Motivado pela crescente importância que os animais domésticos vêem causando na sociedade humana, tanto em relação à busca de melhor qualidade de vida, quanto em relação ao seu valor epidemiológico, visto que são poucos os estudos sobre este assunto, este trabalho objetivou-se em identificar e traçar o perfil de sensibilidade frente aos antífúngicos das espécies de leveduras potencialmente patogênicas isoladas da mucosa oral de cães sem raça definida, da cidade de Campinas, São Paulo. Por motivos de segurança, os animais selecionados foram anestesiados para a realização de exame clínico da cavidade oral e coleta de amostras da região de mucosa oral, seguida de inoculação em ágar Sabouraund dextrose com cloranfenicol. A partir do crescimento em placa, foram isoladas as colônias de fungos leveduriformes, submetidas a exames macromorfológicos e micromorfológicos, meio cromogênico, provas bioquímicas (urease e método API 20C AUX) e teste de sensibilidade aos antifúngicos. Dos 50 animais participantes do estudo, os cães com idade superior a 4 anos e os que apresentavam doença periodontal tiveram maior percentual de isolamento. Foram identificadas 43 leveduras das 45 amostras isoladas, sendo elas 86% (37) correspondentes ao gênero Candida spp, 11,6% (5) pertencentes ao gênero Trichosporon spp e 2,3% (1) do gênero Malassezia pachydermatis. O perfil de sensibilidade pelo método \"Etest\" identificou importante resistência de algumas amostras à antifúngicos rotineiramente utilizados na clínica médica veterinária, o que ressalta a importância da continuidade deste trabalho para o melhoramento da conduta clínica e para a explicação dos inúmeros tratamentos recidivos tanto em animais como em humanos. / Regarding the increasing impact that that the pets have been causing to the human society as its relation to the search for a better quality of life, and its relation with the epidemiological value, this study aimed to identify and draw the profile of the susceptibility to the antifungal drugs of the potentially pathogenic species of yeasts isolated from the oral canine mucosa of animals from indefinite breed of the city of Campinas, São Paulo. For their safety, the selected animals were anesthetized to have a short clinic exam of the oral cavity performed and to have samples from the oral mucosa collected. Later an inoculation in Sabouraud Dextrose Agar with chloramphenicol was performed. After the growth on a dish, colonies of fungi with yeast shape were isolated and submitted to macro morphological and micro morphological exams, chromogenous medium, biochemical proofs (urease and API 20C AUX method), and the test of the susceptibility to the antifungal drugs. Among the 50 animals taken part in the study, the dogs over 4 years old and those which presented periodontal diseases had a higher isolation percentage. Yeasts were identified 43 of the 45 isolates, being that 86%(37) were from the genus Candida spp, 11,6% (5) belonged to the genus Trichosporon spp., and 2,3% (1) belonged to the genus Malasseziapachydermatis.The susceptibility profile through the \"Etest®\" method identified a relevant resistance of some strains to the antifungal drugs commonly used in the veterinary medical clinic. This found highlights the relevance of the continuity of this study to improve the clinical conduct and to explain many relapse treatments in both animals and humans.

Trichosporon spp. são patógenos oportunistas emergentes que causam alta mortalidade entre pacientes imunocomprometidos. A presente investigação teve como objetivos avaliar aspectos ecológicos relacionados à colonização humana e animal; testar 28 amostras de Trichosporon através de métodos de caracterização laboratorial clássica, detectar a atividade enzimática extracelular e avaliar a suscetibilidade desses isolados contra os antifúngicos. A expressão de melanina e glucuronoxylomanana (GXM) em parede celular foi estudada em T. asahii., Trichosporon inkin e T. asahii foram isolados da região perigenital de duas mulheres e dois tamanduás, respectivamente. Microbiologicamente, as amostras investigadas (28) apresentaram características morfológicas e fisiológicas compatíveis com as descritas na literatura. Pouca especificidade na identificação de Trichosporon spp. foi verificada em CHROMagar Candida® e API ID 32C®. O estudo da atividade de exoenzimas demonstra a relevância na produção de lipase. Não foi possível detectar a expressão de melanina em T. asahii. No entanto, GXM foi expressa por amostra-padrão e isolado clínico da mesma espécie. Embora os pontos de corte não estejam, ainda, bem estabelecidos para Trichosporon spp., os testes sugerem valores elevados de concentração inibitória mínima (CIM) para anfotericina B, fluconazol, itraconazol e cetoconazol. Voriconazol demonstrou maior eficácia contra Trichosporon spp. A maior parte das amostras apresentou resistência a caspofungina. / Trichosporon spp. are emergent opportunistic pathogens that cause high mortality among immunocompromised patients. The aim of the study was to evaluate ecological aspects related to human and animal colonization; to test 28 samples of Trichosporon spp. on classic laboratorial characterization, detection of the extracellular enzymatic activity and antifungal susceptibility (E-test®). Melanin and glucuronoxylomanan (GXM) wall expression was studied in T. asahii. Trichosporon inkin and T. asahii were isolated from perigenital area of two women and from the haircoat of two anteaters, respectively. Microbiologically, the samples studied (28) have presented morphological and physiological characteristics according to descriptions of the literature. Few specificity on identification of Trichosporon spp. was verified at CHROMagar Candida® and API ID 32C® commercial tests. The extracellular enzymatic activity showed the relevance of lipase production. The melanin wall expression was not verified in T. asahii.. On the other hand, GXM was expressed by the control and the clinical sample, both of the same specie. Though the sensibility break points were still not established for Trichosporon spp., the tests indicate high values of minimal inhibitory concentration (MIC) for amphotericin B, fluconazole, itraconazole and cetoconazole. Voriconazole showed the best results against Trichosporon spp. The most part of the samples was resistant to caspofungin.

A enzima L-asparaginase é responsável por converter o aminoácido L-asparagina em ácido L-aspártico e amônio. Esta enzima possui importantes aplicações, principalmente na indústria farmacêutica, onde é empregada como um fármaco antileucêmico e na indústria de alimentos, como uma forma de mitigar a formação de acrilamida, um composto altamente tóxico, formado em alguns alimentos processados a altas temperaturas. Leveduras destacam-se como micro-organismos importantes para a produção da Lasparaginase, uma vez que possivelmente produzem enzimas com menores efeitos colaterais para humanos e são, em geral, organismos GRAS, sem restrições de aplicação na indústria de alimentos. O presente trabalho avaliou metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de L-asparaginase, selecionando aquelas capazes de produzir destacadas quantidades desta enzima a partir de um banco contendo 40 cepas e verificando aspectos da sua produção. Foram empregadas metodologias de seleção de leveduras em meio sólido e em meio líquido, avaliando-se a aplicabilidade da quantificação da atividade enzimática pelo método de Nessler e pelo método da hidroxilamina. A produção de L-asparaginase foi posteriormente confirmada por cromatografia em camada delgada. As leveduras selecionadas foram avaliadas quanto à influência dos aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina como indutores na produção de L-asparaginase e quanto à cinética de produção enzimática. De acordo com os resultados, nenhuma das leveduras foi capaz de produzir L-asparaginase extracelular. Entretanto, duas novas leveduras, até então não citadas na literatura pertinente como produtoras de Lasparaginase, foram capazes de produzir L-asparaginase periplasmática: Issatchenkia orientalis e Rhodotorula glutinis. Verificou-se, também, que a metodologia de screening em meio sólido não foi correlacionável com a produção de L-asparaginase em meio líquido por leveduras. Foi necessária a adição de moléculas indutoras ao meio de cultivo, como os aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina, para que houvesse produção de Lasparaginase pelas leveduras I. orientalis e R. glutinis. Verificou-se a maior produção de L-asparaginase periplasmática em meio suplementado com L-asparagina e nitrato de amônio para a levedura I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) e em meio suplementado com Lprolina para a levedura R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). Durante os ensaios de cinética, verificou-se que a produção da enzima ocorreu principalmente durante a fase logarítmica do crescimento microbiano, observando-se também estabilidade da atividade enzimática durante as 144 horas do cultivo. Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram verificar a viabilidade das metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de Lasparaginase bem como selecionar, com sucesso, duas novas leveduras capazes de produzir a enzima L-asparaginase periplasmática, I. orientalis e R. glutinis, determinando aspectos importantes da sua produção em meio líquido. / L-asparaginase is the enzyme responsible for converting the amino acid L-asparagine into L-aspartic acid and ammonium. This enzyme has important applications, mainly in the pharmaceutical industry, where it is used as an antileukemic drug, and in the food industry, as a treatment for mitigating the formation of acrylamide, a highly toxic compound produced in some foods exposed to high temperatures. Yeasts are highlighted as important microorganisms for the production of L-asparaginase since they are capable of producing enzymes with fewer side effects for humans and are, in general, GRAS organisms, being applicable in the food industry without restrictions. This study evaluated screening methods for selecting new yeasts capable of producing L-asparaginase, selecting those capable of producing high amounts of this enzyme from a culture collection containing 40 strains, also verifying aspects of enzyme production. Methods for screening L-asparaginase producing organisms in solid and liquid medium were tested, evaluating the applicability of Nessler and hydroxylamine methods as means for enzyme activity quantification. The production of L-asparaginase was later confirmed through thin layer chromatography. The selected yeasts were evaluated to confirm the influence of the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine as inducers in the production of L-asparaginase, and the kinetics of Lasparaginase production were also evaluated. According to the results, none of the assessed yeasts were able to produce extracellular L-asparaginase. However, two novel yeasts, so far not cited in the pertinent literature as L-asparaginase producers, were able to produce periplasmic L-asparaginase: Issatchenkia orientalis and Rhodotorula glutinis. Tests also verified that the screening methods in solid medium did not correlate with the production of L-asparaginase in liquid medium by yeasts. It was necessary to add inducing molecules, such as the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine, to stimulate L-asparaginase production by the yeasts I. orientalis and R. glutinis. The highest production of periplasmic L-asparaginase was obtained in liquid medium supplemented with Lasparagine and ammonium nitrate for the yeast I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) and in medium supplemented with L-proline for the yeast R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). The production kinetics assay verified that the production of the enzyme took place mainly during the log phase of microbial growth, being stable after144 hours of cultivation. The results presented in this study were able to confirm the viability of the methods for the screening of novel L-asparaginase producing yeasts as well as to select two novel yeasts able to produce this enzyme, I. orientalis and R. glutinis, determining some important aspects in L-asparaginase production in liquid medium.

Objetivando estudar o perfil fenotípico de leveduras mantidas em banco de microrganismos de Cryptococcus neoformans, 40 cepas de origem clínica e 44 de origem ambiental foram escolhidas aleatoriamente. As cepas passaram por tipagem bioquímica para diferenciação em C. neoformans e C. gattii, e dentre as cepas clínicas 90% foram tipadas como C. neoformans e 10% como C. gattii, já dentre as cepas ambientais 95,5% foram C. neoformans e 4,5% C. gattii. As cepas cepas que foram positivas no teste bioquímico para C. gattii passaram por tipagem molecular (PCR-RFLP) e verificou-se que apenas quatro cepas eram realmente C. gattii (VGII), e duas outras C. neoformans (VNI e VNIII). Quando estudado os fatores relacionados a virulência, todas as cepas tanto clínicas quanto ambientais foram produtoras de fosfolipase, sendo que cepas de origem clínica produziram essa enzima em maior quantidade. Todas as cepas tanto clínicas quanto ambientais foram produtoras da enzima protease e todas também apresentaram intensidade de cor da colônia ( melanização). Quando avaliado a espessura capsular in vitro todas apresentaram cápsula, das cepas clínicas, 67% apresentaram cápsula média e das ambientais 70%. Quando avaliado a sensibilidade aos antifúngicos pelo métodos E-test todas as cepas clínicas e ambientais foram sensíveis aos antifúngicos anfotericina B, cetoconazol, fluconazol, voriconazol e posoconazol. O itraconazol também foi testado e apresentou cepas sensíveis à droga, porém uma cepa clínica e duas ambientais tiveram classificação dose dependente. Destacamos que a fosfolipase poderia ser usada como um marcador fenotípico para o complexo Cryptococcus neoformans e uma correta identificação das culturas mantidas em banco de microrganismos é necessário. / Aiming to study the phenotypic profile of yeasts maintened in stock culture identified as Cryptococcus neoformans, 40 clinical and 44 environmental strains, were chosen ran domly. The strains had undergone biochemical typing for differentiation as C. neoformans and C. gattii. Among the clinical strains 90% were typed as C. neoformans and 10% as C. gattii, already among the environmental strains were 95,5% C. neoformans and 4,5% C. gattii. The strains thah were positive in biochemical test for C. gattii underwent molecular typing (PCR-RFLP) and found that only four strain were actually C. gattii (VGII) and two other C. neoformans (VNI and VNII). When the factors related to virulence were studied, both the clinical and environmental strains were phospholipase positive but the clinical strains produced a greater amount of this enzyme. All strains were both clinical and environmental production of protease and also showed an intensity colony color (melanization). When the thickness of the capsule was evaluated, all of it showed a capsule, from the clinical strains 67% had an average capsule and from environmental strains 70% had an average capsule. When assessed by sensitivity to antifungal by E-test method all clinical and environmental strains were sensitive to the anphotericine B, ketoconazole, fluconazole, voriconazole and posoconazole. Itraconazole was tested and the samples showed drug sensitive-strains. We point out that phospholipase production would be used as marked to C. neoformans complex and a correct identification of strains maintened in stock culture is necessary.

Orientador: Telma Teixeira Franco / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T00:32:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anschau_Andreia_D.pdf: 2032545 bytes, checksum: 8d4ec316020e160cada0e585617e1659 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Neste trabalho foram desenvolvidos estudos visando o estabelecimento de um processo de produção de lipídeos microbianos a partir de fontes renováveis, particularmente xilose, carboidrato derivado do processo de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar. Foi utilizada a levedura oleaginosa Lipomyces starkeyi DSM 70296, previamente selecionada no Laboratório de Engenharia Bioquímica, Biorefino e Produtos de Origem Renovável (LEBBPOR). A partir dos resultados preliminares em frascos agitados, partiu-se para estudos de batelada alimentada em biorreator (1,3 a 3L). Foram estudadas diferentes estratégias de alimentação, sendo que em batelada alimentada repetida, foram encontradas as maiores concentrações de células (85,4 g/L) e de lipídeos (41,8 g/L). Posteriormente foram estudados modos de operação em processos contínuos em meio sintético e meio contento o hidrolisado hemicelulósico (H-H). As maiores produtividades de células (0,443 g/g) e de lipídeos (0,236 g/g) foram encontradas em cultivo contínuo a 0,03h-1. Na vazão específica de alimentação de 0,06 h-1 foram obtidas as maiores produtividades de células (0,600 g/L.h) e de lipídeos (0.288 g/L.h). Análises de cromatografia em fase gasosa dos diferentes cultivos feitos revelaram que os principais constituintes deste complexo são os ácidos graxos de cadeia longa, como o ácido palmítico (C16:0), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1) e ácido linoleico. Foi estimado o número de cetano em torno de 61, muito próximo do biodiesel de palma. Também foram feitos estudos de balanço de massa e de energia em cultivo batelada alimentada utilizando somente xilose como fonte de carbono. O valor de calor de combustão (Qc) de 25,7 kJ/g obtido após 142 h de cultivo representa aproximadamente 56% do conteúdo energético do óleo diesel (45,4 kJ/g), indicando o potencial da L. starkeyi para biodiesel. Cultivos contínuos subsequentes foram feitos para a compreensão do processo de acúmulo de lipídeos, utilizando a ferramenta estatística de reconciliação de dados para melhorar os dados experimentais obtidos em quimiostato, reduzindo os erros experimentais para posterior cálculo de análise de fluxos metabólicos (MFA). Nesse sentido, os lipídeos produzidos por L. starkeyi apresentam relevante importância do ponto de vista acadêmico e industrial, podendo ser utilizados como matéria-prima para biodiesel e indústria oleoquímica / Abstract: Studies attempting the establishment of a microbial lipid production process from renewable resources, mainly xylose, were developed. This pentose, obtained from sugar cane bagasse hydrolysis. The oleaginous yeast Lipomyces starkeyi DSM 70296, previously selected at the Laboratory of Biochemical Engineering, Biorefining and Products from Renewable Sources (LEBBPOR), was used throughout this thesis. After preliminary studies in shake flasks, we started fed-batch studies in fermentor (1.3 to 3L). Among the strategies studied, the highest cell mass and lipid concentrations reached up to 85.4 and 41.8 g/L, respectively, when repeated fed?batch strategy was applied. Subsequently, continuous processes were studied in synthetic medium and media containing hemicellulosic hydrolysate (H-H). The highest overall cell mass (0.443 g/g) and lipid yields (0.236 g/g) were achieved at dilution rate of 0.03 h-1. At dilution rate of 0.06 h-1, were obtained the highest productivities of cell mass (0.600 g/L.h) and lipids (0.288 g/L.h). Gas chromatography of esterified lipids revealed that the major constituents of this complex are long-chain fatty acids, such as palmitic acid (C16:0), stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1), and linoleic acid (C18:2) with an estimated cetane (around 61) very close to the palm biodiesel. Also have been studies of mass and energy balances from fed-batch cultivation using xylose as sole carbon source. The combustion heat (Qc) value 25.7 (kJ/g) obtained after 142 h of fed-batch cultivation, represents approximately 56% of the energy content of diesel oil (45.4 kJ/g), indicating the potential of L. starkeyi for biodiesel. Continuous cultures were made subsequently to understanding the process of lipid accumulation using a statistical tool for data reconciliation was used to improve the experimental data obtained in chemostat culture reducing the experimental errors for subsequent calculation of metabolic flux analysis (MFA). In this sense, lipids produced by L. starkeyi have relevant importance of academic and industrial point of view, as feedstock for biodiesel and oleochemical industry applications / Doutorado / Processos em Tecnologia Química / Doutora em Engenharia Quimica

Orientadores: Telma Teixeira Franco, Cecilia Sulzbacher Caruso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SierraAristizabal_RuthVeronica_M.pdf: 1527858 bytes, checksum: 19be6c21b6ac83bc742a54aa2002ae6a (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Material lignocelulósico, como bagaço de cana de açúcar, é matéria prima potencial para produção de biocombustíveis de segunda geração. Hidrolisado hemicelulósico (H-H) rico em xilose pode ser fermentado por leveduras oleaginosas para a produção de lipídeos. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi adaptar a Lipomyces starkeyi DSM 70296 em meios de cultivo contendo H-H de bagaço de cana-de-açúcar. O H-H com 12 g/L de xilose, 2 g/L de glicose, 10 g/L de ácido acético, 0,7 g/L de furfural e 1,3 g/L de HMF foi obtido após sete etapas de sequenciais de extração de bagaço previamente explodido a vapor. A levedura foi adaptada por engenharia evolutiva em meio de cultivo contendo concentrações crescentes de H-H. Como resultado, obteve-se a levedura adaptada ao meio de cultivo contendo 30% de H-H, a qual apresentou maior produtividade celular (113,90 mg/L/h) e concentração celular (9,79 g/L) em relação à cepa não adaptada (73,54 mg/L/h e 5,21 g/L, respectivamente). Fermentações em biorreator em meio sintético e contendo 30% de H-H apresentaram velocidades especificas máximas de crescimento (?max) de 0,117 e 0,122 h-1, respectivamente. Através de planejamento experimental 23 foram determinados os efeitos do ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural (HMF) no crescimento e produção de lipídeos da levedura. Resultados indicaram que o ácido acético apresentou efeito significativo sobre os parâmetros cinéticos aumentando a duração da fase lag até em 34 horas, além da redução da produtividade celular (Px) e da velocidade de consumo de substrato (rs). Adicionalmente foram verificados efeitos sinérgicos positivos entre ácido acético conjuntamente com furfural e HMF. Testes indicaram a possibilidade de altos níveis de inibição dos produtos gerados pela degradação da lignina em concentrações acima de 7,32 g/L / Abstract: Lignocellulosic materials, such sugar cane bagasse, as reported as potential feedstocks for production of second generation biofuels, through hemicellulose hydrolysates (H-H) extraction rich in xylose and the subsequent fermentation with oleaginous yeast for lipids production. In this regard, the objective of this study was to adapt the Lipomyces starkeyi DSM 70296 in culture media containing H-H of sugar cane bagasse. The H-H with 12 g/L of xylose, 2 g/L of glucose, 10 g/L acetic acid, 0.7 g/L of furfural and 1.3 g/L of HMF was obtained after seven sequential extraction steps of bagasse previously pretreated by steam explosion. The yeast was adapted by evolutionary engineering in culture medium containing increasing concentrations of H-H. As result, there was obtained the yeast adapted to culture medium containing 30% of H-H, which showed higher cell productivity (113.90 mg/L/h) and cell concentration (9.79 g/L) compared to not adapted strain (73.54 mg/L/h and 5.21 g/L, respectively). Fermentation in Bioreactor in synthetic medium and containing 30% of H-H medium showed maximum specific growth rate (?max) of 0.117 and 0.122 h-1, respectively. Through experimental design 23 was determined the effects of acetic acid, furfural and hydroxymethylfurfural (HMF) on growth and yield lipid yeast. As result, there was obtained that acetic acid had significant effect on kinetic parameters by increasing the duration of lag phase up to 34 hours, besides reduction of cell productivity (Px) and rate of substrate consumption (rs). Additionally positive synergistic effects were observed when acetic acid is found in culture media with furfural and HMF. Preliminary tests indicate the possibility of high levels of inhibition of products generated by lignin degradation at concentrations above 7.32 g/L / Mestrado / Engenharia de Processos / Mestra em Engenharia Química

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Juan Lucas Argueso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T01:08:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_Aline_D.pdf: 13944014 bytes, checksum: afa01e0dfca6ca3f789845a68d9a1018 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A floculação é um processo de agregação celular observado em muitas linhagens de Saccharomyces cerevisiae que resulta em sedimentação, prejudicando o rendimento fermentativo e a operação de destilarias produtoras de bioetanol. A maioria das linhagens utilizadas por essa indústria, incluindo a linhagem PE-2/JAY270, foi selecionada pela incapacidade de flocular. O controle genético da floculação é bem caracterizado, vários genes foram associados ao fenômeno, incluindo principalmente a família de genes FLO. Previamente observamos que a linhagem JAY291 (haploide derivado de JAY270) não flocula, apesar de possuir o alelo funcional do regulador positivo de floculação FLO8, sugerindo que seu fenótipo envolve outro passo dessa via. A análise da progênie F2 do cruzamento de JAY291 com a linhagem de laboratório S288 (flo8-1) revelou uma proporção fenotípica de ~1:8 (floculantes/não floculantes), esperada para uma característica controlada por três genes não ligados. Sequenciamos os genomas de oito indivíduos F2 floculantes segregando ~40.000 SNPs existentes entre S288c e JAY291. As sequências foram comparadas entre si para localizarmos regiões que co-segregavam com a floculação. Esse mapeamento preliminar foi refinado por PCR-RFLP, revelando um segundo gene, FLO1, que está ausente em JAY291. Para identificar o terceiro gene, analisamos fenotipicamente novos haploides F2 segregantes de um cruzamento entre S288c (FLO8::KanMX4 FLO1::HphMX4) e JAY291 (FLO8 flo1?), dentre os quais os indivíduos FLO1:HphMX4 foram divididos em dois "bulks" (floculante e não floculante) e sequenciados. As frequências alélicas S288c ou JAY291 nos "bulks" foram interrogadas e validadas estatisticamente, revelando um terceiro gene fortemente associado ao fenótipo: MSS11 (fator de transcrição envolvido em floculação). Encontramos ainda outros doze loci contendo genes de efeito menor, mas que atuam como modificadores do fenótipo. Em experimentos independentes, observamos alteração na morfologia de colônia de JAY270 e troca de seu típico fenótipo liso para rugoso, também associado com um grau baixo de floculação. Tais colônias rugosas também são frequentemente encontradas na indústria. Curiosamente, o mesmo fenótipo foi observado cruzando-se haploides específicos derivados de JAY270. Os cruzamentos sugeriram que o fenótipo era controlado um único gene, porém específico de diploides. O mapeamento em genomas de haploides de JAY270 revelou o gene responsável pela alteração de fenótipo: ACE2, envolvido com separação celular. JAY270 é heterozigota para uma mutação frameshift em ACE2 (ACE2/ace2-7A). O fenótipo rugoso ocorre por recombinação mitótica associada com viii perda de heterozigosidade (LOH), produzindo células com duas cópias mutadas desse gene. Para evitar futuros problemas industriais causados pela sedimentação de linhagens rugosas resultantes de LOH na região de ACE2, o defeito detectado ace2-7A foi reparado no genoma da JAY270. O diploide FGY050 (ura3?/ura3?), derivado de JAY270 e auxotrófico para uracila, foi utilizado como plataforma. A linhagem desenvolvida passou a ter duas cópias do alelo selvagem de ACE2 (ACE2/ACE2) e portanto é incapaz de se tornar rugosa por recombinação. Finalmente, em um estudo não relacionado com floculação ou morfologia de colônia, testamos se LOH pode estar relacionada com alguma consequência fenotípica benéfica à JAY270. Dentre onze linhagens LOH testadas em ensaios fermentativos de competição direta com o parental, encontramos uma com ganho de competitividade durante a fermentação / Abstract: Flocculation is a process of cellular aggregation observed in several Saccharomyces cerevisiae strains which results in sedimentation, impairing the fermentation yield and the operation of Brazilian bioethanol distilleries. Most strains used in this industry, including the PE-2/JAY270 strain, were selected for their inability to flocculate. The genetic control of flocculation is well characterized and several genes were associated with this phenomenon, including the FLO family of genes. We previously observed that the JAY291 strain (derivative haploid of JAY270) does not flocculate, despite having the functional allele of the positive regulator of flocculation FLO8, suggesting that its phenotype involves another step of this pathway. Analysis of the F2 progeny from crossing JAY291 with the laboratory strain S288c (flo8-1) revealed the phenotypic ratio of ~1:8 (flocculent/non-flocculent), expected for a trait controlled by three unlinked genes. We sequenced the genomes of eight flocculent F2 individuals segregating ~40.000 SNPs that exist between S288c and JAY291. The sequences were compared to each other to localize regions that co-segregated with the flocculation. This preliminary mapping was refined by PCR-RFLP, revealing a second gene, FLO1, which is absent in JAY291. To identify the third gene, we phenotypically analyzed new F2 haploids segregating from a cross between S288c (FLO8::KanMX4 FLO1::HphMX4) and JAY291 (FLO8 flo1?), among which FLO1:HphMX4 individuals were separated into two bulks (flocculent and non-flocculent) and sequenced. Allele frequencies S288c or JAY291 in bulks were interrogated and statistically validated, revealing a third gene strongly associated with the phenotype: MSS11 (transcription factor involved in flocculation). We also found twelve other loci containing minor effect genes, but acting as modifiers of the phenotype. In independent experiments, we observed alterations in the colony morphology of JAY270 and a transition from its typical rough to smooth phenotype, also associated with a low degree of flocculation. This type of colony is often found in the industry. Interestingly the same phenotype was observed crossing specific haploids derivatives of JAY270. The crosses suggested that the phenotype was controlled by a single gene, but diploid specific. Mapping genomes of haploids of JAY270 revealed the gene responsible for the altered phenotype: ACE2, involved in cell separation. The JAY270 is heterozygous to a frameshift mutation in the ACE2 (ACE2/ace2-7A). The rough phenotype occurs by mitotic recombination associated with loss-of-heterozygosity (LOH), producing cells with two mutated copies of this gene. x To avoid future industrial problems caused by sedimentation of rough strains derived from LOH in the ACE2 region, the ace2-7A defect was repaired in the JAY270 genome. The diploid FGY050 (ura3?/ura3?), derived from JAY270 and auxotrophic to uracil was used as a platform. The developed strain has two copies of the ACE2 wild-type allele (ACE2/ACE2) and is therefore unable to become roughened by recombination. Finally, in a study unrelated to flocculation or colony morphology, we tested whether LOH may be associated with some phenotypic consequence beneficial to the JAY270. Out of eleven LOH strains tested in fermentative assays of direct competition against their parental strain, we found one with gain in competitiveness during fermentation / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Les unités de conditionnement des dattes génèrent des quantités importantes de déchets issues des écarts de triage. Cette biomasse, considérée jusqu'alors comme un déchet avec un impact sur l'environnement peut être transformée en produit à haute valeur ajouté. La valorisation des sous-produits de l'industrie des dattes en biocarburant s'inscrit dans une démarche économique et environnementale. Mais les fortes teneurs en sucres dans les sirops de dattes induisent une forte pression osmotique qui limite la capacité fermentaire des micro-organismes tel que Saccharomyces cerevisiae. Ceci nous a conduit à utiliser des souches osmotolérantes comme Zygosaccharomyces rouxii et Candida Pelliculosa. Différents essais ont été menés dans des milieux de culture à base de sirop de dattes, à différentes teneurs en sucres, en milieu discontinue et parfaitement agité. Les essais menés dans un milieu de culture à base de jus de dattes à 17,4 °Brix, conduisent à la production d'éthanol aux concentrations de 63 g L-1, 41 g L-1 et 33 g L-1 respectivement pour les levures Saccharomyces cerevisiae, Candida Pelliculosa et Zygosaccharomyces rouxii. Les essais menés dans le milieu à 35,8 °Brix (milieu de culture se rapprochant le plus des sirops de dattes brutes) montrent que la croissance des levures Saccharomyces cerevisiae et Candida Pelliculosa est inhibée par la pression osmotique élevée causée par la haute concentration en sucres. Seule la levure xérotolérante Zygosaccharomyces rouxii s'est adaptée au milieu en produisant 55 g L-1 de bioéthanol. La souche isolée des sous-produits de des dattes comme étant un Bacillus amyloliquifaciens est une souche allochtone capable de se developper dans un milieu hyper-osmotique et convertir les trois sucres (glucose, fructose et saccharose) en éthanol, contrairement à Z. rouxii qui est une souche fructophile. Le rendement en éthanol de B. amyloliquefaciens pour le milieu M-S175 est de 0,45 g.g-1, bien supérieur à ceux de S. cerevisiae, C. pelliculosa et Z. rouxii qui donnent respectivemnt 0,38, 0,29 et 0,34 g.g-1. En produisant 90 g.L-1 d'éthanol pour le milieu M-S350, B. amyloliquefaciens nous semble prometteuse pour valoriser un substrat très riche en sucres fermentescible. / Conditioning unit's dates generate large amounts of wastage after sorting. This biomass, previously regarded as waste product with a high impact on the environment can be transformed into a highly valued product. The use of by-products of date fruit into biofuel industry is a part of an environmentaly friended economic process. But high levels of sugars in the syrups of dates induce high osmotic pressure which limits the ability of fermentative microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae. This led us to use osmotolerant strains, Zygosaccharomyces rouxii and Candida pelliculosa. Various tests were conducted in culture media containing date juice at different levels in sugars, and perfectly stirred in batch conditions. The tests performed in a culture medium based on date juice at 17.4 ° Brix, led to the production of 63 g L-1, 41 g L-1 and 33.1 g L-1 of ethanol for the yeasts Saccharomyces cerevisiae, Candida pelliculosa and Zygosaccharomyces rouxii, respectively. Tests conducted at 35.8 °Brix (culture medium close to syrup raw dates) show that the growth of yeast Saccharomyces cerevisiae and Candida pelliculosa is inhibited by high osmotic pressure caused by the high concentration of sugars. Only the xerotolerante yeast Zygosaccharomyces rouxii is adapted to the environment and produced 55 g L-1 of bioethanol. The strain isolated from by-products of dates, identified as bacillus amyloliquefaciens, is able to develop in a hyper-osmotic environment and convert the three sugars (glucose, fructose and sucrose) into ethanol, unlike Z. rouxii which is a fructophilic strain. The yield of ethanol for the M-S175 is 0.45 g.g-1, higher than those of S. cerevisiae, C. pelliculosa and Z. rouxii which give respectivemnt 0.38, 0.28 and 0.34 g.g-1. By producing 90 g.L-1 of ethanol for M-S350, B. amyloliquefaciens seems promising to valorize a very rish substrate in fermentable sugars.

The MAT∝ locus of the yeast Saccharomyces cerevisiae encodes two regulatory proteins responsible for determining the ∝cell type. The MAT∝1 gene encodes ∝1, a positive regulator of ∝cell-specific genes, whereas the MAT∝2 gene encodes a negative regulator of a cell-specific genes (∝2). MAT∝2. (in conjunction with the MATα1 gene) also determines the α/∝ diploid cell type by repressing haploid-specific genes. ∝2 exerts its effect at the transcriptional level in the ∝ cell by binding to a sequence located upstream of α cell-specific genes. The present study undertook to examine, through in vitro genetic manipulation, the structure/function relationship of the MAT∝ regulatory proteins, particularly∝2, in their role as gene regulators. The construction of mutant MAT∝2 genes containing termination codons at various points within the gene, and subsequent transformation of the mutant genes into mat∝2 yeast, indicated that the carboxy-terminal one-third of the gene product was necessary for full repressor activity in the haploid as well as in the diploid. A segment within the carboxy-terminal one-third of ∝2 displays some homology to the higher eukaryote homeo domain as well as to a prokaryotic bihelical DNA-binding structural motif. This region of the gene was subjected to semi-random missense mutagenesis in vitro and the mutant genes were analyzed by transformation into strains containing chimaeric genes that encode β-galactosidase from ∝2 and a1/∝2. repressible promoters. In this manner it was demonstrated that most of those residues in ∝2. which correspond to conserved amino acids in the prokaryotic DNA-binding structure and in the homeo domain are essential for the two repressor activities of ∝2. Several mutations more severely affected the ability of ∝2 to repress α-specific genes than haploid-specific genes. Analysis of the temperature dependence of the activities of some of the mutants was consistent with the existence of a helix-turn-helix structure at this region of the protein. Finally, further analysis of some of these mutants in vitro confirmed that the observed defect correlated with a loss of DNA-binding activity. / Medicine, Faculty of / Biochemistry and Molecular Biology, Department of / Graduate

Ésteres produzidos por via biotecnológica são considerados e classificados como naturais e sua demanda tem aumentado. Várias leveduras podem produzir ésteres e seu método de seleção é altamente importante para inúmeros tipos de indústrias. Trinta e quatro cepas de leveduras, isoladas de vinhos tintos em barris de carvalho elaborados na Serra Gaúcha e de queijos artesanais do Sul do Brasil, foram utilizadas neste trabalho. Cada cepa foi inoculada na superfície de meio sólido inclinado rico em glicose e nitrogênio, diretamente no frasco utilizado para a microextração em fase sólida (SPME) seguida pela injeção num cromatógrafo gasoso com detecção por espectrometria de massas (GC/MS) e quantificação utilizando detector de ionização de chama (GC-FID). O método foi desenvolvido e validado, sendo que a fibra DVB/PDMS/CAR, temperatura de extração de 80˚C e 20 minutos de aquecimento da amostra antes da extração foram as condições ótimas estabelecidas. A metodologia de superfície e resposta foi usada para a otimização da produção de acetato de etila pela levedura Zygosaccharomyces bailii BCV 08, e um planejamento fatorial 22 foi aplicado para determinar as melhores condições de temperatura de cultivo (X1, 20 até 36 ˚C) e agitação (X2, 0 a 200 rev/min). Os melhores resultados foram obtidos com a temperatura de 28 ˚C e 0 rev/min, onde houve um aumento de 60% na produção de acetato de etila. Foram avaliados os efeitos das fontes de carbono (glicose e frutose) e do mosto de uva sobre a produção de acetato de etila. A máxima concentração de acetato de etila produzida foi de 71,11 mg/L, utilizando o mosto de uva como meio. Experimentos utilizando biorreatores de 4L levaram à produção máxima de 133,74 mg/L de acetato de etila, 14,57 mg/L de hexanoato de etila, 4.093,74 mg/L de octanoato de etila e 3.775,28 mg/L de decanoato de etila. / Esters produced by biotechnological means are legally labeled as natural and there is an increasing demand for these products. Several yeasts can accumulate esters, and their selection is highly interesting for many industries. Thirty-four yeast strains isolated from red wine oak barrels of Serra Gaúcha winemaking region and from homemade cheeses of Southern Brazil were used in this research. The yeasts were inoculated in agar slants of a solid medium rich in glucose and nitrogen, directly inside the extraction transparent glass vials, using a headspace solid phase microextraction (SPME) method followed by injection of gas chromatography with mass spectrometric detection (GC/MS), and quantification by flame ionization detector (GC/FID). The analytical method was developed and validated, and the DVB/PDMS/CAR fiber, extraction temperature of 80˚C, and 20 minutes of sample heating time volatilization prior to the extraction step were the best conditions. A response surface methodology was used to optimize the production of ethyl acetate by Zygosaccharomyces bailii BCV 08, which was selected, and a 22 full factorial central composite design was applied to determine the best conditions for the cultivation temperature (X1, 20 to 36 ˚C) and stirring speed (X2, 0 to 200 rev/min). The best results were found with temperature of 28 ˚C and medium agitation of 0 rev/min, with a 60% increase in ethyl acetate production. We evaluated the effect of the carbon sources (glucose and fructose) and grape must on ethyl acetate formation; the maximal yield was reached with grape must and the highest concentration of ethyl acetate produced was 71.11 mg/L. Employing experiments on bioreactors of 4L, it was possible to improve the esters production by this yeast; a maximal production of 133.74 mg/L of ethyl acetate, 14.57 mg/L of ethyl hexanoate, 4093.74 mg/L of ethyl octanoate, and 3775.28 mg/L of ethyl decanoate was reached.