKs em células de leucemia humana induzidas a apoptose e diferenciação. No capítulo 1, estudou-se o efeito da tetrahidroxiquinona (THQ), uma molécula que pode participar de um ciclo redox formando radicais semiquinona e, conseqüentemente, espécies reativas de oxigênio (EROs). A citotoxicidade da THQ, mediada pela formação de EROs, foi revertida por tratamento das células com glutationa e N-acetil-L-cisteína. A produção de EROs ocorreu concomitan-temente com a apoptose das células HL60 através da via mitocondrial e com redução na atividade de várias moléculas anti-apoptóticas da via de sobrevivência celular, inclusive da proteína quinase B (PKB). A transfecção das células HL60 com a PKB levou à diminuição da citotoxicidade dependente de EROs gerada pela THQ. No capítulo 2, demonstrou-se que a análise de um arranjo simultâneo de 1176 substratos com seqüências de consenso de diferentes quinases permitiu identi-ficar a via de sinalização das MAPKs como principal alvo da violaceína, um pigmento com propriedades antitumorais in vitro produzido pela Chromobacterium violaceum do rio Amazonas e que induz diferenciação de células HL60 em monócitos e granulócitos. Os resultados também indicaram que a análise do quinoma empregando arranjos metabólicos é uma ferramenta promissora na elucidação do modo de ação de fármacos em nível molecular. O capítulo 3 corresponde a um artigo de revisão em português sobre a riboflavi-na, componente do complexo vitamínico B2 que participa de importantes eventos bioquímicos, como reações redox envolvendo transferência de um ou dois elétrons, e também agindo como fotossensibilizador. Este artigo mostra que o comportamento peculiar e multifuncional da riboflavina permite que ela atue como nucleófilo ou eletrófilo e também descreve a associação deste composto com diferentes doenças como o câncer e doenças cardiovasculares / Abstract: The principal aim of this work was to assess the MAPKs family status in human leukaemia cells induced to undergo apoptosis and differentiation. In chapter one, the effect of tetrahydroxyquinone (THQ), a highly redox active molecule which can participate of a redox cycle with semiquinone radicals leading to the formation of reactive oxygen species (ROS), was investigated in HL60 cells. THQ caused substantial ROS formation followed by cytotoxicity that was sensitive to glutathione and N-acetyl-L-cysteine. Furthermore, ROS production coincided with HL60 cell apoptosis through the mitochondrial pathway and was followed by reduced activity of various anti-apoptotic survival molecules, including the protein kinase B pathway. Importantly, transfection of protein kinase B into HL60 cells leading to an artificial increase in protein kinase B activity inhibited ROS-dependent cytotoxicity. In chapter two, peptide arrays of 1176 different kinase consensus substrates unambiguously identified the MAP kinase pathway as a major target for violacein, the anti-leukemic purple-colored pigment produced by Chromobacterium violaceum from the Amazon River that stimulates HL60 cells to differentiate into monocytes and granulocytes. The results also indicate that kinome profiling using metabolic arrays is a promising and suitable tool for studying the molecular mechanisms of drug action. Chapter three is a review article in Portuguese about riboflavin, a component of the vitamin B2 complex, that has important roles in biochemistry, especially in redox reactions due to its ability to participate in both one- and two-electron transfers as well as acting as photosensitizer. This article describes the peculiar and multifunctional behavior of riboflavin which allows it to take part in several biochemical pathways both as nucleophile and electrophile. Moreover, the association of this vitamin with different diseases, including cancer and cardiovascular diseases, is also discussed. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Chromobacterium violaceum tem sido muito estudada a fim de explorar seu potencial biotecnológico, especialmente, a violaceína. Este trabalho teve por objetivo estabelecer estratégias para obtenção de mutantes. Linhagens mutantes foram obtidas por transposição com o mini-Tn5 e por recombinação homóloga (mutantes vioB e ubiB). O vioB em fase estacionária demonstrou ser mais resistente a UVC e aos sais metálicos FeCl2 e CdCl2. Com H2O2 não houve uma diferença significativa entre as taxas de sobrevivência exibidas pela linhagem vioB. Análise por microscopia demonstrou maior agregação das células do mutante vioB e uma maior formação de biofilme. O mutante ubiB apresentou crescimento deficiente na presença de 0.4 mg/mL de fenol. / Chromobacterium violaceum has been extensively studied for its biotechnological potential, especially what concerns violacein. In this work we have as goal to establish strategies for obtaining mutant strains. Mutant strains were obtained by transposition using mini-Tn5 and employing homologous recombination (mutant vioB and ubiB). vioB was shown to be more resistant in stationary phase to UVC and the metallic salts FeCl2 and CdCl2. With H2O2, there was no significant difference in survival rates exhibited by vioB. Microscopy analyses demonstrated a higher cell aggregation by the vioB mutant and a higher formation of biofilm. ubiB mutant presented growth defects in presence 0.4 mg/mL phenol.

This thesis deals with the study of microbial pigment violacein in the real sample of lyophilized microorganisms. The sample was investigated by using methods of vibrational spectroscopy with focusing on the applicability of surface enhanced and resonance micro-Raman spectroscopy. For this purpose several different systems for enhancing Raman intensity together with the set of excitation lasers emitting in the visible light region were used. The conclusion of this thesis are the recommendations connected with the appropriateness of using each amplifying systems and excitation wavelengths for the successful identification of violacein pigment in the sample. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

A inibição do quorum sensing (QS) altera a comunicação bacteriana, reduzindo a expressão de fatores de virulência e a formação de biofilmes, o que pode conferir menor pressão seletiva em comparação aos antibióticos tradicionais. As frutas e hortaliças constituem uma fonte rica em compostos com propriedades potenciais de inibição do QS. Entretanto, há pouca referência sobre o potencial de pimentas do gênero Capsicum e de seus compostos isolados como inibidores do QS. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de extratos orgânicos obtidos das variedades de pimenta-malagueta e pimentão vermelho sobre o sistema QS dependente do sinalizador AI-1 (acil homoserina lactona - AHL) em bactérias Gram-negativas. Os extratos foram obtidos por extração em fase sólida e separados em uma fração metanólica e outra amônica; sendo os compostos característicos identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e pela curva de crescimento de Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 e Pseudomonas aeruginosa PAO1. O efeito anti-QS dos extratos foi avaliado pelos testes de difusão em ágar e quantificação da produção de violaceína em meio líquido por C. violaceum e sobre a formação de biofilme, avaliado pelo ensaio de cristal violeta e microscopia confocal, em S. liquefaciens e P. aeruginosa nas temperaturas 30 ºC e 37 ºC. Os resultados obtidos pela CLAE indicaram que o extrato metanólico de pimenta-malagueta (EMPM) continha capsaicinoides como a capsaicina e dihidrocapsaicina, luteolina e outros compostos não identificados; já o extrato amônico desta não continha os compostos capsaicinoides. Ambos os extratos de pimentão vermelho continham luteolina e compostos não identificados, mas não apresentaram capsaicinoides. Como o EMPM era representativo dos demais extratos, por conter tanto capsaicinóides quanto luteolina, o foco deste trabalho foi avaliar os efeitos do EMPM sobre fenótipos microbianos nas concentrações 5; 2,5; 1,25 e 0,625 mg/ml, além de utilizar a capsaicina como controle comparativo em concentrações equivalentes às do extrato (25, 50 e 100 µg/ml). Os resultados da atividade antimicrobiana mostraram inibição parcial do crescimento das bactérias nas concentrações sub-MIC (MIC >5 mg/ml) de 5 e 2,5 mg/ml de EMPM. A capsaicina também inibiu parcialmente o crescimento das bactérias a 100 µg/ml, com exceção de S. liquefaciens a 37 ºC, cujo crescimento foi induzido em 50 e 25 µg/ml. A produção de violaceína foi reduzida pelo EMPM a 1,25 e 0,625 mg/ml, sem afetar o crescimento de C. violaceum. Ensaios com C. violaceum CV026, estirpe biosensora capaz de produzir o pigmento na presença de AI-1 exógeno, sugerem que o possível mecanismo de atuação do extrato sobre o sistema QS em C. violaceum 12472 é sobre a síntese do sinalizador, já que não foi observada inibição da produção de violaceína em CV026 pelo extrato. Contrariamente, a capsaicina incrementou a produção do pigmento na estirpe 12472, mas ensaios com a estirpe CV026 indicaram que a capsaicina não atua como sinalizador do QS, uma vez que esta não induziu a produção de violaceína nesta estirpe. Já a formação de biofilme foi incrementada na presença do EMPM, sendo consideravelmente maior em P. aeruginosa a 30 ºC. Igualmente, observou-se indução da formação de biofilme por capsaicina em S. liquefaciens (37 ºC) e P. aeruginosa (30 ºC). Porém, a capsaicina não teve efeito sobre a formação de biofilme de S. liquefaciens quando cultivada a 30 ºC, nem P. aeruginosa a 37 ºC. Os resultados revelam que a produção de violaceína em C. violaceum ATCC 12472 é inibida pelo EMPM, mas não pela capsaicina. Já, o EMPM e a capsaicina, de forma geral, não inibem a formação de biofilme de S. liquefaciens MG1 nem P. aeruginosa PAO1. Outros estudos são necessários para elucidar os mecanismos pelos quais o EMPM e a capsaicina agem sobre os fenótipos avaliados neste trabalho. / Quorum sensing inhibition alters bacterial communication by reducing virulence factors expression and biofilm formation, exerting less selective pressure compared to antibiotics. Fruits and vegetables are rich sources of compounds with potential QS-inhibition properties. However, there are few references about the potential of peppers belonging to the genus Capsicum and its isolated compounds as QS inhibitors. This study aimed to assess the effect of organic extracts obtained from Capsicum varieties, pimenta-malagueta (red chili) and pimentão vermelho (red bell pepper), on the AI-1 dependent QS system. The extracts were obtained by solid phase extraction and split into a methanolic and an ammonic fraction. Characteristic compounds were identified and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The antimicrobial activity of the extracts was assessed by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) and the growth curve of Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. The anti-QS effect of the extracts was evaluated by the agar diffusion assay and the quantification of violacein production was assessed in liquid medium by C. violaceum, as well as in the biofilm formation test determined by the crystal violet assay and confocal microscopy with S. liquefaciens and P. aeruginosa at 30 ºC and 37 ºC. HPLC results showed that the methanolic extract of pimenta-malagueta (EMPM) contained capsaicinoids such as capsaicin and dihidrocapsaicin, luteolin and other unidentified compounds in lower concentrations; while its ammonic extract did not have capsaicinoids. Both pimentão vermelho extracts contained luteolin and other unidentified compounds in low concentrations, but they did not contain capsaicinoids. As EMPM was representative among the extracts because it contained capsaicinoids and luteolin, the focus of this work was to assess the effect of EMPM over microbial phenotypes at concentrations of 5, 2.5, 1.25 and 0.625 mg/ml, using capsaicin as a comparative control at equivalent concentrations to those in EMPM (25, 50 and 100 µg/ml). Antimicrobial activity assays showed a partial inhibition growth of bacteria at sub-MIC concentrations (MIC >5 mg/ml) of EMPM at 5 and 2.5 mg/ml. Similarly, capsaicin partially inhibited bacterial growth at 100 µg/ml, except for S. liquefaciens at 37 ºC in which growth was induced at 50 and 25 µg/ml. Violacein production was reduced by EMPM at 1,25 and 0,625 mg/ml without affecting C. violaceum growth. Assays with C. violaceum CV026, a biosensor strain that produces violacein in the presence of exogenous AI-1, suggest that EMPM reduced violacein production in C. violaceum 12472 by interfering with the AI-1 synthesis. In contrast, capsaicin incremented violacein synthesis in strain 12472, but experiments with strain CV026 revealed that capsaicin does not function as an analog of AI-1. Biofilm formation was increased in EMPM presence, being remarkably superior in P. aeruginosa cultivated at 30 ºC, as opposed to cultivation at 37 ºC. Similarly, capsaicin induced biofilm formation in S. liquefaciens (37 ºC) and P. aeruginosa (30 ºC). However, capsaicin did not affect biofilm formation on S. liquefaciens cultured at 30 ºC, neither on P. aeruginosa at 37 ºC. These results show that violacein production in C. violaceum ATCC 12472 is inhibited by EMPM, but not by capsaicin. In general, EMPM and capsaicin did not inhibit biofilm formation in S. liquefaciens MG1 neither in P. aeruginosa PAO1. More studies are necessary to elucidate the mechanisms by which EMPM and capsaicin affect the studied phenotypes in this work.

A diversidade genética dos isolados de Chromobacterium sp. foi avaliada por Multilocus sequence analysis com base nas análises dos genes conservados rpoA, lepA, gyrB, fusA e rRNA 16S. A análise do gene rRNA 16S e MLSA agrupou os isolados no gênero Chromobacterium, entretanto, cinco dos isolados estão distantes filogeneticamente das linhagens tipo, C. violaceum e C. subtsugae, sugerindo duas novas espécies. Os extratos brutos, obtidos por soxhlet, dos isolados de Chromobacterium sp., testados em ensaios in vitro em células tumorais humanas, apresentaram atividades antitumorais potenciais e seletivas para determinadas linhagens celulares. Os extratos brutos e frações foram analisados por HPLC-DAD para avaliação da presença ou ausência da violaceína. Além disso, outros metábólitos secundários que não a violaceína podem estar relacionados à atividade antitumoral. / The genetic diversity of strains of Chromobacterium sp was evaluated by Multilocus sequence analysis (MLSA) based on the analysis of conserved genes rpoA, recA, lepA, gyrB, fusA and rRNA 16S. The analysis of 16S ribosomal RNA gene grouped all isolates in the genus Chromobacterium, however, the five isolates are phylogenetically distant of type strain C. violaceum and C. subtsugae, suggesting new species. The crude extracts of the isolates from Chromobacterium sp., obtained by soxlhlet, evaluated in vitro tests on human tumor cells, showed potential and selective antitumor activities for certain cell lines. In addition, other secondary metabolites than violacein may be related with antitumor activity.

A diversidade genética dos isolados de Chromobacterium sp. foi avaliada por Multilocus sequence analysis com base nas análises dos genes conservados rpoA, lepA, gyrB, fusA e rRNA 16S. A análise do gene rRNA 16S e MLSA agrupou os isolados no gênero Chromobacterium, entretanto, cinco dos isolados estão distantes filogeneticamente das linhagens tipo, C. violaceum e C. subtsugae, sugerindo duas novas espécies. Os extratos brutos, obtidos por soxhlet, dos isolados de Chromobacterium sp., testados em ensaios in vitro em células tumorais humanas, apresentaram atividades antitumorais potenciais e seletivas para determinadas linhagens celulares. Os extratos brutos e frações foram analisados por HPLC-DAD para avaliação da presença ou ausência da violaceína. Além disso, outros metábólitos secundários que não a violaceína podem estar relacionados à atividade antitumoral. / The genetic diversity of strains of Chromobacterium sp was evaluated by Multilocus sequence analysis (MLSA) based on the analysis of conserved genes rpoA, recA, lepA, gyrB, fusA and rRNA 16S. The analysis of 16S ribosomal RNA gene grouped all isolates in the genus Chromobacterium, however, the five isolates are phylogenetically distant of type strain C. violaceum and C. subtsugae, suggesting new species. The crude extracts of the isolates from Chromobacterium sp., obtained by soxlhlet, evaluated in vitro tests on human tumor cells, showed potential and selective antitumor activities for certain cell lines. In addition, other secondary metabolites than violacein may be related with antitumor activity.

A inibição do quorum sensing (QS) altera a comunicação bacteriana, reduzindo a expressão de fatores de virulência e a formação de biofilmes, o que pode conferir menor pressão seletiva em comparação aos antibióticos tradicionais. As frutas e hortaliças constituem uma fonte rica em compostos com propriedades potenciais de inibição do QS. Entretanto, há pouca referência sobre o potencial de pimentas do gênero Capsicum e de seus compostos isolados como inibidores do QS. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de extratos orgânicos obtidos das variedades de pimenta-malagueta e pimentão vermelho sobre o sistema QS dependente do sinalizador AI-1 (acil homoserina lactona - AHL) em bactérias Gram-negativas. Os extratos foram obtidos por extração em fase sólida e separados em uma fração metanólica e outra amônica; sendo os compostos característicos identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e pela curva de crescimento de Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 e Pseudomonas aeruginosa PAO1. O efeito anti-QS dos extratos foi avaliado pelos testes de difusão em ágar e quantificação da produção de violaceína em meio líquido por C. violaceum e sobre a formação de biofilme, avaliado pelo ensaio de cristal violeta e microscopia confocal, em S. liquefaciens e P. aeruginosa nas temperaturas 30 ºC e 37 ºC. Os resultados obtidos pela CLAE indicaram que o extrato metanólico de pimenta-malagueta (EMPM) continha capsaicinoides como a capsaicina e dihidrocapsaicina, luteolina e outros compostos não identificados; já o extrato amônico desta não continha os compostos capsaicinoides. Ambos os extratos de pimentão vermelho continham luteolina e compostos não identificados, mas não apresentaram capsaicinoides. Como o EMPM era representativo dos demais extratos, por conter tanto capsaicinóides quanto luteolina, o foco deste trabalho foi avaliar os efeitos do EMPM sobre fenótipos microbianos nas concentrações 5; 2,5; 1,25 e 0,625 mg/ml, além de utilizar a capsaicina como controle comparativo em concentrações equivalentes às do extrato (25, 50 e 100 µg/ml). Os resultados da atividade antimicrobiana mostraram inibição parcial do crescimento das bactérias nas concentrações sub-MIC (MIC >5 mg/ml) de 5 e 2,5 mg/ml de EMPM. A capsaicina também inibiu parcialmente o crescimento das bactérias a 100 µg/ml, com exceção de S. liquefaciens a 37 ºC, cujo crescimento foi induzido em 50 e 25 µg/ml. A produção de violaceína foi reduzida pelo EMPM a 1,25 e 0,625 mg/ml, sem afetar o crescimento de C. violaceum. Ensaios com C. violaceum CV026, estirpe biosensora capaz de produzir o pigmento na presença de AI-1 exógeno, sugerem que o possível mecanismo de atuação do extrato sobre o sistema QS em C. violaceum 12472 é sobre a síntese do sinalizador, já que não foi observada inibição da produção de violaceína em CV026 pelo extrato. Contrariamente, a capsaicina incrementou a produção do pigmento na estirpe 12472, mas ensaios com a estirpe CV026 indicaram que a capsaicina não atua como sinalizador do QS, uma vez que esta não induziu a produção de violaceína nesta estirpe. Já a formação de biofilme foi incrementada na presença do EMPM, sendo consideravelmente maior em P. aeruginosa a 30 ºC. Igualmente, observou-se indução da formação de biofilme por capsaicina em S. liquefaciens (37 ºC) e P. aeruginosa (30 ºC). Porém, a capsaicina não teve efeito sobre a formação de biofilme de S. liquefaciens quando cultivada a 30 ºC, nem P. aeruginosa a 37 ºC. Os resultados revelam que a produção de violaceína em C. violaceum ATCC 12472 é inibida pelo EMPM, mas não pela capsaicina. Já, o EMPM e a capsaicina, de forma geral, não inibem a formação de biofilme de S. liquefaciens MG1 nem P. aeruginosa PAO1. Outros estudos são necessários para elucidar os mecanismos pelos quais o EMPM e a capsaicina agem sobre os fenótipos avaliados neste trabalho. / Quorum sensing inhibition alters bacterial communication by reducing virulence factors expression and biofilm formation, exerting less selective pressure compared to antibiotics. Fruits and vegetables are rich sources of compounds with potential QS-inhibition properties. However, there are few references about the potential of peppers belonging to the genus Capsicum and its isolated compounds as QS inhibitors. This study aimed to assess the effect of organic extracts obtained from Capsicum varieties, pimenta-malagueta (red chili) and pimentão vermelho (red bell pepper), on the AI-1 dependent QS system. The extracts were obtained by solid phase extraction and split into a methanolic and an ammonic fraction. Characteristic compounds were identified and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The antimicrobial activity of the extracts was assessed by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) and the growth curve of Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. The anti-QS effect of the extracts was evaluated by the agar diffusion assay and the quantification of violacein production was assessed in liquid medium by C. violaceum, as well as in the biofilm formation test determined by the crystal violet assay and confocal microscopy with S. liquefaciens and P. aeruginosa at 30 ºC and 37 ºC. HPLC results showed that the methanolic extract of pimenta-malagueta (EMPM) contained capsaicinoids such as capsaicin and dihidrocapsaicin, luteolin and other unidentified compounds in lower concentrations; while its ammonic extract did not have capsaicinoids. Both pimentão vermelho extracts contained luteolin and other unidentified compounds in low concentrations, but they did not contain capsaicinoids. As EMPM was representative among the extracts because it contained capsaicinoids and luteolin, the focus of this work was to assess the effect of EMPM over microbial phenotypes at concentrations of 5, 2.5, 1.25 and 0.625 mg/ml, using capsaicin as a comparative control at equivalent concentrations to those in EMPM (25, 50 and 100 µg/ml). Antimicrobial activity assays showed a partial inhibition growth of bacteria at sub-MIC concentrations (MIC >5 mg/ml) of EMPM at 5 and 2.5 mg/ml. Similarly, capsaicin partially inhibited bacterial growth at 100 µg/ml, except for S. liquefaciens at 37 ºC in which growth was induced at 50 and 25 µg/ml. Violacein production was reduced by EMPM at 1,25 and 0,625 mg/ml without affecting C. violaceum growth. Assays with C. violaceum CV026, a biosensor strain that produces violacein in the presence of exogenous AI-1, suggest that EMPM reduced violacein production in C. violaceum 12472 by interfering with the AI-1 synthesis. In contrast, capsaicin incremented violacein synthesis in strain 12472, but experiments with strain CV026 revealed that capsaicin does not function as an analog of AI-1. Biofilm formation was increased in EMPM presence, being remarkably superior in P. aeruginosa cultivated at 30 ºC, as opposed to cultivation at 37 ºC. Similarly, capsaicin induced biofilm formation in S. liquefaciens (37 ºC) and P. aeruginosa (30 ºC). However, capsaicin did not affect biofilm formation on S. liquefaciens cultured at 30 ºC, neither on P. aeruginosa at 37 ºC. These results show that violacein production in C. violaceum ATCC 12472 is inhibited by EMPM, but not by capsaicin. In general, EMPM and capsaicin did not inhibit biofilm formation in S. liquefaciens MG1 neither in P. aeruginosa PAO1. More studies are necessary to elucidate the mechanisms by which EMPM and capsaicin affect the studied phenotypes in this work.