Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências Biológicas, 2014. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2014-08-13T13:24:07Z No. of bitstreams: 1 2014_DiogoMagnaboscodeAlmeidaGomes_Parcial.pdf: 2936989 bytes, checksum: efbdbdb843f99d312bd84a42e9123e7f (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-08-14T12:45:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_DiogoMagnaboscodeAlmeidaGomes_Parcial.pdf: 2936989 bytes, checksum: efbdbdb843f99d312bd84a42e9123e7f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-14T12:45:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_DiogoMagnaboscodeAlmeidaGomes_Parcial.pdf: 2936989 bytes, checksum: efbdbdb843f99d312bd84a42e9123e7f (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis é um parasita intracelular facultativo que apresenta-se sob a forma de micélio à temperatura ambiente e se diferencia para forma de levedura quando submetido à temperatura de 37°C ou durante a invasão aos tecidos de hospedeiros. P. brasiliensis não necessita do hospedeiro mamífero para completar seu ciclo biológico. Apesar disso, o fungo é capaz de sobreviver e se replicar nos tecidos do hospedeiro com o estabelecimento da doença. Em face desse paradoxo, questiona-se porque tais estratégias de sobrevivência se originaram e foram mantidas pela evolução nesse organismo. A hipótese proposta para vários fungos patogênicos é que fatores de virulência possam ter se desenvolvido como uma resposta à interação com predadores presentes no ambiente. Tais estudos utilizaram a ameba de solo Acanthamoeba castellanii, e mostraram quão expressivas são as similaridades nas estratégias fagocitárias de amebas e macrófagos. O objetivo geral desse trabalho é analisar a interação entre P. brasiliensis e A. castellanii, identificando os principais efeitos dessa interação na viabilidade dos organismos e na virulência desse fungo. Avaliando a interação entre P. brasiliensis e A. castellanii podemos constatar que a ameba é capaz de internalizar células do fungo. A cinética de fagocitose nos mostra que a porcentagem de amebas com fungos internalizados aumenta até 2 h após o início da coincubação e se mantem até 6 h. Analisando resultados da mortalidade de A. castellanii e P. brasiliensis quando coincubados por 24h observamos que a ameba é capaz de sobreviver e eliminar o fungo. Porém acreditamos que o fungo possa aumentar sua virulência quando recuperado após a coincubação com ameba, o que corrobora com resultados de testes similares feitos em macrófagos e nos dão fortes indícios de que esses protozoários estão intimamente ligados com o aparecimento de fatores de virulência em P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis is a facultative intracellular parasite and presents itself in the form of mycelium at room temperature and as yeast at 37°C or during invasion of host tissues. P. brasiliensis does not require a mammalian host to complete its life cycle. Nonetheless, the fungus is able to survive and replicate in the host tissues with the development of the disease. In view of this paradox, it is questioned why such survival strategies were originated and maintained in that organism. To try to answer this question Steenbergen et al (2001) and Casadevall et al (2003) created a hypothesis that virulence factors may have developed in some virulent fungi in response to interaction with predators in the environment. Such studies used the soil amoeba Acanthamoeba castellanii, and showed how significant are the similarities in the phagocytic strategies from amoebae and macrophages. The aim of this study is to analyze the interaction between P. brasiliensis and A. castellanii, identifying the main effects of this interaction in the viability of these two organisms and virulence of this fungus. Evaluating the interaction between P. brasiliensis and A. castellanii we observed that amoeba is capable of internalizing fungal cells. The kinetics of phagocytosis shows that the percentage of amoeba with internalized fungi increases within 2h after the start of coincubation and keeps up to 6h. Analyzing mortality results of A. castellanii and P. brasiliensis after coincubation for 24h we observed that amoeba is capable of surviving and kill the fungus. However, we believe that the fungus can increase its virulence when recovered after coincubation with amoebae, in agreement with results of similar tests on macrophages and gives us strong evidence that this protozoa is closely related with the emergence of virulence factors in P. brasiliensis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-12-07T14:22:53Z No. of bitstreams: 1 2012_AnaCamilaOliveiraSouza.pdf: 9707081 bytes, checksum: f668245bede41d667195b70bc7cc3cbe (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-12-10T10:11:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AnaCamilaOliveiraSouza.pdf: 9707081 bytes, checksum: f668245bede41d667195b70bc7cc3cbe (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-10T10:11:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AnaCamilaOliveiraSouza.pdf: 9707081 bytes, checksum: f668245bede41d667195b70bc7cc3cbe (MD5) / O desenvolvimento de nanopartículas poliméricas tem se tornado uma importante estratégia para otimização da eficácia terapêutica de inúmeros fármacos, podendo ampliar sua atividade e reduzir sua toxicidade. A nanoestruturação da Anfotericina B (NANO-D-AMB), importante antifúngico usado no tratamento de algumas micoses sistêmicas, como a paracoccidioidomicose e a candidíase, apresentou eficácia no tratamento da paracoccidoidomicose (PCM) experimental, com atividade antifúngica similar à da anfotericina B deoxicolato (D-AMB) e possibilitando um menor número de aplicações. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi determinar a capacidade antifúngica e biocompatibilidade desta nova formulação in vitro, bem como comparar a eficácia terapêutica de diferentes doses de NANO-D-AMB com D-AMB e Ambisome® no combate a PCM murina. Para isso, determinou se in vitro a concentração mínima inibitória de NANO-D-AMB em leveduras de Paracoccidioides brasiliensis e avaliou-se sua capacidade hemolítica e citotóxica em macrófagos peritoniais. Realizou se também a infecção de camundongos BALB/c e posteriormente o tratamento com as nanopartículas em diferentes doses, D- AMB e Ambisome®. Foi observado que NANO-D-AMB apresentou eficácia antifúngica in vitro similar a Ambisome®, bem como menor indução de hemólise e menor citotoxicidade em comparação a D-AMB. Além disso, foi observada similar capacidade antifúngica in vivo em relação à D-AMB e Ambisome®, sem indução de alterações histológicas e nas funções renais e hepáticas, com a vantagem de permitir uma diminuição em 25% na quantidade de anfotericina B injetada. O tratamento com NANO-D-AMB e Ambisome® ajudaram a modular positivamente a resposta imunológica em favor do hospedeiro. Além disso, verificou-se que o uso de sobredoses não provocou toxicidade aguda. Juntos esses resultados sugerem NANO-D-AMB como uma alternativa ao uso de D-AMB e Ambisome®. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The development of polymeric nanoparticles has become an important strategy for optimizing the therapeutic efficacy of many drugs, as it may expand their activities and reduce their toxicity.- The nanostructuring of Amphotericin B (NANO-D-AMB), an important antifungal agent used to treat some systemic mycoses such as paracoccidioidomycosis and candidiasis, showed efficacy in treating experimental paracoccidoidomicose (PCM), with antifungal activity similar to that of amphotericin B deoxycholate (D-AMB) and allowing a fewer number of applications. In this context, the aim of this study was to determine the antifungal activity of this new formulation and its biocompatibility in vitro and to compare the efficacy of different doses of NANO-D-AMB between D-AMB and Ambisome® in combating murine PCM. For this, it was determined in vitro minimum inhibitory concentration of NANO-D-AMB in Paracoccidioides brasiliensis yeasts, and it was evaluated its hemolytic and cytotoxic activities in peritoneal macrophages. Also, BALB/c mice were infected and then treated with the nanoparticles in different doses, D-AMB and Ambisome®. It was observed that NANO-D-AMB exhibited in vitro antifungal efficacy similarly to Ambisome® and induced lower hemolysis and cytotoxicity compared to D-AMB. Moreover, it was observed similar in vivo antifungal capacity in relation to D-AMB and Ambisome® without inducing changes in renal and hepatic histology and function, with the advantage of a 25% decrease in the amount of amphotericin B injected. Treatment with NANO-D-AMB and Ambisome® helped to positively modulate the immune response in favor of the host. Furthermore, it was found that the use of overdoses did not cause acute toxicity. Together, these results suggest NANO-D-AMB as an alternative to the use of D-AMB and Ambisome®.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-03-04T12:17:39Z No. of bitstreams: 1 2012_LuanaCastroOliveira.pdf: 2841384 bytes, checksum: 0632b4b2ba99fc494aa9ce5971604fd2 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2013-03-06T14:00:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LuanaCastroOliveira.pdf: 2841384 bytes, checksum: 0632b4b2ba99fc494aa9ce5971604fd2 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-06T14:00:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LuanaCastroOliveira.pdf: 2841384 bytes, checksum: 0632b4b2ba99fc494aa9ce5971604fd2 (MD5) / O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica humana mais comum na América Latina. O local de contato inicial entre o fungo P. brasiliensis e o hospedeiro é o epitélio respiratório. A resistência do hospedeiro à PCM está associada à ativação de células fagocíticas ao longo da infecção. Os antifúngicos atualmente utilizados no combate à PCM apresentam desvantagens como a alta incidência de efeitos colaterais e o aumento de casos de resistência. A epigenética refere-se a modificações nos padrões de expressão gênica herdáveis ao longo de sucessivas divisões celulares ou de sucessivas gerações de um indivíduo, e que não envolvem mudanças na sequência de nucleotídeos do DNA. As principais marcas epigenéticas envolvem a metilação de citosinas em ilhas CpG no DNA e as modificações pós-traducionais de histonas. Drogas como a 5-aza-2’-deoxi-citidina (5-AZA, inibidor de DNA metiltransferases), tricostatina A (TSA) e butirato de sódio (BS, inibidores de histona desacetilases) vêm sendo empregadas para modular estados epigenéticos. Em fungos patogênicos como C. albicans e C. neoformans, a administração de moduladores epigenéticos levou a uma diminuição no crescimento e viabilidade das leveduras. No presente estudo, avaliamos os efeitos biológicos de 5-AZA, TSA e BS sobre leveduras de P. brasiliensis e sobre uma linhagem de macrófagos murinos. As mais altas concentrações de drogas que não interferiram no crescimento celular foram definidas como BS 1 mM, TSA 20 nM e 5-AZA 1 µM, para macrófagos J774, e BS 10 mM, TSA 1,5 µM e 5-AZA 2 µM para leveduras de P. brasiliensis. 5-AZA provocou um aumento do índice de internalização das leveduras pelas células J774 com 2h e 6h de infecção, enquanto BS provocou aumento em 2h e TSA não afetou esse índice. A análise do acúmulo de mensageiros de genes relacionados à resposta imune revelou uma diminuição dos níveis de transcritos de MyD88 em macrófagos tratados com BS, ao passo que 5-AZA elevou os níveis de transcritos desse adaptador. O acúmulo de transcritos NF-κB diminuiu quando os macrófagos foram infectados e tratados com 5-AZA e BS, enquanto TSA não teve efeito. O mensageiro de TNF-α, em macrófagos infectados tratados com 5-AZA, também teve aumento significativo de acúmulo, o que não aconteceu no tratamento com TSA ou BS. Os níveis do transcrito de IL-6 foram afetados apenas pela administração de TSA, que elevou o acúmulo dos mensageiros dessa interleucina. Nas culturas infectadas e tratadas com TSA observou-se uma diminuição do nível de TNF-α secretado, enquanto o tratamento com BS provocou um aumento dessa citocina no sobrenadante. Nossos dados indicam que alterações epigenéticas possam participar da regulação da resposta de fagócitos quando em contato com células fúngicas, e que mais de uma via de sinalização pode estar relacionada a essa resposta. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent deep mycosis in Latin America. The first contact between the fungus and the host is the respiratory epithelium. The host resistance to PCM is related to the activation of phagocytic cells during the course of the infection. The antifungals used against PCM show many disadvantages, as high incidence of side effects and increasing fungal resistance. The term epigenetic refers to modifications in the genetic expression patterns, heritable through cell divisions or individuals generations, which do not implicate in changes in the sequence of nucleotides of the DNA. The main epigenetic marks are the cytosine methylation in DNA CpG islands and histones post-translational modifications. Drugs such as 5-aza-2’-deoxy-cytidine (5-AZA, methyltransferase inhibitor), trichostatin A (TSA) and sodium butyrate (SB, histone desacetylase inhibitors) have been used to modulate epigenetic states. In pathogenic fungi such as C. albicans and C. neoformans, the use of epigenetic modulators led to a lower growth rate and yeasts viability. In the present work we evaluated the biological effects of 5-AZA, TSA and SB on P. brasiliensis yeast cells and on a lineage of murine macrophages. The highest drug concentrations that did not affect cell growth were SB 1 mM, TSA 20 nM and 5-AZA 1 µM, to the macrophages, and SB 10 mM, TSA 1,5 µM and 5-AZA 2 µM, to P. brasiliensis yeast cells. 5-AZA induced a higher internalization yeasts index by the macrophages within 2h and 4h of infection, while SB had the same effect with 2h of infection and TSA did not affect this index. The transcripts accumulation analysis of genes related to the immune response showed a down modulation of the MyD88 transcript levels in macrophages treated with SB, whilst 5-AZA up regulated the transcript levels of this gene. The NF-κB transcript level was lower when macrophages were infected and treated with 5-AZA and SB, while TSA did not show any effect. TNF-α transcripts accumulation was also upregulated in macrophages infected and treated with 5-AZA, what was not observed with TSA or SB. IL-6 transcripts level was only affected by the TSA administration, which upregulated it. In cultures infected and treated with TSA, there was a lower level of secreted TNF-α, while SB had the opposite effect, increasing this cytokine in the supernatant. Our data indicate that epigenetic modifications can participate in the regulation of the phagocytes response to fungal cells and that alternative signaling pathway can be related to this answer.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-06-04T11:38:29Z No. of bitstreams: 1 2012_CamiladeArrudaSaldanha.pdf: 96942110 bytes, checksum: 18a4e202aea1b4948fd6301cc224ad19 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-04T12:52:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_CamiladeArrudaSaldanha.pdf: 96942110 bytes, checksum: 18a4e202aea1b4948fd6301cc224ad19 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-04T12:52:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_CamiladeArrudaSaldanha.pdf: 96942110 bytes, checksum: 18a4e202aea1b4948fd6301cc224ad19 (MD5) / A paracoccidioidomicose, Pbmicose, é uma micose sistêmica autóctone da América central e do sul, de caráter endêmico entre as populações de zona rural. Dentre os fármacos mais utilizados no tratamento da Pbmicose destacam-se o Itraconazol e a Anfotericina B. Este último possui amplo espectro antifúngico e potente atividade fungicida. Apesar disso, induz em humanos diversos efeitos adversos, principalmente a nefrotoxicidade. Nesse contexto, novas estratégias tais como a ligação da Anfotericina B a estruturas biocompatíveis têm sido desenvolvidas para diminuir a sua concentração no plasma sanguíneo e aumentar nos órgãos alvos da terapia e, assim, reduzir os efeitos colaterais induzidos por esse fármaco. Dentre essas estruturas destacam-se os materiais nanoestruturados como as nanopartículas magnéticas. Entretanto, para serem utilizadas na biomedicina essas nanopartículas devem ser biodegradáveis, hemocompatíveis e não tóxicas ao organismo. Para tal, é importante que elas sejam recobertas por substâncias estabilizantes. Nesse sentido, a fim de desenvolver um sistema controlado de entrega de drogas e de reduzir os efeitos colaterais da Anfotericina B, conjugou-se esse fármaco a nanopartículas magnéticas estabilizadas com bicamada de ácido láurico. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia da Anfotericina B quando conjugada a nanopartículas magnéticas estabilizadas com bicamada de ácido láurico, FM-BlaAmB, no tratamento da Pbmicose experimental. Inicialmente, fez-se necessário avaliar se a Anfotericina B nesse complexo mantinha atividade antifúngica e se era tóxica para células de mamíferos. Assim, o fungo Paracoccidioides brasiliensis, isolado virulento 18 (Pb18) e células mesangiais humanas e macrófagos peritoneais murinos foram tratadas, in vitro, com FM-BlaAmB. Os resultados demonstram que a Anfotericina B no complexo FM-BlaAmB mantém a atividade antifúngica similar a Ambisome® e não é tóxica para células de mamíferos. Diante desses dados promissores decidiu-se realizar ensaios in vivo de modo a verificar se a Anfotericina B no complexo FM-BlaAmB era eficaz na Pbmicose experimental, sem, entretanto, ser tóxica para o hospedeiro. Para tal, camundongos BALB/c foram infectados com o fungo III Pb18 e tratados com o complexo durante as formas aguda e crônica da doença, por 30 e 60 dias. A determinação da carga fúngica no pulmão, a histopatologia dos órgãos pulmão, baço, fígado e rim, além da quantificação de citocinas e do DNA fragmentado em células de medula óssea foram realizadas 24 horas após o último tratamento. Os resultados mostram que a Anfotericina B no complexo é eficaz contra a paracoccidioidomicose experimental na infecção aguda, mas não na infecção crônica e não induz alterações bioquímicas e clínicas nem histopatológicas no fígado, nos rins nem no baço de camundongos BALB/c. Ela também não induz efeitos genotóxicos em células da medula óssea desses animais. Assim sendo, é plausível acreditar que a Anfotericina B quando conjugada a nanopartículas magnéticas estabilizadas com bicamada de ácido láurico, por apresentar similar capacidade antifúngica e não induzir efeitos adversos em doses terapêuticas na infecção aguda, além de permitir a diminuição do número de aplicações no tratamento da Pbmicose murina, possa ser uma alternativa ao uso das formulações de Anfotericina B deoxicolato e Ambisome®. Porém estudos posteriores são necessários para melhorar a eficácia no tratamento da infecção crônica. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioidomycosis, PCM, systemic mycosis is a native of Central and South America, the endemic among rural populations. Among the most commonly used drugs in the treatment of PCM stand out Itraconazole and Amphotericin B. The latter has broad spectrum antifungal and potent fungicidal activity. Nevertheless, induces several side effects in humans, particularly nephrotoxicity. In this context, new strategies such as the binding of amphotericin B to biocompatible structures have been developed to reduce its concentration in blood plasma and increase in target organs of therapy and thereby reduce the side effects induced by this drug. Among these structures stand out nanostructured materials as magnetic nanoparticles. However, for use in biomedicine these nanoparticles should be biodegradable and non-toxic hemocompatíveis the body. For this it is important that they are coated by stabilizing substances. Accordingly, in order to develop a system controlled delivery of drugs and reduce side effects of Amphotericin B, this drug is conjugated to magnetic nanoparticles stabilized bilayer lauric acid. This study aimed to evaluate the efficacy of amphotericin B when coupled to magnetic nanoparticles stabilized bilayer lauric acid, FM-BlaAmB in experimental treatment of PCM. Initially, it was necessary to assess whether this Complex Amphotericin B had antifungal activity and was toxic to mammalian cells. Thus, Paracoccidioides brasiliensis, virulent isolate 18 (Pb18), and human mesangial cells and murine peritoneal macrophages were treated in vitro with FM-BlaAmB. The results show that the amphotericin B in the complex FM-BlaAmB mantéma antifungal activity similar to Ambisome ® and is not toxic to mammalian cells. Given these encouraging data was decided to conduct in vivo tests to verify that the Amphotericin B in the complex FM-BlaAmB was effective in experimental Pbmicose, without, however, be toxic to the host fungus. To this end, BALB / c mice were infected with the fungus Pb18 and treated with the compound during the acute and chronic forms of the disease for 30 and 60 days. The determination of the fungal load in the lung histopathology of organs such as lung, spleen, liver and kidney in addition to the quantification of cytokines and the fragmented DNA into bone marrow cells were performed 24 hours after the last treatment. The results show that the amphotericin B in the complex is effective against paracoccidioidomycosis infection in experimental acute, but not chronic infection and does not induce clinical or biochemical and histopathological liver, kidney or spleen of BALB / c mice. It also does not induce genotoxic effects in bone marrow cells of these animals. Therefore, it is reasonable to believe that the Amphotericin B when coupled to magnetic nanoparticles stabilized bilayer lauric acid, by having similar antifungal capacity and do not induce adverse effects at therapeutic doses in acute infection and also allows reducing the number of applications in the treatment of PCM murine, can be an alternative to the use of the formulations of amphotericin B deoxycholate and Ambisome ®. But further studies are needed to improve effectiveness in the treatment of chronic infection.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-16T14:15:13Z No. of bitstreams: 1 Tese_RenataBastosAscencoSoares.pdf: 925364 bytes, checksum: 1f337752deeaae2fd63914bbfbd608e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-01-19T11:44:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_RenataBastosAscencoSoares.pdf: 925364 bytes, checksum: 1f337752deeaae2fd63914bbfbd608e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-19T11:44:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_RenataBastosAscencoSoares.pdf: 925364 bytes, checksum: 1f337752deeaae2fd63914bbfbd608e8 (MD5) Previous issue date: 2007-06 / Paracoccidioides brasiliensis causa uma micose crônica granulomatosa prevalente na América Latina. O sucesso da resolução da infecção por este fungo é dependente da ativação da imunidade celular. Nós identificamos previamente a proteína de choque térmico 60 (HSP60) como um alvo da resposta humoral na paracoccidioidomicose. Neste trabalho nós expressamos o gene codificante para a proteína de choque térmico 60 em Escherichia coli e a atividade imunobiológica deste antígeno recombinante foi analisada. A imunização de camundongos BALB/c com a proteína recombinante emulsificada em adjuvante estimulou a resposta immune celular como acessado pela proliferação e produção de interferon-gama. A vacinação com a HSP60 reduziu a carga fúngica em camundongos infectados com f 106 ou 107 leveduras. As células T CD4+ foram necessárias para a eficácia da vacinação e ambas as fases: aferente e eferente. Contudo, nós demonstramos que o antígeno imunodominante é um candidato para o desenvolvimento de uma vacina contra este fungo. Na segunda parte do trabalho, leveduras de P. brasiliensis foram convertidas em resistentes a higromicina B pelo sistema de transformação mediado por Agrobacterium-tumefaciens utilizando um vetor binário plasmidial pCB301 contendo os genes da higromicina B fosfotransferase (hph) e o repórter green fluorescent protein (GFP) controlados pelo promotor CBP1 de Histoplasma capsulatum e o terminador Ura5. A transformação mediada por Agrobacteriumtumefaciens produziu transformates estáveis capazes de crescer em altas concentrações de higromicina B. A expressão de GFP foi analisada por microscopia confocal e a variação da intensidade de fluorescência sugeriu a integração do TDNA em sítios randômicos do genoma do fungo. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis causes a chronic granulomatous mycosis prevalent in Latin America. Successful resolution of infection with this fungus is dependent on activation of cellular immunity. We previously identified heat shock protein 60 as a target of the humoral response in paracoccidioidomycosis. Herein we expressed the gene encoding the heat shock protein 60 in Escherichia coli and analyzed the immunological activity of this recombinant antigen. Immunization of BALB/c mice with recombinant protein emulsified in adjuvant stimulated a cellular immune response as assessed by proliferation and interferon-gamma production. Vaccination with heat shock protein 60 reduced fungal burden in mice given 106 or 107 yeasts. CD4+ cells were necessary for the efficacy of vaccination in both the afferent and efferent phases. Thus, we have demonstrated that this immunodominant antigen is a candidate for development of a vaccine against this fungus. In a second part of this work, yeasts of P. brasiliensis were transformed to hygromycin B resistance by a Agrobacterium-tumefaciens-mediated transformation system using a binary plasmid vector pCB301 containing the hygromycin B phosphotransferase hph) and the enhanced green fluorescent protein (GFP) genes controlled by the CBP1 promoter from Histoplasma capsulatum and the Ura5 terminator. Agrobacterium-tumefaciens-mediated transformation yielded stable transformants capable of growing on increased concentrations of hygromycin B. The expression of GFP was analyzed by confocal microscopy and the intensity fluorescence variation suggested an integration of the T-DNA at random sites in the genome of the fungus.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-11-03T16:49:34Z No. of bitstreams: 1 Lorena da Silveira Derengowski.pdf: 1542481 bytes, checksum: cb6123102a20bb711c1f94f71d3a369d (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:31:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Lorena da Silveira Derengowski.pdf: 1542481 bytes, checksum: cb6123102a20bb711c1f94f71d3a369d (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorena da Silveira Derengowski.pdf: 1542481 bytes, checksum: cb6123102a20bb711c1f94f71d3a369d (MD5) Previous issue date: 2006 / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. O mecanismo mais importante de defesa do hospedeiro contra infecções por P. brasiliensis é a resposta imunológica celular. Esse fungo é capaz de sobreviver e se replicar no interior de macrófagos murinos e humanos, revelando a existência de mecanismos que permitam a sobrevivência no ambiente inóspito do fagossomo da célula hospedeira. Em concordância com essa habilidade de P. brasiliensis em sobreviver nesse ambiente de carência nutricional, estresse oxidativo e baixo pH, análises do transcriptoma desse fungo revelam ortólogos a potenciais genes de virulência de outros microrganismos patogênicos. Nesse contexto, esse trabalho descreve a análise da expressão de potenciais genes de virulência de P. brasiliensis por RT-PCR. Visando a avaliar a expressão dos genes icl1 (isocitrato liase) e mls1 (malato sintase), que codificam as enzimas do ciclo do glioxalato, leveduras de P. brasiliensis foram crescidas em condições que potencialmente mimetizam às encontradas no interior do fagossomo, substituindo-se glicose por acetato como única fonte de carbono. Os resultados sugerem um significativo aumento na expressão de icl1 e mls1 quando do cultivo do fungo em meio contendo apenas acetato. A mesma análise foi feita para os genes ady2, que codifica uma permease de acetato, e icl2, que parece codificar outra isoforma da enzima isocitrato liase. Entretanto, os resultados indicam que os genes ady2 e icl2 de P. brasiliensis são regulados independentemente das fontes de carbono utilizadas nesse trabalho. Ainda, a expressão de ure1 (urease) foi analisada quando do cultivo de P. brasiliensis em pH ácido. Esses experimentos não mostraram uma regulação do gene ure1 desse fungo dependente de pH. Adicionalmente, esse trabalho descreve, pela primeira vez, experimentos de RT-PCR utilizando RNA extraído de leveduras de P. brasiliensis após 6 horas de co-cultura com macrófagos murinos. Os resultados mostram um aumento no nível de expressão dos genes icl1, mls1 e ady2, quando comparada à expressão por células crescidas em meio convencional. Essas observações indicam claramente que P. brasiliensis utiliza o ciclo do glioxalato como uma importante via metabólica alternativa para produção de energia, como observado para outros fungos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the ethiologic agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. The most important mechanism of host defense against P. brasiliensis infection is cell-mediated immune response. This fungus is able to survive and replicate within the phagossome of murine and human macrophages, revealing that it have evolved mechanisms allowing its survival within the phagocytic cells, which are considered an inhospitable habitat. In agreement with the ability to survive in this nutritionally poor, oxidative stress and low pH environment, the analysis of P. brasiliensis transcriptome revealed several putative orthologs to virulence genes of other human facultative intracellular pathogenic microorganisms. In this context, this work describes the analysis of putative virulence genes expression by RT-PCR. In order to evaluate the expression of glyoxylate cycle genes, icl1 (isocitrate lyase) and mls1 (malate synthase), the yeast form of P. brasiliensis was grown in media mimicking the phagossome millieu, in which glucose was replaced by acetate as a sole carbon source. The results suggests a significantly increase in the icl1 and mls1 expression when this fungus was grown in media with acetate as the only carbon source. The same analyzis was performed for ady2 gene, that encode an acetate permease, and icl2 gene, that probably encodes another putative isoform of isocitrate lyase enzyme. However, the results indicate that ady2 and icl2 genes of P. brasiliensis are not regulated by these different carbon sources used in this work. On the other hand, the expression of ure1 (urease) was analyzed in this work when P. brasiliensis yeast cells were grown in acid pH, mimicking the phagossome environment. These experiments don’t show a pHdependent regulation by ure1 gene of this fungus. In addition, this work describes for the first time RT-PCR experiments using RNA extracted from yeast cells recovered from murine macrophages after 6 hours of co-culture. The results show the higher levels of icl1, mls1 and ady2 gene expression when compared to cells grown in conventional media. These observations clearly indicates that P. brasiliensis uses the glyoxylate cycle as an important alternative energetic metabolism pathway, as observed for other fungi.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-02T19:14:30Z No. of bitstreams: 1 2009_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 1487096 bytes, checksum: d710a5d028048014f75d9399e8d27530 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-03-02T22:57:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 1487096 bytes, checksum: d710a5d028048014f75d9399e8d27530 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-02T22:57:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 1487096 bytes, checksum: d710a5d028048014f75d9399e8d27530 (MD5) Previous issue date: 2009 / O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM) – a micose sistêmica mais comum na América Latina. O tratamento é prolongado e traz severos efeitos secundários. Além disso, a resistência a medicamentos usados tem sido demonstrada em P. brasiliensis. O farnesol, conhecido componente de óleos essenciais, exerce um papel crítico no quorum-sensing e na virulência de Candida albicans. Dados da literatura relataram um efeito antimicrobiano do farnesol para diversos microrganismos. O efeito fungicida deste composto, bem como seu papel no retardo da transição dimórfica do isolado Pb18, pertencente à espécie críptica S1 de P. brasiliensis, foi descrito recentemente por nosso grupo de pesquisa. Neste trabalho estendemos esta análise para representantes de outras espécies crípticas, o isolado Pb01 do grupo “Pb01-like” e o isolado Pb3 do grupo PS2. Em concordância com nossos estudos prévios, confirmamos o efeito fungicida para estes dois outros isolados de P. brasiliensis. A concentração inibitória mínima (MIC90) de farnesol, que inibe 90% do crescimento de P. brasiliensis, tanto para o isolado Pb01 quanto para o isolado Pb3 é de 20μM, enquanto a concentração letal mínima (MLC90) de farnesol para o isolado Pb01 é de 30μM e para o isolado Pb3 é de 40μM. Neste trabalho, analisando o efeito do farnesol na transição dimórfica dos isolados Pb01 e Pb3, observamos que este também retarda a transição de levedura para micélio destes dois isolados. Diante da expectativa de uso deste sequisterpeno como um adjuvante terapêutico, analisamos o seu efeito em associação com alguns antifúngicos empregados no tratamento da PCM. Nossos dados indicam uma ausência de efeito sinergístico entre o farnesol e os antifúngicos da família dos azóis (fluconazol e cetoconazol), além de um possível efeito protetor para o fungo quando associado a uma dada faixa de concentração (0,0312 a 0,125μg/mL) de anfotericina B. Estes resultados sugerem, fortemente, que o farnesol não deve ser utilizado como um adjuvante terapêutico no tratamento da PCM sistêmica. Uma vez que dados da literatura descreveram a indução de apoptose em Aspergilus nidulans pelo farnesol, analisamos a expressão de alguns genes de P. brasiliensis relacionados a este processo. Nenhuma alteração significativa no padrão de expressão dos genes analisados foi observada. No entanto, ainda não podemos descartar a possível ativação deste processo de morte celular em P. brasiliensis em resposta ao tratamento com farnesol. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM) – the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Its treatment is usually long and frequently results in several side effects. Besides, some isolates of P. brasiliensis have developed resistance to many of the anitimicribial agents used. Farnesol, a known component of essential oils, is a quorumsensing molecule and a virulence factor of Candida albicans. It was demonstrated that farnesol exerts an antimicrobial activity in a number of microorganisms. The fungicide effect of this compound, as well as its role in the delay of the dimorphic transition in the isolate Pb18, belonging to the S1 cryptic species of P. brasiliensis, has been recently describe by our research group. In this work, we expanded our analyzes to other cryptic species of P. brasiliensis found in Brazil, namely the isolates Pb01 from “Pb01-like” group and Pb3 from the PS2 cryptic species. In accordance to our previous results, we confirmed the fungicide effect of farnesol in the other two isolates of P. brasiliensis. The minimum inhibitory concentration (MIC90) of farnesol, the concentration that inhibits 90% of growth, was 20μM for both isolates, while the minimum lethal concentration (MLC90) of farnesol were 30μM and 40μM for the isolates Pb01 and Pb3, respectively. Additionally, in this study it was also analyzed the effect of farnesol on the dimorphic transition of the isolates Pb01 and Pb3, which results also reveal that farnesol promotes a delay in the transition from yeast to mycelium of these isolates. Based on its fungicide activity, the use of farnesol has been proposed as a possible adjuvant in the treatment of bacterial and fungal diseases. In this sense, we analysed its effect in association with some fungicides commonly used in the treatment of PCM. Nonetheless, we found an absence of synergism between farnesol and the azole family of fungicides (fluconazole and ketoconazole). Curiously, a protective effect to the fungus was observed when farnesol was associated to amphotericin B in concentrations of 0,0312 to 0,125μg/mL. These results suggest that farnesol should not be used as therapeutic adjuvant in the treatment of PCM. The effect of farnesol as an apoptosis inducer in Aspergillus nidulans was described. In this context, we analysed the expression of some P. brasiliensis’ genes related to the process of programmed cell death. Although no significant alteration was observed in the gene expression pattern, the possible role of farnesol in inducing apoptosis in P. brasiliensis cannot be ruled out.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2010-03-25T19:07:34Z No. of bitstreams: 1 2009_HugoCostaPaes.pdf: 1466586 bytes, checksum: 1606d978954121d718e5bb816fef2e6e (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T13:59:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_HugoCostaPaes.pdf: 1466586 bytes, checksum: 1606d978954121d718e5bb816fef2e6e (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T13:59:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_HugoCostaPaes.pdf: 1466586 bytes, checksum: 1606d978954121d718e5bb816fef2e6e (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / O presente trabalho foi o primeiro a caracterizar o fator de choque térmico (Hsf) em um fungo patogênico para humanos. O gene de Paracoccidioides brasiliensis isolado 01 (Pb01) teve sua seqüência determinada e analisada por ferramentas de bioinformática. Constatou-se que os domínios regulatórios da proteína são divergentes dos de Saccharomyces cerevisiae e similares aos de outros membros da superclasse Eurotiomycetidae, sugerindo especialização evolutiva. O cistron do Hsf de Pb01 foi clonado num vetor epissomal de expressão em S. cerevisiae, e a clonagem do plasmídio resultante na levedura foi capaz de resgatar a perda do gene nativo, que normalmente seria letal. Isso comprova que a proteína de P. brasiliensis reteve seu papel funcional. Uma varredura computacional de promotores de Pb01, em busca de elementos de resposta ao choque térmico (HSE), resultou na constatação de que uma diversidade de genes maior que a vista em levedura contém HSEs em suas regiões regulatórias, embora sejam necessários estudos funcionais para confirmar esse achado. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work is the first to characterise the heat shock factor (Hsf) in a fungal pathogen of humans. The gene of Paracoccidioides brasiliensis isolate 01 (Pb01) had its sequence determined and analysed by bioinformatics tools. Its regulatory domains are distinct from those of the Hsf from Saccharomyces cerevisiae and similar to those of other Eurotiomycetidae, suggesting evolutionary specialisation. The cistron of the Pb01 Hsf was cloned into an episomal expression vector for S. cerevisiae, and the final construct was able to rescue the otherwise lethal loss of the native gene in yeast, thus proving that the Pb01 protein retained its function. A computational screening of Pb01 promoters for heat shock 7 elements (HSE) showed that a greater proportion of genes contains these regulatory regions than in budding yeast. However, functional studies will be necessary to confirm this finding.

Tese (Doutorado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-06-16T19:18:12Z No. of bitstreams: 1 2011_ElainePatríciaCunhaAzevedo.pdf: 2464085 bytes, checksum: e48dcc9556bff9f13311123f0f1829ae (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2011-06-16T20:38:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_ElainePatríciaCunhaAzevedo.pdf: 2464085 bytes, checksum: e48dcc9556bff9f13311123f0f1829ae (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-16T20:38:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_ElainePatríciaCunhaAzevedo.pdf: 2464085 bytes, checksum: e48dcc9556bff9f13311123f0f1829ae (MD5) / A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma endemia de relevância na América Latina, sendo responsável por 1,45 mortes/milhão de habitantes apenas no Brasil, onde é considerada uma doença negligenciada pelo Ministério da Saúde. A atual terapia para a PCM recai principalmente em duas classes de antifúngicos: a) os imidazólicos, como o itraconazol; e b) os polienos como a anfotericina B, cujos tratamentos resultam em graves efeitos colaterais para o paciente e que são considerados como os principais selecionadores das formas resistentes de diversos fungos patogênicos. Este estudo tem como objetivo avaliar uma nova formulação para tratar de infecções fúngicas, pelo uso de itraconazol encapsulado em sistemas nanoestruturado de PLGA (polímero derivado ácido lático e ácido glicólico) no tratamento da PCM em modelo experimental in vitro e in vivo; comparada com o fármaco convencionalmente usado no tratamento desta micose, como estratégia para evitar problemas de efeitos colaterais causados pelos antifúngicos atualmente usados. A caracterização das nanopartículas contendo itraconazol (ITZ-NANO) mostrou sucesso da técnica de nanoencapsulação com eficiência de encapsulação de 72,8 ± 3.50%. As nanopartículas apresentaram formatos esféricos, densidades similares, e diâmetro médio de 174 nm. As partículas apresentaram carga negativa (-40 mV). Por meio do teste de MTT, ITZ-NANO mostrou baixa toxicidade em células mesangiais de rim e hepatócitos; e similar eficácia antifúngica comparada ao fármaco convencional, através de contagem de unidades formadoras de colônia. A biodistribuição de ITZ-NANO foi realizada por meio da marcação das nanopartículas com tecnécio e injetadas em camundongos da linhagem Balb C revelando uma concentração significativamente maior nos pulmões, fígado e rins após 8 horas da administração. Nos testes in vivo, os cortes histológicos dos pulmões dos camundongos Balb C após 30 e 60 dias de tratamento mostraram comprometimento nos indivíduos de todos os grupos infectados, como intenso infiltrado inflamatório, parênquima espesso e presença de granulomas com células fúngicas, porém, nos animais tratados com ITZ-NANO, os pulmões estavam mais preservados e não foi visto célula fúngica. Nas dosagens de enzimas hepáticas, foram observadas alterações depois de 30 dias de tratamento, como aumento da enzima transaminase pirúvica no grupo tratado com itraconazol convencional e diminuição da enzima fosfatase alcalina no grupo tratado com ITZ-NANO. Quanto ao aspecto físico dos animais, o grupo tratado com itraconazol convencional apresentou alopecia após 30 dias de tratamento e maior diminuição de seu peso (15%). Os resultados indicam que ITZ-NANO apresentou melhor ação que o itraconazol convencional quanto à citotoxicidade, in vitro, análises histopatológicas dos pulmões, dosagens de enzimas hepáticas e aparência física dos animais, in vivo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioidomycosis (PCM) is an endemic disease of relevance in Latin America, being responsable for 1,45 deaths/million of inhabitants only in Brazil, where it is an illness neglected by the health authorities. In current days, there are two groups of antifungal agents used in the treatments, the imidazoles (itraconazole) and the polyenes (amphotericin B), both can result in serious side effects for the patient, and are also being considered responsible for the resistant forms of several pathogenic fungi. This study aims to evaluate a new formulation against fungal infections by means of the sustained release of encapsulated itraconazole in nanostructured PLGA in the treatment of paracoccidioidomycosis in an experimental model in vitro and in vivo. Through the characterization of nanoparticle itraconazole (ITZ-NANO) were identified an encapsulation efficiency of 72.8%, rounded shapes, similar densities, average diameter of 174 nm, and also a negatively charged (-40 mV). The biodistribution of ITZ-NANO was performed by marking the nanoparticles with technetium. This showed a higher concentration in the lungs, liver and kidneys. The cytotoxicity assays performed in mesangial cells of kidney and hepatocytes using the MTT assay showed that the ITZ-NANO was less cytotoxic than the conventional itraconazole. In in vivo tests, histological sections of lungs of animals held at 30 and 60 days of treatment, showed impairment in individuals of all infected groups, such as an intense inflammatory infiltrated, a increased thick parenchyma, and the presence of granulomas with fungal cells, on the other hand, in animals treated with ITZ-NANO, the lungs were better preserved and were not observed the presence of fungal cells. In the dosing of the hepatic enzymes, changes were observed after 30 days of treatment, such as an increase in the lactate dehydrogenase in the group treated with conventional itraconazole, and a decrease of the alkaline phosphatase enzyme in the group treated with ITZ-NANO. Regarding the physical appearance of animals, the group that was treated with conventional itraconazole it showed alopecia after 30 days of treatment, and also a significant decrease of their weight (15%). The results suggest that ITZ-NANO showed better action in comparison with the conventional itraconazole regarding cytotoxicity in vitro, histopathological analisys of the lungs, liver enzyme dosings and in the physical appearance of animals in vivo.

Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-02-12T10:07:26Z No. of bitstreams: 1 2014_ElisaFlaviaLuizCardosoBailao_Parcial.pdf: 41760510 bytes, checksum: 670060a9fccb734ae0f283e195a47a24 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-02-12T14:20:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ElisaFlaviaLuizCardosoBailao_Parcial.pdf: 41760510 bytes, checksum: 670060a9fccb734ae0f283e195a47a24 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-12T14:20:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ElisaFlaviaLuizCardosoBailao_Parcial.pdf: 41760510 bytes, checksum: 670060a9fccb734ae0f283e195a47a24 (MD5) / Paracoccidioides spp. is a thermodimorphic fungus, which causes paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic disease in Latin America. Currently, the Paracoccidioides genus is considered a phylogenetic group containing two distinct species: P. brasiliensis and P. lutzii. However, all isolates identified to date are able to cause PCM. Iron is an essential micronutrient for all eukaryotes, since it participates as a cofactor in several metabolic pathways. However, the amount of available iron inside the host is limited to the pathogen. The host iron sources that are used by Paracoccidioides spp. and the molecular mechanisms used by the fungus to acquire iron has not been investigated. In this study, a robust growth of Paracoccidioides spp. in the presence of hemin or hemoglobin was observed. This fact was supported by the ability of the fungus to internalize protoporphyrin rings and to lyse erythrocytes. Transcriptional and proteomic analysis indicated the induction of possible hemoglobin receptors in the presence of hemoglobin and the possibility of internalization of the entire molecule by the fungus. One of these potential receptors, Rbt5, was characterized in this work. Rbt5 is a GPI-anchored protein, present at the Paracoccidioides sp. cell surface. The protein is able to bind hemin, hemoglobin and protoporphyrin and presents antigenic properties. A Paracoccidioides sp.rbt5knockdown strain was obtained in this work using antisense RNA and Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. This strain showed lower survival inside macrophages and in mouse spleen, indicating that Rbt5 may be important for the establishment of Paracoccidioides spp. infection. Furthermore, the reductive iron uptake pathway was investigated in this fungus. In silico analysis pointed that Paracoccidioides spp. could use ferric reductases, ferroxidases and zinc and iron transporters to uptake free iron or iron bound to certain molecules, such as transferrin. The genes encoding those molecules possibly involved in iron uptake were activated in the absence of the metal, which points to the importance of this pathway in conditions of iron deprivation. Genes involved in intracellular iron homeostasis were also investigated in this work and presented regulation by the metal. A ferric reductase activity was demonstrated for Paracoccidioides sp.; however, 59Fe uptake assays showed that the reductive pathway is functional only in conditions of iron deprivation and that the Paracoccidioides spp. ferric reductases are not strongly affected by platinum. Surface molecules involved in iron uptake by the fungus may be important targets for vaccines and/or antifungal drugs. Thus, this work can contribute to the development of alternative therapies for PCM treatment. / Paracoccidioides spp. é um fungo termodimórfico, causador da paracoccidioidomicose (PCM), uma doença endêmica da América Latina. Atualmente o gênero Paracoccidioides é considerado um grupo filogenético, contendo duas espécies distintas: P. brasiliensis e P. lutzii. Porém, todos os isolados identificados até o momento são capazes de causar a PCM. O ferro é um micronutriente essencial para todos os eucariotos, pois participa como cofator de diversas vias metabólicas. Porém, dentro do hospedeiro, a quantidade de ferro disponível para captação pelo patógeno é limitada. As fontes de ferro do hospedeiro preferenciais de Paracoccidioides spp. e os mecanismos moleculares utilizados pelo fungo para captar ferro ainda não foram investigados. Neste trabalho, foi constatado um robusto crescimento de Paracoccidioides spp. na presença de hemina ou hemoglobina, corroborado pela capacidade do fungo de internalizar uma protoporfirina e de lisar hemácias. Análises transcricionais e proteômicas apontaram para a indução de possíveis receptores de hemoglobina na presença desta fonte de ferro e para a possível internalização de toda a molécula de hemoglobina pelo fungo. Um desses possíveis receptores, Rbt5, foi caracterizado neste trabalho. Rbt5 é uma proteína GPI-ancorada presente na superfície de Paracoccidioides sp., capaz de se ligar à hemina, protoporfirina e hemoglobina e apresenta propriedades antigênicas. Uma linhagem silenciada para o gene rbt5 foi obtida através de RNA antisentido e de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Esta linhagem apresentou menor sobrevivência dentro de macrófagos e em baço de camundongo, indicando que Rbt5 pode ser importante para o estabelecimento da infecção por Paracoccidioides spp. Além disso, a via redutiva de captação de ferro foi investigada neste fungo. Análises in silico apontaram que Paracoccidioides spp. possa utilizar redutases férricas, ferroxidases e transportadores de ferro e zinco para captar ferro livre ou ligado a certas moléculas, como a transferrina. Os genes codificantes para essas moléculas possivelmente envolvidas com a captação de ferro foram ativados na ausência desse metal, o que aponta para a importância dessa via em condições de privação de ferro. Genes envolvidos com a homeostase intracelular de ferro também foram investigados neste trabalho e apresentaram-se regulados pelo metal. A atividade de redutase férrica foi demonstrada para Paracoccidioides sp., porém ensaios de captação com 59Fe apontaram que a via redutiva só é funcional em condições de privação do metal e que as redutases férricas de Paracoccidioides spp. não são fortemente afetadas por platina. Moléculas de superfície envolvidas com a captação de ferro pelo fungo podem ser importantes alvos de vacinas e/ou de drogas antifúngicas. Dessa forma, este trabalho pode contribuir para o desenvolvimento de terapias alternativas para o tratamento da PCM.