Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-11-12T16:32:11Z No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-07T15:52:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-07T15:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) Previous issue date: 2006 / O fungo patogênico e dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica de maior prevalência na América do Sul. O fungo ocorre na natureza na forma de micélio, na temperatura de 26ºC, e na forma de levedura, na temperatura de 37ºC in vitro, sendo esta a forma encontrada nos tecidos de hospedeiros. A transição dimórfica da forma miceliana para a de levedura parece ser essencial para a patogênese, como também observado para outros fungos patogênicos e dimórficos. O projeto "Genoma Funcional e Diferencial do Fungo P. brasiliensis", realizado sob coordenação de nosso laboratório, foi empreendido a partir do seqüenciamento de bibliotecas de cDNA das formas de micélio e levedura cultivadas in vitro. No contexto desse trabalho, foi construída uma biblioteca de cDNA a partir do RNA total de P. brasiliensis obtido após seis horas de co-cultivo com células de macrófagos peritoneais murinos, sem qualquer cultivo adicional do fungo in vitro. A análise do perfil transcricional desse fungo a partir dessa biblioteca de cDNA, denominada PbY-MF, visa melhor compreender o padrão de expressão de genes potencialmente importantes para a adaptação e sobrevivência de P. brasiliensis no modelo de infecção. Nesse sentido, esse trabalho iniciou a caracterização do transcriptoma de P. brasiliensis recuperado de macrófagos, pelo seqüenciamento de cDNAs da biblioteca PbY-MF. A partir da submissão das seqüências ao pipeline de análise, um total de 474 ESTs de qualidade (PHRED ³ 20 e tamanho ³ 100 nt), foram geradas e analisadas. Após agrupamento pelo CAP3, essas ESTs foram agrupadas em 16 contigs e 99 singlets. Análises de similaridades empregando os bancos de dados do projeto transcriptoma de P. brasiliensis, GeneBank nr e dbEST, utilizando as ferramentas Blastn e Blastx, foram realizadas. Os resultados dessa análise revelam que 355 ESTs, agrupadas em 4 contigs e 16 singlets, apresentaram similaridades com seqüências já descritas para o fungo P. brasiliensis, sendo a maioria relacionada com genes da maquinaria traducional mitocondrial. Cinco contigs e sete singlets, ainda não descritos em P. brasiliensis, apresentaram similaridades com seqüências de outros organismos, sendo que a maioria também mostrava similaridade com genes mitocondriais que codificam proteínas da cadeia de transporte de elétrons. Das 474 ESTs analisadas no contexto desse trabalho, seis contigs e 63 singlets não apresentaram similaridades com nenhuma seqüência descrita nos bancos de dados empregados nessa análise, correspondendo a genes novos potencialmente específicos de P. brasiliensis. Em adição, nesse trabalho também foi realizada a análise de quatro contigs que apresentam similaridades com o gene de isocitrato liase (icl), o qual codifica uma proteína chave do ciclo do glioxilato, que mostra-se ativado em diferentes modelos de células de mamíferos infectadas por patógenos intracelulares facultativos. Essas contigs foram identificadas no transcriptoma de P. brasiliensis cultivado in vitro. Nesse sentido, foram realizados o seqüenciamento adicional de clones de cDNAs relacionados a essas contigs, análises de similaridade dessas seqüências e experimentos de Southern blot. Os resultados sugerem que três contigs, apresentando similaridade com uma mesma seqüência de isocitrato liase do fungo Coccidioides immitis, representam provavelmente um mesmo transcrito de P. brasiliensis, enquanto a quarta contig apresenta maior similaridade com o gene metilisocitrato liase do fungo Emericella nidulans. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracocidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Dimorphic transition is triggered by a temperature shift from the environmental 26 ºC, in which the fungus is found as a free-living mycelium, to the 37 ºC of the human host, when it changes to the pathogenic yeast form. The dimorphic transition is believed to play an essential role in pathogenesis, as described for other dimorphic pathogenic fungi. The project "Functional and Differential Genomics of the P. brasiliensis fungus", coordinated by our laboratory, has performed the sequencing of cDNA libraries from in vitro grown yeast and mycelium cells, resulting in 19,718 expressed sequence tags (ESTs) from in vitro cultivated yeast (9,941 ESTs) and mycelium (9,777 ESTs). The CAP3 clusterization software has assembled these raw sequence data into 2,655 contigs and 3,367 singlets. In order to better understand the expression of genes potentially involved in P. brasiliensis adaptation and survival in an infection model, in this work we describe the construction of a cDNA library using as template mRNA extracted from a six-hour co-culture of P. brasiliensis yeast cells and murine peritoneal macrophages, named PbY-MΦ. The sequencing of the PbY-MΦ library generated 474 ESTs that suited inclusion criteria of PHRED ≥ 20 and size greater than 100 nucleotides, which were clustered into 16 contigs and 99 singlets. BLAST-analysis against the P. brasiliensis transcritpome project, nr and dbEST databases, grouped 355 ESTs into four contigs and 16 singlets similar to previously described P. brasiliensis sequences, most of them corresponding to components of the mitochondrial translation apparatus. Five contigs and seven singlets, which were not described in P. brasiliensis, were found to be similar to sequences described in other organisms, with most of them implicated in the mitochondrial electron transport chain. Six contigs and 63 singlets were unique in that they had no homology to known sequences. In addition, we have performed a better characterization of four contigs described in the in vitro transcriptome, which were similar to the isocitrate lyase gene (icl), an enzyme of the glyoxylate cycle. Sequencing, similarity analysis and southern blotting experiments of these contigs suggest that three of them correspond to the isocitrate lyase from Coccidioides immitis, while the fourth is related to a methyl-isocitrate lyase gene from Emericella nidulans.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-05-20T15:12:33Z No. of bitstreams: 1 2014_MirelleGarciaSilva.pdf: 8419912 bytes, checksum: e5ccd631407cc5bd54f8bdefba044458 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-20T15:39:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MirelleGarciaSilva.pdf: 8419912 bytes, checksum: e5ccd631407cc5bd54f8bdefba044458 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-20T15:39:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MirelleGarciaSilva.pdf: 8419912 bytes, checksum: e5ccd631407cc5bd54f8bdefba044458 (MD5) / O gênero Paracoccidioides inclui espécies fúngicas termodimórficas, causadoras da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica endêmica da América Latina. A infecção ocorre quando propágulos micelianos ou conídios são inalados pelo hospedeiro. Após conversão para levedura nos alvéolos pulmonares o fungo pode disseminar-se para outros órgãos e tecidos. O ferro é um micronutriente essencial para todos os eucariotos, pois participa de vários processos biológicos essenciais. Entretanto, a biodisponibilidade deste metal dentro do hospedeiro é baixa. Como consequência, micro-organismos patogênicos desenvolveram mecanismos de aquisição de alta afinidade como forma de obter ferro durante a infecção. O presente trabalho descreve a aquisição de ferro mediada por sideróforos neste fungo. Análises in silico demonstraram que as espécies do gênero Paracoccidioides possuem todos os genes necessários para síntese e captação de sideróforos, os quais são produzidos em condições de depleção de ferro. Análises de cromatografia líquida de fase reversa e espectrometria de massas revelaram que Paracoccidioides spp. produz sideróforos do tipo hidroxamato. O fungo sintetiza e secreta coprogeno B, o qual gera ácido dimerúmico como produto de degradação, e também produz ferricrocina e ferricromo C como sideróforos intracelulares. Adicionalmente, Paracoccidioides spp. é capaz de crescer na presença de sideróforos como única fonte de ferro, demonstrando que além de produzir, o fungo também utiliza siderofóros para o crescimento, incluindo o xenosideróforo ferrioxamina. A exposição prévia a ferrioxamina aumentou a sobrevivência de Paracoccidioides spp. após fagocitose por macrófagos ativados. Além disso, o fungo provavelmente induz a síntese de sideróforos quando no interior destas células, demonstrando que estas moléculas provavelmente desempenham papel importante durante a interação patógeno-hospedeiro. Ademais, sideróforos produzidos por Paracoccidioides spp. podem ser utilizados como fontes de ferro por Aspergillus nidulans. Em conjunto, estes dados demonstraram que a síntese e a utilização de sideróforos são mecanismos empregados por Paracoccidioides spp. para superar a limitação de ferro. Como a escassez deste micronutriente é encontrada no hospedeiro, a produção de sideróforos está provavelmente relacionada à patogenicidade e virulência do fungo e representa um possível alvo para terapia com antifúngicos levando-se em consideração a ausência de tal via em humanos. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The genus Paracoccidioides includes termodimorphic fungal species which causes paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis endemic in Latin America. The infection occurs when mycelium propagules or conidia are inhaled by the host. After conversion to yeast in the alveoli the fungus may disseminate to other organs and tissues. Iron is an essential micronutrient for all eukaryotes, since it participates in a variety of essential biological processes. However, the bioavailability of this metal is low inside the host. As a consequence, pathogenic microorganisms evolved high affinity acquisition mechanisms to obtain iron during infection. Here we describe the siderophore mediated iron acquisition in this fungus. In silico analysis demonstrated that species from Paracoccidioides genus possess all the necessary genes for synthesis and uptake of siderophores, which are produced under iron limiting conditions. Reversed phase liquid chromatography and mass spectrometry analysis revealed that Paracoccidioides spp. produce siderophores of hydroxamate type. The fungus synthesizes and secretes coprogen B, which generates dimerumic acid as a breakdown product, and also produces ferricrocin and ferrichrome C as intracellular siderophores. Moreover, Paracoccidioides spp. is able to grow in presence of siderophores as the only iron sources, demonstrating that beyond producing, the fungus also utilizes siderophores for growth, including the xenosiderophore ferrioxamine. Previous exposure to ferrioxamine increased Paracoccidioides spp. survival following phagocytosis by activated macrophages. Moreover, the fungus probably induces siderophore synthesis inside these cells, demonstrating that these iron chelators play an important role during host-pathogen interaction. Additionally, siderophores produced by Paracoccidioides spp. can be utilized as iron sources by Aspergillus nidulans. Altogether, these data demonstrated that synthesis and utilization of siderophores are mechanisms employed by Paracoccidioides spp. to surpass iron limitation. As iron paucity is found within the host, siderophore production may be related to fungus pathogenicity and virulence and represents a possible target for antifungal therapy since these pathway is absent in humans.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-21T21:29:13Z No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-21T21:32:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-21T21:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo patogênico humano, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). P. brasiliensis apresenta dimorfismo térmico, apresentando-se sob a forma miceliana a temperaturas inferiores a 28 ºC e sob a forma leveduriforme no hospedeiro humano e em temperaturas superiores à 28 ºC. Proteases são enzimas que clivam proteínas e desempenham funções como o processamento intracelular e a clivagem de proteínas do meio extracelular para obtenção de nitrogênio. Em microrganismos patogênicos proteases podem atuar como fatores de virulência, clivando proteínas do hospedeiro para facilitar a penetração pelos tecidos. No presente trabalho, foi realizado o rastreamento e identificação de proteases em banco de dados de ESTs oriundas de células leveduriformes de P. brasiliensis. Foram detectadas 53 ORFs codificantes para proteases. As seqüências preditas de aminoácidos foram obtidas e classificadas por homologia em banco de dados de proteases, sendo agrupadas em 3 aspartil, 8 cisteíno proteases, 10 metalo-, 10 serino proteases e 22 proteínas relacionadas às subunidades proteassomais. O presente trabalho inclui também o rastreamento e a identificação de ESTs codificantes de proteínas relacionadas à síntese e ao processamento de proteínas em banco de dados de ESTs oriundas de células de P. brasiliensis durante a transição dimórfica de micélio para levedura por 22 horas. Foram identificadas 200 ORFs apresentando homologia com seqüências codificantes a proteínas relacionadas aos processos de síntese e processamento de proteínas. Destas, 16 ORFs codificam para genes não descritos anteriormente em P. brasiliensis. Foi possível identificar ESTs que compõem subunidades ribossomais, assim como fatores de iniciação transcricional induzidos durante a transição dimórfica, sugerindo um aumento no nível de proteínas sintetizadas durante este processo. Também foram identificadas ESTs codificantes para chaperonas, para glicosiltransferases e para proteínas relacionadas com a aceleração do enovelamento de proteínas, sugerindo aumento da produção e do controle de qualidade durante a transição dimórfica de micélio para células leveduriformes. Alguns genes codificantes para proteases são induzidos após a indução da transição termodimórfica: uma aspartil protease A01, uma lon protease S16 e uma metaloprotease M28, o que sugere aumento dos processos de controle de qualidade das proteínas produzidas e da aquisição de aminoácidos do meio extracelular. Uma serino protease S08 foi caracterizada. As seqüências de nucleotídeos (Pbsp) e aminoácidos (PbSP) foram obtidas e analisadas. O cDNA codificante para Pbsp foi clonado em vetor de expressão para sistema bacteriano e a proteína recombinante foi utilizada para obtenção de anticorpo policlonal em camundongos. O anticorpo policlonal reconheceu especificamente uma espécie protéica de 66 kDa em extrato protéico e em sobrenadante de cultura de células leveduriformes de P. brasiliensis, sugerindo que PbSP seja uma molécula secretada. Ensaios de deglicosilação in vitro com endoglicosidase H demonstraram que PbSP é uma molécula N-glicosilada. PbSP tem seu nível de expressão induzido durante a privação de nitrogênio tanto em extrato protéico quanto em sobrenadante de cultura de células leveduriformes de P. brasiliensis, sugerindo que PbSP tenha importância na captação de nitrogênio. A expressão de Pbsp é aumentada durante a internalização de células leveduriformes por macrófagos murinos, sugerindo a importância do produto deste gene na resposta adaptativa de P. brasiliensis à internalização por macrófagos. A interação de PbSP com moléculas de P. brasiliensis foi avaliada utilizando o sistema de duplo-híbrido em Saccharomyces cerevisiae. Proteínas relacionadas com enovelamento protéico, controle de qualidade e destinação de proteínas, além de uma proteína de parede celular de P. brasiliensis foram identificadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a human pathogenic fungus, the causative agent of paracoccidioidomycose (PCM). P. brasiliensis is a thermodimorphic fungus presents as mycelium form in temperatures below 28º C and as yeast form in the human host and in temperatures above 28ºC. Proteases are enzymes that cleave proteins and are related to the intracellular protein processing and cleavage of extracellular proteins to nitrogen acquisition. In pathogenic microorganisms proteases could act as virulence factors by cleaving host proteins facilitating the invasion process in the host tissues. The present work identified proteases in ESTs database constructed with cDNAs sequences of P. brasiliensis yeast form. It was detected 53 ORFs encoding proteases. The predicted amino acids sequences were obtained and classified by homology in protease database: 3 sequences were classified as aspartil, 8 as cysteine, 10 as metallo-, 10 as serino and 22 proteins related to proteasomal subunits. The present work also includes the identification of ESTs encoding proteins related to protein synthesis and processing in ESTs database of P. brasiliensis during transition from mycelium to yeast cells. It was identified 200 ORFs presenting homology to sequences encoding proteins related to protein synthesis and processing. Sixteen ORFs were described as novel genes of P. brasiliensis. It was identified ESTs related to ribosomal subunits and initiation transcription factors, suggesting intense synthesis of new ribosome particles, affecting the rate of protein synthesis. It was identified ESTs encoding chaperones, glycosiltransferases and proteins related to acceleration of protein folding, suggesting high protein production and high quality control in the protein production during transition from mycelium to yeast cells in P. brasiliensis. Transcripts encoding proteases were induced in P. brasiliensis during transition from mycelium to yeast: an aspartil protease A01, a lon protease S16 and a metaloprotease M28. The higher expression of these genes during transition in P. brasiliensis suggests high control quality of proteins and nitrogen acquisition. A serine protease S08 was characterized. The cDNA (Pbsp) and deduced amino acids (PbSP) sequences were obtained and analyzed. Pbsp was cloned into expression vector in bacterial system and used to generate polyclonal antibody in mice. The polyclonal antibody recognized specifically a 66 kDa protein species in protein extracts and culture supernatants of P. brasiliensis yeast cells, suggesting PbSP is a secreted molecule. In vitro deglycosylation assays with endoglycosidase H demonstrated that PbSP is a N-glycosylated molecule. PbSP is increased during nitrogen starvation both in protein extracts and cultures supernatants of P. brasiliensis yeast cells, suggesting PbSP is important in nitrogen acquisition. Pbsp expression was induced during internalization of P. brasiliensis yeast cells by murine macrophages, suggesting the Pbsp product is important in the P. brasiliensis adaptative response to macrophage internalization. PbSP interaction with P. brasiliensis proteins was evaluated by two-hybrid assay in Saccharomyces cerevisiae. Proteins related to protein folding, quality control of translation, protein destination and a cell wall protein of P. brasiliensis were identified.

Carrapatos são artrópodos hematófagos com ampla distribuição mundial, sendo capazes de parasitar quase todos os animais vertebrados terrestres. Estes parasitos causam grandes impactos em saúde pública e na produção animal por serem vetores de diversas doenças infecciosas e, também, pelos distúrbios diretos associados ao parasitismo. O Ornithodoros brasiliensis, conhecido popularmente como carrapato mouro, é uma espécie de carrapato somente encontrada no Brasil, e com distribuição restrita à região dos Campos de Cima da Serra no Rio Grande do Sul (RS). Desde os primeiros relatos, O. brasiliensis tem sido considerado um potencial risco à saúde pública no RS devido a ocorrência de parasitismo em humanos. Somado a isto, alguns relatos indicam que sua picada é capaz de induzir distúrbios locais e sistêmicos severos nas pessoas e animais parasitados, possivelmente enquadrando-se na definição de toxicose induzida pela picada de carrapatos. Depois de mais de 50 anos sem relatos sobre O. brasiliensis, recentemente, novos casos de parasitismo humano e animal foram observados na mesma região onde este carrapato foi originalmente descrito. O objetivo deste trabalho é caracterizar o parasitismo pelo carrapato O. brasiliensis, bem como a síndrome tóxica desencadeada nos hospedeiros parasitados. Com esta finalidade, neste trabalho realizamos: (i) um estudo epidemiológico sobre o parasitismo por O. brasiliensis, determinando sua prevalência em propriedades situadas nos municípios de São Francisco de Paula e Jaquirana (regiões de ocorrência natural), descrevendo características de seu habitat e determinando possíveis fatores de risco associados à sua ocorrência; (ii) a descrição de casos retrospectivos de parasitismo em humanos e animais domésticos; (iii) a descrição de um caso clínico de toxicose induzida por O. brasiliensis em cão naturalmente parasitado; (iv) a caracterização clínico-patológica do parasitismo e da toxicose experimentalmente induzida pela picada de O. brasiliensis em ratos; (v) a caracterização dos efeitos do conteúdo salivar sobre o processo de cicatrização in vivo e sobre células endoteliais. Entre as propriedades incluídas na amostragem, em 16,7% foram coletados exemplares de O. brasiliensis. O. brasiliensis foram encontrados perto das habitações humanas e enterrados no solo em pequenas áreas com grande densidade de parasitos, em uma espécie de “ninho”. A análise dos fatores de risco demonstrou que somente duas das 17 variáveis estudadas (falta de higiene e a presença de porão com chão de terra na propriedade) aumentam a probabilidade de ocorrência deste carrapato. Foram identificadas 28 pessoas e 11 cães previamente parasitados. A partir de relatos foi possível identificar os principais sintomas associados ao parasitismo: prurido, eritema, edema, dor, lesão de lenta cicatrização. Evidências indicam que, além do homem e do cão, Conepatus chinga (zorrilho) e Dasypus hybridus (tatu-mulita) podem servir de hospedeiros. A síndrome associada à picada do O. brasiliensis foi caracterizada em detalhes através do registro do progresso clínico de um cão naturalmente exposto ao carrapato, e em ratos experimentalmente infestados. Os achados decorrentes destas observações são compatíveis entre si e com as descrições dos casos retrospectivos em humanos, e evidenciam a severidade do quadro induzido pela picada de O. brasiliensis. Por fim, foi demonstrado que o extrato de glândula salivar de O. brasiliensis inibe a cicatrização in vivo, possivelmente por inibir a proliferação endotelial e por ser citotóxico. Esta atividade relaciona-se diretamente a uma das características marcantes da picada por O. brasiliensis: a indução de uma lesão de lenta cicatrização. O conjunto dos resultados aqui mostrados fornece novos subsídios para a compreensão das peculiaridades evolutivas, de habitat, biológicas e ecológicas do O. brasiliensis, bem como dos efeitos desencadeados pelo seu parasitismo. / Ticks are blood-sucking arthropods distributed worldwide and able to parasitize almost all terrestrial vertebrate animals. Ticks are considered a great hazard for both public health and animal breeding due to their ability to transmit infectious diseases and to induce direct toxic effects leading to clinical disturbances. Ornithodoros brasiliensis, popularly known as mouro tick, is a specie only found in highlands region of Rio Grande do Sul state, Southern Brazil. Since initial reports, O. brasiliensis is considered a potential public health hazard in Rio Grande do Sul state due to the possibility of human parasitism. In addition, few reports indicate that O. brasiliensis bite is able to induce severe local and systemic disturbances in humans and animals. This clinical profile possibly fits in the definition of tick toxicosis syndrome. After more than 50 years without reports about O. brasiliensis, new cases of human and animal parasitism were recently reported in the same region of its original description. This work aimed to describe the characteristics of O. brasiliensis parasitism, as well as the toxicosis observed in bitten hosts. Thus, we performed: (i) an epidemiological study about O. brasiliensis parasitism in farms located in the municipalities of São Francisco de Paula and Jaquirana (endemic region) to determine its prevalence and risk factors, and also, to describe the characteristics of its habitat; (ii) an analysis of retrospective cases of human and animal parasitism; (iii) the report of a clinical case of tick toxicosis in a dog naturally parasitized; (iv) a clinico-pathological characterization of the toxicosis induced in experimentally bitten rats; (v) the evaluation of salivary glands effects on skin wound healing. in vivo and upon endothelial cells. Specimens of O. brasiliensis were collected in 16.7% of sampled farms. Ticks were found near human houses and buried in sand. They were found in a very restricted area and in great density, in a kind of tick “nest”. Risk factor analysis showed that only two of the 17 studied variables (insufficient sanitary conditions and presence of house basement with sand floor) were significantly associated with an increased probability to find O. brasiliensis. Twenty-eight people and eleven bitten dogs were identified by analysis of retrospective cases. This analysis also showed the most common symptoms associated to parasitism (pruritus, erythema, edema, pain and slow healing lesion). Our results indicate that in addition to human and dogs, Conepatus chinga (hog-nosed skunk) and Dasypus hybridus (long nosed armadillo) may serve as potential hosts. The toxicosis syndrome induced by tick bite was characterized registering the clinical progress of a naturally bitten dog, and in experimentally infested rats. The clinical findings both in the dog and in rats were similar, and also were compatible with the symptoms reported by bitten humans. The set of all clinical findings evinced the clinical severity of this syndrome. Finally, it was shown that salivary gland extract inhibit in vivo wound healing, possibly due to inhibition of endothelial cell proliferation and cytotoxicity. This biological activity may explain one of the most common symptoms of O. brasiliensis bite: the induction of a slow healing lesion. The set of all results showed here gives new evidences for the understanding of habitat distribution, biology, ecology and peculiarities of O. brasiliensis, as well as for the clinical signs induced by its parasitism.

Muitos estudos têm demonstrado que extratos de Agaricus brasiliensis têm atividade citotóxica e antimutagênica, estes efeitos foram relacionados à β-glicana, um polissacarídeo constituinte de parede celular presente em um grande numero de organismos. No entanto, os mecanismos pelos quais este composto atua ainda não foram elucidados. O propósito deste trabalho foi identificar as possíveis vias de sinalização celular pelas quais a β-glicana induz os seus efeitos. Nós empregamos o inibidor da Proteína Cinase Ativada por Mitógeno p38 (MAPK p38) para avaliar a possível participação desta proteína de sinalização celular nas atividades citotóxica e antimutagênica da β-glicana. Os efeitos da β-glicana sobre a citotoxicidade (Sulforhodamine B – SRB – e thiazolyl blue tetrazolium bromide – MTT), antimutagênese (Micronúcleos), ciclo celular (Citometria de fluxo) e indução de apoptose (Vybrant® Apoptosis Assay Kit) foram verificados na linhagem celular H460 (Adenocarcinoma de efusões pleurais). Citotoxicidade foi observada com altas concentrações do polissacarídeo, porém estas concentrações não induziram a apoptose pelo ensaio Vybrant®. No entanto, as mesmas concentrações levaram a um grande acumulo de células em G2/M, indicando que a citotoxicidade da β-glicana resulta de sua capacidade de induzir a paradas de G2/M que podem inibir a proliferação celular. Por outro lado, concentrações não citotóxicas exibiram efeito antimutagênico, reduzindo o dano ao DNA induzido pelo MMS e permitindo a progressão do ciclo celular. Além disso, tanto a antimutagênese quanto a citotoxicidade da β-glicana foram inibidas pelo uso do inibidor da MAPK p38, demonstrando que estas duas diferentes atividades são dependentes de uma mesma via de sinalização celular. / Many studies have demonstrated that Agaricus brasiliensis has cytotoxic and antimutagenic activities; these effects were related to ß-glucan, a polysaccharide constituent of the cell wall present in a large number of organisms. However, the exact mechanisms by which ß-glucan acts are not yet elucidated. The purpose of this work was to better undestand the possible signaling pathways by which ß-glucan carries its effects. We employed a p38 Mitogen Activated Protein Kinase (p38 MAPK) inhibitor (SB 202190) to evaluate the possible involvement of this signaling protein in the antimutagenic and cytotoxic activities of ß-glucan. Its effects on cytotoxicity (Sulforhodamine B – SRB – e thiazolyl blue tetrazolium bromide – MTT), antimutagenesis (Micronucleus assay), cell cycle progression (Flow Cytometry) and apoptosis induction (Vybrant® Apoptosis Assay Kit) were evaluated in H460 (human, pleural effusion, adenocarcinoma) cell line. Cytotoxicity was only observed at high concentrations of the polysaccharide. These concentrations did not induce a significant induction of apoptosis. However, these same concentrations trigger a high G2/M arrest, indicating that cytotoxicity of ß-glucan in H460 results from its capacity to induce cell cycle arrest that could prevent cell proliferation. On the other hand, low concentrations showed antimutagenesis effect, reducing MMS-induced DNA damage and allowing cell cycle progression. Besides, both antimutagenesis and cytotoxicity were greatly abrogated by the use of p38MAPK inhibitor, showing that these different activities are dependent on the same signaling pathway.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), que acomete preferencialmente o pulmão, sendo este um dos poucos órgãos que está em continua e intensa interação com o meio ambiente e o sistema imune. O grande desafio para o sistema imune pulmonar é discriminar o que é nocivo e reagir de acordo. As células dendríticas (DCs) são apresentadoras de antígenos \"profissionais\" capazes de fazer o processamento do antígeno e a apresentação de peptídeos a linfócitos T e são ideais para manter este equilíbrio delicado entre a tolerância e uma resposta imune efetora. Sabendo da importância dessas células no sistema imune e que a infecção por P. brasiliensis ataca preferencialmente o pulmão, células de lavado broncoalveolar (BAL), após infecção experimental com leveduras de P. Brasiliensis, foram analisadas. Nós observamos um significante aumento de DCs no BAL após 24hrs da infecção intratraqueal com 104 leveduras de P. brasiliensis. A caracterização das DCs mostraram que essas células expressaram CD11c, MHC-II e DEC205. A fim de verificar a capacidade de migração das DCs, as mesmas foram diferenciadas a partir de células de medula óssea e pulsadas com leveduras de P. brasiliensis, marcadas com CFSE e injetadas intratraquealmente em camundongos. Como controle negativo, utilizamos PBS e DCs não pulsadas com o fungo. Os resultados mostraram, que após 12 horas de infecção, as DCs (CFSE+CD11c+), migraram para os linfonodos torácicos. No entanto, a quantidade destas células diminui discretamente após 24 horas de infecção. Além disso, não observamos DCs nos linfonodos regionais, quando analisamos os grupos controle. Dessa forma, as células pulmonares também foram marcadas in vivo injetando-se intratraquealmente o corante CFSE juntamente com leveduras de P. brasiliensis. Verificamos que após 12 horas, as DCs pulmonares, dos animais infectados com o fungo, migraram para os linfonodos regionais. Esses resultados comprovam que o fungo P. brasiliensis foi capaz de ativar as DCs, induzindo sua migração para linfonodos regionais, e induziu nesse órgão uma resposta por células T evidenciada pela produção preferencial de IL-10. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), which mainly affects the lungs. They are one of the few organs that are in constant and intense interaction with the environment and the immune system. The great challenge for the pulmonary immune system is to discriminate what is harmful and react accordingly. Dendritic cells (DCs) are \"professionals\" antigen-presenting cells and they can do the antigen processing. They can also do the presentation of peptides to T lymphocytes and are ideal for maintaining this delicate balance between tolerance and an effector immune response. Knowing the importance of these cells in the immune system and that the infection by P. brasiliensis preferentially attacks the lungs, cells from bronchoalveolar lavage (BAL), after experimental infection with yeasts of P. Brasiliensis, were analyzed. We observed a significant increase of DCs in BAL after 24 hours of intratracheal infection with 104 of yeast cells of P. brasiliensis. The characterization of these cells showed that DCs expressed CD11c, MHC-II and DEC205. In order to verify the ability of migration of DCs, they were differentiated from bone marrow cells and pulsed with yeasts of P. brasiliensis, they were also labeled with CFSE and injected intratracheally into mice. As a negative control, we used PBS and DCs that were not pulsed with the fungus. The results showed that after 12 hours of infection, the DCs (CFSE + CD11c +), migrated to the thoracic lymph nodes. However, the quantity of these cells decreases slightly after 24 hours of infection. Furthermore, we observed no DCs in regional lymph nodes when we analyzed the control groups. Thus, the lung cells were also labeled in vivo by injecting the CFSE dye intratracheally with yeasts of P. brasiliensis. We found that after 12 hours, pulmonary DCs of the animals infected with the fungus migrated to regional lymph nodes. These results indicate that the fungus P. brasiliensis was able to activate DCs, inducing their migration to regional lymph nodes, and inducing a response in that organ by T cells as evidenced by preferential production of IL-10.

Entre as estratégias que os protozoários do gênero Leishmania apresentam para o escape da resposta imune do hospedeiro vertebrado, há a ocorrência de um tipo de morte celular programada, conhecida como apoptose. Quando em contato com o macrófago, a Leishmania é fagocitada de forma silenciosa, evitando a resposta inflamatória do hospedeiro vertebrado. Alguns autores defendem que a Leishmania mimetiza a apoptose, expondo entre outras moléculas um fosfolipídio que sinalizaria para o macrófago que está em apoptose, e esse mecanismo é denominado na literatura como mimetismo apoptótico. O objetivo desta tese foi elucidar como ocorre esse escape com o enfoque nos fosfolipídios presentes e expostos em parasitas mutantes de L. (L.) amazonensis com características fenotípicas distintas, utilizando diferentes estratégias: transfecção com cosmídeos contendo frações do genoma de L. (L.) amazonensis; identificação e clonagem do gene pi4k contido no cosmídeo em vetor de expressão em Leishmania; seleção de parasitas resistentes a miltefosina, mantidos ou não sob pressão do antibiótico, seleção de parasitas na 28a passagem em cultura; seleção de parasitas purificados de macrófagos de linhagem RAW. A caracterização desses mutantes foi realizada em relação à ligação de anexina V-FITC, infectividade em macrófagos da linhagem RAW, tomada de fosfolipídios fluorescentes (NBD), IC50 de células tratadas com os antibióticos duramicina, miltefosina e anfotericina B. De acordo com os ensaios de ligação à anexina V-FITC, identificamos que os mutantes pi4k-pSNBR e os mutantes resistentes à miltefosina apresentaram maior ligação à anexina V-FITC. O gene que codifica a fosfatidilinositol (PI) 4-kinase, fez com que os parasitas que continham tanto o cosmídeo como o superexpressor pi4k, apresentassem menor infectividade em relação ao controle selvagem. O mesmo ocorreu para os parasitas resistentes à miltefosina. Em contrapartida, os parasitas derivados desses resistentes, mas mantidos sem pressão do antibiótico, recuperaram os valores de infectividade comparáveis ao grupo controle. Interessante é que os parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão, assim como o parasita superexpressor do gene pi4k apresentaram maior ligação à anexina V-FITC em relação ao controle selvagem, indicando que a ligação à anexina V-FITC não se correlaciona com infectividade. Parasitas resistentes à miltefosina, mantidos ou não sob pressão apresentaram maior sensibilidade à duramicina, e quando tratados com anfotericina B, esses parasitas apresentaram maior resistência. Uma outra abordagem analisada nessa tese foi elucidar qual o fosfolipídio é reconhecido pelo macrófago durante a infecção por L. (L.) amazonensis. Como resultado, observamos que os lipossomas contendo PC levam à diminuição dose-dependente da infecção, o que não foi visto em PS ou PC:PE. Esse resultado sugere a importância de PC para o estabelecimento da infectividade. / Among the strategies that Leishmania protozoans present to escape the immune response of the vertebrate host, there is a type of programmed cell death, known as apoptosis. When in contact with the macrophage, Leishmania is phagocytized in a silent manner, avoiding the inflammatory response of the vertebrate host. Some authors argue that Leishmania mimics apoptosis, exposing among other molecules a phospholipid that would signal to the macrophage that is in apoptosis, and this mechanism is denominated in the literature as apoptotic mimicry. The objective of this thesis was to elucidate how this escape occurs with the focus on the phospholipids present and exposed in mutant parasites of L. (L.) amazonensis, with distinct phenotypic characteristics, using different strategies, such as selection of parasites showing higher attachment to annexin V-FITC. After transfection with cosmids containing the genome of L. (L.) amazonensis; identification and cloning of the pi4k gene contained in the cosmid in Leishmania expression vector; selection of parasites resistant to miltefosine, whether or not under antibiotic pressure, selection of parasites at the 28th passage in culture; selection of purified strains of RAW lineage macrophages. The characterization of these mutants was performed in relation to the annexin V-FITC binding, infectivity in RAW lineage macrophages, fluorescent phospholipid (NBD) uptake, IC50 of cells treated with the antibiotics duramycin, miltefosine and amphotericin B. According to the binding assays to Annexin V-FITC, we have identified that pi4k-pSNBR mutants and miltefosin-resistant mutants showed higher attachment to annexin V-FITC. The gene coding for phosphatidylinositol (PI) 4-kinase caused the parasites containing both the cosmid and the pi4k superexpressor to have less infectivity than the wild-type control. The same occurred for parasites resistant to miltefosine. In contrast, the parasites derived from these resistant, but kept without antibiotic pressure, recovered infectivity values, comparable to the control group. Interestingly, miltefosine-resistant parasites, whether or not under pressure, as well as the overexpressing parasite of the pi4k gene showed greater attachment to annexin V-FITC over wild-type control, indicating that attachment to annexin V-FITC does not correlate with infectivity. Parasites resistant to miltefosine, whether or not under pressure, showed greater sensitivity to duramycin, and when treated with amphotericin B, these parasites showed greater resistance. Another approach analyzed in this thesis was to elucidate the phospholipid recognized by the macrophage during infection by L. (L.) amazonensis. As a result, we observed that PC-containing liposomes lead to dose-dependent decrease of infection, which has not been seen in PS or PC: PE. This result suggests the importance of PC for the establishment of infectivity.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica de natureza profunda e granulomatosa, que afeta preferencialmente o tecido pulmonar causada pelo Paracoccidioides brasiliensis, um fungo que exibe dimorfismo térmico. O P. brasiliensis interage com células apresentadoras de antígenos (APCs), alterando suas principais funções biológicas. Entre as APCs, os macrófagos são células que desempenham um papel importante na indução e regulação da resposta imune e/ou inflamatória. São células do sistema fagocítico mononuclear que podem discriminar entre o que é próprio do organismo e os patógenos, através da expressão de receptores de reconhecimento padrão (PRR) que reconhecem padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs), sendo células importantes no processo de fagocitose controlando o crescimento destes patógenos. Recentemente tem sido demonstrada a importância dos receptores Notch na regulação da atividade de macrófagos e do sistema imune. Os ligantes de Notch estão envolvidos nas locais inflamatórios de infecção devido ao aumento da expressão dos mesmos na superfície de células envolvidas neste processo. Considerando que a sinalização Notch pode estar envolvida na modulação da função de macrófagos, nós avaliamos se P. brasiliensis tem a capacidade de modular a ativação desta via e interferir na produção de citocinas pró-inflamatórias. Para isso, macrófagos J774, pré-estimulados com LPS ou não, foram interagidos com leveduras do fungo, seguido por análise de PCR em tempo real e citometria de fluxo, dosagem de citocinas e índice de fagocitose. Nossos dados revelaram que na presença do fungo existe aumento dos níveis de transcrição do receptor Notch 1 e diminuição da transcrição do ligante Delta 4 em macrófagos pré-estimulados com LPS. Entretanto, verificamos que o fungo sozinho não é capaz de induzir a transcrição de NF-κB, nem na presença do LPS, mas quando os macrófagos são estimulados com LPS e sofrem inibição da via de Notch existe aumento dos níveis de transcritos após interação com o fungo, sugerindo que esse fator é ativado na ausência de Notch. Nesse contexto de inibição de Notch, evidenciamos que a fagocitose de leveduras do fungo por macrófagos tornou-se mais eficiente, visto que houve aumento do índice de fagocitose na ausência de Notch. Foi possível verificar que o fungo tem a capacidade de promover a produção de IL-6 via TLR-Notch, fazendo-nos supor que essa citocina seja importante para o estabelecimento da doença ao ser benéfica para o fungo e prejudicar o hospedeiro. E concomitantemente ao aumento de IL-6 existe diminuição da produção de TNF-α. Com base nesses resultados, podemos sugerir que o P. brasiliensis utiliza a via de sinalização Notch como um mecanismo de escape. A interação entre as leveduras do fungo e os macrófagos promove a ativação dessa via, através do receptor Notch 1, induzindo maior produção de IL-6, citocina importante para o crescimento do fungo no hospedeiro, conjuntamente com a diminuição de TNF-α prejudicando a atividade fungicida dos macrófagos. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis and deep granulomatous in nature, which affects mainly the lung tissue caused by Paracoccidioides brasiliensis, a fungus that exhibits thermal dimorphism. The P. brasiliensis interacts with antigen presenting cells (APCs), changing its main biological functions. Among the APCs, macrophages are cells that play an important role in the induction and regulation of the immune response and/or inflammatory response. They are cells of the mononuclear phagocytic system that can discriminate between what is characteristic of the organisms and pathogens, by expression of pattern recognition receptors (PRR) that recognizes the pathogen-associated molecular pattern (PAMPs), and are considered cells important in phagocytosis for controlling the growth of these pathogens. It has been recently demonstrated the importance of the Notch receptor in regulating the activity of macrophages and of the immune system. The ligands of Notch are involved in inflammatory sites of infection because there are increased expression of these ligands on cell surface involved in this process. Whereas the Notch signaling may be involved in modulating macrophage function, we evaluated whether P. brasiliensis has the ability to modulate the activation of this pathway and interfere with the production of pro-inflammatory cytokines. For this, J774 macrophages, pre-stimulated with LPS or not, are interacted with yeast fungus, followed by Real Time PCR analysis and flow cytometry, cytokine and phagocytosis index. Our data showed that the presence of the fungus exists increased levels of transcription of the Notch 1 receptor, and a decrease in ligand Delta 4 transcription on macrophages pre-stimulated with LPS. However, we found that the fungus itself is not able to induce transcription NF-κB, even in the presence of LPS, but when macrophages are stimulated with LPS and suffer inhibition of the Notch signaling, exists increased levels of transcripts after interaction with the fungus, suggesting that this factor is activated in the absence of Notch. Within the context of inhibition of Notch, we found that phagocytosis of yeasts by macrophages become more efficient, since the increased rate of phagocytosis in the absence of Notch. It was verified that the fungus has the ability to promote the production of IL-6 via TLR-Notch, making us suppose that this cytokine is important for the establishment of the disease to be beneficial for the fungus and damage the host. And concurrently with increased IL-6 there is decreased production of TNF-α. Based on these results, we suggest that P. brasiliensis uses the Notch signaling pathway as an escape mechanism. The interaction between the yeasts with macrophages promotes the activation of this pathway, by means of a Notch 1 receptor, inducing increased production of IL-6 cytokine important for the growth of fungus on host, together with a reduction of TNF-α, contributing with a damaging fungicidal activity of macrophages.

O reconhecimento eficiente do fungo Paracoccidioides brasiliensis pelos receptores do sistema imune inato do hospedeiro é essencial para a proteção contra a paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica prevalente na América Latina. Diferente dos receptores do tipo Toll (TLRs),os receptores do tipo Nod-like (NLRs) são proteínas citoplasmáticas com capacidade de formar uma plataforma molecular denominada inflamassoma. Esta plataforma ativa caspase-1 e desencadeia a produção de IL-1? e IL-18. O inflamassoma de NLRC4 regula a resposta imune contra bactérias intracelulares através do reconhecimento de flagelina. No entanto, mesmo na ausência desta molécula, a bactéria Shigella flexneri é capaz de ativar o inflamassoma de NLRC4, o que sugere a existência de outros agonistas. Trabalhos recentes mostraram que o inflamassoma de NLRC4 tem papel importante no controle da infecção por Candida albicans. Contudo, sua participação na infecção por P. brasiliensis é uma incógnita. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a participação do inflamassoma de NLRC4 na paracoccidioidomicose experimental. Os resultados obtidos demonstram que durante a infecção experimental por P. brasiliensis,macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) provenientes de animais Nlrc4-/- produzem mais IL-1? do que BMDM de animais controles. Não foram detectadas diferenças significativas quanto aos níveis de TNF- ? em ambos os grupos. Para investigar o mecanismo responsável pelo aumento da produção de IL-1? por BMDM de camundongos Nlrc4-/-, as expressões do gene Nlrp3 e Nlrc4 foram avaliadas por qPCR durante, 0, 2, 6, 12, e 24 horas após a infecção. Comparado aos camundongos WT, BMDM de animais Nlrc4-/- exibiram um aumento na expressão de Nlrp3 durante as primeiras 12 horas de infecção. Surpreendentemente, 24 horas após a infecção, um aumento na expressão do gene de Nlrc4 foi detectado em BMDM de animais Nlrp3-/-, comparado ao controle. Estes resultados sugerem que o inflamassoma de NLRC4 reprime a atividade do inflamassoma de NLRP3, e consequentemente, anula a produção de IL-1? em macrófagos estimulados por P. brasiliensis. Além disso, camundongos Nlrc4-/- exibiram um aumento na produção de IL-1? e redução na produção de IL-18 aos7 dias após a infecção in vivo. Em contraste, a produção de IL-1? foi menor e a produção de IL-18 aumentou aos 30 dias após a infecção.Comparado ao grupo controle observamos menor carga fúngica, formação de granulomas bem definidos e compactos e redução na fibrose em pulmões de camundongos Nlrc4-/- aos 30 dias após infecção. Adicionalmente, observamos aumento na produção de citocinas do perfil Th1 (IFN-?, IL-12p40) e níveis reduzidos de IL-10. Em conclusão, estes dados mostram que o inflamassoma NLRC4 tem papel importante na suscetibilidade do hospedeiro durante a infecção por P. brasiliensis. / The efficient recognition of P. brasiliensis fungal cells by immune system receptors is essential for protection against paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in Latin America. Different from the Toll-like receptors (TLRs), NOD-like receptors (NLRs) are cytoplasmic proteins able to form the molecular platform, denominated inflammasome. This platform activates caspase-1 and triggers the production of IL-1? and IL-18. The NLRC4 inflammasome regulates the immune response against intracellular bacteria through recognition of flagellin. However, even in the absence of this structure, the bacteria Shigella flexneri activates the NLRC4 inflammasome, suggesting the existence of other agonists. It is known that NLRC4 control the Candida albicans infection. Therefore, in this study we evaluated the participation of NLRC4 inflammasome in experimental paracoccidioidomycosis. Our data demonstrated that Nlrc4-/- BMDMs produces more IL-1? than WT BMDMs during P. brasiliensis infection. No differences were detected regarding to TNF-? levels in both groups. To investigate the mechanism responsible to improvement of IL-1? production by Nlrc4-/- BMDMs, the nlrp3 and nlrc4 gene expression were evaluated by qPCR during 2, 6, 12 and 24 hours post infection. Compared to WT mice, the expression of nlrp3 was increased in Nlrc4-/- BMDMs during the first 12 hours of infection. Surprisingly, at 24 hour post infection and nlrc4 exhibited increased expression in Nlrp3-/- BMDMs, compared to WT controls. These data suggest that NLRC4 represses NLRP3 inflammasome activity, and consequently, abrogates the IL-1B production by P.brasiliensis estimuled macrophages. Furthermore, Nlrc4-/- mice exhibited an increased production of IL-1? and decreased production IL-18 at 7 days post infection in vivo. In contrast, there was a decrease in the production of IL-1? and increased production of IL-18 at 30 days post infection. Compared to controls, we observed lower fungal load, the formation of well-defined and compact lung granulomas, and decreased fibrosis in the lungs of Nlrc4-/- mice after 30 days post infection. In addition, we observed increased production of Th1 cytokine profile (IFN-?, IL-12p40) and reduced levels of IL-10. In conclusion, these data show that NLRC4 inflammasome play an important role on the host susceptibility during P. brasiliensis infection.

A esporotricose é uma doença crônica que envolve o tecido subcutâneo afetando seres humanos e animais, causada pelo fungo termodimórfico Sporothrix spp.. A esporotricose é endêmica na América latina, principalmente no Brasil que teve o maior surto zoonótico já registrado, ocorrendo na cidade do Rio de Janeiro. A espécie Sporothrix brasiliensis é a mais diagnosticada no surto e a mais virulenta entre as especies de Sporothrix spp., causando formas mais graves da doença. A esporotricose em gatos é endêmica, fatal e um dos principais fatores pelo alto número de casos no Rio de Janeiro. O tratamento é longo e não vem sendo o suficiente para conter o número de casos da doença. Uma vacina contra a esporotricose poderia mudar esse paradigma no Brasil. O presente trabalho obteve o proteoma da cepa S. brasiliensis 5110 por meio de uma eletroforese 2D, e caracterizou e identificou as possíveis proteínas imunogênicas do fungo por espectrometria de massa. Por meio de programas de predição, foi avaliado e sintetizado 7 sequências de aminoácidos,das proteínas identificadas com maiores chances de se acoplar a molécula MHC de classe II. Apenas 3 foram capazes de induzir proliferação in vitro, os peptídeos ZR3, ZR4 e ZR8, que foram utilizados como vacina na esporotricose subcutânea e avaliados sua eficácia por meio da carga fúngica, diâmetro das lesões, perfil celular e níveis de citocinas. Neste trabalho concluímos que o peptídeo ZR8 foi o melhor candidato à vacina na esporotricose, pois foi capaz de diminuir o diâmetro das lesões, aumentar os níveis de citocinas protetoras (IFN-γ, IL-17A e IL-1β) e aumentar o número de células TCD4+ e CD3-/CD19+, sendo assim induzindo uma resposta imunológica protetora na esporotricose subcutânea. / Sporotrichosis is a chronic disease, which involves the subcutaneous tissue affecting humans and animals caused by the thermodymorphic fungus Sporothrix spp. Sporotrichosis is endemic in Latin America, mainly in Brazil that had the largest zoonotic outbreak ever recorded, occurring in the city of Rio de Janeiro. The Sporothrix brasiliensis is the species more diagnosed in the outbreak and most virulent, causing severe forms of the disease. Sporotrichosis in cats is endemic, fatal and the main factors due to the high number of cases of the disease in Rio de Janeiro. The treatment is long, and has not been enough to contain the number of cases of sporotrichosis. A vaccine against sporotrichosis could change this paradigm in Brazil. The present work obtained the proteome of S. brasiliensis 5110 strain by 2D electrophoresis, and characterized and identified possible immunogenic proteins by mass spectrometry. By prediction programs were evaluated and synthesized 7 peptide sequence from antigenic proteins that have the highest chances of coupling to the MHC class II molecule. From these 7 peptides only 3 were able to induce proliferation in vitro, called ZR3, ZR4 and ZR8 peptides, that were used as a vaccine in subcutaneous sporotrichosis and evaluated their efficacy through fungal load, lesion diameter, cell profile and cytokine levels. We conclude that ZR8 peptide was the best candidate for sporotrichosis vaccine, since it was able to decrease the lesion diameter, increase the levels of protective cytokines (IFN-γ, IL-17A and IL-1β) and increase the number of CD4+ T cells and CD3-/CD19+ inducing a protective immune response in subcutaneous sporotrichosis.