A enzima L-asparaginase (ASNase) usada como biofármaco no tratamento de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é de origem bacteriana, o que provoca reações imunológicas nos paciente e a ASNase usada no Brasil é importada o que dificulta seu uso por razões de abastecimento e de preço. Por outra parte, dentro dos sistemas de expressão de proteínas recombinantes usados pela biotecnologia, destaca-se a Pichia pastoris, levedura metilotrófica de fácil manipulação, crescimento rápido, alta capacidade de expressão e capaz de realizar modificações pós-traducionais. Neste projeto, o gene de ASNase II de Saccharomyces cerevisiae foi expressa em P. pastoris (Muts), tendo sido analisada a localização da enzima nos meios extracelular, intracelular e espaço periplasmático. Além disso, foram avaliadas diversas condições de crescimento e indução da ASNase em agitador orbital e finalmente foi feito o cultivo em biorreator de 3L operado em batelada. Segundo o analise da expressão, a enzima foi localizada no espaço periplasmático. O crescimento de P. pastoris em diferentes concentrações de glicerol (10,0 - 50,0 g.L-1) mostraram parâmetros cinéticos similares (µmáx = 0,35 h-1; tg= 2,0 h) e o maior fator de conversão de substrato em células (Y x/s = 0,9 g g-1) foi obtido com 10,0 g.L-1 de glicerol. A expressão de ASNase somente ocorreu a 20 °C e melhora com concentrações de metanol acima de 1,0% (v/v), obtendo-se a maior produção da enzima a 3% de metanol durante 48 horas, o que foi corroborado pelo planejamento fatorial fraccionado (3n-k + 2), n = 3 e k =1. Também se observou que o pH de indução, a suplementação com aminoácidos ou casaminoácidos e concentração de glicerol durante a fase de crescimento apresentaram pouca ou nenhuma influência na expressão. Entretanto, as células induzidas imediatamente após o glicerol ter sido consumido melhoraram a produção de ASNase. No cultivo em biorreator, a fase de crescimento foi feita com 10,0 e 40,0 g.L-1-1 de glicerol, e a fase de indução com pulsos de 3,0% (v/v) de metanol durante 120 horas. A maior atividade volumétrica (710,2 U.L-1) de ASNase foi obtida na batelada com 40,0 g.L-1 de glicerol e a atividade periplasmática foi constante durante o tempo de cultivo o que significa que o controle do pH afeta positivamente na expressão de ASNase. / The bacterial L-asparaginase (ASNase) is used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and non-Hodgkin lymphoma and because his origin causes immune reactions in patients. The ASNase used in Brazil is imported which hinders its use due to supply availability and price. The methylotrophic yeast Pichia pastoris, is a microrganism easy to handle and with fast growth and high capacity of expression of recombinant proteins and that is able to carry out post-translational modifications. In this work, Saccharomyces cerevisiae ASNase II gene was expressed in Pichia pastoris (Muts) and was analyzed its localization in extra and intracellular medium and periplasmic space. Also, different conditions of growth and induction were evaluated in shaker, that culminated in a cultivation carried out in 3L bioreactor operated in batch. According the expression analysis, the enzyme was localized in periplasmic space; Pichia pastoris growth in different concentrations of glycerol (10 - 50 g.L-1) show similar kinetic parameters (µmáx = 0.35 h-1; tg = 2.0 h), with the higher substrate to biomass yield (Y x/s= 0.9 g.g-1) obtained with 10 g.L-1 of glycerol. The ASNase expression only occurred at 20°C and improves with methanol concentrations above 1.0% (v/v) to yield the highest production ASNase 3.0% methanol for 48 hours, which was corroborated by factorial fractionated design (3n-k + 2), n = 3 and k = 1. Also was observed that the pH of induction, supplementation with amino acids or casaminoacids and glycerol concentration during the growth phase had little or null influence on the expression. However the induction immediately after glycerol depletion improved the ASNase production. In bioreactor, were used 10 and 40 g.L-1 of glycerol in the growth phase and in the induction phase were used methanol pulses of 3.0% (v/v) during 120 hours. The major volumetric activity (710,2 U.L-1) of ASNase occurred in batch cultivation with 40 g.L-1 of glycerol and periplasmic activity was almost constant during the process which means that the control of pH affects positively the ASNase expression.

Os biossurfactantes são compostos de origem vegetal e microbiana, com propriedades tensoativas e/ou emulsificantes, que devido ao seu apelo ambiental em relação aos surfactantes sintéticos vêm se destacando nos últimos anos. São considerados produtos ecologicamente corretos, por serem biodegradáveis e exibirem reduzida/nula toxicidade. Além disso, a possibilidade de biossíntese utilizando processos fermentativos, empregando subprodutos agroindustriais como fonte de nutrientes é outra vantagem destes bioprodutos. O presente trabalho avaliou a produção de biossurfactantes por leveduras utilizando o hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono. Durante o estudo utilizou-se processos fermentativos em frascos na biossíntese dos biossurfactantes e métodos cromatográficos, espectrofotométricos, espectrométricos na caracterização dos hidrolisados e dos biossurfactantes. Observou-se que as 30 leveduras estudadas produziram biossurfactantes glicolipídicos em meio de cultivo suplementado com hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, utilizando entre 14 e 99 % da xilose e exibiram produtividades variando de 0.0035 a 0,1667 g/L.h. Os glicolipídeos produzidos pelas leveduras SSS1, SSS5, SSS6, SSS13, SSS18, SSS27 e SSS28 apresentaram potencial larvicida quando testados frente a Aedes aegypti, eliminando entre 20 - 100 % das larvas. Dentre as leveduras estudadas, a Trichosporon mucoides (SSS11) mostrou-se como melhor produtora de biossurfactante glicolipídico (produção de 11,334 ± 2,169 g/L - produtividade de 0,1667 g/L.h), produzindo um soforolipídeo com propriedades emulsificantes destacadas em diversas condições ambientais, onde os parâmetros temperatura, salinidade e pH foram variados. Após a otimização da produção tendo como base o meio suplementado com hidrolisado hemicelulósico, o biossurfactante produzido pela levedura apresentou um índice de emulsificação variando entre 86 - 90 % e uma tensão superficial de 34 mN/m, sendo considerado um promissor bioproduto para aplicação industrial. / Biosurfactants are plant and microbial metabolites with surface-active properties and / or emulsifiers, which due to environmental concerns about synthetic surfactants, have been highlighted in recent years. This intrinsic biodegradability and non-toxity of biosurfactants are responsible for their increased importance when compared to synthetic analogues. More than that, additionally the possibility of using alternative substracts for its synthesis, like biodegradable agroindustrial subproducts and the use of a bioprocess, reduce their the final cost of the production. Considering this, the present research evaluated biosurfactants production by yeasts using sugar cane bagasse hemicellulosic hydrolysate as carbon source, suggesting these compounds are potential alternative products for lignocellulosic biorefineries. The 30 yeasts studied produced glycolipid biosurfactants in supplemented sugar cane bagasse hydrolysate growth media, with 14 - 99 % of xylose and 0,0035 -0,1667 g/L.h productivity. The glycolipids produced by yeasts SSS1, SSS5, SSS6, SSS13, SSS18, SSS27 and SSS28 presented high larvicidas properties when tested against Aedes aegypti, killing 20 - 100 % of larvaes. Among the analyzed yeasts, Trichosporon mucoides (SSS11) was the best glycolipid biosurfactant productor (11,334 ± 2,169 g/L - productivity of 0,1667 g/L.h), allowing the isolation of a sophorolipid with emulsifier properties, tested in many physico-chemical conditions like variation of temperature, salt concentrations and pH. After nutritional otimization using the suplemented hemicellulosic hydrolysate media growth, the biosurfactant produced by Trichosporon mucoides presented emulsification levels from 86 - 90 % and a superficial tension of 34 mN/m, being considered an important bioproduct for industrial application.

Foram estudados a composição e o pH do meio de cultivo para a produção do fragmento de anticorpo (scFv) anti-LDL(-), expresso em Pichia pastoris recombinante. Os experimentos que definiram a composição e pH do meio assim como a concentração inicial de células na fase de indução foram realizados em agitador orbital a 250 rpm, com temperatura de 30 ºC na fase de crescimento e 20 ºC na fase de indução, durante 72 horas, com adição diária de 1% (v/v) de metanol. Para modificação do meio foi realizado um planejamento experimental empregando como variáveis independentes: extrato de soja, casaminoácidos e ureia, os quais substituíram o YNB e a biotina presentes no meio padrão (BMMY). Apesar de haver maior produção no meio com extrato de soja, o meio contendo 10 g.L-1 de casaminoácidos foi selecionado, uma vez que este favoreceu a etapa de purificação. A partir da faixa de pH estudada entre 3,0 e 8,0, determinou-se que o pH 8,0 no início da fase de indução favorece a maior produção. Finalmente, o meio BMMY-CA (pH 8,0) foi utilizado para cultivo em biorreator com volume de trabalho de 10L e a partir deste cultivo foram calculados os parâmetro cinéticos (velocidades de crescimento, de consumo de substrato e de produção, bem como produtividade). Diante do conjunto de experimentos realizados, foi possível otimizar a composição do meio de cultivo e as condições operacionais, que possibilitaram um aumento do rendimento bem como aumento do volume de produção do scFv anti-LDL(-) em biorreator. / Composition and pH culture medium for the production of anti- LDL(-) antibody fragment (scFv) were studied in recombinant yeast Pichia pastoris. The experiments that defined medium composition, pH and the initial cell concentration in the induction phase were carried out in baffled shaker flasks at 250 rpm, with temperature at 30°C for growth phase and 20°C for induction phase, during 72 hours with daily addition of 1% (v/v) methanol. A design of experiments employing for medium modification with independent variables: soy extract, casamino acids and urea, which replaced the YNB and biotin present in the standard medium (BMMY) was conducted for medium formulation. Even though, there was an increase in medium production with soy extract, the medium containing 10 g.L-1 casamino acids was selected since it favors the purification step. Through a pH range study (3.0 to 8.0), it was determined that pH 8.0 during induction phase offered higher levels. Then, the best results from shaker flask cultivation (BMMY-CA with casamino acids and pH 8.0) were carried out in 1L bioreactor, showing a biomass and a scFv production increase compared to the standard, BMMY (pH 6.0). Finally, the medium BMMY-CA (pH 8,0) was submitted to a volume scale-up into a 10L bioreactor, which was also used to evaluate kinetic parameters (rates of growth, substrate consumption and production as well as productivity). In conclusion, by optimizing culture medium and operating conditions it was possible to increase yield and scale-up the production of scFv anti-LDL(-) in bioreactor.

O objetivo deste trabalho foi estudar a influência de bactérias dos gêneros Bacillus e Lactobacillus, bem como de seus produtos metabólicos, na redução da viabilidade celular Saccharomyces cerevisiae, quando em cultura mista de levedura e bactérias ativas e tratadas. Também foi avaliado um meio alternativo de cultivo de bactérias e leveduras, constituído de caldo de cana diluído a 5o brix e suplementado com extrato de levedura e peptona. As bactérias Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum foram cultivadas em associação com Saccharomyces cerevisiae (cepa Y-904) por 72 h a 32oC, sob agitação. A viabilidade celular, a taxa de brotamento e a população de células da levedura, a acidez total, a acidez volátil e o pH do meio foram determinados às 0, 24, 48 e 72 h do cultivo misto. Também foi determinada a população inicial e final dos microrganismos através de plaqueamento em profundidade, em meio de cultivo tradicional (PCA para os Bacillus, MRS-agar para os Lactobacillus e YEPD-agar para S. cerevisiae) e no meio constituído de caldo de cana. As culturas de bactéria foram tratadas através do calor (esterilização em autoclave a 120oC por 20 minutos), de agente antimicrobiano (Kamoran HJ na concentração de 3,0 ppm) ou da irradiação (radiação gama, com doses de 5,0 kGy para os Lactobacillus e 15,0 kGy para os Bacillus). Os resultados mostraram que apenas os meios de cultivo mais acidificados (com maiores concentrações de acidez total e volátil, e menores valores de pH), contaminados com as bactérias ativas L. fermentum e B. subtilis, provocaram diminuição da viabilidade celular da levedura. Excetuando a bactéria B. subtilis inativada por radiação, as demais bactérias tratadas pelos diferentes processos (calor, radiação e antimicrobiano) não causaram diminuição da viabilidade celular e da população das leveduras, indicando que a presença isolada dos metabólitos celulares dessas bactérias não foi suficiente para reduzir a porcentagem de células vivas e a densidade populacional da levedura. Para todos os microrganismos, as contagens obtidas com o cultivo em meio à base de caldo de cana foram semelhantes às obtidas nos meios tradicionais, provavelmente porque o meio alternativo simula a composição do mosto de caldo de cana-de-açúcar, do qual as bactérias foram isoladas do processo industrial de produção de etanol. Sendo assim, o meio de cultivo à base de caldo de cana-de-açúcar pôde substituir os meios tradicionais de cultivo da levedura e das bactérias testadas neste trabalho. / The aim of this work was to study the influence of the bacteria Bacillus and Lactobacillus, as well as their metabolic products, in reduction of cellular viability of Saccharomyces cerevisiae, when in mixed culture of yeast and active and treated bacteria. Also was to evaluated an alternative medium (MCC) for the cultivation of bacteria and yeast, constituted of sugarcane juice diluted to 5o Brix and supplemented with yeast extract and peptone. The bacteria Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum were cultivated in association with yeast Saccharomyces cerevisiae (strain Y-904) for 72 h on 32oC, under agitation. The cellular viability, budding rate and population of S. cerevisiae, the total acidity, volatile acidity and pH of culture were determined from 0, 24, 48 e 72 h of mixed culture. Also were determined the initial and final of microorganism population across the pour plate method, in traditional culture medium (PCA for Bacillus, MRS-agar for Lactobacillus and YEPD-agar for yeast S. cerevisiae) and in medium constituted of sugarcane juice. The bacteria cultures were treated by heat sterilization (120oC for 20 minutes), antibacterial agent (Kamoran HJ in concentration 3,0 ppm) or irradiation (radiation gama, with doses of 5,0 kGy for Lactobacillus and 15,0 kGy for Bacillus). The results of the present research showed that just the culture mediums more acids (with higher concentrations of total and volatile acidity, and smaller values of pH), contaminated with active bacteria L. fermentum and B. subtilis, caused reduction on yeast cellular viability. Except the bacteria B. subtilis treated with radiation, the others bacteria treated by different procedures (heat, radiation e antibacterial) did not cause reduction on yeast cellular viability and population, indicating that the isolated presence of the cellular metabolic of theses bacteria was not enough to reduce the percentage of the yeast live cells and a density population. For all microorganisms, the counts obtained with the cultivation medium constituted of sugarcane juice were similar obtained in traditional mediums, probably because the alternative medium simulate the composition of sugarcane must, that the bacteria were isolated in industrial process of ethanol yield. However, the culture medium constituted of sugarcane juice could be replacing traditional culture mediums of yeast and bacteria tested in this work.

A levedura Yarrowia lipolytica tem sido muito investigada, especialmente por ser um microrganismo oleaginoso, ou seja, capaz de acumular grandes quantidades de lipídios, o que ocorre majoritariamente em organelas denominadas partículas lipídicas. Estes lipídios apresentam várias potenciais aplicações biotecnológicas, como por exemplo na produção de óleo microbiano (single cell oil) e na produção de biodiesel. Durante este projeto de mestrado, objetivou-se estudar a fisiologia de duas linhagens da levedura Y. lipolytica, sendo uma tradicionalmente estudada pela comunidade científica internacional (linhagem w29) e outra isolada da Baía da Guanabara, no Rio de Janeiro (linhagem IMUFRJ 50682). Foram realizados cultivos em frascos agitados tipo Erlenmeyer com defletores tampados com algodão (volume total 500 mL, volume de meio 100 mL, 28 oC e 200 rotações por minuto), durante os quais foi possível: 1) escolher um meio de cultivo de composição totalmente definida, com tiamina como único fator de crescimento, adequado a estudos de fisiologia quantitativa com esta levedura; 2) verificar que Y. lipolytica não é capaz de crescer com sacarose ou xilose como única fonte de carbono; 3) verificar que Y. lipolytica cresce com velocidade específica de crescimento máxima (Máx) de 0,49 h-1 num meio complexo contendo glicose, extrato de levedura e peptona (meio YPD), 0,31 h-1 em meio definido com glicose como única fonte de carbono e 0,35 h-1 no mesmo meio, mas com glicerol como única fonte de carbono, sem excreção de metabólitos para o meio de cultivo; 4) verificar que ocorreu limitação por oxigênio nos cultivos em frasco agitado, sendo este o motivo pelo qual as células deixaram de crescer exponencialmente; 5) verificar que o uso de ureia, em vez de sulfato de amônio, como fonte de nitrogênio, contribui para uma variação menor do pH durante os cultivos, sem prejuízo ao crescimento da levedura; 6) observar que, ao se restringir a oferta de nitrogênio à levedura (aumento da relação C/N inicial no meio de 12,6 para 126), as células têm sua morfologia alterada e apresentam maior quantidade de partículas lipídicas; 7) determinar uma composição elementar para a biomassa de Y. lipolytica (CH1,98O0,58N0,13), em que os átomos de carbono encontram-se em média mais reduzidos do que na biomassa de leveduras como Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis. Foram também realizados cultivos em biorreator em batelada (1 L de volume útil, 28 oC, aerobiose plena e pH controlado em 5,0), durante os quais foi possível: a) estabelecer um protocolo de cultivo para Y. lipolytica em biorreator (que envolvem agitação mecânica, aeração e uso de anti-espumante, entre outras diferenças em relação aos cultivos em frasco); b) confirmar os valores dos principais parâmetros fisiológicos apresentados por esta levedura, anteriormente obtidos a partir de cultivos em frasco; c) confirmar que o fator de conversão de substrato a células (Yx/s) é maior para cultivos realizados com glicerol como fonte única de carbono (0,53 g/g para a linhagem IMUFRJ 50682), do que com glicose (0,48 g/g para a mesma linhagem). Finalmente, cultivos realizados em quimiostato com glicerol como fonte de carbono e energia, limitados por amônio (fonte de nitrogênio, relação C/N 126), às vazões específicas de 0,25 h-1 e 0,15 h-1, permitiram observar que o número de partículas lipídicas por célula de Y. lipolytica permaneceu em torno de 2 em ambas as situações e houve uma diminuição no teor de nitrogênio nas células quando a velocidade específica de crescimento diminuiu de 0,25 para 0,15 h-1. / The yeast Yarrowia lipolytica has been intensively investigated, especially for being an oleaginous microorganism, thus possessing the capacity of accumulating high amounts of lipids, which mainly takes place in organeles known as lipid bodies. These lipids present several potential biotechnological appications, as in the production of single cell oil or biodiesel. During this research project, we aimed at investigating the physiology of two Y. lipolytica strains: w29, traditionally investigated by the international scientific community, and IMUFRJ 50682, isolated from the Guanabara Bay in Rio de Janeiro. Shake-flask cultivations in baffled Erlenmeyer flasks (total volume 500 mL, liquid volume 100 mL, 28 oC and 200 rotations per minute) with cotton stoppers were carried out and allowed us to: 1) choose a fully defined cultivation medium, in which tiamine is the sole growth factor, suitable for quantitative physiological studies with this yeast; 2) verify that Y. lipolytica is not capable of growing on sucrose or xylose as the sole carbon source; 3) observe that Y. lipolytica grows with a maximum specific growth rate (MAX) of 0.49 h-1 in a complex medium containing glucose, yeast extract and peptone (YPD medium), 0.31 h-1 in a defined medium with glucose as the sole carbon source, and 0.35 h-1 in the same medium, but with glycerol as the sole C-source, without excreting metabolites to the cultivation medium; 4) verify that oxygen limitation took place during our shakeflask cultivations and that this caused cells to leave the exponential growth phase; 5) verify that urea can substitute ammonium as the sole nitrogen-source for Y. lipolytica, keeping pH variations less pronounced, without compromising cell growth; 6) observe that cells presented an altered morphology and higher amounts of lipid bodies, when less nitrogen was added to the medium (C/N ratio increased from 12.6 to 126); 7) determine an elemental composition for the biomass of Y. lipolytica (CH1,98O0,58N0,13), in which the average carbon atom was more reduced with respect to the biomass of yeasts such as Dekkera bruxellensis and Saccharomyces cerevisiae. Bioreactor cultivations in batch mode (working volume 1 L, 28 oC, full aerobiosis and pH controlled at 5.0) were also carried out, which allowed us to: a) define a protocol for the cultivation of Y. lipolytica in this system (which involves mechanical agitation, aeration and the use of anti-foam, among other differences with respect to shake-flask cultivations); b) confirm the main physiological parameters presented by this yeast, previously obtained from shake-flask cultivations; c) confirm that the biomass yield on substrate (Yx/s) is higher on glycerol than on glucose (0.53 g/g and 0.48 g/g, respectively). Finally, N-limited chemostat cultivations with glycerol as the carbon and energy source and ammonium as the N-source were also performed (dilution rates of 0.25 h-1 and 0.15 h-1, C/N ratio in the medium of 126), allowing us to verify that the number of lipid particles per cell is around 2 under both conditions and that there was a decrease in the N content in the cells when the specific growth rate decreased from 0.25 to 0.15 h-1.

O desenvolvimento de sistemas de expressão através da modificação de fortes promotores conhecidos vem sendo amplamente utilizado para a produção de proteínas com potencial utilização biotecnológica em diversos hospedeiros como S. cerevisiae. O objetivo do trabalho foi construir um promotor quimérico através de modificações do promotor cbh1 de T. reesei e inserção de elementos de resposta a metais provenientes do promotor ZRT1 de S. cerevisiae. O promotor desenhado foi utilizado na construção de um sistema de expressão, que foi inserido na levedura e teve sua atividade analisada pelo teste de ONPG. Foi possível observar que, conforme a concentração de zinco aumenta, a atividade do promotor diminui. O promotor teve maior atividade no meio sem zinco e menor no meio com 1000 μM de zinco. Esses resultados confirmam que o sistema funciona de forma eficiente em S. cerevisiae. Também foi possível observar que os mutantes crescidos em meio com limitação de zinco e, consequentemente com maior atividade do promotor, tiveram sua taxa de crescimento alterada. O que é esperado devido ao fenômeno conhecido como estresse metabólico, comum durante a produção de proteínas recombinantes em leveduras, na qual a cultura apresenta uma diminuição significativa do crescimento. / The development the expression systems by modifying strong promoters has been widely used for the production of proteins with potential biotechnological use in various hosts such as S. cerevisiae. This study aimed to construct an expression system constituted of the chimeric promoter built with cbh1 promoter modified by inserting metal responsive elements from the promoter of ZRT1 gene of S. cerevisiae. The S. cerevisiae was transformed and the system was induced with different concentrations of zinc and was tested using ONPG as substrate. It was observed that under high zinc concentrations promoter activity is low. At low zinc concentrations the opposite effect is observed, and the promoter reaches its highest activities. These results confirm that the system functions efficiently in S. cerevisiae. It was also observed that the mutant grown in environment with zinc limitation, hence with higher activity of the promoter, showed reduced growth rate. Indeed, this is expected due to the phenomenon known as metabolic burden, characterized by a joint stress during the production of recombinant proteins in yeast, under conditions which the culture has a significant growth reduction.

Motivado pela crescente importância que os animais domésticos vêem causando na sociedade humana, tanto em relação à busca de melhor qualidade de vida, quanto em relação ao seu valor epidemiológico, visto que são poucos os estudos sobre este assunto, este trabalho objetivou-se em identificar e traçar o perfil de sensibilidade frente aos antífúngicos das espécies de leveduras potencialmente patogênicas isoladas da mucosa oral de cães sem raça definida, da cidade de Campinas, São Paulo. Por motivos de segurança, os animais selecionados foram anestesiados para a realização de exame clínico da cavidade oral e coleta de amostras da região de mucosa oral, seguida de inoculação em ágar Sabouraund dextrose com cloranfenicol. A partir do crescimento em placa, foram isoladas as colônias de fungos leveduriformes, submetidas a exames macromorfológicos e micromorfológicos, meio cromogênico, provas bioquímicas (urease e método API 20C AUX) e teste de sensibilidade aos antifúngicos. Dos 50 animais participantes do estudo, os cães com idade superior a 4 anos e os que apresentavam doença periodontal tiveram maior percentual de isolamento. Foram identificadas 43 leveduras das 45 amostras isoladas, sendo elas 86% (37) correspondentes ao gênero Candida spp, 11,6% (5) pertencentes ao gênero Trichosporon spp e 2,3% (1) do gênero Malassezia pachydermatis. O perfil de sensibilidade pelo método \"Etest\" identificou importante resistência de algumas amostras à antifúngicos rotineiramente utilizados na clínica médica veterinária, o que ressalta a importância da continuidade deste trabalho para o melhoramento da conduta clínica e para a explicação dos inúmeros tratamentos recidivos tanto em animais como em humanos. / Regarding the increasing impact that that the pets have been causing to the human society as its relation to the search for a better quality of life, and its relation with the epidemiological value, this study aimed to identify and draw the profile of the susceptibility to the antifungal drugs of the potentially pathogenic species of yeasts isolated from the oral canine mucosa of animals from indefinite breed of the city of Campinas, São Paulo. For their safety, the selected animals were anesthetized to have a short clinic exam of the oral cavity performed and to have samples from the oral mucosa collected. Later an inoculation in Sabouraud Dextrose Agar with chloramphenicol was performed. After the growth on a dish, colonies of fungi with yeast shape were isolated and submitted to macro morphological and micro morphological exams, chromogenous medium, biochemical proofs (urease and API 20C AUX method), and the test of the susceptibility to the antifungal drugs. Among the 50 animals taken part in the study, the dogs over 4 years old and those which presented periodontal diseases had a higher isolation percentage. Yeasts were identified 43 of the 45 isolates, being that 86%(37) were from the genus Candida spp, 11,6% (5) belonged to the genus Trichosporon spp., and 2,3% (1) belonged to the genus Malasseziapachydermatis.The susceptibility profile through the \"Etest®\" method identified a relevant resistance of some strains to the antifungal drugs commonly used in the veterinary medical clinic. This found highlights the relevance of the continuity of this study to improve the clinical conduct and to explain many relapse treatments in both animals and humans.

A atual demanda mundial para redução nas emissões de dióxido de carbono vem aumentando e o uso de etanol como combustível tem sido considerado como uma boa alternativa. Entretanto as condições de cultivo da levedura obrigam o micro-organismo a lidar com diferentes estressores, sendo as altas temperaturas e elevadas concentrações de etanol exemplos dos mais limitantes durante o processo produtivo. Assim, o presente estudo teve como objetivo encontrar mutantes de Saccharomyces cerevisiae que apresentassem maior resistência a altas concentrações de etanol e altas temperaturas concomitantemente. Para isso, utilizamos como modelo a coleção YKO (Invitrogen®), que contém 4,828 linhagens mutantes para genes não essenciais na levedura. Primeiramente, estabelecemos as condições de estresse (concentração de etanol e temperatura) as quais se mostrassem limitantes para o crescimento da linhagem isogênica selvagem (BY4741). Foram estabelecidas as condições de estresse em 10% de etanol em conjunto com aumento de temperatura para 37ºC, que foram então utilizadas para testar a tolerância das linhagens mutantes agrupadas em 53 pools. Foram identificadas as linhagens mutantes para as ORFs UBP15, THI12, CLA4, DIT1 e MTC7 que suportaram tais condições, se mostrando possíveis candidatos para melhora genética em linhagens industriais como PE2 e CAT1. / The current world demand for reduced emissions of carbon dioxide is increasing the use of ethanol as a fuel has been considered as a good alternative. However culture conditions requiring the yeast micro-organism to cope with different stressors, as the high temperatures and high concentrations of ethanol the most lititant examples during the production process. Thus, the present study aimed to find Saccharomyces cerevisiae mutants that having greater resistance to high ethanol concentrations and high temperatures concurrently. For this, we use a model collection YKO (Invitrogen®) which contains 4.828 mutant strains for non-essential genes in yeast. First, we establish the stress conditions (ethanol concentration and temperature) which would prove limiting to the growth of the isogenic wild type (BY4741). Were established stress conditions in 10% ethanol together with temperature rise to 37ºC, which were then used to test the tolerance of mutant strains grouped into 53 pools. The mutant lines were identified for UBP15, THI12, CLA4, DIT1 and MTC7 ORFs who endured such conditions are showing possible candidates for genetic improvement in industrial strains as PE2 and CAT1.

Para avaliar o efeito de diferentes linhagens de leveduras, Saccharomyces cerevisiae, vivas, na redução de aflatoxicoses e, contribuir para o entendimento do modo de ação destas leveduras sobre aflatoxina B1 marcada com trítio (AFB13H), foram conduzidos três experimentos. No primeiro experimento, foram utilizados ratos Wistar para investigar o efeito de duas linhagens de S. cerevisiae (Y1026 e Y904), e da suplementação com aminoácidos na redução de aflatoxicoses. O bioensaio, em delineamento inteiramente casualizado, foi conduzido por 28 dias para avaliar sete tratamentos (dietas), sendo um livre de aflatoxinas e seis contendo 400g kg-1 de aflatoxinas; destes, cinco com leveduras, a saber: Y1026 (níveis de 0,5; 1,0 e 5,0%) e Y904 (níveis de 1% e 1%+1000ppm de metionina + 1000 ppm de cisteína). Não foram observadas diferenças estatistiticamente significativas no consumo de alimentos, ganho de peso, conversão alimentar e função hepática entre os animais submetidos aos diferentes tratamentos. No entanto, o exame histopatológico revelou que os animais que receberam aflatoxinas sem leveduras sofreram danos mais severos em relação aos que receberam aflatoxinas juntamente com leveduras, os quais apresentaram poucos danos celulares. Conclui-se que, as duas linhagens de leveduras em todas as situações estudadas apresentaram capacidade de reduzir as aflatoxicoses. O segundo ensaio foi conduzido com o objetivo de investigar o efeito de diferentes doses da levedura Y1026 no controle de aflatoxicoses em ratos. Neste bioensaio, os animais foram distribuídos em gaiolas individuais ao acaso, e foram submetidos a 7 tratamentos (dietas) por 60 dias, sendo uma sem aflatoxinas e seis contaminadas com 550 g kg-1 de aflatoxinas, das quais cinco contendo a levedura Y1026 (doses: 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0%). Foram realizadas análises sobre o aproveitamento do alimento, funções hepáticas e tecido hepático. O consumo de alimentos pelos animais alimentados com dieta livre de aflatoxinas foi maior do que pelos animais que receberam dietas contaminadas com a toxina, os demais parâmetros para julgamento do aproveitamento dos alimentos não diferiram estatisticamente entre os animais que foram submetidos a ambos os tratamentos. A atividade de enzimas hepáticas foi maior nos animais que não receberam a toxina do que nos demais. O exame histopatológico revelou que os animais que receberam aflatoxinas e aflatoxinas mais 0,2 ou 0,5% da levedura apresentaram sinais claros de hepatotoxidez e que os demais animais que ingeriram os níveis mais altos da levedura sofreram poucos danos celulares. Conclui-se que, a dose de levedura Y1026 aplicada foi determinante na redução das aflatoxicoses em ratos Wistar. No último bioensaio, trinta ratos foram alimentados por 28 dias seguindo-se quatro tratamentos (dietas): uma dieta livre de aflatoxinas e as outras três contaminadas com 500 g kg 1 de aflatoxina, sendo uma o controle com aflatoxinas e as outras duas na presença de 1% de levedura Y1026 ou Y904. No 18º dia, seis animais de cada um dos tratamentos que recebiam aflatoxinas foram transferidos para gaiolas metabólicas, onde permaneceram por cinco dias em adaptação e, no 23º dia, estes receberam, por via oral, uma dose simples de 2Ci/animal de AFB13H. Os animais restantes (três ratos em cada um dos tratamentos) foram utilizados nos exames histopatológicos. A radioatividade foi determinada 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a introdução do material radioativo nos animais. Os animais que receberam dietas contendo as leveduras apresentaram a absorção, a distribuição e a excreção da radioatividade mais lenta do que aqueles que não receberam os probióticos. O exame histopatológico revelou que os animais que ingeriram leveduras sofreram poucos danos celulares e que aqueles que não receberam levedura foram muito afetados. As leveduras apresentaram habilidade de reduzir aflatoxicoses e modificaram a absorção, a distribuição e a excreção da radioatividade de AFB13H em ratos Wistar. / The capacity of Saccharomyces cerevisiae, from two Strain, to reduce aflatoxicosis and the effect of yeast cells on tritium-labeled B1 aflatoxin (AFB13H) were investigated in three distinct studies. The effects of S. cerevisiae Y1026 and Y904 strains and diets amended with amino acids on the reduction of aflatoxicosis in Wistar rats were evaluated in the first study. A completely randomized block-designed bioassay with Wistar rats was conducted to evaluate seven formulations (Treatments), which consisted of an aflatoxin-free formulation and six formulations with 400 g kg-1 of aflatoxins. Of these, three formulations had the yeast strain Y1026 (at 0.5, 1.0 and 5.0%) and two had the strain Y904 (at 1% and 1%+1000ppm of methionine + 1000 ppm of cysteine). No statistical differences were observed for the food consumption, weights of the body organs, feed conversion and liver function between the animals fed the different treatments. Histopathological analysis revealed that animals fed aflatoxins diet without yeast cells had liver damage caused by the toxins and those that were fed aflatoxin-diet amended with yeast cells had less liver tissue damage. Therefore, the results obtained suggested that the presence of either yeast strain in the formulations caused a reduction in aflatoxicosis. The second study was conducted to investigate the effect of different dosages of the yeast strain Y1026 on the control of aflatoxicosis in rats. The bioassay was conducted with rats randomly placed in individual cages and fed seven different diets (7 treatments) for 60 days. These were an aflatoxin-free formulation and six others containing aflatoxins at 550 g kg-1, of which five had the yeast strain Y1026 (concentrations at 0.2; 0.5; 1.0; 2.0 and 5%). Feed conversion, liver functions indexes and liver tissue parameters were evaluated. The activity of the liver enzymes was greater in animals that fed the toxin-free diet when compared to other animals. Histopathological analysis showed that animals fed aflatoxin containing diets with and without 0.2 or 0.5% yeast cells showed clear signs of hepatotoxicity, while animals that were fed diets with higher concentrations of yeast cells had less liver tissue damage. The concentration of the yeast cells (Y1026) used in the formulations was correlated with the reduction of aflatoxicosis in Wistar rats. The third study fed Wistar rats an aflatoxin-free diet and diets with aflatoxins (at 500 g kg 1) and aflatoxin amended with a 1% concentration of the yeast strains Y1026 or Y904. In this study, six animals from each group fed the aflatoxin-diets were transferred to metabolic cages and received a single oral dose of AFB13H at 2Ci/animal. Three animals of each treatment were kept at the initial conditions and their liver tissues were used for histopathological analysis. Radiation levels in the animals were monitored at 12, 24, 48, 72, 96 and 120 h after receiving the labeled aflatoxin. Animals fed diets with active yeast cells had absorption, distribution and excretion levels of the labeled toxin different than those that did not receive the probiotic. Histopathological analysis showed that animals fed diets with yeast cells had less liver tissue damage while those fed the aflatoxin-diet had significantly higher liver damage. Therefore, these results indicate that active yeast cells have the ability to reduce aflatoxicosis and modify the absorption, distribution and excretion of radioactivity from AFB13H in Wistar rats.

A transformação do mosto de uva em vinho envolve uma série de ações combinadas de diferentes gêneros e espécies de microrganismos. A espécie Saccharomyces cerevisiae domina a fase intermediária e a fase final da fermentação alcoólica. De modo geral, as leveduras enológicas podem ser caracterizadas pela capacidade fermentativa, produção de H2S (sulfeto de hidrogênio) e seu comportamento killer. A Embrapa uva e vinho possui em sua Coleção, diversas leveduras autóctones isoladas de bagas de uvas oriundas de diversas regiões do Brasil. Entretanto, a diversidade genética destes isolados não é conhecida. Neste estudo foram avaliados a capacidade fermentativa, formação de H2S, fator killer e sensibilidade ao fator killer de 150 leveduras provenientes das cultivares Malvasia Bianca (FMB14), Moscato Alexandria (FMA14) e Moscato Tradicional (MBTF14) todas oriundas da região de Farroupilha- RS. A capacidade fermentativa foi avaliada juntamente com a formação de H2S, inoculando as leveduras em meio mosto sulfito. Os testes ao fator killer e sensibilidade ao fator killer foram avaliados através do meio Lorena/ELNC (80:20). As linhagens com perfil para elaboração de vinhos e produtoras da toxina killer foram identificadas por amplificação da região ITS1- 5.S- ITS2 por PCR e por PCR-RFLP. Foi avaliada também a diversidade genética de 23 linhagens da espécie de Saccharomyces cerevisiae da Coleção da Embrapa Uva e Vinho, usando a técnica de PCR-RAPD. Foram empregados para detectar a variabilidade genética das leveduras os oligonucleotídeos iniciadores: (GTG)5, (GAC)5, (GACA)4 e M13. Os resultados mostraram que a maioria das linhagens apresentaram baixa velocidade fermentativa aliada à diferentes níveis de produção de H2S. Somente 3 linhagens apresentaram capacidade fermentativa adequada quando comparadas com as linhagens de referencia 1vvt/97 e K1, quais sejam, 29MBF14, 39MBTF14 e 50MBF14. Apenas a linhagem 29MBTF4 formou pequenas quantidades de H2S. Verificou-se que 64% das linhagens isoladas mostraram-se metabolicamente capazes de biossintetizar H2S. Somente 9,33% apresentaram comportamento killer e apenas 6,66% mostraram sensibilidade à proteína killer. Os resultados apresentados sugerem ter relação com as cultivares utilizadas no isolamento. Verificou-se a existência de diferenças genéticas entre as linhagens de Saccharomyces cerevisiae estudadas com todos os iniciadores utilizados. Os iniciadores que mais discriminaram linhagens de Saccharomyces cerevisiae foram (GTG)5 e (GAC)5. / Grape must conversion into wine involve combined actions of different genus and species of microorganism. The species Saccharomyces cerevisiae dominates intermediate and final stages of alcoholic fermentation. Generally, the oenological yeasts are characterized by their fermentative capacity, production of H2S (hydrogen sulfide) and killer behavior. Embrapa Grape and Wine has a Yeast Collection that encompasses many autochthonous strains isolated of grape berries from different regions of Brazil. However, the genetic diversity of these yeasts are stilling known. This study has evaluated the fermentative capacity, production of H2S, killer factor and killer factor sensibility of 150 yeasts isolated from the cultivars Malvasia Bianca (FMB14), Moscato Alexandria (FMA14) and Moscato Tradicional (MBTF14) all belonging from Farroupilha commune in Rio Grande do Sul State. The fermentative capacity has been tested along with the evaluation of H2S production by the inoculation of the yeasts in sulfite must medium. The production and detection of factor killer and the evaluation of sensitive characteristics have been measured in Lorena/ELNC (80:20) solid medium. Yeasts with optimal fermentative characteristics and the ones producing killer toxin have been identified by amplification of ITS1-5.8S-ITS2 region by PCR -RFPL. This study also has evaluated the genetic diversity of 23 yeasts strains of Saccharomyces cerevisiae, belonging to the Yeast Collection of Embrapa Grape and Wine, employing PCRRAPD technique. The primers (GTG)5, (GAC)5, (GACA)4 and M13 have been used to detect the yeasts genetic diversity. The results showed that the majority of the yeasts analyzed have demonstrated low fermentative velocity combined with different levels of H2S production. From the three cultivars analyzed, only Moscato Tradicional showed yeasts with a suitable fermentative capacity when compared to the reference yeasts EMBRAPA 1vvt97 e K1, and they were named as 29MBF14, 39MBTF14 and 50MBF14. It was verified that 84%, 76% and 36% of the isolated strains from Malvasia Bianca, Moscato Tradicional and Moscato Alexandria, respectively, were capable to biosynthesize H2S. Concerning to killer behavior, 14%, 12% and 2% of the isolated strains from Moscato Tradicional, Moscato Alexandria and Malvasia Bianca, respectively, were capable of producing killer factor. These outcomes suggest the influence of the cultivar into the microflora biodiversity. Genetic differences were also demonstrated between the strains of Saccharomyces cerevisiae for all the primers tested. Primers GTG5 and GAC5 were the most discriminative.