Associer les thérapies ciblées et la chimiothérapie cytotoxique constitue un axe thérapeutique extrêmement prometteur en oncologie clinique. La combinaison des fluoropyridines orales de dernière génération (capécitabine) aux inhibiteurs de tyrosine kinase (erlotinib, lapatinib)a ainsi été proposée dans divers contextes cliniques, avec une efficacité variable, allant de l'échec (pancréas) à la réponse thérapeutique (sein). L'objectif de ce travail de recherche est de dégager, sur des modèles expérimentaux non-cliniques, un rationnel pharmacologique d'utilisation de la capécitabine avec divers TKI. Ce travail se focalise notamment sur l'étude de la modulation des déterminants de réponse aux drogues dans les modèles pancréatiques(association capecitabine + erlotinib) et mammaires (capecitabine + lapatinib). Nous avons ainsi pu montrer les effets délétères de l'association erlotinib-capecitabine dans les modèles pancréatiques chimio-résistants, liés d'une part à un effet represseur de l'expression du récepteur à l'EGF par la capécitabine, combiné à une sécrétion exocrine de VEGF en réponse aux diverses séquences d'association testées. Ces effets se sont soldés par l'obtention de réponses antagonistes aux drogues combinées, comparativement aux monothérapies respectives. Nos données suggèrent que quelle que soit la séquence d'utilisation envisagée,capecitabine et erlotinib ne devraient jamais faire l'objet d'association. A contrario, l'étude de l'association lapatinib-capecitabine sur diverses lignées mammaires a permis de mettre en évidence un effet positif allant de la supra-additivité à la synergie. Nos données suggèrent que c'est d'une part par une dérégulation de la thymidylate syntahse par le lapatinib qu'une plus grande efficacité anti-proliférative est obtenue. Par ailleurs, une meilleure inhibition de la voie p-AKT après exposition à la capécitabine des cellules traitées par le lapatinib pourraitde surcroît expliquer la synergie observée. Nos données suggèrent qu'une utilisation concomitante de ces deux molécules devrait garantir un gain d'efficacité optimal. La synergie de l'association a été conservée sur un modèle de souris porteuses de tumeurs mammaires ectotopiques et traitées de façon concomitante, avec un net ralentissement de la croissance tumorale comparativement aux animaux traités par monothérapie, sans augmentation de la toxicité médicamenteuse.En conclusion, nos données illustrent le fait que les associations thérapiesciblées/antimétabolites doivent faire l'objet systématiquement d'un travail préalable de recherche des déterminants oncopharmacologiques d'efficacité afin d'anticiper le gain d'efficacité qu'on est en droit d'en tirer, et d'identifier au mieux les modalités d'association de ces drogues. / Optimizing cancer treatments remains an on going task. The rise over the last decade of a new class of anticancer agents (the so-called “targeted therapies”) has fuelled agreat hope in the search for achieving better response with lower toxicities. To date,the actual efficacy of targeted therapies used alone looks in some respect below the initial expectations, and associating them with classic cytotoxic drugs represents therefore a new promising combinational strategy in clinical oncology. However, littleis known on the pharmacologic rationale for combing these drugs, and identifying molecular determinants could help to rationalize the way the drugs should beassociated. Anti-EGFR erlotinib (Tarceva®) has been approved for the treatment of patients with metastatic pancreatic cancer, in combination with a standard chemotherapy, gemcitabine, both in the USA and in Europe. Its combination with capecitabine has recently been tested in patients with gemcitabine-refractorypancreatic tumours, with limited success. Lapatinib (Tykerb®) is an innovative small molecule with unique dual-TK inhibitory action against both HER1 and HER2.Lapatinib showed clinical efficacy in various models and has heightened the expectation for new breast cancer therapies. Associating lapatinib with capecitabine(Xeloda®) has been recently approved for the treatment of patients with HER2+metastatic breast cancer, after failure of trastuzumab treatment, both in the USA andin Europe as well. The aim of our work was to study, either in vitro or in tumor bearing animals, the effects of these drugs used either alone or in combination. In this preclinical study, we studied the molecular determinants of this new targeted therapies + antimetabolite association on various, representative human pancreatic and breast cancer cell lines. Efficacy and apoptosis experiments were performed after concomitant and various sequential combinations, along with study ofresponse/resistance determinants such as dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD),thymidylate synthase (TS), thymidine phosphorylase (TP), Bax, Bcl-2, P21 andHER1/2 signaling pathway. Determination of Chou & Talalay combination indices (CI)allowed us to determine whether the tested associations led to synergism, additivity or antagonism. The best sequences found were transposed to tumor-bearing animal model for in vivo confirmation of the efficacy observed in vitro. Lapatinib andcapecitabine showed additive to moderate synergistic effects in our breast cancer celllines. Further experiments were performed to identify the mechanisms underlyingthis efficacy. We first found that lapatinib down-regulates thymidylate synthase (-30%) but did not have any effect on dihydropyrimidine dehydrogenase levels, thussuggesting theoretically a better cytotoxic effect of capecitabine within tumor cellspreliminary exposed to Lapatinib. Besides, capecitabine, when added to lapatinib,strongly down-regulates P-AKT and p-P42/44, thus allowing a deeper inhibition of the downstream signaling pathway after inhibition of HER1 and HER2. Muchinterestingly, we showed as well an increase of the Bax/Bcl2 ratio in cells exposed toboth drugs, leading to the enhancement of apoptosis induction and cell death. Thisfinding is fully consistent with the fact that the association of lapatinib andcapecitabine led to an increase of the P21 protein expression and consequently tothe arrest of cell cycle indeed. Besides, in pancreatic cancer cell lines, wedemonstrated that erlotinib up-regulated thymidine phosphorylase (+50%) anddown-regulated dihydropyrimidine dehydrogenase (-55%), thus suggestingtheoretically a better activation of capecitabine within tumor cells preliminaryexposed to erlotinib. We checked as well that Bax, P27, p-AKT were fully functionalin our models. Nevertheless, when not antagonist, only moderate additive effectswere achieved. To understand these rather surprising results, further experimentswere performed to identify the putative causes of this lack of efficacy. We first foundthat capecitabine down-regulates EGFR (-35%) in capan-1 cells with no effect on itsdownstream signalisation pathway nor antiproliferative related effects, thussuggesting a possible loss of efficacy when cells were subsequently treated witherlotinib due to the diminution of its target. Much interestingly, we showed as well adramatic overexpression of both cytosolic (+100 up to +1900%) and extra-cellular(+100 up to 3500%) VEGF secretion in response to our treatments, leading possibly to a boost in cell proliferation. Taken together, this in vitro study suggests that themore-than-additive efficacy observed when associating lapatinib and capecitabine inbreast cancer is based upon TS modulation and down-regulation of HER1/2 signalingpathways, resulting in apoptosis and cell death eventually. In vivo experiments are ongoing to fully confirm these data. Concerning the erlotinib/capecitabineassociation in pancreatic cancers, we suggest that VEGF secretion could be a new,major mechanism of resistance to the erlotinib + capecitabine association inpancreatic cancers, and, possibly, to other targeted therapy + antimetabolitescombinations. To test this hypothesis, further experiments including the use of anti-VEGF bevacizumab will be undertaken.

Le cancer est un véritable problème de santé publique et représentera en 2010 la première cause de mortalité dans le monde. La lutte contre cette maladie est donc, plus que jamais, un enjeu capital. Les processus tumoraux associés à la carcinogénèse, tels que la métastase, l'invasion ou l'angiogenèse, dépendent étroitement de la composition du milieu extracellulaire, lui-même affecté par la sécrétion de protéines par les cellules tumorales. La mutation ou la variation d'expression de facteurs pro- ou anti-oncogénique joue un rôle important dans le développement et la progression de la tumeur. Durant ce travail de thèse, nous avons voulu apporter des éléments de réponse à la problématique suivante : l'étude par protéomique des protéines sécrétées par la tumeur apporte t'elle des informations contribuant à la compréhension des mécanismes de la tumorogenèse et peut elle permettre de mettre en valeur de nouvelles cibles d'intérêt clinique ? Nous avons ciblé notre étude sur le cancer du poumon, le plus fréquent au niveau mondial tant en terme d'incidence que de mortalité. Ce cancer présente le plus fort taux de mutation du gène p53, un anti-oncogène clé de la cellule. Cette perte de fonction module la sécrétion de nombreuses protéines dont l'investigation est primordiale, bien que paradoxalement, peu étudiée. Notre travail s'est ainsi focalisé sur l'étude de l'influence de p53 sur la modulation de la sécrétion de protéines par les tumeurs du poumon. Nous avons ainsi développé un procédé d'analyse protéomique adapté, basé notamment sur un marquage iTRAQ, une séparation par isoélectrofocalisation de type OFFGEL et une analyse LC-MALDI-MS/MS. Ce procédé a été appliqué à l'étude du rôle joué par l'expression conditionnelle de p53 sur la modulation du secretome d'une lignée cellulaire d'adénocarcinome du cancer du poumon non à petites cellules. Plusieurs protéines d'intérêt ont ainsi été caractérisées et confirmées in vivo chez la souris au niveau tumoral et plasmatique. Ces résultats apportent une meilleure compréhension du rôle primordial joué par l'altération de p53 dans la modulation de l'environnement tumoral et font des secretomes cellulaires un modèle de choix pour l'identification de marqueurs tumoraux.

Au-delà de l'intérêt cognitif de la démarche, la compréhension des mécanismes qui régissent le développement pancréatique humain reste la clé pour décrypter les acteurs physiopathologiques des maladies du pancréas et pour développer des approches thérapeutiques innovantes. En outre, alors que la cellule bêta de rongeurs et la cellule bêta humaine partagent un grand nombre de similitudes, certaines données indiquent également des différences marquées entre les espèces. L'absence de systèmes expérimentaux robustes , à partir de matériel humain, n'a pas permis un examen détaillé du développement pancréatique humain jusqu'à présent. Dans le laboratoire, il a été précédemment validé un modèle de xénogreffe de pancréas immature humain sous la capsule rénale de souris immuno-incompétentes SCID. Il a été démontré que celui-ci permettait de récapituler l'ensemble des étapes du développement endocrine humain. Néanmoins le site de greffe limitait les possibilités de modifier ce développement, notamment par infection virale. Dans ce travail, nous avons développé et validé un nouveau site de greffe dans le muscle squelettique, plus simple et plus superficiel. En outre, nous démontrons qu'il est possible de créer un pancréas humain partiellement transgénique in vivo en réalisant du transfert de gènes médié par des lentivirus, après injection directe de la solution virale dans le greffon. Ce modèle de greffe dans le muscle est une nouvelle approche permettant d'envisager des études longitudinales, dans lesquelles il serait possible d'étudier la régulation de certains gènes ou le devenir de certaines lignées marquées par des gènes rapporteurs apportés par le virus à différents stades de développement.

Au-delà de l’intérêt cognitif de la démarche, la compréhension des mécanismes qui régissent le développement pancréatique humain reste la clé pour décrypter les acteurs physiopathologiques des maladies du pancréas et pour développer des approches thérapeutiques innovantes. En outre, alors que la cellule bêta de rongeurs et la cellule bêta humaine partagent un grand nombre de similitudes, certaines données indiquent également des différences marquées entre les espèces. L'absence de systèmes expérimentaux robustes , à partir de matériel humain, n'a pas permis un examen détaillé du développement pancréatique humain jusqu’à présent. Dans le laboratoire, il a été précédemment validé un modèle de xénogreffe de pancréas immature humain sous la capsule rénale de souris immuno-incompétentes SCID. Il a été démontré que celui-ci permettait de récapituler l’ensemble des étapes du développement endocrine humain. Néanmoins le site de greffe limitait les possibilités de modifier ce développement, notamment par infection virale. Dans ce travail, nous avons développé et validé un nouveau site de greffe dans le muscle squelettique, plus simple et plus superficiel. En outre, nous démontrons qu’il est possible de créer un pancréas humain partiellement transgénique in vivo en réalisant du transfert de gènes médié par des lentivirus, après injection directe de la solution virale dans le greffon. Ce modèle de greffe dans le muscle est une nouvelle approche permettant d’envisager des études longitudinales, dans lesquelles il serait possible d’étudier la régulation de certains gènes ou le devenir de certaines lignées marquées par des gènes rapporteurs apportés par le virus à différents stades de développement. / Whilst sporadic human genetic studies have permitted some comparisons between rodent and human pancreatic development, the lack of a robust experimental system has not permitted detailed examination of human pancreatic development. We previously developed a xenograft model of immature human fetal pancreas grafted under the kidney capsule of immune-incompetent mice, which allowed the development of human pancreatic beta cells. Here, we compared the development of human and murine fetal pancreatic grafts either under skeletal muscle epimysium or under the renal capsule. We demonstrated that human pancreatic beta cell development occurs) both by differentiation of pancreatic progenitors and by proliferation of developing beta cells. The superficial location of the skeletal muscle graft and its easier access permitted in vivo lentivirus-mediated gene transfer which targeted specific cells. This model of engraftment under the skeletal muscle epimysium is a new approach for longitudinal studies, which allows localized manipulation to determine the regulation of human pancreatic development.

Les cellules souches cancéreuses mammaires sont considérées d'initier et d'être responsable du développement des tumeurs. Un certain nombre de marqueurs ont été proposées, mais la question sur la définition de la CSC dans les cancers du sein RE+ reste ouverte. Nous avons utilisé les lignées MCF7 et T47D comme modèles RE+ et les SUM159 comme RE- pour rechercher les fractions cellulaires enrichies des CSC. Nous avons utilisé un panel de marqueurs tels qu'ALDH, CD44/CD24, combiné avec la formation de mammosphères. Les xénogreffes dérivées de patients (PDXs) de cancer du sein ont également été analysées. ALDH+ et/ou CD44+/CD24- définie des fractions cellulaires enrichies en cellules initiatrices de mammosphères et la capacité de différenciation dans les SUM159 et T47D, mais pas dans les MCF7. Nous avons demandé si cela pourrait être lié à différents statuts de p53. Dans ce but, nous avons généré des cellules MCF7shP53 et a montré une augmentation nette de fraction CD44+/CD24- dans ces cellules et une formation accrue de mammosphères. Cependant, les fractions triées ALDH+ ou CD44+/CD24- ont augmenté la formation de mammosphères d'un facteur 2 maximal. Nous voulions enrichir les CSC (basées sur l'initiation de mammosphères), les cellules en monocouche et en mammosphères sont exposées sous faible tension d'oxygène (<2%) pendant 7 jours, elles sont ensuite caractérisées sur la base de leur expression d'un certain nombre de marqueurs de différenciation soit par FACS soit par immunofluorescence. Dans les mammosphères des lignées RE+, les cellules ont passé à un phénotype bipotent CK5+/CK8+ et augmenté la fraction CD24+/CD44-. La même tendance a été observée parallèlement dans les cellules incubées en hypoxie. En outre, les sphères ne portent pas d'augmentation de la tumorigénicité. En conclusion, les cellules formant les mammosphères correspondent à un sous-ensemble avec un phénotype spécifique qui ne portent pas d'augmentation de la tumorigénicité. / Breast cancer stem cells (BCSCs) are believed to initiate and sustain tumor development. A number of markers have been proposed but open questions remain on the definition of CSC in ER+ breast cancer. We used MCF7 and T47D BCCL as ER+ models and the SUM159 BCCL for ER- to search for BCSC enriched subpopulations. We used a panel of markers such as ALDH, CD44/CD24, combined with mammosphere formation. Breast patient derived xenografts (PDX) were also analyzed. ALDH+ and/or CD44+/CD24- define fractions of cells enriched in mammosphere initiation and differentiation capacity in SUM159 and T47D, but not in MCF7. We asked whether this could be linked to different p53 statuses. To this aim, we generated MCF7-shp53 cells and showed a net increase in CD44+/CD24- in these cells and increased mammosphere formation. However, sorted ALDH+ or CD44+/CD24- cells increased mammosphere formation at most by a factor 2. We wanted to further enrich for CSC (based on mammosphere initiation), cultured 2D and mammosphere cells to low oxygen (<2%) for 7 days and characterized the cells on the basis of their expression of a number of differentiation markers by either FACS or immunofluorescence. In mammosphere of ER+ BCCL cells switched to a bipotent CK5+/CK8+ phenotype and increased the CD24+/CD44- fraction. Parallel findings were made with cells incubated under low O2. Furthermore, spheres do not bear increased tumorigenicity. In conclusion mammosphere forming cells correspond to a specific phenotypic subset of breast cancer cells that do not bear increased tumorigenicity.

La leucémie aiguë lymphoblastique T (LAL-T) est une hémopathie maligne représentant environ 15% des LAL pédiatriques et 25% des LAL de l'adulte. Malgré l'amélioration de la prise en charge des LAL, le devenir des patients atteints de LAL-T reste péjoratif avec environ 30% de rechute dans les deux années suivant le diagnostic. En effet, les LAL-T constituent un groupe de leucémies particulièrement hétérogène dans lequel différents oncogènes sont activés dans des combinaisons diverses. De ce fait, l'identification de voies oncogéniques pouvant être ciblées thérapeutiquement reste un des défis majeurs dans la recherche translationnelle des LAL-T. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée au mode d'activation de deux oncogènes majeurs dans les LAL-T: les oncogènes MYC et TAL1. Nous avons montré que l'hyperactivation de la voie AKT, notamment à travers les mutations perte de fonction du gène PTEN induisait une augmentation de la protéine MYC. Nos résultats suggèrent que les axes MYC et PTEN/AKT pourraient représenter des cibles thérapeutiques potentielles dans les LAL-T. Nous avons alors conduit une étude pharmacologique révélant qu'in vitro plusieurs drogues induisent l'apoptose ou l'arrêt de prolifération des cellules de LAL-T. Par ailleurs, certaines de ces drogues sont responsables d'une inhibition de l'expression de MYC. L'efficacité de ces drogues est maintenant testée in vivo grâce à des souris immunodéficientes xénogreffées avec des cellules de LAL-T primaires humaines. / T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL) are malignant proliferations of thymocytes which represents around 15% of pediatric and 25% of adult ALL. Despite indisputable therapeutic progress, T-ALL remains of poor prognosis and about 30% of cases relapse within the first 2 years following diagnosis. In fact T-ALL is a heterogeneous disease in which different oncogenes are activated in various combinations and this represents a major hurdle in the molecular analysis of T-ALL oncogenesis. During my thesis I investigated how MYC and TAL1, two key oncogenes in T-ALL, are activated. We showed that hyperactivation of AKT pathway, notably through PTEN loss-of-function mutations, gives rise to an increase of MYC protein level. Our data suggest that in T-ALL, MYC and PTEN/AKT axis may represent potential therapeutic targets. Then, we performed a pharmacological study which shows that, in vitro, several drugs lead to apoptosis or proliferation arrest of T-ALL cells. Moreover, some of those drugs impede MYC expression. The efficacy of these compounds are now tested in vivo using immunodeficient mice engrafted with primary human T-ALL blasts.

Hsp90 (heat shock protein 90) est une protéine chaperonne ubiquitaire et conservée impliquée dans le repliement et la réparation de protéines dites « clientes ». Parmi ces protéines, de nombreuses sont impliquées dans des phénomènes oncogéniques, faisant de hsp90 une cible d’intérêt dans le traitement du cancer. Hsp90 est constituée de trois domaines, un domaine N-terminal site de l’hydrolyse de l’ATP, nécessaire à sa fonction ; un domaine intermédiaire où vient se fixer la protéine cliente et un domaine C-terminal impliqué dans la dimérisation, étape indispensable pour le repliement de la protéine cliente. De nombreux inhibiteurs ont été synthétisés en ciblant ces différents domaines. Les inhibiteurs N-terminaux sont efficaces, à l’instar de la Geldanamycine en termes d’activité anti-tumorale mais des effets secondaires ainsi que des résistances au traitement ont limité leur utilisation en pratique clinique. En effet, l’inhibition N-terminale induit une réponse au stress caractérisée par une augmentation de hsp90 et de ses co-chaperonnes, souvent associée à une résistance au traitement et un pronostic défavorable. La novobiocine, un antibiotique coumarinique, est capable d’inhiber le domaine C-terminal de hsp90, sans induire de réponse au stress. Ainsi de nombreux dérivés de cette molécule ont été synthétisés, parmi lesquels on trouve le 6BrCaQ. Cette molécule induit l’apoptose et le blocage dans le cycle cellulaire sur plusieurs lignées cellulaires (dont MCF-7 et MDA-MB-231) et provoque la dégradation de plusieurs protéines clientes impliquées dans le développement tumoral mais sa faible solubilité limite son administration in vivo.Dans cette thèse, une forme liposomale du 6BrCaQ a été développée et étudiée sur des lignées cellulaires de cancer de prostate, de sein et de leucémie aigüe myéloïde in vitro et in vivo sur un modèle orthotopique de cancer du sein (MDA-MB-231 luc-GFP). Le 6BrCaQ liposomal est capable d’ induire de l’apoptose, de bloquer le cycle cellulaire sur différentes lignées cellulaires (PC-3, MDA-MB-231 et MOLM-13) mais également de ralentir la migration cellulaire sur PC-3 (test de comblement de blessure). De plus, le 6BrCaQ liposomal entre en synergie avec la doxorubicine (cellules PC-3) et la daunorubicine (cellules MOLM-13). Au niveau moléculaire, les liposomes de 6BrCaQ modifient l’expression protéique de Hsp90 sans modifier celle d’Hsp70 sur PC-3 alors que les gènes codant pour les Hsp70 semblent être légèrement induits dans MDA-MB-231. Les résultats in vivo ont montré un ralentissement de la croissance tumorale sur un modèle de cancer du sein orthotopique (MDA-MB-231-luc2-GFP) dès 13 jours de traitement pour une dose de 1 mg/kg injectée une fois par semaine. Des analyses histologiques ont révélé une augmentation de la proportion des zones nécrotiques dans le groupe traité par rapport au contrôle et une diminution significative de la prolifération cellulaire (marquage au KI67) intra-tumorale.Par ailleurs, Hsp90 possède également des isoformes et des analogues localisés dans des organites intracellulaires, parmi lesquelles, TRAP-1, localisée au niveau de la mitochondrie, impliquée dans la rgulation du métabolisme mitochondrial et qui pourrait jouer un rôle dans la progression tumorale et les métastases. Le déqualinium (DQ) est capable de cibler la mitochondrie. Dans une seconde partie du travail, des liposomes encapsulant le DQ ont été formulés dans le but de vectoriser le 6BrCaQ vers la mitochondrie. Toutefois, face à la difficulté d’encapsuler le DQ dans des liposomes, une étude de physico-chimie sur l’interaction DQ/liposomes a été mise en place pour comprendre comment le DQ agit sur les bicouches phospholipidiques. Cette étude a révélé que, malgré une capacité de ciblage mitochondrial des liposomes, le DQ était difficile à encapsuler dans les milieux salins et n’était pas inerte sur les bicouches lipidiques ce qui limite son utilisation pour la formulation de liposomes ciblant la mitochondrie. / Hsp90 (Heat shock protein 90) is an ubiquitous and well-conserved chaperone protein involved in the folding and the repair of « client » proteins. Among these proteins, several are involved in oncogenic phenomena making hsp90 an interesting target for cancer therapy. Hsp90 consists of three domains ; a N-terminal domain as the ATP hydrolysis site ; a middle domain where the client proteins binds and a C-terminal domain involved in the dimerization, a necessary step to refold the client protein. Several inhibitors were synthesized to target these different domains. N-terminal inhibitors such as Geldanamycin ; were shown to be very efficient but side effects and resistance to the treatment limited their clinical use. Indeed, N-terminal inhibition induces a stress response characterized by an increase of hsp90 and its co-chaperones which is often associated with resistance to the treatment and poor prognosis. Novobiocin, a coumarin antibiotic, is capable of inhibiting the C-terminal domain of hsp90, without inducing a stress response. Several derivatives of this molecule have been synthesized, including 6BrCaQ. The latter was effective in terms of apoptosis induction and cell cycle blockade on several cell lines (MCF-7, MDA-MB-231) and induced pro-tumoral client protein degradation but its low solubility limits its in vivo administration. In this thesis, a liposomal formulation of 6BrCaQ has been developed and studied on in prostate cancer cell lines and acute myelogenous leukemia in vitro and in vivo in an orthotopic model of breast cancer (MDA-MB-231 luc-GFP). Liposomal 6BrCaQ showed ability to induce apoptosis, to block the cell cycle on several cell lines (PC-3 and MDA-MB-231) and slow down migration of PC-3 cells (wound healing assay). Liposomal 6BrCaQ is able to synergize with doxorubicine or daunorubicine in PC-3 cells and in MOLM-13 cells, respectively. Moreover, protein and RNA expression profiles show that in PC-3 cells liposomal 6BrCaQ downregulates Hsp90 protein and in MDA-MB-231 cells slightly upregulates Hsp70 gene expression. Results obtained during in vivo experiments on the breast orthotopic model revealed a slow downslowdown of tumor growth after 13 days for a dose of 1 mg/kg injected weekly. Histological analysis revealed necrosis in treated groups and aassociated with a decreased cell proliferation (ki67 staining).Hsp90 also has isoforms and analogues localized in intracellular organelles, including, TRAP-1, localized in the mitochondrion and probably implicated in malignant progression through its role in the regulation of the mitochondrial metabolism. Dequalinium (DQ) demonstrated ability to target the mitochondrion. In a second part of the work, liposomes encapsulating DQ have been formulated in order to target 6BrCaQ to mitochondria. However, faced with the difficulty of encapsulating the DQ in liposomes, a physical chemistry study on the interaction DQ / liposomes was established to understand how DQ acts on phospholipid bilayers. Though a mitochondrial targeting capacity, this study revealed DQ was difficult to encapsulate in liposomes in saline medium and not completely inert on lipid bilayers limiting its use to target liposomes to mitochondria.

Le cancer de l'ovaire est la première cause de décès par cancer gynécologique. Cette thèse avait pour objectif la prospection de nouvelles solutions thérapeutiques fondées sur la délivrance prolongée d'agents anti tumoraux à l'aide de systèmes macromoléculaires de synthèse. L'un des obstacles majeurs était la disposition d'un modèle de tumeur pertinent chez l'animal. Après un examen bibliographique des connaissances acquises, le deuxième chapitre examine le potentiel d'un panel de xénogreffes dérivées de tumeurs ovariennes humaines directement greffées chez la souris immunodéprimée. Il est montré que les principales caractéristiques phénotypiques et moléculaires des tumeurs originales sont maintenues au niveau des greffes. Les résultats traduisent la présence d'une hétérogénéité intra-tumorale et d'une oligoclonalité au niveau des tumeurs primaires. L'ensemble confirme l'importance du choix du modèle tumoral pour l'évaluation de nouveaux traitements et l'étude des mécanismes aboutissant aux rechutes de la maladie et au développement d'une chimiorésistance. Un troisième chapitre traite l'exemple d'un système de délivrance prolongée fondé sur le couplage d'un agent antitumoral modèle, la doxorubicine, associé de diverses manières à un vecteur macromoléculaire biorésorbable, le poly(L-lysine citramide). Le premier conjugué obtenu par couplage direct sur le vecteur étant trop stable, divers systèmes ont été conçus pour obtenir la libération souhaitée. L'utilisation d'un bras espaceur clivable de type ester-hydrazone a fourni le meilleur résultat. Pour pallier la complexité de ces conjugués, une stratégie innovante fondée sur le piégeage de la doxorubicine dans une gélatine artificielle à base de poly(N-acryloyl glycinamide) est prospectée qui devrait permettre l'utilisation simultanée de plusieurs principes actifs piégés temporairement par voie physique dans un gel adhésif et fournir des solutions mieux adaptées aux contraintes cliniques des traitements intrapéritonéaux. / Ovarian carcinoma is the most lethal gynecologic malignancy. The aim of this PhD thesis was to develop new therapeutic approaches based on novel synthetic macromolecular drug delivery systems for intraperitoneal chemotherapy. These objectives were limited by the requirement of reliable tumor models for experimental studies. After a concise review of knowledge published in the literature, the potential interest of the establishment of a collection of tumor grafts derived from samples of human tumors is examined in a second chapter. Data show that the major phenotypic and genotypic features of the original tumors are maintained in the xenografts. They also confirm the importance of this tumor model to test new drugs and to analyze intratumoral heterogeneity and oligoclonality in primary ovarian carcinoma. The collection will be also helpful to study the mechanisms leading to disease recurrences and resistance to chemotherapies. An example of drug delivery system based on the different associations of a model chemotherapeutic drug (doxorubicin) with a bioresorbable macromolecular vector, namely poly(L-lysine citramide), is addressed in a third chapter. Direct amid linkage in the first conjugate was too stable with respect to antitumoral cytotoxicity desired after in vivo administration and different systems were generated subsequently to increase drug release in tumor deposits. The best results were obtained with a hydrazone cleavable spacer containing an ester group. To overcome the complexity of these conjugates, a novel strategy based on doxorubicin entrapment in a synthetic gelatin made of (poly(N-acryloyl glycinamide) is developed. This strategy should allow physical temporary entrapment of different drug molecules in a adhesive gel and could provide new solutions to the therapeutic challenges of intraperitoneal administration.

La P-glycoprotéine (P-gp) est une protéine transmembranaire de la famille des ATP binding cassette transporteurs. Elle est impliquée dans l’efflux du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire d’une grande variété de médicaments anticancéreux. Elle peut être responsable de la diminution de la biodisponibilité orale et de la concentration intra-tumorale des médicaments qui en sont substrats. Elle peut notamment être surexprimée par les cellules cancéreuses des adénocarcinomes du colon naïfs de tout traitement, suggérant une résistance naturelle de cette tumeur et également après une chimiothérapie. Notre premier travail in vivo a documenté le caractère substrat de la P-gp de l’evérolimus, inhibiteur de mTOR indiqué dans divers cancers (rein, tumeurs neuroendocrines d’oringine pancréatique et sein), jusqu’à maintenant uniquement étudié dans des modèles in vitro. Une augmentation significative de l’AUC de l’evérolimus administré par voie orale est observée chez des souris mdr1a-/b- comparées à des souris mdr1a+/1b+. Une amélioration significative de la biodisponibilité orale de l’evérolimus est aussi notée chez des souris prétraitées par le lapatinib (Tyverb®), inhibiteur des tyrosines kinases (EGFR et HER2) indiqué dans le cancer du sein, par rapport aux souris ayant reçu l’evérolimus seul. Ce résultat est accompagné d’une inhibition de l’expression de la P-gp intestinale par le lapatinib mesurée par la technique de Western Blot. Enfin, une étude préclinique menée chez des souris porteuses d’une xénogreffe colorectale mutée KRAS montre une activité anti-tumorale certaine des deux médicaments utilisés seuls et en schéma séquentiel. Notre seconde étude a montré pour la première fois que le cétuximab (Erbitux®), anticorps anti-EGFR, inhibe la fonctionnalité de la P-gp dans deux lignées cellulaires surexprimant la P-gp (les cellules IGROV-1 et les HEK P-gp) indépendamment de leur statut EGFR et entraîne chez des souris porteuses d’une xénogreffe colorectale une augmentation significative de la biodisponibilité orale et de la concentration intra-tumorale du SN-38, métabolite actif de l’irinotécan (Campto®) administré par voie orale. Le cétuximab étant prescrit en association avec l’irinotécan chez des patients atteints d’un cancer colorectal métastasé, initialement réfractaire à l’irinotécan, ces résultats pourraient en partie expliquer la réversion de la résistance à l’irinotécan par le cétuximab par une inhibition de l’efflux de la P-gp. Grâce à l’étude de deux associations de médicaments «lapatinib-evérolimus» et «cétuximab-irinotécan», nous avons démontré l’intérêt de l’étude de l’inhibition de la P-gp avec les traitements les plus récents, notamment son rôle dans l’amélioration de la biodisponibilité orale de chimiothérapies utilisées par voie orale. / P-glycoprotein (P-gp) is a membrane transporter and belongs to the ATP-binding cassette (ABC) transporter super family. P-gp decreases oral bioavailability of substrate drugs and can cause multidrug resistance in tumor cells by decreasing intracellular drug levels. P-gp is overexpressed in colorectal carcinoma naturally resistant to chemotherapy. The aim of our first study was to document the in vivo transport of everolimus (Afinitor®), a mTOR inhibitor, by P-gp. A significant increase of everolimus oral bioavaibility was observed in mdr1a-/1b- mice compared to the wild type. In addition, a significant increase of everolimus oral bioavaibility was showed in mice that received a lapatinib pre-treatment (a dual EGFR/HER2 tyrosine kinase inhibitor) compared to mice that received everolimus alone. These results were accompanied by a significant decrease of P-gp expression in duodenum segment in lapatinib pre-treated group as compared to control group. Finally, each drug given alone or in association showed a major antitumor activity in a xenograft model of human colorectal carcinoma with KRAS mutation. Our second study showed for the first time that cetuximab (Erbitux®), a monoclonal antibody directed towards EGFR, inhibits P-gp functionality in two cell lines overexpressing P-gp (IGROV-1 and HEK P-gp cells) independently of EGFR status and leads to significant increases of oral bioavailability and intratumoral concentration of SN-38, the active metabolite of irinotecan (Campto®) in mice bearing colorectal carcinoma xenograft. Cetuximab is used in combination with irinotecan in patients with metastatic colorectal cancer, initially refractory to irinotecan, our results may partly explain the reversion of resistance to irinotecan by inhibiting P-gp efflux by cetuximab. In conclusion, our results showed the interest to study the effect of recent anticancerous drugs on P-gp, including their ability to improve oral bioavailability of oral chemotherapy used.

Une analyse génomique (Comparative Genomic Hybridization) a été réalisée sur une cohorte d’adénomes et de tumeurs coliques et a mis en évidence, parmi d’autres altérations, la délétion de la région 1p36.12 dans 23% des adénomes et 47% des carcinomes. Parmi les 15 gènes ayant une fonction connue retrouvés dans cette zone, le gène codant pour le facteur de transcription E2F2 a été retenu en raison de son implication dans des processus cellulaires clés. Une analyse de Kaplan- Meier a montré que la délétion de E2F2 est un facteur de bon pronostic de survie sans progression. Afin de mieux cerner l’implication des gènes ciblés par la micro-délétion en 1p36.12, une étude fonctionnelle in vitro et in vivo de la perte de fonction de E2F2 a été réalisée, et étendue à celle de ID3 dont le gène est le voisin direct de E2F2. Nos observations indiquent qu’in vivo, la perte d’E2F2 favorise la croissance tumorale et bloque le développement de métastases. Dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe de biochimiste du Pr Céline TARNUS (U.H.A.), une étude pilote a été réalisée pour prouver l’efficacité anti-tumorale de nouveaux inhibiteurs hautement sélectifs pour l’aminopeptidase N. / A genomic analysis (Comparative Genomic Hybridization) evidenced, among other chromosomic alterations, a microdeletion at 1p36.12 locus in 23% and 47% of colon adenomas and carcinomas, respectively. Among the 15 genes located in the deleted region, we focused on E2F2 gene involvedin various cellular processes. The Kaplan-Meier curve analysis showed that E2F2 deletion is associated with a better progression-free survival. To better understand the involvement of genes targeted by the microdeletion in colon tumors, we assessed the functional impact of the underexpression of E2F2 and of its direct neighbor gene ID3, coding for a dominant-negative repressor involved in cell differentiation. Our results indicated that E2F2 loss favors tumor growth and prevent metastatic spread. In collaboration with the biochemical team directed by the Pr Céline TARNUS, we started a pilotstudy to prove the anti-tumor potential of new chemical inhibitors highly selective of the aminopeptidase N.