Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-04-08T14:45:04Z No. of bitstreams: 1 2013_PatriciadeSousaLima.pdf: 9860957 bytes, checksum: 310079c43625523f20cdf02c8b2ef356 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-08T15:21:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_PatriciadeSousaLima.pdf: 9860957 bytes, checksum: 310079c43625523f20cdf02c8b2ef356 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-08T15:21:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_PatriciadeSousaLima.pdf: 9860957 bytes, checksum: 310079c43625523f20cdf02c8b2ef356 (MD5) / Paracoccidioides spp. causa a paracoccidioidomicose, uma das micoses mais frequentes na América Latina. O fungo cresce como micélio no meio ambiente, e como levedura, no hospedeiro. A fim de sobreviver no corpo humano, patógenos devem se adaptar nos microambientes os quais são frequentemente caracterizados por baixas disponibilidades de nutrientes e oxigênio. Uma das primeiras linhas de defesa deste fungo durante invasão no hospedeiro são os macrófagos residentes nos pulmões, considerados pobres em aminoácidos e nutrientes. Durante a doença sistêmica, o fungo também pode atingir órgãos e tecidos onde o patógeno é exposto a variações nas concentrações de oxigênio. Neste estudo, as respostas de Paracoccidioides, Pb01, sob condições de privação de glicose e de oxigênio foram obtidas a partir de abordagens transcricionais (RNAseq), proteômicas (NanoUPLC-MSE e 2D-PAGE) e ensaio de complementação gênica. Os resultados revelaram que Pb01 muda seu metabolismo em resposta à privação de glicose. O fluxo de carbono é centrado na produção de etanol e gliconeogênese pela modulação de outras vias tais como β-oxidação e ciclos do glioxilato e ácido tricarboxílico. Mais ainda, as células privadas de glicose foram mais susceptíveis à morte por macrófagos indicando que a glicose proporciona vantagem na sobrevivência do fungo dentro dos macrófagos. Em relação à hipóxia, as respostas do Pb01 possivelmente são mediadas pelo fator de transcrição SrbA, uma proteína da família de ligação ao elemento regulatório esterol (SREBP). A PbsrbA é funcional no mutante nulo para o gene srbA, de A. fumigatus (ΔsrbA), e também restaura ambos, a susceptibilidade do ΔsrbA à classe de azóis de drogas antifúngicas e a produção de biomassa em resposta à condições de privação de ferro. Além disso, os níveis de transcritos e proteínas de células leveduriformes do Pb01 mostraram que, em hipóxia, o fungo aumenta a expressão de transcritos associados com a glicólise e biossínteses de ergosterol e ácidos graxos. Um aumento na abundância de proteínas envolvidas com o metabolismo de aminoácidos, carboidratos, lipídios/ ácidos graxos, produção de etanol e destino protéico foi detectado por análises em gel bi-dimensional além da redução daquelas relacionadas a processos oxidativos (de aminoácidos, ácidos graxos e acetaldeído), TCA e transporte de elétrons. Desde que estudos têm mostrado a importância do metabolismo de carbono e adaptação à hipóxia nos fungos, concluímos que a caracterização das respostas de Pb01 às condições de privação de glicose e de oxigênio é importante para elucidação de importantes moléculas e processos relevantes para o entendimento do estabelecimento fúngico no hospedeiro. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides spp. represent the causative agent of paracoccidioidomycosis, one of the most frequent systemic mycoses in Latin America. The fungus grows as mycelium in the environmental, and as yeast form, in the host tissue. To survive in the human body, pathogens must adapt to microenvironments which are often characterized by low nutrient and oxygen availability. One of the first lines of defense during Paracoccidioides spp. host invasion are the lung resident macrophages, considered a glucose- and amino acid-poor environment. During the systemic disease, it also can reach organs and tissues where the pathogen is exposed to variations in oxygen concentrations. In this study, a comprehensive response of Paracoccidioides, isolate Pb01, under glucose and oxygen deprivation was accessed by transcriptional (RNAseq), proteomic (NanoUPLC-MSE and 2D-PAGE) and genetic complementation approaches. The results revealed that Pb01 changes its metabolism to responds to glucose deprivation. The carbon flow is focused in gluconeogenesis and ethanol production through β-oxidation, glyoxylate and tricarboxylic acid cycles modulations. Moreover, the glucose deprived cells are more susceptible to macrophages killing indicating that the glucose provides a survival advantage to Pb01 inside macrophages. Regarding hypoxia, the responses of Pb01 showed that it is possibly mediated by a highly conserved transcription factor, SrbA, a protein of the sterol regulatory element binding protein family. Our results showed that the PbsrbA is functional in a null mutant of srbA of A. fumigatus (ΔsrbA) and also restore both, the susceptibility of ΔsrbA to the azole class of antifungal drugs and the biomass production in response to low iron conditions. Furthermore, the transcripts and proteins levels of the Pb01 yeast cells under hypoxia showed that Pb01increases the expression of transcripts associated with glycolysis and ergosterol/ fatty acid biosynthesis. In addition, as detected by 2D-PAGE, the fungus also increases the abundance of proteins involved in amino acid, carbohydrate and lipid/fatty acids metabolism, ethanol production and protein fate and reduce of those related to oxidative processes (amino acids, fatty acid and acetaldehyde), TCA and electron transport. Because studies have highlighted the importance of carbon metabolism and hypoxia adaptation in fungi, we conclude that the characterization of glucose and oxygen deprivation responses in Pb01 is important to elucidate molecules and processes relevant in the understanding of the fungal establishment in the host.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:50:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1544_1.pdf: 2210014 bytes, checksum: f0b8010a969a882f4bd43af5029b827c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Neste trabalho são relatados os resultados obtidos na utilização da lectina obtida das sementes de Canavalia brasiliensis, sobre a expressão e atividade de metaloproteinases extraídas de lesões de pele experimentais. O efeito da lectina foi testado em quatro esquemas terapêuticos (2º, 7º e 12º dia após a cirurgia), em camundongos os quais foram divididos em quatro grupos: ConBr (10μg), NaCl (150mM), ConBr/manose (10μg preparadas em solução fisiológica com manose 0,1M) e manose (0,1M). O estudo prosseguiu com a coleta das lesões para as análises da área da lesão, histopatológica, atividade colagenolítica utilizando azocolágeno e PCR em tempo real com primers específicos para metaloproteinase 2 (MMP-2) e metaloproteinase 9 (MMP-9). O grupo tratado ConBr apresentou sinais inflamatórios macroscópicos menos intensos e uma maior evolução cicatricial quando comparado aos demais grupos. A atividade colagenolítica esteve presente nos quatro grupos estudados, porém o grupo ConBr apresentou a menor atividade no 2º dia após a cirurgia, já o grupo ConBr/manose obteve a maior atividade no tempo referido acima, este perfil de atividade manteve-se para o grupo ConBr/manose no 12º dia após a cirurgia. Este resultado da atividade pode está relacionado com os achados histopatológicos, os quais demonstraram um padrão semelhante na organização tecidual entre os grupos ConBr e ConBr/manose, porém este último apresentou uma melhor organização das fibras de colágeno. Observou-se quanto a área das lesões que houve uma diferença estatisticamente significativa entre o Grupo ConBr e o grupo controle NaCl no 7º e 12º dia após a cirurgia. A expressão dos genes de MMP-2 e MMP-9 foi observada em todos os tempos para os grupos ConBr, ConBr/manose e manose, com diferentes quantidades, porém no grupo NaCl não houve expressão no 2º dia de tratamento da MMP-2 e MMP-9 e no 12º dia para o gene de MMP-9. Apesar do grupo ConBr/manose ter apresentado uma melhor organização das fibras colágenas, o grupo ConBr favoreu positivamente o fechamento da ferida em relação aos demais grupos

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-03T22:40:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Oliane Maria Correia Magalhães.pdf: 578908 bytes, checksum: bd57c22da972523afb5d5f5eb9771e5f (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-14T15:34:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Oliane Maria Correia Magalhães.pdf: 578908 bytes, checksum: bd57c22da972523afb5d5f5eb9771e5f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-14T15:34:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Oliane Maria Correia Magalhães.pdf: 578908 bytes, checksum: bd57c22da972523afb5d5f5eb9771e5f (MD5) Previous issue date: 2007-09-28 / Paracoccidioidomicose (PCM) apresenta múltiplas manifestações clínicas é causada pelo fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. PCM é diagnosticada pela detecção microscópica de células leveduriformes multibrotantes em amostras clínicas, pela cultura cotonosa e/ou cerebriforme e testes sorológicos. Os objetivos desta pesquisa foram padronizar antígenos de P. brasiliensis de cultura selvagem e de culturas obtidas na Coleção de Culturas Micoteca URM. As estruturas leveduriformes multibrotantes evidenciadas a partir da termoconversão demonstraram que as referidas culturas depositadas na Micoteca URM são compatíveis às descritas de P. brasiliensis, contudo algumas culturas apresentaram características morfológicas atípicas e perda da habilidade dimórfica. Os critérios adotados para seleção das culturas para obtenção de antígenos foram baseados nos aspectos macroscópicos das colônias e da termoconversão das células de P. brasiliensis, os quais permitiram selecionar as culturas URM 3634, 3635 e a cultura selvagem 5378. Com NGTA os antígenos produzidos foram padronizados pela titulação, concentração de proteínas e identificação de frações protéicas. O título dos antígenos foi 1/4, 1/8 e 1/32 e a concentração de proteínas 541μg/mL, 658μg/mL e 808μg/mL respectivamente das culturas URM 3634, 3635 e 5378. Os exoantígenos apresentaram várias frações protéicas. Com soros adquiridos de bancos de soros, foram realizados testes sorológicos com as técnicas de imunodifusão (ID), contraimunoeletroforese (CIE) e imunobloting (IB). Com o teste de ID, os soros apresentaram 86,0% de sensibilidade, com CIE 98,0%. Com IB 100% de 29 soros testados reconheceram a molécula de 43 KDa, gp43, considerada o principal antígeno usado no imunodiagnóstico da PCM. Todos os testes expressaram 100% de especificidade. / Paracoccidioidomycosis (PCM) presents multiples clinical manifestations being caused by thermally dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. PCM is diagnosed by detection microscopic of yeast cells that reproduces by multiple budding in clinical samples, by culture cottony and/or cerebriform and by serological tests. The aims of research were to standard antigens of P. brasiliensis wild strain and strain obtained at the Coleção de Culturas - Micoteca URM. Like-yeast structures multiple-budding in thermoconversion ensured that the strains deposited at the Micoteca URM are P. brasiliensis; however some strains showed atypical morphological patterns and loss for dimorphic ability. The adopted criterion from selection of the fungi strains aiming at antigen production were based in observation macroscopic of the colonies and of the cells thermoconvertion from P. brasiliensis, wich it allowed to select the strains URM 3634, 3635 and the wild strain URM5378. The antigens produced with NGTA were standardized by titers, protein content and identifications of proteins fraction. The titers of antigens produced were of 1/4, 1/8 e 1/32 and the protein content was 541μg per ml, 658μg per ml and 808 μg per ml for strains URM3634, 3635 and 5378 respectively; the exoantigens apresented several antigenic fractions. The serological tests immunodiffusion (ID), counterimmunoelectrophoresis (CIE) and Immunobloting (IB) were made with serum samples obtained from a bank of sera. The ID and CIE tests presented 86.0% and 98.0% of sensitivity, respectively. The IB test realized with 29 sera showed that all it (100%) recognized the 43-KDa molecule, gp 43, considered to the main antigen used for immunodiagnostic of PCM. All of the tests expressed 100% specificity.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Sarah Veloso Nogueira.pdf: 4968384 bytes, checksum: 1a3070a4c2260fba10919cd4f6ccd4f4 (MD5) Previous issue date: 2010-03-11 / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a human systemic mycosis, prevalent in Latin America. Extracellular matrix (ECM) is a complex net where collagens, laminin and fibronectin can be found and, when exposed, is the first site for the fungus adhesion. Our aim was to study genes involved in the adhesion process using Representational Difference Analysis (RDA). RDA is a PCR-coupled subtractive method that allows the isolation of genes differentially expressed in two different cDNA populations. Hence, cDNAs were synthesized from RNAs extracted from P. brasiliensis yeast cells adhered to collagen and fibronectin to identify overexpressed genes. Genes involved in a wide range of cellular process were found and PbCtr3 (cooper transporter) and enolase (PbEno) were chosen to further studies. A synthetic peptide (PbCTR3) and the recombinant enolase (rPbEno) were utilized together with the anti-rPbEno polyclonal antibody in functional analysis with ECM components and plasminogen. The studies suggest that P. brasiliensis enolase, in the surface, is able to generate plasmin from plasminogen by plasminogen activator. Therefore, it was also demonstrated that this protein is secreted and able to promote fungus adhesion and invasion to cells. These findings clearly establish the role of enolase in the patogenicity of P. brasiliensis. / Paraccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, prevalente na América Latina. A matriz extracelular (MEC) é uma rede complexa formada por colágeno, laminina, fibronectina, entre outros componentes, que, quando exposta, é o local inicial de adesão do fungo. Nosso objetivo foi estudar genes envolvidos nesse processo de adesão utilizando Análise Diferencial Representacional (RDA). RDA é um método de subtração acoplado a PCR que permite o isolamento de genes diferencialmente expressos entre duas populações de cDNAs diferentes. Assim, cDNAs foram sintetizados a partir de RNAs extraídos de células leveduriformes de P. brasiliensis aderidos à colágeno e fibronectina para identificar genes super-expressos nestas condições. Genes envolvidos com vários processos celulares foram observados e PbCtr3 (transportador de cobre) e enolase (PbEno) foram escolhidos para análises adicionais. Um peptídeo sintético (PbCTR3) e a proteína recombinante (rPbEno) foram utilizados, juntamente com o anticorpo policlonal antirPbEno em análises funcionais com componentes da MEC e plasminogênio. Os estudos sugerem que a enolase de P. brasiliensis, localizada na parede celular, é capaz de gerar plasmina a partir do plasminogênio mediada pelo ativador de plasminôgenio. Além disso, foi também demonstrado que esta proteína é secretada sendo capaz de promover a adesão e invasão do fungo a células. Esses estudos claramente estabelecem o papel da enolase na patogenicidade de P. brasiliensis.

A imunidade inata mostra-se importante na defesa do hospedeiro contra a infecção por fungos, e dentro desse contexto macrófagos e neutrófilos (PMN) desempenham papel central na Paracoccidioidomicose. O tratamento desta doença inclui o uso de antifúngicos que, além do prolongado tempo de administração, podem ter diversos efeitos colaterais, sendo necessário pesquisa de tratamentos mais eficientes ou adjuvantes. A laserterapia de baixa potência (LLLT) vem sendo utlizada como tratamento adjuvante para muitas enfermidades, e já foi demonstrado seu efeito modulador em células imunes. Neste trabalho avaliamos os efeitos da LLLT (λ= 780 nm e 50 mW) aplicadas in vivo e em dias alternado em dois pontos das patas traseiras de camundongos Swiss inoculados pela via “air pouch” subcutânea com P. brasiliensis cepa 18 (Pb18) ou com Zymosan. Grupos de animais que não sofreram irradiação foram utilizados como controle. Após 10 dias da infecção nós obtivemos uma população de PMN altamente pura, que posteriormente foram mantidos em cultura na presença de Pb18 para ensaios de produção de proteínas, avaliação da atividade mitocondrial, produção de metabólitos do oxigênio e quantificação de fungos viáveis por ensaios de UFC. Os resultados mostraram que os PMN de animais que sofreram irradiação, independente do estímulo in vivo para sua obtenção, apresentaram maior produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), atividade mitocondrial elevada e maior atividade fungicida. Com relação à produção de proteínas, os PMN de animais que não sofreram irradiação in vivo apresentaram crescimento constante na produção, enquanto que nos PMN de animais que sofreram irradiação essa produção diminuiu com o tempo de incubação. Podemos concluir que a LLLT rende aos PMN maior atividade metabólica, o que resulta em maior atividade fungicida contra o Pb18, provavelmente devido à maior produção de ERO independente do estímulo utilizado para sua obtenção. / Innate immunity is an important component of host defense against by fungi, and into this context macrophages and neutrophils (PMN) play a central role in paracoccidioidomycosis. The treatment of this disease includes the use of antifungals that, which in addition to the prolonged administration time needed may have many side effects, so research for more efficient drugs or adjuvant treatments is needed. Low level laser therapy (LLLT) has been used as adjuvant treatment for many ailments, and its modulating effect on immune cells has already been demonstrated. In this work, we evaluated the effects of LLLT (λ= 780 nm e 50 mW) applied “in vivo” in alternate days at two points of hind paws of Swiss mice inoculated in the subcutaneous air pouch with the virulent P. brasiliensis Pb18 isolated or with Zymosan. Unirradiated animals were used as controls. After 10 days of infection we obtained a highly pure population of PMN, which subsequently were maintained in culture in presence of Pb18 for trials to protein production, evaluation of mitochondrial activity, production of reactive oxygen species (ROS) and quantification of viable fungi. The results showed that PMN from irradiated animals, regardless of the “in vivo” stimulus for their obtention, presented higher production of ROS, elevated mitochondrial activity and increased fungicidal capacity. Regarding the production of proteins, PMN from unirradiated animals showed increased production, while the treated group decreased gradually this production with the time of incubation. We conclude that LLLT renders PMN more active metabolically, resulting in higher fungicidal activity against Pb18, probably due to increased production of ROS, independently of the stimulus used to obtain it.

Made available in DSpace on 2018-08-01T23:26:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10694_74 - Gleison Oliosi.pdf: 1944334 bytes, checksum: df87e23fef05be6676fc13c8464071ea (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / A demanda por sistemas sustentáveis de produção tem aumentado consideravelmente nos últimos anos, de forma que busca-se sistemas de cultivos que possam aliar a produção agropecuária à manutenção da qualidade do solo, garantindo a segurança alimentar e a produtividade dos nossos solos para as futuras gerações. Deste modo, objetivou-se com este trabalho avaliar as alterações dos atributos microbiológicos e químicos do solo sob diferentes sistemas de cultivo, em diferentes épocas. O experimento foi realizado no município de Jaguaré-ES, onde foram avaliados cinco sistemas de manejo do solo, sendo, 01- café Conilon em monocultivo, 02- café Conilon consorciado com seringueira, 03- seringueira em monocultivo, 04- pastagem de Brachiaria brizantha, e 05- fragmento de mata Atlântica. As análises microbiológicas do solo foram realizadas no inverno e verão, e as análises químicas somente no verão, ambas na profundidade de 0 a 10 e 10 a 20 cm. Os dados foram submetidos à análise multivariada e análise descritiva das variáveis, com média e erro padrão da média. Os atributos microbiológicos do solo não apresentaram alteração expressiva quanto às épocas avaliadas, evidenciando que a frequente ocorrência de maiores valores no verão está associada às altas precipitações aliada às altas temperaturas. A adoção de sistemas de manejo com café e seringueira em consórcio ou em monocultivo, e pastagem de Brachiaria brizantha, nas condições estudadas, apresentaram pouca alteração nos atributos microbiológicos do solo, mostrando-se como alternativas viáveis para promover a sustentabilidade do solo, aliada a produção agropecuária. Os atributos químicos do solo variam independente dos atributos microbiológicos nos sistemas de manejo avaliados, sendo mais influenciados pelas adubações e correções do solo, de modo que nem sempre a área com melhores atributos químicos apresentarão melhores atributos microbiológicos.

Submitted by Ívy Rafacho Vieira null (ivy.raff@yahoo.com.br) on 2017-02-20T18:11:01Z No. of bitstreams: 1 Dissertação final mesmo Ivy.pdf: 2121270 bytes, checksum: ae8b49d15e98a6f5efb7ad097fe78b38 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-02-22T20:26:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vieira_ir_me_bot.pdf: 2121270 bytes, checksum: ae8b49d15e98a6f5efb7ad097fe78b38 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T20:26:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vieira_ir_me_bot.pdf: 2121270 bytes, checksum: ae8b49d15e98a6f5efb7ad097fe78b38 (MD5) Previous issue date: 2017-01-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina, causada pela inalação de propágulos micelianos do fungo termodimórfico do gênero Paracoccidioides spp.(Pb). Dentre os mecanismos de resposta imune contra o fungo, destacam-se os exercidos pelas células fagocitárias como os macrófagos, neutrófilos e células dendríticas (DCs). Além do importante papel efetor, isto é, de destruição do fungo, essas células, por terem capacidade de produzir citocinas tanto pró como anti-inflamatórias, desempenham um importante papel modulador da resposta imune inata, assim como de instrução da resposta imune adaptativa que será gerada posteriormente. Para essa última função, as células dendríticas merecem destaque por constituírem a população de células fagocitárias mais adaptada ao processo de ligar, fagocitar, destruir, processar microrganismos e após migrarem aos órgãos linfóides periféricos, locais onde elas maturam para desenvolver o processo de apresentação de antígeno, desencadear e instruir a resposta imune adaptativa. No entanto, de forma similar às outras células fagocíticas, as DCs são capazes de liberar potentes moléculas citotóxicas que as capacita a destruírem eficientemente os microrganismos. Essa capacidade, embora necessária ao papel modulador das DCs citado acima, representa um mecanismo efetor importante durante a resposta imune inata. A maior ou menor capacidade das DCs destruírem os vários microrganismos pode resultar em diferenças na disseminação dos mesmos durante a migração dessas células da periferia até os órgãos linfóides secundários. Neste contexto, em estudo anterior avaliamos se DCs humanas exercem atividade fungicida contra o P. brasiliensis e se esse processo envolve a ativação do sistema NADPHoxidase com consequente produção de H2O2, o metabolito envolvido na destruição do P. brasiliensis. Detectamos que as DCs não liberam níveis adequados de H2O2 e consequentemente não desenvolvem atividade fungicida contra o P. brasiliensis. Em outro estudo observamos que a interação das DCs com o Pb não resulta em maturação eficiente dessas células. O tipo de receptor de reconhecimento padrão (PRR) ao qual o fungo se liga pode determinar o seu destino no interior das células fagocitárias. Estudos têm mostrado que enquanto alguns deles estão envolvidos na replicação dos microrganismos no interior das células fagocíticas, ao contrário, outros participam da destruição dos mesmos. Nesse sentido, estudos sugerem que a estimulação de TLR9 através do ligante agonista CpG-ODN culmina com ativação do metabolismo oxidativo e consequente destruição de patógenos. Corroborando com esses estudos, detectamos que a incubação de DCs humanas com um agonista do TLR9 induziu um aumento significativo na atividade fungicida dessa células contra o P.brasiliensis . No entanto, esse efeito não esteve associado à um aumento da produção de H2O2. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis, endemic to Latin America, caused by the inhalation of mycelial propagules of the thermodymorphic fungus of the genus Paracoccidioides spp. (Pb). Among the mechanisms of immune response against the fungus, we highlight those exerted by phagocytic cells such as macrophages, neutrophils and dendritic cells (DCs). In addition to their important effector role, that is, fungus destruction, these cells, due to the capacity to produce both pro and anti-inflammatory cytokines, play an important role in modulating the innate immune response, as well as instructing the adaptive immune response. For this latter function, DCs deserve special attention, as they are the phagocytic cells population more adapted to the process of binding, phagocytizing, destroying, processing microorganisms and after migrate to the peripheral lymphoid organs, where they mature and instruct the adaptive immune response. However, similarly to other phagocytic cells, DCs are able to release potent cytotoxic molecules that enable them to efficiently destroy microorganisms. This ability, although necessary to their modulatory role cited above, represents an important effector mechanism during the innate immune response. The higher or lower capacity of DCs to destroy the various microorganisms may result in differences in dissemination of the infection during the migration of these cells from the periphery to the secondary lymphoid organs. In this context, in a previous study we evaluated whether human DCs exert fungicidal activity against P. brasiliensis and whether this process involves the activation of the NADP oxidase system with consequent H2O2 production, the metabolite involved in the P. brasiliensis killing. We have detected that DCs do not release adequate levels of H2O2 and consequently do not exert fungicidal activity against P. brasiliensis. In another study, we observed that the interaction of DCs with Pb does not result in efficient maturation of these cells. The type of pattern recognition receptor (PRR) to which the fungus binds can determine its fate within the phagocytic cells. Studies have shown that while some PRRs are associated to the replication of microorganisms within the phagocytic cells, other, on the contrary, are involved in the mechanisms of pathogens killing. In this sense, studies suggested that TLR9 stimulation by the agonist CpG-ODN culminates with oxidative metabolism activation and pathogens elimination. Accordinly, in our study we detected that human DCs incubation with a TLR9 agonist results in a significant increase of the fungicidal activity of these cells against P.brasiliensis. However, this effect was not associated with an increase in H2O2 production.

Resumo: Este trabalho objetivou desenvolver um protocolo para produção, isolamento e purificação de clamidósporos do P. brasiliensis (Pb) e estudar seu potencial infectante em camundongos. A cepa Bt83 foi cultivada em meio líquido por 14 dias à temperatura de 25 ºC e posteriormente incubada por 36 horas a 32°C para a produção de clamidósporos. Os clamidósporos foram liberados por agitação magnética e sonicação. A purificação foi realizada em gradiente de concentração com Percoll a 95%, resultando em suspensão de clamidósporos com viabilidade de 90% e com poucos (8%) fragmentos miceliais. Para avaliar seu potencial infectante, os clamidósporos foram inoculados em camundongos por via intranasal, e os animais eutanasiados após 24h, 1, 2 e 4 semanas de infecção foram estudados através da histologia e quantificação da carga fúngica pela contagem de unidades formadoras de colônia dos pulmões, baço e fígado. Vinte e quatro horas pós-infecção observaram-se no pulmão focos de broncopneumonia contendo grande número de leveduras, algumas em brotamento múltiplo. Nos períodos subseqüentes observaram-se lesões granulomatosas, com presença de fungos, principalmente nos pulmões. A disseminação para baço e fígado foi precoce, iniciando na 1ª semana de infecção. Neste trabalho demonstramos que os clamidósporos do Pb podem ser, fácil e rapidamente, produzidos e isolados. Também mostramos que estes esporos são altamente infectantes e capazes de disseminação precoce. Os resultados indicam que os clamidósporos podem desempenhar um importante papel na infecção e desenvolvimento da paracoccidioidomicose / Abstract: This study aimed at development a protocol for production, isolation and purification of chlamydospores of P. brasiliensis (Pb) and study their potential infectious in mice. Bt83 strain was grown in liquid medium for 14 days at 25 °C and then incubated for 36 hours at 32°C to produce chlamydospores. The chlamydospores were released by magnetic stirring and sonication. The purification was performed in concentration gradient with Percoll to 95%, resulting in a suspension of chlamydospores 90% viable and few (8%) mycelia non-viable fragments. To assess their potential infectious the chlamydospores, mice were inoculated intranasally and euthanized after 24 h, 1, 2 and 4 weeks of infection and their lungs, spleen and liver studied histologically and quantified the fungal burden by colony forming units counting. Twenty-four hours postinfection, multiple foci of bronchopneumonia were seen containing many multibudding yeast cells. In subsequent periods there were granulomatous lesions with the presence of fungi, mainly in the lungs. Dissemination to the spleen and liver was an early event, starting at 1 week of infection. This work provided evidences that the chlamydospores of Pb can be quickly and easily produced and isolated. It was also shown that these spores are highly infectious and have great ability to disseminate soon after infection. These results indicate that chlamydospores might be elected as an important infectious particle in paracoccidioidomycosis / Orientador: Denise Fecchio / Coorientador: Julio Defaveri / Banca: Angela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Terezinha Inez Estivalet Svidzinski / Mestre

While lipid droplets have traditionally been considered as inert sites for the storage of triacylglycerols and sterol esters, they are now recognized as dynamic and functionally diverse organelles involved in energy homeostasis, lipid signaling, and stress responses. Unlike most other organelles, lipid droplets are delineated by a half-unit membrane whose protein constituents are poorly understood, except in the specialized case of oleosins, which are associated with seed lipid droplets. Recently, we identified a new class of lipid-droplet associated proteins called LDAPs that localize specifically to the lipid droplet surface within plant cells and share extensive sequence similarity with the small rubber particle proteins (SRPPs) found in rubber-accumulating plants. Here, we provide additional evidence for a role of LDAPs in lipid accumulation in oil-rich fruit tissues, and further explore the functional relationships between LDAPs and SRPPs. In addition, we propose that the larger LDAP/SRPP protein family plays important roles in the compartmentalization of lipophilic compounds, including triacylglycerols and polyisoprenoids, into lipid droplets within plant cells. Potential roles in lipid droplet biogenesis and function of these proteins also are discussed.

Thesis (Ph. D.)--University of Texas at Austin, 2001. / Vita. Includes bibliographical references. Available also from UMI/Dissertation Abstracts International.