O estresse é uma realidade na produção avícola mundial. Sabe-se que ambientes estressores prejudicam o bem-estar, os parâmetros produtivos e a imunidade de frangos de corte. Sabe-se, também, que o estresse por calor diminui a atividade de macrófagos em frangos de corte e, que existem, inúmeros estressores ambientais que insidem sobre a produção animal e podem aumentar a susceptibilidade às doenças. A Salmonella spp. é uma das maiores zoonoses do mundo, causando mais de 1 bilhão de casos de infecção. Nesse sentido, o presente trabalho analisa os efeitos do estresse por calor (31±1°C) sobre os índices zootécnicos, a imunidade, a invasão bacteriana e a integridade intestinal em frangos de corte infectados com Salmonella enteritidis; os dados obtidos foram discutidos dentro de uma perspectiva neuroimune. Os frangos foram divididos em quatro grupos: 1) Controle (C); 2) Estresse por Calor a 31±1 °C (HS31°C); 3) Controle infectados com Salmonella enteritidis (Controle Positivo [PC]) e; 4) Estresse por calor a 31±1 °C e infectados com Salmonella (PHS31°C). Nossos resultados mostraram que o estresse por calor em uma situação de infecção experimental por Salmonella enteritidis (grupo PHS31°C) 1) diminuiu os índices zootécnicos; especificamente, diminuiu o ganho de peso, consumo de alimento e a conversão alimentar; 2) diminuiu os níveis plasmáticos de INF-γ e IgA; 3) diminuiu a expressão de, IL-6 e IL-12 em baço e diminui IL1- β, IL-10 e TGF-β em tonsila cecal; 4) diminuiu a expressão de AvBD-4 e AvBD-6 em tonsila cecal e; 5) diminuiu a expressão de TLR-2 em baço e tonsila cecal. Observamos, também, 6) aumento dos níveis séricos de corticosterona nos animais dos grupos HS31°C e PHS31°C e; 7) piora no quadro de enterite produzida pela Salmonella enteritidis, quando os animais foram estressados por calor, caracterizando-se uma enterite moderada ao longo de todo o intestino delgado. Finalmente, 8) observamos que o estresse por calor aumentou a migração de Salmonella enteritidis para baço das aves do grupo PHS31°C, porém esse aumento não foi observado no fígado; observamos, também, presença de Salmonella na medula osssea dos animais estressados e infectado com essa bactéria. Os dados obtidos sugerem que a somatória dos fatores estresse por calor e infecção por Samonella prejudicou os parâmetros produtivos, a integridade intestinal, a imunidade e, em especial a ativação e atividade de macrófagos, possibilitando um aumento da migração de Salmonella enteritidis para o baço e medula óssea dos frangos de corte. Neste sentido, o estresse por calor teria prejudicado a qualidade da barreira imune intestinal, via ativação do eixo HPA e aumento dos níveis de corticosterona, diminuindo a imunidade inata proporcionando a migração das bactérias patogênicas através da mucosa intestinal para o baço e a medula óssea das aves estressadas. / Stress is a reality in the world poultry production. Environmental stressors impair both welfare, performance parameters and immunity in broiler chickens. Heat stress decreases macrophage activity in broiler chickens and many environmental stressors that impact animal production increases animal\'s susceptibility to diseases. Samonella spp is one of the most endemic zoonotic diseases of the world, inducing more than 1 billion infection cases per year. In this way, we studied the effects of 31±1°C heat stress on performance parameters, immunity, bacteria invasion and intestinal integrity in broiler chickens experimentally infected with Salmonella enteritidis; the data were discussed under a neuroimmune perspective. The broiler chickens were divided into four different groups: 1) Control group (C); 2) 31±1 °C heat stressed group (HS31°C); 3) Control group infected with Salmonella enteritidis Positive control (PC) and; 4) 31±1 °C heat stressed and Salmonella enteritidis infected group (PHS31°C). We showed the heat stress applied in the course of Salmonella enteritidis infection (PHS31°C group) decreased poultry performance parameters; specifically, it decreased the body weight gain, the feed intake and the food conversion; 2) decresead INF-γ and IgA plasmatic levels; 3) decreased the mRNA expression of IL-6 and IL- 12 in spleen and the mRNA expression of IL1-β, IL-10 and TGF-β in cecal tonsil; 4) decreased the mRNA expression of AvBD-4 and AvBD-6 in cecal tonsil and; 5) decreased the mRNA expression of TLR-2 in spleen and cecal tonsil. We also observed 6) an increase in corticosterone serum levels in the animals of the HS31°C and the PHS31°C groups and, 7) more severe intestinal inflamation produced by Salmonella enteritidis in heat stressed chickens, characterized by a moderate enteritis throughout all the small intestine mucosa (PHS31°C group). Finally, 8) we showed that the heat stress increased splenic Salmonella enteritides invasion in PHS31°C broiler chickens; we also observed the presence of Salmonella in the bone marrow of stressed and infected broiler chickens. These data suggest that heat stress and Salmonella infection working together impair chicken\'s performance parameters, intestinal integrity and immunity (specially the macrophage activity), increasing ate the same time splenic and bone marrow Salmonella enteritidis invasion. Thus, heat stress could have impared the intestinal immunity barrier quality, via HPA axis activation and corticosterone serum levels release, decreasing the inate immunity and, providing pathogenic bacteria migration through the intestinal mucosa for spleen and bone marrow of the heat stressed chickens.

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Avec quatorze anticorps utilisés en oncologie, les anticorps monoclonaux ont enfin une place de choix dans l'arsenal thérapeutique anticancéreux. Cependant, l'un des modes d'action les plus importants de ces molécules, la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), souffre de plusieurs limites en raison de la nécessité d'une interaction optimale avec le FcγRIIIA. L'équipe du Dr. Daniel Baty a conçu de nouveaux formats d'anticorps bispécifiques basés sur l'utilisation de domaine unique d'anticorps de lamas (sdAb) et capables de contourner la plupart de ces limites. Des banques de phages issus de lamas immunisés ont permis de sélectionner deux sdAbs (d'affinités différentes) dirigés contre le FcγRIIIA exprimé par des cellules NK et les macrophages, ainsi qu'un sdAb dirigé contre l'antigène tumoral carcino-embryonnaire (ACE). En utilisant les domaines CH1 et Ck d'IgG1 humaine comme motif d'hétérodimérisation et les sdabs anti-ACE et anti-FcγRIII précédemment sélectionnés, nous avons développé des formats innovants d'anticorps bispécifiques Fab-like nommés bsFabs. Ces molécules sont faciles à produire, très stables et peuvent déclencher la lyse des cellules tumorales par les cellules NK humaines à des concentrations de l'ordre du picomolaire. Elles ne se lient pas au récepteur inhibiteur FcγRIIB, n'entrent pas en compétition avec des IgG sériques pour la liaison aux récepteurs, et leur activité cytotoxique est indépendante de la glycosylation du Fc et du polymorphisme du FcγRIIIA. / With fourteen antibodies used in oncology, monoclonal antibodies finally have a place in the therapeutic arsenal against cancer. However one of the modes of action of the most important of these molecules, cell-mediated cytotoxicity antibody-dependent (ADCC), suffers from several limitations due to the need for optimal interaction with the FcγRIIIA. Daniel Baty's team has developed new formats of bispecific antibodies based on the use of single domain llama antibodies (SdAb) that are capable of circumventing most of the these limitations. Phage libraries from immunized llamas were used to select two sdAbs directed against the FcγRIIIA expressed by NK cells and macrophages (with different affinities for FcγRIII), as well as one SdAb directed against the tumor antigen carcinoembryonic (CEA). Using CH1 and Ck domains of human IgG1 as a motif for heterodimerization and sdabs previously selected, we have developed innovative anti-CEA and anti-FcγRIII formats of bispecific antibodies Fab-like named bsFabs. These molecules are easy to produce, very stable and can trigger tumor cell lysis by human NK cells at picomolar concentrations. They do not bind FcγRIIB inhibitory receptor, do not compete with serum IgG and their cytotoxic activity is independent of FcγRIIIA polymorphism. In addition, they slow tumor growth in mouse model. In terms of pharmacokinetics, although bsFabs have a reasonable tumor retention, one of the limitations of these formats is size, which leads to rapid renal elimination. Such findings led us to consider the creation of new antibody formats to both increase tumor retention and secondly the half-life of antibodies in the body.

A metilação do DNA é uma alteração epigenética que atua na regulação da expressão gênica. A deficiência de vitaminas (cobalamina, B6 e folato) pode interferir na taxa de metilação. O efeito da deficiência destas vitaminas foi determinado em estudos com cultura de células e em animais. No entanto, são raros os estudos realizados com seres humanos. Os objetivos deste trabalho foram: avaliar a taxa de metilação do DNA de leucócitos na região promotora dos genes Interferon gama (IFNγ), Serpin B5 e Stratifin; verificar se existe associação entre as concentrações das vitaminas e dos metabólitos com a taxa de metilação do DNA dos 3 genes; e analisar quais são os fatores de predição para a taxa de metilação do DNA (variável dependente) considerando como variáveis independentes os valores séricos das vitaminas e metabólitos, em mulheres com idades gestacionais de 16, 28 e 36 semanas. Cento e oitenta e três mulheres foram convidadas a participar desse estudo, porém apenas 96 completaram o estudo prospectivo. Foram determinadas as concentrações séricas da cobalamina (Cbl), folato, vitamina B6, S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomocisteína (SAH), ácido metilmalônico (MMA), homocisteína total (tHcy) e folato eritrocitário. A taxa de metilação nos 3 genes foi determinada por qMSP (Quantitative Methylation Specific - Polimerase Chain Reaction). Várias mulheres estavam fazendo uso de suplementação com ácido fólico e/ou polivitamínicos. Diante deste fato foram formados 4 subgrupos: Grupo 1 (constituído por mulheres que não usaram suplementação), Grupo 2 (mulheres que usaram suplementação em todas as idades gestacionais estudadas - 16, 28 e 36 semanas), Grupo 3 (mulheres que usaram suplementação no início da gestação até a 16ª semana) e Grupo 4 (mulheres que usaram suplementação na 16ª e 28ª semana gestacional). Não houve diferença entre as taxas de metilação do DNA dos genes IFNγ, Serpin B5 e Stratifin durante o período gestacional estudado. As taxas de metilação no gene IFNγ do grupo 1 foram maiores, quando comparadas as taxas dos demais grupos. Em modelos de regressão linear múltipla, considerando o período gestacional como um todo, apenas a vitamina B6 e a tHcy foram diretamente associadas aos valores da taxa de metilação do gene IFNγ. No entanto, a vitamina B6 foi inversamente associada, enquanto que tHcy esteve diretamente associada aos valores da taxa de metilação do gene Stratifin. A taxa de metilação não sofre alterações durante a gestação; a vitamina B6 e a tHcy foram os fatores de predição para as taxas de metilação do DNA na região promotora dos genes IFNγ e Stratifin. / DNA methylation is an epigenetic modification that regulates gene expression. Cobalamin, vitamin B6 and folate deficiencies can impair the DNA methylation index. Studies involving cultured cells and animals have evaluated the effect of vitamin deficiencies in DNA methylation. However, few studies were conducted in humans. The goals of this study were: to evaluate the leukocyte DNA methylation index in the promoter region of interferon gamma (IFNγ), Serpin B5 and Stratifin genes; to assess the association between vitamins and metabolites concentrations and DNA methylation index in three genes; and to examine the predictive factors for DNA methylation index using as independent variables: serum folate, serum cobalamin, serum vitamin B6, erythrocyte folate, methylmalonic acid (MMA), total homocysteine (tHcy) in three gestational ages (16th, 28th and 36,th weeks). A hundred eighty three women were included, but only 96 completed the prospective study. The serum concentrations of cobalamin, folate, vitamin B6, S-adenosylmethionine (SAM), Sadenosylhomocysteine (SAH), MMA, tHcy were determined. The erythrocyte folate concentration was also evaluated. The DNA methylation index was determined in three genes by qMSP (Quantitative Methylation Specific - Polymerase Chain Reaction). Several women were taking folic acid supplementation and/or multivitamins. Four groups were formed according to supplementation use: Group 1 (women who take no supplementation), Group 2 (women who took supplements at 16th, 28th and 36th weeks of pregnancy), Group 3 (women who took supplements in early pregnancy and up to 16 weeks) and Group 4 (women who took supplements in the 16th and 28th week of pregnancy). There was no difference between the DNA methylation index in the IFNγ, Serpin B5 and Stratifin genes during the gestational periods studied. The DNA methylation index in the IFNγ gene in group 1 was higher than those indexes from other groups. In multiple linear regression models considering the gestational periods as a whole, only vitamin B6 and tHcy were directly associated to DNA methylation index in IFNγ gene. However, vitamin B6 was inversely associated, whereas tHcy was directly associated with values of DNA methylation in Stratifin. The DNA methylation index does not change during pregnancy, vitamin B6 and tHcy were the predictors of DNA methylation in the promoter region of IFNγ and Stratifin genes.

Para elucidar os mecanismos envolvidos na inibição da hipersensibilidade do tipo I em proles murinas mediada pela imunização materna com Ovalbumina (OVA), as proles foram avaliadas quanto aos linfócitos Tγδ produtores de IL-17 (CD27-). A imunização materna com OVA reduziu a expressão de CD27, o que também se refletiu nos pulmões, e a produção de IL-17 por linfócitos Tγδ das proles. A redução da expressão de CD27 também foi evidenciada em linfócitos Tγδ intratímicos das proles após a transferência passiva de anticorpos IgG alérgeno específicos para fêmeas gestantes não imunizadas e in vitro em resposta a estes mesmos anticorpos, efeito que parece envolver a expressão de receptores para IgG expressos por outras células presentes no timo. As evidências obtidas indicam que a imunização materna influi na maturação tímica de linfócitos inibindo a população que colaborara com a inflamação alérgica. Aparentemente, os anticorpos IgG maternos são responsáveis por este fenômeno e a população estudada está envolvida na inibição da inflamação alérgica observada nas proles. / To elucidate the mechanisms involved in inhibition of type I hypersensitivity in murine offsprring mediated by maternal immunization with Ovalbumin (OVA), the offspring were evaluated as IL-17-producing γδT cells (CD27-). Maternal immunization with OVA reduced the expression of CD27, which was also reflected in the lungs, and the production of IL-17 by γδT cells of offspring. Reduction of CD27 expression was also evidenced in intrathymic γδT cells of offspring after passive transfer of allergen-specific IgG antibodies to non-immunized pregnant females and in vitro in response to these same antibodies, effect that seems to involve the expression of IgG receptors expressed by other cells present in the thymus. Evidence obtained indicates that maternal immunization influences the thymic maturation of lymphocytes by inhibiting the population that collaborate with allergic inflammation. Apparently, maternal IgG antibodies are responsible for this phenomenon and the population studied is involved in the inhibition of allergic inflammation observed in offspring.

Células dendríticas (DCs) são componentes centrais da imunidade celular, responsáveis pelo priming de linfócitos T naïve. A polarização de linfócitos T é restrita aos sinais fornecidos durante a apresentação do antígeno. Além desses sinais, a origem e natureza de DCs que induzem diferentes perfis de linfócitos T não é totalmente compreendida. Foi investigada a capacidade de células Natural Killer (NK) de modular estágios iniciais da diferenciação de monócitos em DCs e de impactar na sua função de primar e polarizar linfócitos T naïve. DCs derivadas de monócitos pré-co-cultivados com células NK favorecem o priming de linfócitos T CD8 do tipo Tc1/Tc17, com potente capacidade de produção de IFN-γ. Este fenômeno foi dependente de interações longas via NKp30 e da maquinaria citotóxica de células NK desencadeada nas etapas inicias da sua interação com monócitos. Esta interação pode ter implicações na compreensão da imunidade mediada por linfócitos T CD8 e pode ser explorada para imunoterapia em que a produção de IFN-γ por células T CD8 é necessária ou exacerbada. / Dendritic cells (DCs) are central components of cellular immunity, responsible for the priming of naïve T cells. The polarization of T cells is restricted to signals provided during antigen presentation. Besides such signals, the origin and nature of DCs that induce different T cell profiles is not fully understood. The ability of natural killer cells (NK) to modulate early stages of monocytes differentiation into DCs and to impact on DCs function to prime and polarize naïve T cells was investigated. DCs derived from monocytes co-cultured with NK cells support the priming of type Tc1/Tc17 CD8 T cells with potent IFN-γ production capacity. NK cell-mediated cytotoxicity triggered at early stages of NKp30-dependent long-lasting monocytes-NK-cells interactions, mediated the mechanism by which this phenomenon occurred. This interaction may have implications in the understanding of CD8 T cell-mediated immunity and can be exploited for immunotherapy in which IFN-γ production by CD8 T cells is required or exacerbated.

A inflamação é fundamental para a manutenção da homeostasia e para a resposta do organismo à injúria. A resposta inflamatória deve ser adequada aos estímulos agressores; no sistema nervoso central, sua inadequação conduz à gênese de diferentes doenças neurodegenerativas. A proteína anexina A1 (ANXA1) e os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPAR) controlam a inflamação, pois ambos inibem o desenvolvimento da inflamação e aceleram sua resolução. Nosso grupo de pesquisa tem mostrado que a ANXA1 modula a expressão de PPARγ em macrófagos. Assim, o presente trabalho investigou a modulação da expressão do PPARγ e das suas funções em células da microglia pela ANXA1. Foram empregadas células imortalizadas da linhagem BV2 (microglia murina), inalteradas ou transfectadas para redução da expressão de ANXA1, tratadas com ANXA1 exógena (recombinante - rANXA1) ou com agonista ou antagonista de PPARγ (pioglitazona e GW9662, respectivamente). Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamento com rANXA1 aumenta as expressões gênica (RT-PCR) e proteica (Western Blotting) de PPARγ, e ambas as expressões estão reduzidas em células com deficiência endógena de ANXA1, sendo que tal efeito foi revertido pela ação da rANXA1; 2) tratamento com rANXA1 não induz a expressão dos fatores de transcrição ligados a expressão de PPARγ: proteínas ligantes de elementos de resposta ao cAMP - CREB - e transdutores de sinais e ativadores de transcrição - STAT6 - (Western Blotting), mas os níveis de ambos os fatores estão reduzidos em células transfectadas, e tal efeito não foi revertido pelo tratamento com rANXA1; 3) tratamento com pioglitazona ou com rANXA1 individualmente aumenta a fagocitose de células PC12 apoptóticas (citometria de fluxo), mas o tratamento simultâneo não altera a fagocitose induzida por pioglitazona ou rANXA1; no entanto, tratamento com GW9662 inibiu a fagocitose induzida pelo tratamento com rANXA1; 4) o tratamento com rANXA1 aumenta a expressão de CD36 (citometria de fluxo); a expressão de CD36 está reduzida em células transfectadas e tal expressão não é revertida pelo tratamento com rANXA1. Em conjunto, os dados obtidos mostram a modulação da ANXA1 sobre PPARγ em células da micróglia, com possível ação sobre a fagocitose de células apoptóticas, e que a redução da expressão de ANXA1 reduz acentuadamente a expressão dos fatores de transcrição STAT6 e CREB, bem como a expressão de CD36. A elucidação dos efeitos resultantes destas alterações desencadeadas pela deficiência de ANXA1 endógena poderá contribuir para compreensão da fisiopatologia da neuroinflamação. / Inflammation is a key process in maintaining homeostasis and is essential for the body\'s response to injury. The inflammatory response must be proportional to the aggressor stimuli; in the central nervous system, a failed proper modulation leads to the development of different neurodegenerative diseases. Protein annexin A1 (ANXA1) and peroxisome proliferated-activated receptors (PPAR) control inflammation, as both inhibit development of inflammation and accelerate its resolution. Our research group has demonstrated that ANXA1 modulates PPARγ expression in macrophages. Thus, the present work investigated the modulation of PPARγ expression and its functions in microglia cells by ANXA1. In order to assess such, immortalized cells from cell line BV2 (murine microglia), either unadulterated or transfected for reduced expression of ANXA1, were treated with exogenous ANXA1 (recombinant protein - rANXA1) or either with PPARγ agonist or antagonist (pioglitazone and GW9662, respectively). The obtained results demonstrated that: 1) treatment with rANXA1 increases both gene (RT-PCR) and protein (Western Blotting) expressions of PPARγ, and also that both expressions are reduced in cells with endogenous deficiency of ANXA1, and such effect was reversed by the actions of rANXA1; 2) treatment with rANXA1 does not promote the expression of transcription factors associated with PPARγ expression: cAMP response element binding protein - CREB - and signal transductor and activator of transcription 6 - STAT6 (Western Blotting), but the expression levels of both factors are reduced in transfected cells, and such effect was not reversed by treatment with rANXA1; 3) individual treatment with pioglitazone or rANXA1 increases phagocytosis of apoptotic PC12 cells (flow cytometry), but simultaneous treatment does not affect pioglitazone/rANXA1-induced phagocytosis; however, treatment with GW9662 inhibited rANXA1-induced phagocytosis; 4) treatment with rANXA1 increases CD36 expression (flow cytometry); the expression of CD36 is reduced in transfected cells, and such expression is not reversed by treatment with rANXA1. The obtained data demonstrate the modulation ANXA1 exerts upon PPARγ in microglia cells, with a possible action upon phagocytosis of apoptotic cells, and that reduction of ANXA1 expression greatly reduces the expression of transcription factors STAT6 and CREB, as well as the expression of CD36. Elucidation of such effects that arise from a deficiency of endogenous ANXA1 will contribute to a better comprehension of the pathophysiology of neuroinflammation.

O sistema imunológico materno desempenha um papel importante no estabelecimento da gestação e desenvolvimento de concepto até início do parto. A hipótese deste projeto é que há um recrutamento de células Tγ&#948 para o endométrio ao longo da gestação que expressam citocinas que favorecem o estabelecimento e manutenção da tolerância materna a antígenos fetais durante a gestação em bovinos. Experimento I Para estudar a dinâmica populacional das células do sistema imune no sangue periférico de não lactantes não prenhes (NLNP), vacas lactantes no 1º trimestre e vacas no 3º trimestre da gestação, as PBMCs foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll, seguido por protocolo de imunocitoquímica e analisadas em citômetro de fluxo para os anticorpos CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ e WC1+. As células analisadas tanto na região de linfócitos quanto na região de monócitos, não apresentaram diferença significativa entre os grupos analisados. Experimento II Para análise do perfil de expressão gênica das células Tγ&#948, foram coletadas amostras de sangue de vacas no 1º trimestre da gestação, vacas lactantes não prenhes (LNP) e vacas não lactantes não prenhes (NLNP). As células mononucleares foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll e células Tγ&#948 foram analisadas quanto ao perfil de citocinas por qRT-PCR para os genes IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 e TNFA. A análise de expressão gênica mostrou tendência no aumento na expressão de IL1B, IL6 e TGFB2 em células PBMC em vacas NLNP quando comparado com vacas LNP e no 1º trimestre da gestação, enquanto que os outros genes analisados não apresentaram diferença significativa. Experimento III Fragmentos de endométrio, provenientes de abatedouro, foram coletados de vacas em 1º trimestre (33 a 35 dias de gestação), 2º trimestre (143 a 182 dias de gestação) e 3º trimestre de gestação (228 a 247 dias de gestação). Cortes congelados foram imunolocalizados e quantificados para as células do sistema imune CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+ e WC1+ por imunofluorescência. Nossos estudos mostraram aumento das células CD25+ e CD62L+ no endométrio no início da gestação. No meio da gestação, há um aumento das células WC1+ e CD14+. No final da gestação, observamos o aumento de CD14+, CD25+, CD18+ e CD62L+. Em suma, nossos dados sugerem que a modulação do sistema imune materno é específica para cada estágio da gestação, sendo que no início da gestação há um envolvimento de células T ativadas (CD25+) provavelmente para o estabelecimento de uma resposta ativa para tolerância dos antígenos fetais. Já no meio da gestação, há um recrutamento massivo de células Tγ&#948 para o endométrio gravídico provavelmente para manter um microambiente de tolerância para o desenvolvimento fetal e no final da gestação células efetoras como macrófagos são recrutadas para o endométrio para auxiliar no processo do parto e involução uterina. / The maternal immune system plays an important role on the establishment and maintenance of pregnancy until the onset of parturition in mammals. Our hypothesis is that there is a recruitment of γ&#948T-cell to the endometrium during pregnancy. These cells express a particular cytokine profile that is important to the establishment and maintenance of maternal toleranceto fetal antigens in cattle. Experiment I - To study the population dynamics of immune cells in the peripheral blood of NLNP, 1st and 3rd trimester of pregnancy, PBMCs were separated by Ficoll density gradient and the abundance of CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ and WC1+ was analyzed by single-color flow cytometry. There was no statistical difference of the abundance of CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+ among groups of cows. Experiment II To analyze the gene expression profile of 1st trimester, LNP and NLNP. PBMCs were isolated by Ficoll density gradient and γ&#948T-cells (WC1+) were enriched by magnetic cell sorting. Both PBMC and WC1+ cells gene expression was analyzed for IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 and TNFA by qRT-PCR. Gene expression analysis showed increased expression of the IL1B, IL6 and TGFB2 in PBMC in NLNP compared with 1st trimester of pregnancy and LNP cows, while other genes analyzed showed no significant difference. Experiment III fragments of endometrium were collected from cows at the early (33 to 35 days of pregnancy), mid (143 to 182 days of pregnancy) and late pregnancy (228 to 247 days of pregnancy). Endometrial immune cells were quantified (CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+, and WC1+) by single-color immunofluorescence. There was an increase CD25+ and CD62L+ cells in the endometrium in early pregnancy. In the mid of pregnancy, there was an increase of WC1+ and CD14+ cells. At the end of pregnancy, there was an increase of CD14+, CD25+, CD18+ and CD62L+. In conclusion, our data suggest that the maternal immune system is modulated according to the stage of pregnancy in the cow. In early pregnancy, there is an increased number of endometrial CD25+ cells that may reflect the activation of local immune response and recruitment of putative T-reg cells to the endometrium for an active establishment of maternal tolerance to fetal antigens. While, in mid pregnancy there is a massive recruitment of γ&#948T-cells and CD14+ to the pregnant endometrium perhaps to maintain an tolerogenic microenvironment and to promote tissue remodeling for proper fetal development and growth. Finally, in late pregnancy, there is a recruitment of effector immune cells such as CD62L+, CD18 and CD14+ cells associated with an increased expression of proinflammatory cytokines (i.e. IFNG, IL-6) to play a role on induction of parturition and uterine involution in the cow

No câncer, o aumento da expressão das enzimas indolamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1) e triptofano 2,3-dioxigenase (TDO), que convertem o triptofano (Trp) em quinurenina (QUIN), tem sido associado ao mecanismo de imuno escape tumoral e inibidores destas enzimas têm sido considerados como imunoadjuvantes na terapia antitumoral. O mais conhecido deles é o 1-metil-triptofano (1-MT), um inibidor competitivo da IDO e alvo de estudos clínicos. O 1-MT é encontrado nas formas enantioméricas D- e L- e embora o enantiômero 1-L-MT seja mais eficiente na inibição da IDO1 (a isoforma mais ativa em tumores), é o 1-D-MT o enantiômero mais eficiente na redução experimental de tumores. Esse dado sugere que o 1-MT pode ter ações adicionais à inibição da IDO. Neste estudo avaliamos os efeitos diretos dos estereoisomeros, 1-D-MT, 1-L-MT, 1-DL-MT, sobre melanomas humanos e também do composto 680C91 (um inibidor de TDO). Proliferação, migração e invasão são os ensaios usuais in vitro para avaliar como um determinado composto afetaria a progressão tumoral. Observamos que todos os compostos testados possuem algum efeito direto sobre pelo menos um desses parâmetros, sendo que esse efeito varia de acordo com a linhagem. Logo, todos eles possuem ação direta sobre a célula tumoral que deve contribuir com a atividade antineoplásica. Também analisamos os efeitos destes compostos sobre a ação tumoricida de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC). Em co-culturas, observamos que o 1-MT foi capaz de potencializar a atividade tumoricida de PBMC\'s e levou à diminuição da produção de IFN-γ e TNF-α e aumento de IL-10. Essas alterações não cursam com a inibição da produção de QUIN, o que nos faz pensar que esta ação de 1-MT sobre IFN-γ ocorre independente da enzima IDO e que parte dos efeitos antitumorais da 1-MT seja consequência de sua ação sobre a liberação destas citocinas. 1-MT também levou a modificações na concentração de outros metabólitos do Trp. Por fim, a co-cultura por si só aumentou o consumo de ácido xanturênico (XA) e aumentou a produção de ácido quinurênico (KA). Esse resultado parece significativo para a imunologia de tumores dado os efeitos biológicos destes compostos. / In cancer, the increased expression of the enzymes indolamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) and tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO), that convert tryptophan (Trp) to kynurenine (KYN), has been associated with the mechanism of immune escape of tumoral cells and inhibitors of these enzymes have been considered as immuno-adjuvants in antitumor therapy. The most known is the 1-methyl-tryptophan (1-MT), a competitive inhibitor of IDO and a target in clinical trials. 1-MT is found in the enantiomeric forms D- and L- and although 1-L-MT is more efficient to inhibit IDO1 (the isoform more active in tumors), 1-D-MT is more efficient in experimental models. This fact suggests that 1-MT may have additional actions beyond IDO inhibition. In this study, we evaluated the direct effects of 1-D-MT, 1-L-MT and 1-DL-MT on human melanomas. We also tested the effects of the compound 680C91 (an inhibitor of TDO). Proliferation, migration and invasion are the usual in vitro tests to evaluate how a specific compound affects tumor progression. We observed that all of the tested compounds have some direct effect on at least one of these parameters depending on the cell lineage. Therefore, direct effects on proliferation, migration and invasion must compose the antineoplastic activity of these compounds. In co-cultures, we observed that 1-MT was able to potentiate the tumoricidal activity of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and led to a decreased production of IFN-γ and TNF-α, and an increase in IL-10. These changes were not linked with the inhibition of KYN production, and led us to consider that the effect of 1-MT on cytokine production occurs independently of the enzyme IDO and is part of its antitumor effects. 1-MT also led to changes in the concentration of other Trp metabolites. Finally, the co-culture by itself led to an increased consumption of xanthurenic acid (XA) and increased production of kynurenic acid (KA). This result seems significant to the immunology of tumors given the biological effects of these compounds.

A presente tese de doutorado descreve a integração de metodologias sintéticas da química de organoteluretos desenvolvidas nos últimos anos pelo grupo. Especialmente a hidroteluração de cetonas α,β-insaturadas, a resolução cinética enzimática de hidróxi-teluretos e a reação de troca Te/Li. Tais metodologias, empregadas em sequência, possibilitaram a obtenção de blocos sintéticos versáteis na preparação de reagentes organometálicos funcionalizados e enantiomericamente enriquecidos. Esse protocolo mostrou-se eficiente na preparação de uma variedade de produtos naturais, como por exemplo, feromônios de insetos-praga e butirolactonas com atividades biológicas relevantes. O trabalho foi dividido em duas partes. Estudou-se a reatividade e o emprego de organoteluretos alquílicos (sp3) e vinílicos (sp2) O-funcionalizados, na síntese dos produtos naturais citados acima. Na primeira parte do trabalho estudou-se a utilização de organoteluretos vinílicos. Esta classe de compostos foi preparada a partir da hidroteluração de alquinonas, os intermediários carbonílicos foram reduzidos com NaBH4, fornecendo uma mistura racêmica de hidróxi-teluretos vinílicos. Esses compostos foram submetidos à resolução cinética enzimática, empregando a lipase, disponível comercialmente, Novozyme® 435. Os resultados, quanto à excessos enantioméricos e rendimentos foram bons, possibilitando a obtenção de hidróxi-teluretos vinílicos enantiomericamente enriquecidos em até 96% e.e. Na etapa seguinte, efetuou-se a reação de troca Te/Li, gerando um reagente organometálico funcionalizado, denominado 1,4-(C,O) diânion vinílico de lítio. Pela eletronegatividade do átomo de lítio possibilitar vários tipos de transmetalações, esse intermediário é de grande valia em síntese orgânica. Na presença de eletrófilos, como CO2, esse diânion apresentou boa reatividade, gerando α-alquil-γ-butenolidas, após hidrólise em meio ácido. Tais butenolidas, constituíram-se como esqueleto avançado na síntese da (+)-Blastimicinona, (-)-Blastimicinolactol, (+)-Antimicinona, (-)-NFX-2 e todos os isômeros da Acaterina, em bons rendimentos globais. Esses compostos apresentam atividades antifúngicas, antitumorais e inibitórias de enzimas relacionadas à Arteriosclerose, respectivamente. Na segunda parte do trabalho estudou-se a utilização de um organotelureto alquílico em particular. Obtido a partir da hidroteluração da metil-vinil-cetona e redução in situ, do intermediário carbonílico. A mistura racêmica obtida foi resolvida através de resolução cinética enzimática, empregando a lipase, disponível comercialmente, Novozyme® 435. Os resultados, quanto a excessos enantioméricos e rendimentos foram bons, possibilitando a obtenção dos dois enantiômeros do respectivo hidróxi-telureto alquílico em excessos enantioméricos de até 99%. Na etapa seguinte, efetuou-se a reação de troca Te/Li, gerando um reagente organometálico funcionalizado, denominado 1,4-(C,O) diânion alquílico de lítio que foi transmetalado para uma série organocupratos. Ao reagi-lo com tosilatos específicos e realizar work-up com Ac2O, obteve-se uma série de feromônios de insetos-praga (C. pisi, M. destructor e D. mulleri) em bons rendimentos. / This PhD thesis describes the integration of synthetic methodologies involving organotellurides chemistry developed in recent years by the group, especially hydrotelluration of α,β-unsaturated ketones, enzymatic kinetic resolution of hydroxytellurides and Te/Li exchange reaction. These methods, used together, made it possible to obtain versatile synthetic blocks which were used in the preparation of functionalized and enantiomerically enriched organometallic reagents, featuring a synthetic key step in preparing a variety of natural products, such as Insect Pheromones and Butyrolactones with relevant biological activities. This work was divided into two parts. We studied the reactivity and the application of alkyl (sp3) and vinyl (sp2) O-functionalized organotellurides, in the synthesis of natural products cited above. In the first part of the work we studied the use of vinyl organotellurides. This class of compounds was prepared from hydrotelluration of alkynones, carbonyl intermediates were reduced with NaBH4 giving a racemic mixture of hydroxy-vinyl tellurides. These compounds were subjected to enzymatic kinetic resolution, using the lipase NovozymeTM 435. The results, as the yields and enantiomeric excesses were good yielding hydroxy-vinylic tellurides with enantiomeric excesses up to 96%. In the next step we performed the Te/Li exchange reaction, generating a functionalized organometallic reagent, known as lithium 1,4-(C,O) vinyl dianion. According to the characteristics of the electronegative atom of lithium, this intermediate is of great value in organic synthesis. In the presence of electrophiles such as CO2 showed good reactivity generating α-alkyl-γ-butenolides after acid hydrolysis. Such Butyrolactones constituted themselves as a skeleton for the synthesis of advanced (+)-Blastmycinone, (-)-Blastmycinolactol, (+)-Antimycinone, (-)-NFX-2 and all isomers of Acaterin in good overall yields. These compounds have antifungal and antitumor activity and inhibitory enzymes related to arteriosclerosis, respectively. In the second part of the work we studied the use of a specific alkyl organotelluride obtained by hydrotelluration of methyl vinyl ketone and in situ reduction of carbonyl intermediate by NaBH4. The racemic mixture was submitted to enzymatic kinetic resolution using the lipase NovozymeTM 435. The results, as the yields and enantiomeric excesses were good, allowing to obtain the two enantiomers of the corresponding hydroxy-alkyl telluride with enantiomeric excess of up to 99%. In the next step we performed the Te/Li exchange reaction, generating a functionalized organometallic reagent, known as lithium 1,4- (C,O) alkyl dianion that was used for the transmetallation for several organocuprate which when reacted with tosylates and perform specific work-up provided a number of pheromones of pest insects (C. pisi, M. destructor and D. mulleri) in good yields.