La démonstration du rôle de la CDT (« Cytolethal Distending Toxin ») de Helicobacterhepaticus dans le développement de l’hépatocarcinome murin fait de cette toxine un candidatpertinent dans l'activation de processus pro-cancéreux. Comme la toxine CagA de Helicobacterpylori, la sous-unité active CdtB de la CDT pourrait être une oncoprotéine. Nous avons étudié lerôle de la CdtB des Hélicobacters dans l’inflammation et la carcinogenèse digestive via unestratégie lentivirale d’expression constitutive ou conditionnelle de la CdtB ou de son mutant pourl’activité DNase. Nous avons réalisé une étude du transcriptome et montré que la CdtB deH. hepaticus induisait une réponse inflammatoire en surexprimant des cytokines, chimiokines,peptides antimicrobiens et en activant la voie du NF-κB des cellules épithéliales. La CdtB réguleégalement l’expression et la localisation nucléaire du facteur de transcription et oncogène MafB.Ces résultats ont été confirmés pour la CdtB de Helicobacter pullorum. Des expériencesd'infection des cellules avec des souches sauvages et mutées pour la CDT (deH. hepaticus & H. pullorum) ont permis de valider les résultats obtenus et de les attribuer à laCdtB et notamment à son activité DNase. Nous avons aussi développé un nouveau modèle dexénogreffes de cellules épithéliales inductibles pour l’expression de la CdtB de H. hepaticus.Dans ce modèle, la CdtB, en plus de ses effets déjà connus, retarde la croissance tumorale,induit l’apoptose, la sénescence et la surexpression du marqueur nucléaire de prolifération,Ki-67, suggérant la survie cellulaire. L’ensemble de ces résultats fournit de nouveaux argumentsen faveur du potentiel oncogénique de la CDT. / The demonstration of the role of the Cytolethal Distending Toxin (CDT) of Helicobacter hepaticusin the development of hepatocarcinoma in mice, makes this toxin a relevant candidate in theactivation of precancerous processes. As in the case of the CagA toxin of Helicobacter pylori, theCdtB active subunit of CDT could be an oncoprotein. We studied the role of Helicobacter CdtB ininflammation and digestive carcinogenesis using a lentiviral strategy for constitutive or conditionalexpression of the CdtB subunit or its corresponding DNase mutant. We conducted a study of thetranscriptome and showed that CdtB induced an inflammatory response by overexpressingcytokines, chemokines, antimicrobial peptides and activating the NF-kB pathway in epithelialcells. The CdtB also regulated the expression and nuclear localization of the transcription factorand oncogene MafB. These results were confirmed for the CdtB of Helicobacter pullorum.Infection of cells with wild type strains and the corresponding CDT-mutant strains (of H. hepaticus& H. pullorum) were used to validate the results and to attribute the effects to the CdtB and, inparticular, to its DNase activity. We also developed a novel epithelial cell xenograft model toevaluate the inducible expression of H. hepaticus CdtB. In this model, the CdtB, in addition to itspreviously well-known effects, delayed tumor growth, induced apoptosis, senescence and theoverexpression of nuclear proliferation marker, Ki-67, suggesting cell survival. All of these resultsprovide new arguments in favor of the oncogenic potential of the CDT.

Les cellules Natural Killer (NK), actrices majeures de la vigilance anti-tumorale, sont modulées par des facteurs nutritionnels et métaboliques. L'inhibition de leur activité favorise le développement tumoral. Un régime alimentaire hypercalorique induisant l'obésité est un facteur de risque de développer un cancer du sein. Au niveau du micro-environnement tumoral mammaire, la biodisponibilité en certaines molécules contrôle non seulement les cellules néoplasiques mais, également les cellules immunes infiltrées. Ainsi, la leptine, sécrétée à forte concentration par les adipocytes mammaires, pourrait favoriser la croissance tumorale et altérer les cellules NK. L'arginine fortement consommée par les cellules tumorales et les cellules suppresseurs dérivées des myéloïdes pourrait faire défaut aux cellules NK. L'objectif de cette thèse est de caractériser les activités fonctionnelles et métaboliques des cellules NK en situation de stress nutritionnel. Dans un premier temps, nous avons exploré, in vivo, l'impact d'un régime hypercalorique sur l'activité des cellules NK et sur le développement tumoral mammaire. Ensuite, nous avons cherché à identifier les potentielles altérations fonctionnelles des cellules NK en mimant, in vitro, les conditions retrouvées au niveau du micro-environnement tumoral telles que la présence de concentration élevée en leptine et la déplétion en arginine. Des souris Balb-c "nude" femelles ont été soumises à un régime hypercalorique (HC) versus une diète normo-calorique (NC) pendant 6 mois. Au bout de 5 mois, des cellules tumorales mammaires (MCF-7 ; groupes NCT et HCT) ou le véhicule (groupes NC et HC) ont été implantés au niveau de la quatrième paire de glandes mammaires. Sous régime HC, le développement tumoral s'accompagne d'une perte de masse grasse, de masse maigre et de poids corporel avec un volume et un poids de tumeur augmentés. Cette diète induit au niveau tumoral une sur-expression des ARNm d'enzymes impliquées dans la glycolyse et une sous-expression des acteurs du cycle de Krebs. Sous régime HC, l'expression de la caspase 3 clivée et des récepteurs des oestrogènes β et de la progestérone est réduite alors que celle du Ki67 est accrue. Les cellules NK des souris HC ont une cytotoxicité diminuée. Bien que la présence de tumeur stimule l'activité lytique des cellules NK, la cytotoxicité de ces cellules reste inférieure dans le groupe HCT comparativement à celle du groupe NCT. La leptine stimule, in vitro, de façon dose-dépendante l'activité métabolique des cellules NK. A fortes concentrations, elle active leur cytotoxicité vis-à-vis des cellules cibles MDA-MB-231. Cet effet passe par une stimulation de l'expression de TRAIL et de l'IFN-γ par les cellules NK. En revanche, vis-à-vis des cellules cibles MCF7, les cellules NK présentent une activité lytique réduite en présence de fortes concentrations de leptine, probablement en lien avec une réduction de l'expression de la perforine. En réponse à une déplétion en arginine dans le milieu de culture, la prolifération et la cytotoxicité des cellules NK sont abaissées. L'altération de la reconnaissance des cellules cibles par les récepteurs NKp46 et NKp30, la moindre transmission du signal activateur par la chaine ζ et la faible production d'IFN-γ peuvent expliquer l'inhibition de la cytotoxicité des cellules NK. Ainsi, un apport énergétique élevé favorise le développement tumoral mammaire notamment eninhibant la cytotoxicité des cellules NK. De plus, la leptine à fortes concentrations stimule ou réduit, in vitro, la cytotoxicité des cellules NK selon la nature des cellules cancéreuses mammaires cibles. Une déplétion en arginine, in vitro, quant à elle, inhibe la prolifération et la cytotoxicité des cellules NK. Ces travaux contribuent à mieux comprendre l'impact du micro-environnement sur la réponse antitumorale des cellules NK. / Natural killer (NK) cells are critical mediators of anti-tumor immunity. A high-calorie diet inducing obesity is associated with breast cancer development. NK cells are modulated by dietary and metabolic factors and a decrease in their lytic activity promotes mammary tumor development. In the breast microenvironment, high concentration of leptin can be secreted by mammary adipocytes and thereby could stimulate tumor growth and control immune cells. Arginine, strongly consumed by tumor and myeloid-derived suppressor cells, could be lacking to NK cells. The aim of this work is to characterize the functional and metabolic activities of NK cells in response to nutritional stress. Initially, we explored in vivo the impact of a high-calorie diet on NK cells activity and mammary tumor development. Then, we identified potential functional alterations in NK cells by mimicking the conditions found in the tumor microenvironment such as the presence of high leptin concentration and arginine depletion. Female Balb-c nude mice were fed a high-caloric diet (HC) versus a standard caloric diet (SC) for 6 months. After five months, mammary tumor cells (MCF-7, SCT, HCT) or MatrigelTM (SC, HC) were implanted into the fourth mammary fat pads. The tumor development in HC diet-fed mice was associated with a decrease in body weight, body fat and lean mass and an increase in volume and weight of tumors. This diet induced tumor over-expression, at the transcriptional level, of enzymes involved in glycolysis and a down-expression of citrate cycle actors. Protein tumor levels of cleaved caspase 3, estrogen β and progesterone receptors were reduced while Ki67 was increased in the HC diet-fed mice. NK cell cytotoxicity of HC diet-fed mice was reduced. Although the presence of tumor stimulated NK cell lytic activity, this later was lower in the HCT group compared to the one of SCT mice. In vitro, leptin stimulated, in dose-dependent manner, the metabolic activity of NK cells. High leptin concentrations enhanced NK cell cytotoxicity against the MDA-MB-231 target cells. This phenomenon involved the increase of expression of TRAIL and IFN-γ in NK cells. However, against the MCF-7 target cells, NK cell lytic activity was reduced in the presence of high concentrations of leptin, probably in link to the decreased perforin expression. NK cell proliferation and cytotoxicity were impaired in response to arginine depletion. This inhibition of NK cell cytotoxicity could be linked to a low target cells recognition by NKp46 and NKp30, a reduced activating signal transmission by ζ chain and a low production of IFN-γ. Thus, high energy intake promotes mammary tumor development in particular by inhibiting NK cell cytotoxicity. In vitro, high leptin concentrations stimulate or reduce NK cell cytotoxicity according to the breast cancer cell targets. Furthermore, arginine depletion inhibits NK cell proliferation and cytotoxicity in vitro. These findings provide insight into the microenvironment impacts on NK cell antitumor response in tumor development.

Les métastases hépatiques de tumeurs endocrines digestives sont hypervasculaires et hétérogènes. Les mécanismes de développement de ces métastases hépatiques, en particulier le rôle de l’angiogenèse tumorale associée à ces tumeurs, sont complexes. Ceci explique la difficulté de prédire le profil évolutif de ces tumeurs et de trouver des facteurs prédictifs de réponses aux traitements médicaux utilisés. L’objectif de notre travail a été de mieux comprendre : le rôle de l’angiogenèse dans le développement des métastases hépatiques de tumeurs endocrines digestives ; les mécanismes d’actions et en particulier leur activité anti-angiogénique, de deux types de molécules (analogue de la somatostatine et inhibiteur de mTOR). Nos résultats nous ont permis à travers une double approche expérimentale, in vitro et in vivo de : (a) montrer la complexité de la régulation de la synthèse et de la sécrétion du VEGF par les cellules endocrines néoplasiques ; (b) confirmer expérimentalement la dissociation entre expression du VEGF et capacités angiogéniques d’une part, propriétés invasives et métastatiques d’autre part, dans les tumeurs endocrines digestives ; (c) montrer expérimentalement que l’inhibition de l’angiogenèse peut contribuer à l’effet anti-tumoral de substances d’intérêt thérapeutique dans les tumeurs endocrines digestives / Liver metastases of digestive endocrine tumors are hypervascular and heterogeneous. The mechanisms of development of these metastases, especially the role of angiogenesis, are complex. This explains the difficulty to predict the natural history of these tumors and to find predictive factors of response to medical treatments. Our aim was to evaluate: the role of angiogenesis in the development of liver metastasis from digestive endocrine tumors; mechanisms of action, especially antiangiogenic activity, of two drugs (somatostatin analogues and mTOR inhibitor). We were able to demonstrate through an in vitro and in vivo experimental approach that: (a) the regulation of VEGF synthesis and secretion is complex, with different roles according to the cell studied; (b) there is a dissociation between VEGF expression and angiogenic capacities, on one hand, and invasive and metastatic properties, on the other hand; (c) the inhibition of angiogenesis may contribute to the anti-tumoral effect of several drugs of therapeutic interest in digestive endocrine tumors

La progression tumorale est un processus multi-étapes dépendant notamment des interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma environnant. Le développement du cancer du sein implique une communication étroite entre les cellules épithéliales mammaires, les cellules inflammatoires, les myofibroblastes et les cellules endothéliales. Ainsi, le microenvironnement tumoral apparaît comme une cible de choix dans le traitement anti-tumoral. L’utilisation de modèles précliniques est une étape clé dans le développement et la validation de nouvelles thérapies. Néanmoins, peu d’études sont disponibles sur le rôle du stroma péri-tumoral dans ces modèles.Dans le but d’étudier le stroma péri-tumoral des modèles précliniques de cancers du sein, nous avons combiné une analyse par cytométrie en flux à une analyse par immunohistochimie afin d’identifier, puis de quantifier, les différentes populations stromales hématopoïétiques (lymphocytes, monocytes/macrophages, polynucléaires) et non hématopoïétiques (myofibroblastes, cellules endothéliales). Vingt et un modèles de xénogreffe de tumeurs humaines de cancers du sein ainsi que 2 modèles transgéniques (MMTV-PyMT et MMTV-ErbB2), ainsi que leurs allogreffes respectives, furent utilisés lors de ce travail.Les analyses des tumeurs humaines et murines ont montré un infiltrat stromal très hétérogène d’une tumeur à l’autre, avec pour composante majoritaire les macrophages. Un infiltrat important en polynucléaires a également été détecté dans les modèles de PDX, caractéristique d’une inflammation locale importante dans ces modèles. L’analyse phénotypique de macrophages a montré une expression variable de marqueurs M1 et M2 dans les modèles de PDX. Les macrophages issus de tumeurs murines transgéniques, spontanées ou allogreffées, présentaient quant à eux un profil majoritairement M1. L’étude transcriptomique de macrophages triés, a permis à la fois de valider les résultats obtenus au niveau protéique mais a également mis en évidence des différences majeures dans l’expression de nombreux gènes, impliqués dans des voies de signalisation variées telles que la croissance tumorale, l’invasion et la métastase.Cette étude nous a permis de mettre en évidence le rôle de la tumeur sur son microenvironnement. En effet, celle-ci est à la fois capable d’attirer un panel de cellules stromales qui lui et propre et ensuite de l’activer de façon spécifique. / Tumor development is a multi-step process influencing by interactions between tumor cells and surrounding stroma. Breast cancer development involves a high level of communication between mammary epithelial cells, inflammatory cells, myofibroblasts and endothelial cells. So, the tumoral microenvironment appears as a prime target for anti-tumoral treatment. The use of preclinical models is a critical step in development and validation processes of new therapies. Nevertheless, the role of stroma in these models is poorly understood.In order to evaluate stromal cell populations in breast cancer preclinical models, we combined flow cytometry analysis and immunohistochemistry to identify, and then quantify, various stromal populations as hematopoietic cells (lymphocytes, monocytes/macrophages, polymorphonuclear leukocytes) and non-hematopoietic cells (myofibroblasts, endothelial cells). Twenty-one breast cancer patient-derived xenografts as well as 2 transgenic mouse models (MMTV-PyMT and MMTV-ErbB2), and their respective allografts, were studied.Analysis of human and murine tumors showed a strong heterogeneity between tumors regarding infiltrating stroma-cells, with a high proportion of macrophages. A significant amount of polymorphonuclear leukocytes was also detected in PDXs, indicating a local inflammation in these models. The phenotypic analysis of macrophages showed a variable expression of M1 and M2 markers in PDXs. Macrophages infiltrating transgenic mouse tumors, spontaneous or allografted, were mainly M1. Transcriptomic analyses of sorted macrophages, allowed us to validate previous results but also highlighted major differences in the expression of numerous genes implicated in various pathways as tumor growth, invasion and metastasis.Finally, this study highlighted the impact of tumor cells on their surrounding stroma. Indeed, we demonstrate that cancer cells are able to attract a specific panel of stromal cells and activate them in a specific way.

La mise en place de la lignée germinale au cours du développement constitue une des étapes fondamentales conditionnant la fertilité de l’individu adulte. Au cours des dernières décennies, le nombre croissant de couples consultant pour une aide médicale à la procréation a fait émerger l’hypothèse d’une altération des fonctions de reproduction chez l’Homme qui pourrait trouver son origine dans la perturbation du développement précoce. Dans l’ovaire fœtal, les cellules germinales s’orienteront vers la voie de l’ovogénèse, caractérisée entre autres par l’entrée en méiose de ces cellules. La majorité des données actuelles relatives à ces évènements sont issues du modèle murin alors que le développement de l’ovaire humain est significativement diffèrent de celui de la souris. Il est donc nécessaire d’approfondir nos connaissances du développement ovarien humain et d’identifier ses éventuelles perturbations. L’objectif de mon travail a été de mettre au point un outil d’étude du développement ovarien et d’identifier de nouvelles voies impliquées dans la régulation de l’entrée en méiose des cellules germinales fœtales humaines et leurs perturbations éventuelles.Nous avons mis au point un nouveau modèle de xénogreffe d’ovaires fœtaux humains du premier trimestre de gestation (au moment de l’apparition des premières cellules méiotiques). Ce modèle nous a permis d’observer un développement de l’organe et une différenciation des cellules germinales similaires à ceux observés in vivo. Ce modèle permettra des travaux à des âges auxquels le matériel d’étude est peu accessible. En couplant ce modèle de xénogreffe à une stratégie d’ARN-interférence, il nous a été possible d’inhiber l’expression d’un gène spécifiquement exprimé dans les cellules germinales ovariennes, DMRTA2, et de mettre en évidence un potentiel rôle de ce gène dans leur différenciation pré-méiotique. Nous avons observé une diminution du nombre de cellules ayant initié la méiose après inhibition de l’expression de ce gène. Par ailleurs, nous avons également identifié la présence dans l’ovaire fœtal de nombreux marqueurs décrits comme testiculaires chez la souris (PLZF, DNMT3L, FGF9, NANOS2 ou CYP26B1). L’expression de ces marqueurs pourrait expliquer la présence de cellules mitotiques tardives dans l’ovaire fœtal humain que nous avons pu observer jusqu’à 30 semaines de gestation. En parallèle de ces travaux, nous avons testé la sensibilité des cellules germinales à la dexaméthasone, glucocorticoïde pouvant être administré au cours de la grossesse. Il a été observé une augmentation de l’expression de PLZF, gène cible de l’activation des récepteurs aux glucocorticoïdes, pouvant expliquer la diminution du nombre de cellules germinales.En conclusion, ce travail de thèse a permis d’identifier un nouveau gène potentiellement régulateur de la transition mitose/méiose dans l’ovaire humain, et d’affiner nos connaissances sur le développement de l’ovaire humain et l’entrée en méiose des cellules germinales. Toutefois, de nombreuses questions restent posées ainsi de futures études devront clarifier si les cellules germinales mitotiques observées à des stades tardifs sont capables de se différencier en ovocytes compétents. / Woman fertility is partially dictated by the set up of the human female germ line. During the last ten years, which saw an increased number of couples consulting for assisted reproductive cares, the hypothesis of an early alteration in reproduction functions has emerged.In the fetal ovary, germ cells enter the path of oogenesis differentiation characterized by meiotic initiation. On this subject, vast majority of the scientific data are obtained from the mouse model, even if differences with human ovarian physiology are widely acknowledged. Therefore it is necessary to extend our knowledge on human ovarian development and identify its perturbations. The objective of my work was to assess a new model to study ovarian growth, studying regulation of meiotic entry and perturbation of germ line differentiation.We sat up a new xenograft model of early human fetal ovaries, when very early meiotic germ cells appear. Organ growth and germ cells differentiation were comparable with in vivo observations. Using this model with an RNA-interference strategy, we inhibited the expression of an oogonia germ cell gene, DMRTA2. This inhibition conducted to a significantly reduced number of germ cells gene that initiated meiosis and DMRTA2 seemed to be required for mitotic-meiotic transition. In another hand, we identified, in the ovary, the expression of germ cells markers described as specifically male in rodent (PLZF, DNMT3L, FGF9, NANOS2 ou CYP26B1). The expression of these markers in the human ovary could explain the observation of mitotic germ cells in late fetal ovaries (30 wpf).In parallel, we tested germ cells sensibility to a synthetic glucocorticoid, dexamethasone, administrated during pregnancy in some justified pathologies. We observed an increased expression of PLZF that could explain the decreased number of germ cells observed in treated ovaries.In conclusion, we identified a new gene expressed in human fetal ovaries, potentially involved in the meiotic entry, and we extended our knowledge to characterized human germ line development. However, many points have to be clarified, as the possible competence of late mitotic germ cells to form oocytes.

La P-glycoprotéine (P-gp) est une protéine transmembranaire de la famille des ATP binding cassette transporteurs. Elle est impliquée dans l'efflux du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire d'une grande variété de médicaments anticancéreux. Elle peut être responsable de la diminution de la biodisponibilité orale et de la concentration intra-tumorale des médicaments qui en sont substrats. Elle peut notamment être surexprimée par les cellules cancéreuses des adénocarcinomes du colon naïfs de tout traitement, suggérant une résistance naturelle de cette tumeur et également après une chimiothérapie. Notre premier travail in vivo a documenté le caractère substrat de la P-gp de l'evérolimus, inhibiteur de mTOR indiqué dans divers cancers (rein, tumeurs neuroendocrines d'oringine pancréatique et sein), jusqu'à maintenant uniquement étudié dans des modèles in vitro. Une augmentation significative de l'AUC de l'evérolimus administré par voie orale est observée chez des souris mdr1a-/b- comparées à des souris mdr1a+/1b+. Une amélioration significative de la biodisponibilité orale de l'evérolimus est aussi notée chez des souris prétraitées par le lapatinib (Tyverb®), inhibiteur des tyrosines kinases (EGFR et HER2) indiqué dans le cancer du sein, par rapport aux souris ayant reçu l'evérolimus seul. Ce résultat est accompagné d'une inhibition de l'expression de la P-gp intestinale par le lapatinib mesurée par la technique de Western Blot. Enfin, une étude préclinique menée chez des souris porteuses d'une xénogreffe colorectale mutée KRAS montre une activité anti-tumorale certaine des deux médicaments utilisés seuls et en schéma séquentiel. Notre seconde étude a montré pour la première fois que le cétuximab (Erbitux®), anticorps anti-EGFR, inhibe la fonctionnalité de la P-gp dans deux lignées cellulaires surexprimant la P-gp (les cellules IGROV-1 et les HEK P-gp) indépendamment de leur statut EGFR et entraîne chez des souris porteuses d'une xénogreffe colorectale une augmentation significative de la biodisponibilité orale et de la concentration intra-tumorale du SN-38, métabolite actif de l'irinotécan (Campto®) administré par voie orale. Le cétuximab étant prescrit en association avec l'irinotécan chez des patients atteints d'un cancer colorectal métastasé, initialement réfractaire à l'irinotécan, ces résultats pourraient en partie expliquer la réversion de la résistance à l'irinotécan par le cétuximab par une inhibition de l'efflux de la P-gp. Grâce à l'étude de deux associations de médicaments "lapatinib-evérolimus" et "cétuximab-irinotécan", nous avons démontré l'intérêt de l'étude de l'inhibition de la P-gp avec les traitements les plus récents, notamment son rôle dans l'amélioration de la biodisponibilité orale de chimiothérapies utilisées par voie orale.

De nos jours, la cryoconservation est une technique très largement utilisée dans les protocoles d’assistance à la reproduction ou comme outil pour la sauvegarde des ressources génétiques. Toutefois, la chienne est un modèle animal complexe pour l’application des biotechnologies de la reproduction du fait de ses nombreuses singularités anatomiques et physiologiques. L’objectif de notre travail était d’étudier et de développer une méthode de cryoconservation des ressources génétiques chez la chienne par le biais de deux types de ressources : les embryons et le tissu ovarien. Après avoir mis au point une méthode de collecte d’embryons, nous nous sommes appliqués à la constitution d’un stock d’embryons cryoconservés en prévision d’un transfert embryonnaire. L’étude et le développement d’un protocole de cryoconservation du tissu ovarien ont été abordés après avoir adapté et validé nos méthodes d’analyses in vitro. L’utilisation de plans d’expériences factoriels fractionnaires a permis de mettre en évidence les facteurs les plus influents sur la qualité de la réserve folliculaire (nature du cryoprotecteur pénétrant, cinétique de congélation, étapes d’équilibration) et de proposer un protocole de cryoconservation. La combinaison du DMSO incorporé en un seul bain d’équilibration avec une vitesse de congélation de 0,3°C/min est apparue comme la combinaison la plus appropriée à la cryoconservation de tissu ovarien chez la chienne et a permis d’observer, après xénogreffe de tissu ovarien cryoconservé, une reprise de la croissance folliculaire et de l’activité hormonale du tissu greffé / Nowadays, cryopreservation is widely used in animal assisted reproduction or safeguarding of genetic resources. Nevertheless, the bitch is a complex animal model concerning the use of this biotechnology, due to numerous anatomical and physiological peculiarities. The aim of our research work was to investigate and develop a method of cryopreservation of genetic resources in the bitch by exploring two kinds of resources: embryos and ovarian tissue. After the setting up of a method for embryo collection, we have built up a stock of cryopreserved embryo for subsequent embryo transfer. After a preliminary validation of our in vitro assessment methods, the investigation and development of a cryopreservation protocol has been conducted. The use of fractional experimental design allowed us to highlight the main factors affecting the follicular pool quality (CPA nature, freezing rate and equilibration steps). The combination of DMSO incorporated in a unique equilibration bath with a freezing rate of 0.3°C/min appeared to be suitable for the cryopreservation of bitch ovarian tissue. Finally, Follicular growth and hormonal activity resumption have been observed after xenotransplantation of cryopreserved bitch ovarian tissue

Les cellules souches cancéreuses (CSC) représentent une sous-population de cellules tumorales à l’origine de l’hétérogénéité et de la croissance tumorale. Les CSC sont plus résistantes aux traitements, et à l’origine de la rechute et des métastases. L’identification des CSC constitue actuellement un enjeu majeur dans le développement de nouvelles thérapies ciblées pour inhiber la croissance tumorale et éradiquer le cancer. Dans ce travail, nous avons cherché à identifier, caractériser, et cibler les CSC dans l’adénocarcinome gastrique. Des modèles murins de xénogreffe de tumeurs primaires de patients atteints d'adénocarcinome gastrique hors cardia de types intestinal et diffus ont été développés, ainsi qu’un modèle de tumorsphere in vitro afin d’évaluer les capacités tumorigéniques de sous-populations tumorales. Nous avons identifié CD44 et l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH) comme marqueurs d’enrichissement des CSC dans les 2 types d’adénocarcinomes gastriques, l’ALDH représentant un marqueur plus spécifique que CD44. Nous avons ensuite étudié l'effet de l’acide rétinoïque tout trans (ATRA), et nous avons montré que l'ATRA inhibe la formation et la croissance des tumorspheres in vitro ainsi que la croissance tumorale in vivo. Cet effet de l’ATRA passe par l’inhibition de l’expression des marqueurs souches et des capacités d'auto-renouvèlement des CSC. En conclusion, CD44 et ALDH sont des marqueurs de CSC dans les adénocarcinomes gastriques hors cardia de types intestinal et diffus, et le traitement par l’ATRA constituerait une stratégie commune de traitement pour cibler spécifiquement les CSC et inhiber la croissance tumorale dans ces deux types de cancer gastrique. / Cancer stem cells (CSCs) are a subpopulation of tumor cells at the origin of the heterogeneity and growth of tumors. CSCs are more resistant to treatment, and are responsible for relapse and metastasis. The identification of CSCs is a major challenge for the development of new targeted therapies to inhibit tumor growth and eradicate cancer. In this work, we aimed to identify, characterize, and target CSCs in gastric adenocarcinoma. Mouse models of primary tumor xenografts from intestinal and diffuse type non-cardia gastric adenocarcinomas from patients were developed, as well as an in vitro tumorsphere assay, to assess the tumorigenic capacity of subpopulations of tumor cells. We identified CD44 and aldehyde dehydrogenase (ALDH) as CSC enrichment markers in the two types of gastric adenocarcinoma, ALDH representing a more specific marker than CD44. We then studied the effect of All-trans retinoic acid (ATRA), and showed that it inhibited the formation and growth of tumorspheres in vitro and tumor growth in vivo. This effect of ATRA is due to the inhibition of stem marker expression and the self-renewal capacity of CSCs. In conclusion, CD44 and ALDH are effective CSC markers in intestinal and diffuse type non-cardia gastric adenocarcinomas, and treatment with ATRA provides a common treatment strategy to specifically target CSCs and inhibit tumor growth in both subtypes of this gastric cancer.

L’infection chronique par Helicobacter pylori touche plus de la moitié de la population mondiale et est la principale cause connue de l’adénocarcinome gastrique. La metformine, un antidiabétique oral, est de plus en plus étudiée pour ses propriétés antitumorales dans de nombreux types de cancers. Cependant, ses effets potentiels ont très peu été étudiés dans le cancer gastrique. Des expériences réalisées sur des lignées cellulaires cancéreuses gastriques et des tumeurs de patients amplifiées par xénogreffe chez la souris (PDX), ont permis de confirmer les propriétés antitumorales de la metformine. La metformine, en traitement préventif et curatif, diminue la capacité de formation des tumorsphères, l’expression des marqueurs de CSC gastriques, et la capacité d’auto-renouvellement propre aux CSC. Dans un second temps, nous avons montré que la metformine est capable d’inhiber la croissance bactérienne de H. pylori invitro et in vivo. Enfin, les effets de l’infection par H. pylori ont été étudiés sur la voie de signalisation mTOR par la réalisation d’une analyse transcriptomique et de western-blots sur des lignées cellulaires gastriques. Ceci a permis de démontrer que H. pylori inhibe le complexe mTORC1.Pour conclure, ce travail de thèse a permis i) de démontrer la capacité de la metformine à cibler les CSC gastriques, ii) de découvrir une nouvelle propriété antibactérienne de la metformine vis-à-vis de H. pylori, iii) de démontrer que H. pylori inhibe la voie de signalisation mTOR. / Chronic infection with Helicobacter pylori affects more than half of the world's population and is the main known cause of gastric adenocarcinoma. Metformin is an oral antidiabetic drug used to treat type 2 diabetes patients, and is being increasingly studied for its antitumoral properties in several cancer types. However, its potential effects in gastric cancer have not been thoroughly studied. Experiments performed on gastric cancer cell lines and patient-derived gastric carcinoma xenografts (PDX), have confirmed the antitumoral properties of metformin. Metformin, in preventive and curative treatment, decreases the tumorsphere formation, the expression of gastric CSC markers and the self-renewal capacity of CSC. In a second time, we have shown that metformin is able to inhibit the bacterial growth of H. pylori in vitro and in vivo. Finally, the effects of the H. pylori infection have been studied on the mTOR signaling pathway using a transcriptomic analysis and western blots, performed on gastric cancer cell lines. These show the ability of H. pylori to inhibit mTORC1.To conclude, this thesis work allowed i) to demonstrate the ability of metformin to target gastric CSCs, ii) to discover a new antimicrobial property of metformin against H. pylori, iii) to demonstrate that H. pylori inhibits the mTOR signaling pathway.

Le PCK3145 est un peptide de 15 acides aminés inhibant la sécrétion de MMP-9 et démontrant une activité anti-tumorale contre le cancer de la prostate. Comme les cancers hématologiques sécrètent MMP-9, nous avons donc évalué l’effet du PCK3145 sur ces cancers. Nous avons démontré que les lignées humaines de lymphome non- Hodgkinien (LNH) SR et de myélome multiple RPMI-8226 ainsi que la lignée murine de mastocytome P815 ont une prolifération réduite suite à une exposition au PCK3145. Ce peptide diminue également la clonogénicité de ces cellules. In vivo, le PCK3145 diminue significativement la croissance des tumeurs sous-cutanées P815 comparativement au PBS (p<0.001) et aux peptides contrôles (« scrambled peptide » (p<0.05) et PCK5266 (p<0.01)). De plus, le traitement au PCK3145 diminue le nombre de métastases au niveau du foie par rapports aux contrôles (p<0.05). Les niveaux de MMP-9 dans le sang des souris traitées au PCK3145 sont similaires à ceux dans le sang des souris sans tumeur. Par contre, chez les souris recevant le PBS ou le « scrambled peptide », les niveaux de MMP-9 étaient significativement plus élevés que dans les souris sans tumeur et les souris traitées au PCK3145 (p<0.05). De surcroît, dans un modèle de xénogreffe, le PCK3145 diminue significativement la croissance des lymphomes SR par rapport au PBS (p<0.01) et au « scrambled peptide » (p<0.001). Ces résultats indiquent que le PCK3145 possède une activité anti-tumorale et pourrait représenter un agent intéressant pour le traitement de plusieurs cancers hématologiques. / PCK3145 has been shown to exert anti-tumor activity against prostate cancer cells. In a Phase I clinical study, this peptide demonstrated low toxicity. To determine whether PCK3145 could exert cytotoxic activity against other marrow infiltrating cancers, we tested its activity against hematologic cancers. Interestingly, PCK3145 inhibited the proliferation of human NHL (SR) and myeloma (RPMI-8226) cell lines and murine mastocytoma (P815) cell line in vitro. Moreover, PCK3145 reduced the clonogenicity of these cell lines. To explore its activity in vivo, DBA/2 mice were injected with P815 cells. PCK3145 treatment significantly decreased P815 tumors growth in comparison to PBS (p<0.001), scrambled peptide (p<0.05) and PCK5266 (amino acids 52-66 of PSP-94) (p<0.01). Intraperitoneal PCK3145 treatment led to a decreased number of liver metastasis compared to PBS (p<0.05) and scrambled peptide (p<0.05). MMP-9 levels, measured by ELISA, in the peripheral blood of treated P815 bearing mice were similar to those obtained with healthy animals (12.83 1.890 (mean SD) ng/ml and 6.48 0.4070 ng/ml, respectively), while MMP-9 levels were elevated in mice treated with PBS and scrambled peptide (35.12 8.559 ng/ml and 22.60 3.944 ng/ml, respectively; p<0.05). In NOD/SCID mice PCK3145 treatment resulted in significant inhibition of human NHL SR growth compared to treatment with PBS (p<0.001) and scrambled peptide (p<0.01). Consequently, treatment with PCK3145 can reduce tumor cell proliferation of murine and human hematologic cancers. In addition, PCK3145 has the potential to inhibit tumor cells dissemination by lowering MMP-9 secretion. Thus, PCK3145 represents a unique peptide demonstrating sequence-specific anti-tumor activity hematologic malignancies.