Parmi les couples avec un projet parental, le facteur masculin d’infertilité est responsable d’environ 20%. Malgré de longues années d’activités d’assistance médicale à la procréation, un nombre important de cas reste idiopathiques. Considérant le nombre élevé des gènes potentiellement impliqués dans la gamétogenèse, il est fort probable que la majorité des formes ‘idiopathiques’ sont d’origine génétique. Dans l'étude présente, nous avons d’identifier deux nouveaux gènes impliqués dans une infertilité masculine. Nos données suggèrent que la mutation dans TEX15 puisse corréler avec une diminution du nombre de spermatozoïdes au fil du temps. Un test diagnostique identifiant la mutation chez un patient pourrait fournir une indication d’organiser au plus tôt une cryopréservation du sperme. On a aussi identifié MAGEB4 liées à l’X comme un nouveau gène impliqué dans une infertilité masculine héritée. Cette étude fournit le premier indice sur la fonction physiologique d'une protéine MAGE. / Among couples with a desire for a child, male factor is responsible approximately 20%. Despite long years of assisted reproductive activities, a significant number of cases remain idiopathic. Considering the high predicted number of genes involved in male gametogenesis, it is likely that most ‘idiopathic’ forms may have a genetic origin. In the present study, we have defined two new genes implicated in male infertility. Our data suggested that a nonsense mutation in TEX15 correlates with a decrease in sperm count over time. A diagnostic test identifying the mutation in man could provide an indication of spermatogenic failure and prompt patients to undertake sperm cryopreservation at an early age. We also identified MAGEB4 as a new X-linked gene involved in an inherited male infertility. This study provides the first clue on the physiological function of a MAGE protein.

La déficience intellectuelle (DI) est définie comme un dysfonctionnement intellectuel général inférieur à la moyenne, qui s'accompagne de limitations significatives du fonctionnement adaptatif (DSM-V). Il s'agit d'un handicap fréquent qui concerne près de 3% de la population générale. L'identification de l'étiologie d'une DI est une question primordiale car elle permet d'optimiser la prise en charge des patients sans risque de passer à côté d'une cause curable, et d'évaluer le risque de récidive dans la famille afin d'offrir un conseil génétique pour les grossesses à venir. Malgré les récents progrès, l'étiologie de la maladie reste inconnue dans près de 40% des cas. Le démembrement des causes génétiques et la compréhension des bases physiopathologiques des DI constituent donc un grand défi scientifique et médical. Par ailleurs, l'identification des gènes impliqués dans les DI et le décryptage des processus cellulaires sous-jacents à ces phénotypes sont une approche de choix pour étudier le développement et la plasticité cérébrale chez l'homme d'une part et entrevoir le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques d'autre part. Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit s'inscrit dans cette thématique de recherche et a porté sur l'analyse, par la méthode de Whole Exome Sequencing (WES), de cinq familles indépendantes dans lesquelles ségrège une forme syndromique de DI. La première partie détaille les résultats obtenus pour l'analyse de trois familles consanguines dans lesquelles ségrège une DI autosomique récessive. La seconde partie présente l'étude de deux familles indépendantes dont les enfants atteints présentent une clinique très semblable. Au total, ce mémoire décrit l'identification de i) deux gènes précédemment associés à la DI (WDR62 et AP4M1), ii) deux gènes candidats (RAD54B et HERC2), potentiels modificateurs des symptômes observés, puis iii) la définition d'un nouveau mode d'hérédité, et enfin iv) la caractérisation de deux nouveaux gènes impliqués dans la DI (TTI2 et NONO) suivie des études fonctionnelles des efiets des mutations sur les cellules de patients et l'analyse d'un modèle murin Nonogt. / Intellectual deficiency (ID) is characterized by a broad range of deficits in higher brain functions that result in significant limitations in adaptive and cognitive capacities required for competence in daily living, communication, social interaction and integration, self-direction, and work (DSM-V). ID affects approximately 3% of the population. Identifying ID causes is essential to improve patients' care services with no risk to miss a curable cause, but also to provide genetic counselling to the family for future pregnancies. Little is known about the biological bases of these conditions. Indeed, despite recent advances in cytogenetic and molecular genetics, the cause of the mental handicap remains unexplained in 40% of the cases. Understanding the molecular bases of these disorders is therefore an important medical challenge for the next years. Also, ID genes identification and analysis of the cellular mechanisms underlying these conditions should provide significant insight into the molecular and cellular pathways involved in cognition and may lead to new therapeutic trials aiming at improving the daily living of these patients and their families. The PhD work presented here report on the analysis, using Whole Exome Sequencing (WES), of five different families presenting with syndromic ID. The first part develops results from the analysis of three consanguineous families with an autosomal recessive form of ID. The second part presents the study of 2 unrelated male ID patients who presented the same clinical features. Overall, this work allowed the identification of i) two genes previously associated with ID (WDR62 and AP4M1), ii) two candidate genes (RAD54B and HERC2), potential modifiers of the phenotype, then iii) the definition of a novel hereditary mode, and finally iv) the characterization of two new genes of ID (TTI2 and NONO) followed by the functional analysis of mutations effects in patients' cells and the Nonogt mouse model.

Les syndromes oro-facio-digitaux (OFD) sont caractérisés par la présence d'une atteinte orale, faciale et digitale et classés en 13 sous-types. Pendant longtemps seul le gène OFD1, responsable du type I et codant pour une protéine centrosomale et du corps basal, était principalement connu, faisant suspecter l’implication du cil primaire dans les syndromes OFD. Des mutations ont été rapportées plus récemment dans les gènes TMEM216, DDX59, SCLT1, TBC1D32 et TCTN3 chez un ou deux patients. Dans le but d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans ces syndromes, nous avons réalisé une stratégie de séquençage haut débit d’exome chez 24 patients. Cette stratégie a permis d’identifier 5 nouveaux gènes (C2CD3, TMEM107, INTU, KIAA0753, IFT57), d'étendre aux syndromes OFD le spectre clinique de 3 gènes déjà connus dans d'autres ciliopathies (C5orf42, TMEM138, TMEM231) et de confirmer l'implication de 3 gènes déjà connus comme responsable de syndrome OFD (OFD1, DDX59, WDPCP). Les analyses fonctionnelles ont montré l’implication de la croissance centriolaire, de la zone de transition et du transport intraflagellaire, avec notamment la caractérisation de 3 complexes protéiques principaux : le complexe ternaire KIAA0753/OFD1/FOPNL, régulant la croissance centriolaire, le complexe MKS (TMEM107, TMEM231, TMEM216) constituant majeur de la zone de transition et le complexe CPLANE (INTU/FUZ/WDPCP), favorisant l’assemblage des protéines périphériques du complexe de transport intraflagellaire IFT-A. En conclusion, cette étude, la plus importante consacrée aux syndromes OFD, démontre la très grande hétérogénéité clinique et génétique de ces syndromes, de même que de nombreux allélismes avec d’autres ciliopathies. Elle étend à 15 le nombre de gènes causaux, rendant la classification clinique initiale totalement obsolète et permettant de considérer les syndromes OFD comme un nouveau sous-groupe de ciliopathies à part entière. / Oral-facial-digital syndromes (OFDS) are characterized by the association of oral, facial and digital anomalies. The different modes of inheritance and additional features lead to clinically delineate 13 subtypes. For a long time, only the OFD1 gene, responsible for OFDI subtype and coding for a centrosomal protein, has been known, suggesting the involvement of the primary cilium in OFDS. Mutations have recently been reported in the TMEM216, DDX59, SCLT1, TBC1D32 and TCTN3 genes in anecdotic cases. To identify new genes involved in OFDS, we performed whole-exome sequencing in 24 patients. In 14/24 cases, we identified 5 novel genes (C2CD3, TMEM107, INTU, KIAA0753, IFT57), enlarged the clinical spectrum of OFDS of 3 known genes responsible for other ciliopathies (C5orf42, TMEM138, TMEM231) and confirmed the involvement of 3 known genes in OFDS (OFD1, DDX59, WDPCP). Functional studies demonstrated the involvement of the centriolar growth, the transition zone and the intraflagellar transport, through the characterization of 3 major protein complexes: the KIAA0753/OFD1/FOPNL complex controlling the centriole elongation, the MKS module (TMEM107/TMEM231/TMEM216), an essential component of the transition zone, and the CPLANE complex (INTU/FUZ/WDPCP) enabling in the IFT-A assembly. We demonstrated the large clinical and genetic heterogeneity of OFDS, yielding the initial classification in 13 subtypes obsolete, extending the number of 15 causal genes, and confirming OFDS as a new full subgroup of ciliopathies.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22341号 / 医博第4582号 / 新制||医||1042(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 髙折 晃史, 教授 羽賀 博典, 教授 伊藤 貴浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

L’histiocytose langerhansienne (HL) est la plus fréquente des histiocytoses, liée à l’accumulation de cellules pathologiques de phénotype langerhansien. La découverte de la mutation somatique BRAFV600E dans environ 50% des cas à ouvert un nouveau champ d’investigation pour tirer bénéfice de ce statut moléculaire pour la prise en charge des patients.Tout d’abord, nous avons montré l’efficacité des inhibiteurs de BRAF sans rapporter de résistance dans les formes actives d’HL, en particulier dans les formes multisystémiques avec atteinte des organes à risque (MS OR+) du nourrissons, confirmant le rôle driver de cette mutation dans l’HL. Toutefois, après l’arrêt du traitement administré durant 2 à 6 mois, de nombreuses récidives ont été constatées.Ensuite, nous avons montré que pour les enfants atteints d’HL, la mutation BRAFV600E était significativement associée aux formes MS OR+, retrouvée dans 87,8% de ces cas. Comparés aux patients non mutés BRAF, les patients avec la mutation BRAFV600E présentaient un taux de résistance plus élevé à la chimiothérapie de première ligne velbé - corticoïde (21,9% contre 3,3%), un taux plus élevé de réactivation à 5 ans (42,8% contre 28,1%) et un taux de séquelles supérieur (27,9% contre 12,6%).Par ailleurs, nous avons montré que, pour les HL BRAFV600E mutées, la quantification de BRAFV600E dans l’ADN libre circulant par PCR digitale en gouttelette était un biomarqueur pertinent pour les cas d’HL MS OR+ et les présentations résistantes au traitement de première ligne.Enfin, après un criblage de points chauds mutationnels d’une série d’échantillons tissulaires d’HL ayant permis de mettre en évidence un cas avec la mutation somatique PIK3CAE542K, 9 couples d’échantillons tumeur/constitutionnel ont été étudiés par séquençage d’exome. Cela nous a permis de mettre en évidence une mutation récurrente (n=2) de BRAF au niveau du site d’épissage 5’ (donneur) de l’intron 12. Selon l’analyse de l’ARN, cette mutation conduirait à l’insertion de 3 acides aminés (LLR) dans le domaine kinase de la protéine mutée, dont l’analyse fonctionnelle est en cours. / Langerhans cell histiocytosis (LCH) is the most common type of histiocytosis owing to accumulation of pathologic CD1a+ CD207+ histiocytes. The identification of BRAFV600E in more than half of patients with LCH has launched a new field of investigation to study potential patient’s management benefits and implications from this molecular status.First, in BRAFV600E mutated LCH, we reported the effectiveness of BRAF inhibitors. Efficacy with no resistance to vemurafenib was reported in all cases with active LCH disease, especially for multi-system LCH with risk organ (MS RO+) involvement, confirming the driver status of this mutation in LCH. However, after discontinuation of this treatment administered during 2-6 months, many recurrences were observed.Then, we showed that children with BRAFV600E mutated LCH manifested more severe disease, comprised 87.8% of patients with MS RO+ involvement. Compared to patients with wild-type BRAF, patients with BRAFV600E more commonly displayed resistance to combined vinblastine and corticosteroid therapy (21.9% vs. 3.3%), showed a higher 5-year reactivation rate (42.8% vs. 28.1%) and had more long-term permanent consequences (27.9% vs. 12.6%).Moreover, we showed that BRAFV600E quantification in circulating cell-free DNA by droplet digital PCR is a relevant biomarker to monitor response to therapy for MS RO+ LCH and RO- LCH children who failed to respond to first line chemotherapy.Finally, after the screening of LCH biopsy (n=86) for the BRAF, KRAS, NRAS and PI3KCA most common mutations, leading to highlight one case with the PIK3CAE542K somatic mutation, 9 paired tumor-normal samples from children with LCH were analyzed by whole exome sequencing. Data showed a new BRAF recurrent mutation (n=2) in the 5′ splice sites of the intron 12. According to RNA analysis, this mutation would lead to the insertion of 3 amino acids (LLR) in the smaller N-terminal lobe of the BRAF kinase domain. Functional analysis is ongoing.

Bc. Klára Horáčková DIPLOMA THESIS Mechanisms of immune dysregulation leading to inflammatory bowel disease Abstract Inflammatory bowel disease (IBD) is a complex disorder characterized by chronic inflammation of the gastrointestinal tract. Classical IBD is a multifactorial disease with adulthood or later-childhood onset. However, children with very early onset IBD (VEO-IBD, before 6 years of age) are a specific cohort, whose pathology can be caused by severe genetic defects in genes connected to immune homeostasis in the gut. We aimed to identify the causal genetic variants in 20 pediatric patients diagnosed with IBD (age of onset from 3 to 154 months) using whole exome sequencing (WES). We evaluated several bioinformatical approaches for WES data analysis. This included a comparison of two methods of variant identification using VarScan2 or GATK4-based tools. Furthermore, we compared 4 gene lists ("virtual panels") for variant filtering, one of which was compiled purposefully for this thesis. We identified and validated via segregation analysis 5 causal variants in 4 genes (DUOX2 compound heterozygote, FOXP3, NLRP3 and NOD2) accounting for 20 % of the cohort. NOD2 (p.A755V) variant has already been reported in IBD cases, while DUOX2 (p.R1216W + p.A1131T), FOXP3 (p.H400L) and NLRP3 (p.V200M) were newly...

Genetic factors account for about half of Alzheimers Disease (AD) risk and only about a quarter of that heritability is accounted for by known variants. Family based approaches to understanding AD genetics may be an effective way to identify additional risk factors. Here we report the results of whole exome sequencing (WES) and analyses done on pairs of AD affected cousins from 19 families from the Utah Population Database (UPDB) with a statistical excess of AD risk. WES variants passing quality control were additionally filtered by population frequency (minor allele <<> 0.01) and concordance between cousin pairs, resulting in 564 variants shared by at least one pair of cousins. For each of these variants we conducted in depth annotations using Ingenuity Variant Analysis (IVA), Wellderly Data Allele Frequencies, and literature searches. To further aid in variant prioritization we analyzed each variant for association with Age at Onset of AD, AD Risk, CSF AB42, CSF Tau, CSF PTau and Rate of Disease Decline in data from the Alzheimers Disease Genetics Consortium (ADGC) and from the Knight Alzheimers disease research center. Statistical analyses were conducted using PLINK. Twelve variants (rs201665195, rs28933981, rs148294193, rs147599881, rs61729902, rs140129800, rs191804178, rs200290640, rs199752248, rs45541434, rs141402160 and rs140914494) in eight genes (ABCA7, TTR, PELI3, FCHO1, SNAP91, COX6A2, MUC16, PIDD1, SYT5 and NOTCH3) were prioritized using a clear pipeline of IVA filters and the additional analysis information. We propose that these genes and variants are the most interesting for follow-up based on current knowledge.This family-based approach to finding rare AD variants adds to a growing body of research suggesting a role for NOTCH3 in late-onset AD. This approach replicated two known AD risk variants and also implicated novel putative risk AD variants and genes. These results suggest that further application of this method of using pairs of cousins may result in additional insights into AD genetics and the ability to find novel rare, causal AD variants.

Identification of recurrent mutations through next-generation sequencing (NGS) has given us a deeper understanding of the molecular mechanisms involved in chronic lymphocytic leukemia (CLL) development and progression and provided novel means for risk assessment in this clinically heterogeneous disease. In paper I, we screened a population-based cohort of CLL patients (n=364) for TP53, NOTCH1, SF3B1, BIRC3 and MYD88 mutations using Sanger sequencing, and confirmed the negative prognostic impact of TP53, SF3B1 or NOTCH1 aberrations, though at lower frequencies compared to previous studies. In paper II, we assessed the feasibility of targeted NGS using a gene panel including 9 CLL-related genes in a large patient cohort (n=188). We could validate 93% (144/155) of mutations with Sanger sequencing; the remaining were at the detection limit of the latter technique, and technical replication showed a high concordance (77/82 mutations, 94%). In paper III, we performed a longitudinal study of CLL patients (n=41) relapsing after fludarabine, cyclophosphamide and rituximab (FCR) therapy using whole-exome sequencing. In addition to known poor-prognostic mutations (NOTCH1, TP53, ATM, SF3B1, BIRC3, and NFKBIE), we detected mutations in a ribosomal gene, RPS15, in almost 20% of cases (8/41). In extended patient series, RPS15-mutant cases had a poor survival similar to patients with NOTCH1, SF3B1, or 11q aberrations. In vitro studies revealed that RPS15mut cases displayed reduced p53 stabilization compared to cases wildtype for RPS15. In paper IV, we performed RNA-sequencing in CLL patients (n=50) assigned to 3 clinically and biologically distinct subsets carrying stereotyped B-cell receptors (i.e. subsets #1, #2 and #4) and revealed unique gene expression profiles for each subset. Analysis of SF3B1-mutated versus wildtype subset #2 patients revealed a large number of splice variants (n=187) in genes involved in chromatin remodeling and ribosome biogenesis. Taken together, this thesis confirms the prognostic impact of recurrent mutations and provides data supporting implementation of targeted NGS in clinical routine practice. Moreover, we provide evidence for the involvement of novel players, such as RPS15, in disease progression and present transcriptome data highlighting the potential of global approaches for the identification of molecular mechanisms contributing to CLL development within prognostically relevant subgroups.

Le système immunitaire est particulièrement dépendant des mécanismes de réparation de l’ADN, en effet le développement du système immunitaire adaptatif nécessite certains mécanismes de réparation de l’ADN, lors de la recombinaison V(D)J et lors de la commutation de classe des immunoglobulines. De plus, le système hématopoïétique est par sa nature très sensible aux lésions spontanées de l’ADN. Il existe chez l’homme de nombreux déficits immunitaires directement liés à un défaut de réparation de l’ADN. L’identification du gène responsable est importante pour un conseil génétique familial approprié et pour la prise en charge médicale. Nous avons accès aujourd’hui à de puissants outils de dépistage génétique grâce au séquençage à haut débit et la liste des gènes responsables d’un déficit immunitaire s’allonge de plus en plus en rapidement. La première partie de ce travail porte sur la mise au point d’un nouvel outil de dépistage rapide des déficits de la réparation de l’ADN, en particulier dans le cas de déficit immunitaires. Ce test est fondé sur l’observation d’un biais du répertoire du TCRdes lymphocytes T circulants lorsque les thymocytes ont une durée de vie diminuée, or un défaut de réparation de l’ADN entraîne une diminution de la survie thymocytaire. Nous avons mis au point deux techniques, par biologie moléculaire et par cytométrie en flux, pour détecter un éventuel biais du répertoire du TCRα et évaluer la pertinence de ce test dans les déficits immunitaires liés à un défaut de réparation de l’ADN. Un biais a notamment été détecté dans les cas de déficit en facteur du NHEJ et en ATM. Nous avons également établi en collaboration avec le service d’Immunologie Clinique de l’hôpital Saint-Louis une cohorte de patients atteints de déficit immunitaire commun variable (DICV) dont la présentation clinique est évocatrice d’un défaut de réparation de l’ADN. Une série de test fonctionnels de dépistages de déficit de la réparation de l’ADN ainsi que des analyses génétiques (CGH array, séquençage complet de l’exome) ont été fait chez ces patients afin d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans les DICV. Parmi les 18 patients analysés, dans 5 cas on retrouve une sensibilité cellulaire accrue aux agents génotoxiques et chez 15 patients, un gène candidat a été identifié. Ces résultats sont encore préliminaires et la caractérisation génétique et fonctionnelle des mutations identifiées sera poursuivie par notre équipe. Pour finir, nous avons entrepris l’exploration génétique et fonctionnelle de deux mutations identifiées chez une jeune patiente atteinte de déficit immunitaire combiné (CID) associé à un syndrome lymphoprolifératif et une auto-immunité, et chez qui une hypersensibilité cellulaire à la Mitomycine C, agent pontant de l’ADN, a été détectée. La première mutation a été identifiée dans le gène ELKS qui code pour un facteur impliqué dans la réparation de l’ADN. La complémentation fonctionnelle de ce gène prouve l’implication de cette mutation dans l’hypersensibilité des cellules de la patiente à la MMC. Nous avons développé un modèle murin KO conditionnel de ce gène dans les cellules hématopoïétiques qui n’a pas montré de défaut de développement du système immunitaire. La deuxième mutation identifiée se situe dans le gène BACH2 codant pour un répresseur transcriptionnel très impliqué dans le développement du système immunitaire. Les souris KO pour ce gène ont un phénotype proche du déficit immunitaire décrit chez cette patiente. Les investigations de cette mutation sont en cours chez elle et chez les membres de sa famille également porteurs de la mutation. / The immune system is particularly dependent on DNA damage response (DDR) pathways. The development of the adaptive immune system requires certain DDR mechanisms, in particular during the V(D)J recombination and during class switch recombination (CSR), furthermore, the hematopoietic system is very sensitive to spontaneous DNA lesions. Therefore, there are many immune deficiencies in human directly related to a DDR deficiency. The identification of the responsible gene is important for appropriate genetic counseling. Today, we have access to powerful genetic screening tools, in particular next generation sequencing (NGS) and the list of genes responsible for immune deficiency is growing rapidly. The first part of this work focuses on the development of a new screening tool for DDR defects, in particular in the case of immune deficiency, and evaluation of clinical interest. This test is based on the observation of a bias of the TCRα repertoire in circulating T lymphocytes when thymocytes lifespan is diminished and we know that DDR defect causes decreased thymocyte survival. We have developed two techniques, by molecular biology and by flow cytometry, to detect a potential bias of the TCRα repetoire and assess the suitability of this test in some immunodeficiencies linked to a DDR defect. A significant bias was detected in the case of ATM and NHEJ factor deficiency. Furthermore, we have established a cohort of patients suffering from common variable immunodeficiency (CVID) with a clinical presentation highly suggestive of DDR defect, in collaboration with the Clinical Immunology Service of Hôpital Saint-Louis (Paris). Functional test for DDR defect and genetic analysis (CGHarray, whole exome sequencing) were performed in these patients to identify new genes involved in CVID. Among the 18 patients analyzed until now, five cases of cellular sensitivity to genotoxic agents have been detected and a candidate gene was identified in 15 of them. These results are still preliminary and our team will pursue genetic and functional characterization of the identified mutations. Finally, we undertook genetic and functional exploration of two mutations identified in a young patient with combined immunodeficiency (CID) associated with a lymphoproliferative disease and autoimmunity, and in whom a cellular hypersensitivity to mitomycin C, a DNA crosslinking agent, was detected. The first mutation was identified in the ELKS gene, which codes for a factor involved in DNA repair. Functional complementation of this gene demonstrates the involvement of this mutation in the hypersensitivity of patient’s cells to MMC. We have developed a conditional knockout mouse model of this gene in hematopoietic cells that did not show any defect in development of the immune system. The second mutation was identified in BACH2 gene encoding a transcriptional repressor involved in the development of the immune system. Knockout mice for this gene have a similar phenotype to the immune deficiency described in this patient. Investigations on this mutation are ongoing in the patient and among family members that also carry the mutation.

Le système immunitaire est particulièrement dépendant des mécanismes de réparation de l’ADN, en effet le développement du système immunitaire adaptatif nécessite certains mécanismes de réparation de l’ADN, lors de la recombinaison V(D)J et lors de la commutation de classe des immunoglobulines. De plus, le système hématopoïétique est par sa nature très sensible aux lésions spontanées de l’ADN. Il existe chez l’homme de nombreux déficits immunitaires directement liés à un défaut de réparation de l’ADN. L’identification du gène responsable est importante pour un conseil génétique familial approprié et pour la prise en charge médicale. Nous avons accès aujourd’hui à de puissants outils de dépistage génétique grâce au séquençage à haut débit et la liste des gènes responsables d’un déficit immunitaire s’allonge de plus en plus en rapidement. La première partie de ce travail porte sur la mise au point d’un nouvel outil de dépistage rapide des déficits de la réparation de l’ADN, en particulier dans le cas de déficit immunitaires. Ce test est fondé sur l’observation d’un biais du répertoire du TCRdes lymphocytes T circulants lorsque les thymocytes ont une durée de vie diminuée, or un défaut de réparation de l’ADN entraîne une diminution de la survie thymocytaire. Nous avons mis au point deux techniques, par biologie moléculaire et par cytométrie en flux, pour détecter un éventuel biais du répertoire du TCRα et évaluer la pertinence de ce test dans les déficits immunitaires liés à un défaut de réparation de l’ADN. Un biais a notamment été détecté dans les cas de déficit en facteur du NHEJ et en ATM. Nous avons également établi en collaboration avec le service d’Immunologie Clinique de l’hôpital Saint-Louis une cohorte de patients atteints de déficit immunitaire commun variable (DICV) dont la présentation clinique est évocatrice d’un défaut de réparation de l’ADN. Une série de test fonctionnels de dépistages de déficit de la réparation de l’ADN ainsi que des analyses génétiques (CGH array, séquençage complet de l’exome) ont été fait chez ces patients afin d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans les DICV. Parmi les 18 patients analysés, dans 5 cas on retrouve une sensibilité cellulaire accrue aux agents génotoxiques et chez 15 patients, un gène candidat a été identifié. Ces résultats sont encore préliminaires et la caractérisation génétique et fonctionnelle des mutations identifiées sera poursuivie par notre équipe. Pour finir, nous avons entrepris l’exploration génétique et fonctionnelle de deux mutations identifiées chez une jeune patiente atteinte de déficit immunitaire combiné (CID) associé à un syndrome lymphoprolifératif et une auto-immunité, et chez qui une hypersensibilité cellulaire à la Mitomycine C, agent pontant de l’ADN, a été détectée. La première mutation a été identifiée dans le gène ELKS qui code pour un facteur impliqué dans la réparation de l’ADN. La complémentation fonctionnelle de ce gène prouve l’implication de cette mutation dans l’hypersensibilité des cellules de la patiente à la MMC. Nous avons développé un modèle murin KO conditionnel de ce gène dans les cellules hématopoïétiques qui n’a pas montré de défaut de développement du système immunitaire. La deuxième mutation identifiée se situe dans le gène BACH2 codant pour un répresseur transcriptionnel très impliqué dans le développement du système immunitaire. Les souris KO pour ce gène ont un phénotype proche du déficit immunitaire décrit chez cette patiente. Les investigations de cette mutation sont en cours chez elle et chez les membres de sa famille également porteurs de la mutation. / The immune system is particularly dependent on DNA damage response (DDR) pathways. The development of the adaptive immune system requires certain DDR mechanisms, in particular during the V(D)J recombination and during class switch recombination (CSR), furthermore, the hematopoietic system is very sensitive to spontaneous DNA lesions. Therefore, there are many immune deficiencies in human directly related to a DDR deficiency. The identification of the responsible gene is important for appropriate genetic counseling. Today, we have access to powerful genetic screening tools, in particular next generation sequencing (NGS) and the list of genes responsible for immune deficiency is growing rapidly. The first part of this work focuses on the development of a new screening tool for DDR defects, in particular in the case of immune deficiency, and evaluation of clinical interest. This test is based on the observation of a bias of the TCRα repertoire in circulating T lymphocytes when thymocytes lifespan is diminished and we know that DDR defect causes decreased thymocyte survival. We have developed two techniques, by molecular biology and by flow cytometry, to detect a potential bias of the TCRα repetoire and assess the suitability of this test in some immunodeficiencies linked to a DDR defect. A significant bias was detected in the case of ATM and NHEJ factor deficiency. Furthermore, we have established a cohort of patients suffering from common variable immunodeficiency (CVID) with a clinical presentation highly suggestive of DDR defect, in collaboration with the Clinical Immunology Service of Hôpital Saint-Louis (Paris). Functional test for DDR defect and genetic analysis (CGHarray, whole exome sequencing) were performed in these patients to identify new genes involved in CVID. Among the 18 patients analyzed until now, five cases of cellular sensitivity to genotoxic agents have been detected and a candidate gene was identified in 15 of them. These results are still preliminary and our team will pursue genetic and functional characterization of the identified mutations. Finally, we undertook genetic and functional exploration of two mutations identified in a young patient with combined immunodeficiency (CID) associated with a lymphoproliferative disease and autoimmunity, and in whom a cellular hypersensitivity to mitomycin C, a DNA crosslinking agent, was detected. The first mutation was identified in the ELKS gene, which codes for a factor involved in DNA repair. Functional complementation of this gene demonstrates the involvement of this mutation in the hypersensitivity of patient’s cells to MMC. We have developed a conditional knockout mouse model of this gene in hematopoietic cells that did not show any defect in development of the immune system. The second mutation was identified in BACH2 gene encoding a transcriptional repressor involved in the development of the immune system. Knockout mice for this gene have a similar phenotype to the immune deficiency described in this patient. Investigations on this mutation are ongoing in the patient and among family members that also carry the mutation.