Como neoplasia maligna que mais acomete a cavidade oral, o carcinoma epidermóide gera infinidade de estudos acerca de sua gênese e progressão. O variado perfil genético e protéico observado leva a freqüente insucesso nas terapias adotadas, contribuindo para pobres prognósticos. Este estudo visa compreender melhor o papel da proteína Akt, tida como chave para a proliferação de diversas neoplasias, frente ao estímulo das células derivadas de carcinoma epidermóide humano em cultura (HaCat, HN6, HN19, HN30, HN31) com EGF 10ng/ml e TGF β 5ng/ml. Para tanto, analisou-se a expressão de pAkt, ciclina D1, Bad, caspase-3 e PTEN, através de imunofluorescência, western-blot e imunoprecipitação. Os resultados mostraram aumento da expressão de pAkt e ciclina D1 frente ao tratamento com EGF, bem como diminuição de Bad e PTEN, com exceção de HN31. A imunoprecipitação revelou neste caso que pAkt previne a apoptose através de inativação direta de Bad. Já nas células tratadas com TGF β , obtivemos resultados diferentes do esperado para este supressor de tumor. A expressão de pAkt mostrou-se aumentada nas linhagens celulares, mas estável em HN19 e HN31. Ciclina D1 mostrou aumento em HN6 e HN30, manutenção em HaCat e HN19 e diminuição em HN31. HaCat mostrou queda dos níveis de caspase-3 e Bad, manutenção em HN6, aumento em HN30, aumento somente de Bad em HN31 e HN19 com níveis inalterados após o tratamento para ambas as proteínas. Estes achados sugerem o importante papel desempenhado pelo EGF nas linhagens de carcinoma epidermóide estudadas, e como esta via é importante candidata a ser visada em tratamentos quimioterápicos. A ação do TGF β mostrou discrepâncias, revelando seu comportamento dúbio frente os diversos tipos celulares, e sugerindo possível relação entre este receptor e a via do pAkt, o que requer estudos mais apropriados. A baixa ocorrência de apoptose também reforça esta possibilidade, mostrando como a via do Akt é essencial para a progressão neoplásica e pode estar relacionada a mais eventos celulares do que já sabido. / Squamous cell carcinoma raises a great interest regarding carcinogenesis and its proliferative pathways, due to the high incidence and poor prognosis. The broad genetic and proteic profiles contribute to this poor prognosis. The present study aims to better comprehend the role played by pAkt, key protein for the development of many neoplasms. Cell lines derived from oral squamous cell carcinoma (HaCat, HN6, HN19, HN30 and HN31) were induced with 10ng/ml EGF and 5ng/ml TGF β . The expressions of pAkt, cyclin D1, Bad, caspase-3 and PTEN were analyzed through immunofluorescence, western-blot and immunoprecipitation. Results showed higher pAkt and cyclin D1 expression after EGF treatment, as well as a decrease in Bad and PTEN levels, except for HN31. Immunoprecipitation revealed that pAkt prevents apoptosis through Bad direct inactivation. However, TGF β treatment revealed different results, from what expected for this tumor supressor. pAkt expression revealed to be increased in all cells lines, but stable for HN19 and HN31. HaCat exhibited decreased levels of caspase-3 and Bad, which were unaltered in HN6, augmented in HN30. HN31 revealed only Bad increased levels, and no alterations in HN19. These findings suggest the crucial role played by EGF stimulation in the studied cell lines, and a good candidate to be targeted by chemotherapeutical approaches. TGF β treatment showed discrepancies, revealing diverse behaviors in the different cell lines. An exhisting relation between TGF β receptors and pAkt pathway may not be discharged, requiring further studies. The low occurrence of apoptosis reinforces this possibility, showing how important is Akt and related pathways for neoplastic progression, and its possible relation to cellular events not described to date.

A Doença de Alzheimer é a causa mais freqüente de demência senil e os gastos com pacientes com demência já supera os de pacientes com câncer ou com doenças cardiovasculares. As lesões características dessa doença são as placas amilóides e os emaranhados neurofibrilares. A neuroinflamação também está presente na maioria dos pacientes com Alzheimer, e parece contribuir para o dano no tecido neuronal. Adicionalmente, estudos vêm demonstrando que pacientes com Alzheimer também apresentam alterações sistêmicas, e, dessas, a mais relatada é o estado pró-inflamatório em tecidos periféricos, permitindo que a Doença de Alzheimer seja estudada em um contexto neuroimunológico. Utilizando um modelo murino para a Doença de Alzheimer, o camundongo 3xTg-AD (que desenvolve ambas as patologias β-amilóide e tau), investigamos se aumento de mediadores inflamatórios também pode ser detectado nesse modelo, tanto no hipocampo (estrutura relevante para os sintomas da doença) como no sangue. Alterações cognitivas e comportamentais e a presença do precursor da proteína amilóide (APP) e/ ou peptídeo β-amilóide em estruturas cerebrais relevantes para a doença (córtex, hipocampo, subículo e amígdala) permitiram validar o camundongo 3xTg-AD como um modelo murino da Doença de Alzheimer. Análises da expressão de mediadores inflamatórios no hipocampo demonstraram que a presença de APP e/ ou peptídeo β-amilóide no cérebro não induz um estado pró-inflamatório no hipocampo ou no sangue, até os 12 meses de idade. Porém, a expressão de APP e/ ou peptídeo β-amilóide no cérebro parece induzir distúrbios sistêmicos, já que algumas alterações periféricas foram encontradas. Como a resposta ao LPS envolve tanto tecidos periféricos, como o Sistema Nervoso Central, avaliou-se os efeitos da administração periférica de LPS nesse camundongo, aos 12 meses de idade. A resposta inflamatória ao LPS diferiu entre camundongos Wild Type (grupo controle) e 3xTg-AD. No sangue, menor aumento de IL-6 e MCP-1 e maior aumento de IFN-γ foram encontrados nos camundongos 3xTg-AD. As conseqüências deste perfil de citocinas séricas no Sistema Nervoso Central foram distintas, dependendo da resposta avaliada: enquanto que a ativação do eixo HPA foi semelhante, a produção de citocinas inflamatórias no hipocampo foi atenuada. Portanto, no camundongo 3xTg-AD, a diferente resposta inflamatória ao LPS no sangue promoveu menor produção de mediadores inflamatórios no hipocampo. / Alzheimer\'s Disease is the most frequent cause of senil dementia and the costs with demented patients already exceeds that of patients with cancer or cardiovascular diseases. The characteristic lesions of this disease are amyloid plaques and neurofibrillary tangles. Neuroinflammation is also present in most of Alzheimer\'s patients, and seems to contribute to neuronal tissue damage. In addition, studies have demonstrated that patients with Alzheimer also display systemic alterations, and of those, the most reported is the pro-inflammatory state in peripheral tissues, allowing Alzheimer\'s Disease to be studied in a neuroimmunology context. Using a murine model of Alzheimer\'s Disease, the 3xTg-AD mice (which develops both amyloid-βand tau pathologies), we investigated whether enhancement of inflammatory mediators can also be detected in this model, in both hippocampus (a relevant structure for the symptoms of the disease) and in blood. Cognitive and behavioral alterations and the presence of amyloid precursor protein (APP) and/ or amyloid-β peptide in relevant brain structures for the disease (cortex, hippocampus, subiculum and amigdala) allowed the validation of 3xTg-AD mice as a murine model of Alzheimer\'s Disease. Analysis of inflammatory mediators expression in hippocampus demonstrated that the presence of APP and/ or amyloid-β peptide in the brain does not induce a pro-inflammatory state in hippocampus or in the blood, until 12 months of age. Nevertheless, APP and/or amyloid-β peptide expression in the brain seems to induce systemic disturbances, once peripheral alterations were detected. As LPS response includes both peripheral tissues and the Central Nervous System, we evaluated peripheral administration effects of LPS in these mice, at 12 months of age. The inflammatory response to LPS differed between Wild Type (control group) and 3xTg-AD. In the blood, smaller enhancement of IL-6 and MCP-1 and higher enhancement of IFN-γ were found in 3xTg-AD mice. The consequences of this serum cytokine profile on the Central Nervous System were distinct, depending on the response evaluated: while HPA axis activation was similar, production of inflammatory cytokines in hippocampus was attenuated. Therefore, in the 3xTg-AD mice, a different inflammatory response to LPS in blood promoted lesser inflammatory mediators production in hippocampus.

Utilizando uma bibioteca de expressão feita a partir do epitélio do intestino médio da larva de Diatraea saccharalis, nós clonamos e sequenciamos 3 cDNAs completos (DsβglyA, DsβglyB e DsβglyC), além de uma seqüência parcial que teoricamente codificam β-glicosidases. As sequências dos peptídeos obtidos após digestão por tripsina das β-glicosidases βgly1 e βgly2 de D. saccharalis mostraram que DsβglyA codifica a βgly1, caracterizada anteriormente. DsβglyB e DsβglyC provavelmente codificam duas β-glicosidases solúveis com massas moleculares teóricas de, respectivamente, 57,5 KDa e 56,2 KDa. Levando em consideração as semelhanças entre βgly1 e βgly3 e entre DsβglyA e DsβglyC, é razoável supor que DsβglyC codifique a βgly3. Os peptídeos produzidos após a hidrólise de βgly2 por tripsina não são codificados por nenhum dos cDNAs que nós sequenciamos. βgly2 provavelmente é codificada pelo cDNA cuja seqüência ainda está incompleta. A inativação da βgly2 por carbodiimida usando o tio-glicosídeo sinigrina e o O-glicosídeo p-nitrofenil β-D-galactopiranosídeo resulta na mesma constante de inativação, indicando que o mesmo sítio ativo é responsável pela hidrólise dos dois substratos. A mesma conclusão é obtida calculando o Km de βgly2 para os dois substratos e o Ki da inibição que cada um deles causa na hidrólise do outro. Os resultados indicam que uma só enzima é responsável pela hidrólise de sinigrina e p-nitrofenil β-D-glicosídeo com atividade semelhante. Essa propriedade nunca foi descrita para outra tio- ou O-glicosidase. / We used an expression library made from Diatraea saccharalis midgut epithelium and succeeded in cloning and sequencing three complete cDNAs (DsβGlyA; DsβGlyB; DsβGlyC) plus a partial sequence that hypothetically code for β-glycosidases. The sequence of peptides obtained from the purified D. saccharalis β-glycosidases (βGly1 and βGly2) after trypsin digestion shows that DsβGlyA codes for βGly1, an enzyme that had already been characterized. DsβGlyB and DsβGlyC probably code for two soluble β-glycosidases with, respectively, 503 and 493 amino acid residues and theoretical molecular weighs of 57.5 kDa and 56.2 kDa. Taking into account the similarities of βGly1 and βGly3 and of DsβGlyA and DsβGlyC it is reasonable to suppose that DsβGlyC codes for βGly3. The peptides produced after βGly2 hydrolysis by trypsin could not coded by any of the complete sequenced cDNAs, although they might be code by the still partial sequence we have. We determined the chemical inactivation of βGly2 using the thio-glucoside sinigrin and the O-glycoside p-nitrophenyl-β-D-galactoside, and found the same inactivation constant, indicating that the same active site is responsible for the hydrolysis of the two substrates. The same conclusion is reached determining βGly2 Km for both substrates and the Ki for inhibition of the hydrolysis of one substrate using the other as inhibitor. These results indicated that only one enzyme is responsible for the hydrolysis of sinigrin and p-nitrophenyl-β-D-galactoside with similar activities, which is not a property reported before for any O- or S- β-glycosidase.

A nefropatia diabética (ND) é uma das complicações microvasculares do diabetes e consiste no dano ao parênquima renal por consequência de uma série de fatores hemodinâmicos e moleculares. A ocorrência de ND e de outras complicações mesmo em indivíduos sob adequado controle glicêmico tem sido associada a um fenômeno conhecido como memória metabólica. Neste trabalho foram investigadas vias bioquímicas e moleculares persistentemente alteradas no rim de animais diabéticos tratados após um período inicial de hiperglicemia, com o propósito de entender os mecanismos envolvidos na memória metabólica. Para tanto, ratos com diabetes induzida por estreptozotocina foram mantidos hiperglicêmicos durante 4 semanas (período curto) ou 12 semanas (período longo) e posteriormente tratados com insulina isoladamente ou combinada com metformina (100mg/kg/dia) durante as 4 (período curto) ou 12 (período longo) semanas seguintes. Todos os animais tratados tiveram os seus níveis glicêmicos e função renal normalizados. Os tratamentos também foram capazes de normalizar os níveis elevados de malonaldeído no rim, bem como a excreção aumentada dos adutos de DNA 8-oxo-2\'-desoxiguanosina (8-oxodG) e N2-carboxietil-2\'- desoxiguanosina (CEdG) na urina observados nos animais diabéticos. Níveis aumentados de 8-oxodG foram detectados em DNA mitocondrial (mtDNA), mas não em DNA nuclear, de animais diabéticos apenas no período curto de estudo e também foram normalizados após o controle glicêmico. Nós identificamos uma via gradualmente alterada durante o curso do diabetes que permanece persistentemente alterada após o controle glicêmico tardio. Essa via compreende um declínio precoce do clearance de ácido úrico e expressão da pAMPK, seguida pelo acúmulo de fumarato, expressão aumentada de TGF-β, expressão reduzida de PGC-1α e redução da metilação e hidroximetilação do mtDNA. A redução persistente do clearance de ácido úrico em animais diabéticos tratados pode sustentar as alterações bioquímicas renais prolongadas observadas após o controle glicêmico, e essa regulação é provavelmente mediada pela redução sustentada da expressão de pAMPK e pela indução de inflamação. Este trabalho propõe a primeira consideração do possível papel da hiperuricemia e das alterações bioquímicas subjacentes como parte da memória metabólica na nefropatia diabética. / Diabetic nephropathy is one of the diabetes microvascular complications, and it consists on the damage to the renal parenchyma due to several hemodynamic and molecular factors. The occurrence of diabetic nephropathy and other complications even in those individuals under tight glycemic control has been associated to a phenomenon known as metabolic memory. Here we investigated biochemical and molecular pathways persistently altered in the kidney of diabetic animals treated after a previous period of hyperglycemia, aiming to understand underlying mechanisms in metabolic memory. Streptozotocin-induced diabetic rats were maintained hyperglycemic during 4 (short period) or 12 weeks (long period), and then they were treated with insulin alone or combined with metformin (100 mg/kg/day) for the following 4 or 12 weeks, respectively. All the treated animals had them glycemic levels and renal function normalized. The treatments were also able to control enhanced kidney malondialdehyde levels, as well as the increased urine excretion of the DNA adducts 8-oxo-2\'- deoxyguanosine (8-oxodG) and N2-carboxyethyl-2\'-deoxyguanosine seen in diabetic animals. Increased levels of 8-oxodG were detected in mitochondrial DNA, but not in nuclear DNA of diabetic animals in the short period, and were also recovered after glycemic control. We have identified a kidney pathway that is gradually altered during the course of diabetes and remains persistently changed after late glycemic control. This pathway comprises an early decline of uric acid clearance and pAMPK expression followed by fumarate accumulation, increased TGF-β expression, reduced PGC-1α expression, and downregulation of methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA. The sustained decrease of uric acid clearance in treated diabetes may support the prolonged kidney biochemical alterations observed after tight glycemic control, and this regulation is likely mediated by the sustained decrease of AMPK activity and the induction of inflammation. This work proposes the first consideration of the possible role of hyperuricemia and the underlying biochemical changes as part of metabolic memory in diabetic nephropathy.

As cianobactérias apresentam distribuição variada e podem ocorrer desde as regiões frias do ártico até os trópicos, em corpos dágua doce e no ambiente marinho. Algumas espécies de cianobactérias produzem compostos com conhecida toxidade, podendo causar efeitos deletérios em seres humanos e animais. Entre estes compostos estão os com atividade neurotóxica devido aos mais variados mecanismos de ação. O objetivo geral deste projeto é a obtenção por via sintética de algumas neurotoxinas e variantes, entre elas a β-N-metil-L-alanina (L-BMAA), anatoxina-a e anatoxina-a(s), bem como algumas aplicações. Para a L-BMAA, foi buscada a determinação de rotas sintéticas viáveis para a obtenção deste aminoácido modificado sob a forma racêmica e enantiomericamente pura, além de um possível produto cíclico que pode ser gerado naturalmente a partir da L-BMAA. Algumas rotas estratégicas foram determinadas com êxito para a síntese destes compostos. Entre as aplicações dos produtos obtidos podem ser citados: (i) a determinação de um método analítico para a determinação deste aminoácido por RMN de 1H; (ii) um método analítico por LC-MS utilizando D3-L-BMAA como padrão interno e (iii) a indicação de um possível mecanismo de neurotoxidade ligado a neurodegeneração via um intermediário produzido naturalmente do equilíbrio entre L-BMAA e íons bicarbonato. Duas rotas sintéticas estratégicas foram traçadas para a anatoxina-a. Na primeira, que não foi bem sucedida, partiu-se de um biciclo já formado e em sua etapa chave deveria ocorrer à expansão de um anel tropânico que conduziria ao biciclo 1:2:4. Na segunda, tentou-se a síntese a partir de uma molécula extremamente simples, o 1,5- ciclooctadieno, e após cinco passos reacionais obteve-se a síntese total da anatoxina-a sob a forma racêmica. A etapa mais importante para essa rota foi a ciclização utilizando-se paládio divalente. Entre as possíveis aplicações dos produtos obtidos sugere-se: (i) o desenvolvimento de um método analítico por LC-MS utilizando D3-anatoxina-a como padrão interno e (ii) ensaios biológicos com os análogos para se determinar potencial agonista, antagonista ou agonista parcial de receptores nicotínicos para esses compostos. A anatoxina-a(s) apresentou um grande desafio para a sua síntese total. Por se tratar de um organofosforado com uma parte alquílica heterocíclica, buscou-se primeiramente a sua síntese parcial. Assim, foi possivel a síntese da guanidina cíclica sob a forma racêmica e quiral, além da obtenção de alguns compostos análogos inéditos. Para a síntese da N-hidroxiguanidina cíclica traçou-se duas diferentes rotas, uma enantioseletiva, partindo do aminoácido asparagina, e outra racêmica, com a utilização de álcool benzílico como material de partida. No entanto, apesar da produção de intermediários e análogos, não foi possível a obtenção do produto final. Entre as aplicações dos produtos sintéticos obtidos estão: (i) o desenvolvimento e validação de um método analítico para a quantificação indireta de anatoxina-a(s) utilizando a N-hidroxiguanidina cíclica como padrão e (ii) a utilização destes intermediários sintéticos em ensaios para se determinar os mecanismos de ação tóxicos, especialmente como inibidores de colinesterases. / Cyanobacteria are aquatic and photosynthetic organisms that can be present in cold areas, such as the Arctic, as well as in tropical waters, in both marine and freshwater environment. They are important species for aquatic life and terrestrial ecosystems since they are on the base of the food web. However, some cyanobacterial species can produce toxic secondary metabolites that have deleterious effects for animals and human. These toxic metabolites are also called cyanotoxins and show different mechanisms of action ranging from hepatotoxic to neurotoxic effects. The aim of this study is the organic synthesis of some common neurotoxins, including some analogues, such as β-N-methyl-L-alanine (L-BMAA), anatoxin-a and anatoxin-a(s). Moreover, focus was given for some possible application of these compounds, especially as analytical standards for water monitoring. Some synthetic routes were carried out in order to produce L-BMAA in both racemic and enantiomerically pure forms. Also, it was synthesized a possible cyclic analogue that may be formed in vivo from L-BMAA. The racemate and the pure L-BMAA were successfully obtained. Some possible application of these compounds were suggested: (i) the development of an analytical method based on 1H NMR analyses for the determination of L-BMAA in environmental and biological samples; (ii) the development of an analytical method based on LC-MS for the determination of L-BMAA, using D3-L-BMAA as an internal standard, in different matrices and (iii) the indication of a cyclic derivative formed in vivo that can be involved in the neurotoxicity of L-BMAA. Two strategies were planned in order to produce anatoxin-a. The first one was not successful and was started by using the bicyclic precursor. The crucial step was the expansion of tropanic ring to produce the 1:2:4 byciclic anatoxin-a precursor. The second strategy was initiated with the 1,5 cyclicoctadiene and after five reaction steps anatoxin-a was finally synthesized in its racemic form. The most important step for this route was the use of palladium. Similar applications were suggested for anatoxin-a: (i) the development of an analytical method based on LC-MS for the determination of anatoxin-a using D3-anatoxin-a as an internal standard in different matrices and (ii) the screening of anatoxin-a and analogues in bioassays based on nicotinic receptors in order to determine their agonistic and antagonistic mechanism of action. The total synthesis of anatoxin-a(s) is still a challenge. This cyanotoxin is a natural organophosphate with an alkylic heterocyclic chain. Therefore, the first step was the production of the cyclic guanidine in both racemic and enantiomerically pure forms. Some cyclic guanidine derivatives were prepared via asparagine and/or benzilic alcohol. However, anatoxin-a(s) was not achieved. The use of the cyclic guanidine can be recommended for: (i) the development of an analytical method based on LC-MS for the indirect determination of anatoxin-a(s) using its alkylic chain as a standard after sample alkalinization and (ii) the screening of anatoxin-a(s) derivatives in cholinesterase assays to determine their toxicity and mechanisms of action.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Adilson Bosetto 2015 PDF.pdf: 2419034 bytes, checksum: 3fdc9e711199e04fe0746f89b07c4bea (MD5) Previous issue date: 2015-03-10 / The application of enzymes in industrial processes, in its broad sense, has shown the market evolution for innovative alternatives for preserving the environment. Brazil has a great potential to develop some technologies, which allow the use of such materials as substratum for products with higher added value, due to the large amount of lignocellulose as waste that comes from agriculture. Therefore, the analysis of genes expression related to microbial degradation of plant cell wall has caught the researchers attention, mainly because it is associated to the possibility of controlled large-scale synthesis of enzymes applied in biofuel production. In this context, the Gram-negative bacterium C. crescentus is found as a promising microorganism for biotechnological exploitation due to its ability on degrading xylan, the major component of plant hemicellulose. There are several genes in the bacterial genome that codify to Xylanases and β-Xylosidases. In order to purify and biochemically characterize the β-Xylosidase III protein of C. crescentus, xynB3 gene (CCNA_00856) that contains 1,623 nucleotides and encodes a protein with conserved domains of β-Xylosidase with 540 amino acid residues has been studied. Therefore, xynB3 gene was isolated from genomic DNA of C. crescentus NA1000 by Polymerase Chain Reaction (PCR) using specific primers. The single amplification product was cloned into pJet1.2Blunt vector in non-cohesive sites and reintroduced in vector of pTrcHisA expression within the reading frame to produce a histidine tag at the amino-terminus area of fusion protein. The obtained construction was denominated pTrcHis-xynB3 and the confirmation of its gene identification was figured out by the DNA sequence after insertion into the TOP10 E. coli strain and subsequent experimental tests of expression in different temperature of growth, IPTG concentrations and induction times. The recombinant protein was overexpressed into inclusion bodies, thus, in a non-soluble form. Different induction and purification protocols were used to obtain the β-xylosidase III pure of C. crescentus, in native or non-native form. However, assays of enzymatic activity with different substrates neither demonstrated β-xylosidase activity nor detectable levels of the protein. These results suggest that the enzyme was not active during the assays, due its expression in inclusion bodies. This suggests that this protein may have a toxic effect on E. coli when expressed at high levels. Thus, this trial contributes to additional data about the xylanolytic complex concerning the aquatic bacterium C. crescentus. / A utilização de enzimas em processos industriais, no seu sentido mais amplo, demonstra a evolução do mercado em relação a alternativas inovadoras de preservação do meio ambiente. Devido à grande quantidade de material lignocelulósico residuário, proveniente da agricultura, o Brasil é um país com elevado potencial para o desenvolvimento de tecnologias que possibilitem a utilização desses materiais como substrato para produtos de maior valor agregado. Dessa forma, o estudo da expressão de genes microbianos relacionados com a degradação da parede celular vegetal tem despertado a atenção de pesquisadores, principalmente pelo fato de estar relacionado com a possibilidade de síntese controlada e em larga escala de enzimas utilizadas na produção de biocombustíveis. Neste contexto, a bactéria gram-negativa Caulobacter crescentus encontra-se como um microrganismo promissor para a exploração biotecnológica em função da capacidade que tem de degradar o xilano, principal componente hemicelulósico das plantas. Essa bactéria contém em seu genoma vários genes que codificam para xilanases e β-xilosidases. Dentre eles o gene xynB3 (CCNA_00856), que apresenta 1623 nucleotídeos e codifica uma proteína contendo domínios conservados de β-xilosidase, com 540 resíduos de aminoácidos, denominada neste trabalho como β-xilosidase III de C. crescentus. Com o objetivo de possibilitar em estudos futuros a caracterização bioquímica dessa proteína, foi estudado o gene xynB3. Para isso, xynB3 foi isolado a partir do DNA genômico de C. crescentus NA1000 por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando oligonucleotídeos específicos. O único produto de amplificação foi clonado no vetor pJet1.2blunt em sítios não coesivos e reintroduzido no vetor de expressão pTrcHisA dentro do quadro de leitura para a produção de uma cauda de histidinas na região amino-terminal da proteína de fusão. A construção obtida foi denominada pTricHis-xynB3 e após confirmação da identidade da mesma por sequenciamento de DNA foi inserida na cepa TOP10 de Escherichia coli e submetida a ensaios experimentais de expressão com diferentes temperaturas de crescimento, concentrações de IPTG e tempos de indução. A proteína recombinante foi super-expressa em corpos de inclusão, portanto, em uma forma não solúvel. Diferentes protocolos de indução e purificação foram empregados para obtenção da β-xilosidase III de C. crescentus pura, em forma nativa ou não nativa. Entretanto, nos ensaios de atividade enzimática, com diferentes substratos, foram obtidos níveis de atividade de β-xilosidase não detectáveis pelas ferramentas utilizadas. Esses resultados sugerem que a enzima não se mostrou ativa durante os ensaios, em função da formação de corpos de inclusão. Isso leva a crer que essa proteína pode apresentar efeito tóxico para E. coli quando expressa em níveis elevados. Assim, este trabalho contribui com dados adicionais a cerca do complexo xilanolítico da bactéria aquática C. crescentus.

Made available in DSpace on 2017-07-10T14:17:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 kelly Jaque.pdf: 1788989 bytes, checksum: 65d07041b0d9003d6666dd84d7fee873 (MD5) Previous issue date: 2013-08-01 / The growing number of overweight and obesity has led to an increase in the number of patients with insulin resistance and diabetes mellitus type 2. MSG obese rats were glucose intolerant, insulin resistant and theirs pancreatic islets secrete more insulin in response to glucose. Subdiafragmatic vagotomy changes the response of islets to glucose and improves glucose homeostasis, supporting the hypothesis that an unbalance of autonomic nervous system with increased parasympathetic nervous system (PNS) action but a decreased sympathetic nervous system function. Studies showed that the PNS is also involved in β-cell proliferation. Therefore, we investigated of PNS participation, using a subdiafragmatic vagal denervation, upon pancreatic β-cell function and mass regulation, and the body glucose control disruption in MSG-obese rats. For this, Male Wistar rats received during the first five days of life monosodium glutamate (MSG) or saline. Subdiaphragmatic vagotomy was performed at 30 days of life. At 90 days of age, we verified static insulin secretion, pancreas morphometric, ERK expression in islets, glucose homeostasis and lipidis. The MSG treatment caused obesity at 90 days of life. MSG rats presented lower body weight and nasoanal length, increased Lee index and fat depots, normoglycemia, hyperinsulinemia, dyslipidemia, glucose intolerance and insulin resistance when compared to CTL. Vagotomy performed at 30-days of age prevented obesity, fat deposition in the liver and ameliorated glucose tolerance and insulin sensitivity in adult MVAG rats in relation to MSG rats. Islets from MSG rats secreted more insulin at stimulatory glucose concentrations than CTL islets. Histological analysis showed that pancreatic islets from MSG rats were lower with a reduction in β-cell area without modification in α-cell content when compared with CTL. Also, MSG group presented an increased number of pancreatic islets per mm2, with higher number of islets, which may contributes to the higher islet and β-cell relative mass in the MSG pancreas. These effects were associated with enhanced proliferation in MSG group. The number of MVAG pancreatic islet were less than MSG. Vagotomoy performed at 30-days of age, reduced islet and β-cell area in the pancreas from 90-days old CVAG rats. Finally, the relative islet and β-cell mass in MVAG and CVAG rats was similar to CTL. Here we verified if ERK was involved in β-cell replication in MSG rats, but presented no alteration. We demonstrate for the first time that adult MSG rats showed enhanced pancreatic β-cell proliferation which contributes to the higher islet insulin secretion in response to glucose. The vagus nerve is the main factor involved in such a process, since vagotomy performed at 30 days of age prevented islet morphological alterations in adult MVAG rats. Possibly this increase PNS activity in MSG endocrine pancreas is responsible to hyperinsulinemia that enhanced fat storage, damaged glucose homeostasis and insulin action in MSG obesity / O crescente número de pessoas com sobrepeso e obesidade tem levado ao aumento no número de pacientes com resistência à insulina (RI) e portadores do Diabetes mellitus tipo 2. Ratos obesos MSG são intolerantes à glicose (Gli), RI e suas ilhotas pancreáticas secretam mais insulina em resposta à concentrações de Gli. A vagotomia subdiafragamática altera a responsividade das ilhotas à Gli e melhora a homeostase glicêmica nestes animais, sugerindo um desbalanço do sistema nervoso autonômico, com aumento do tônus parassimpático e redução do simpático. Estudos demonstram que o sistema nervoso parassimpático (SNP) possui efeito na proliferação das células β-pancreáticas. Desta forma, investigamos a participação do SNP, através da vagotomia subdiafragmática, no metabolismo energético e na proliferação das ilhotas e de células β-pancreáticas de ratos obesos-MSG. Para isto, ratos Wistar machos receberem durante os cinco primeiros dias de vida glutamato monossódico (grupo MSG) ou salina (grupo CTL). A vagotomia subdiafragmática foi realizada aos 30 dias de vida formando os grupos MVAG e CVAG. Aos 90 dias, verificamos a secreção estática de insulina, homeostase glicêmica e lipídica, morfometria do pâncreas e conteúdo proteico da ERK nas ilhotas. Ratos MSG apresentaram redução do peso corporal e comprimento nasoanal, aumento do índice de Lee e acúmulo de gordura, normoglicêmia, hiperinsulinemia, dislipidemia, intolerância à Gli e RI comparados aos CTL. A vagotomia realizada aos 30 dias de vida preveniu obesidade, acúmulo de gordura no fígado e melhorou a tolerância à Gli e a sensibilidade à insulina em ratos MVAG adultos em relação aos ratos MSG. As ilhotas dos animais MSG secretaram mais insulina quando estimulada pela Gli, em relação aos animais CTL. As análises histológicas mostram que as ilhotas pancreáticas dos animais MSG são menores com redução da área das células β sem alteração nas células α em relação aos CTL. O grupo MSG apresenta um aumento do número das ilhotas por mm2, que pode estar contribuindo com o aumento da massa relativa das ilhotas e das células β. Esse efeito está associado ao aumento da proliferação no grupo MSG. O número de ilhotas foi menor nos MVAG em relação aos MSG. A vagotomia realizada aos 30 dias de vida reduziu a área das ilhotas e das células β aos 90 dias de vida nos animais CVAG. Finalmente, a massa relativa das ilhotas e da células β no MVAG e CVAG foram similares ao CTL. Verificamos se a ERK estava envolvida na proliferação das células β nos ratos MSG, porém não apresentaram alterações desta proteína. Pela primeira vez demonstramos que ratos MSG apresentam aumento da proliferação das células β que contribui com o aumento da secreção de insulina em resposta à Gli. O nervo vago é o principal fator envolvido neste processo, visto que a vagotomia realizada aos 30 dias de vida preveniu as alterações morfológicas das ilhotas nos ratos MVAG adultos

Made available in DSpace on 2017-07-10T14:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ final - ENTREGA.pdf: 2247856 bytes, checksum: 146d4be3628d74a867ddf4826f6f6e8a (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Purpose: Herein we evaluated the expression of genes and protein involved with hepatic lipids pathway and investigate whether the improvement on glucose homeostasis is associated with modifications in the islets morphology in HyO rats submitted to duodenal-jejunal bypass (DJB). Methods: During the first 5 days of life, male newborn Wistar rats received a subcutaneous injection of monosodium glutamate [4 g/kg body weight (BW), hypothalamic obesity (HyO) group], or saline (CTL group). At 90 days of age, HyO rats were submitted to DJB or sham operations forming HyO DJB and HyO Sham group, respectively. Two months after DJB, serum parameters, expression of genes and protein in the liver and islets morphology were verified. Results: Although DJB operation normalized serum triglycerides (TG) and non-esterified fatty acids (NEFA) concentration compared to HyO Sham rats, HyO DJB rats did not alter TG liver content as well as, the expression of hepatic genes and protein involved with lipids metabolism. DJB operation normalized insulinemia and insulin resistance and restored β-cell secretion in the presence of 8.3 mM glucose independently of weight loss. In addition, HyO DJB rats presented a reduction in total islets and β-cell area (pancreas area percentage) and in islets cells proliferation (verified by the number of nucleus stained by Ki67 protein - a cellular marker for proliferation). Conclusions: Although DJB not affect liver lipids metabolism in HyO rats two months after surgery, the improvement on glucose homeostasis could be associated with modifications in islets morphology and proliferation. / Objetivo: Avaliar a expressão de genes e proteínas envolvidos com a via lipídica hepática e investigar se a melhoria na homeostase glicêmica está associada a alterações na morfologia das ilhotas em ratos MSG submetidos à derivação duodeno-jejunal (DDJ). Métodos: Durante os primeiros 5 dias de vida, ratos Wistar recém-nascidos receberam injeções subcutâneas de glutamato monossódico [4 g / kg de peso corporal (BW), grupo MSG], ou solução salina (grupo CTL). Aos 90 dias de idade, os animais MSG foram submetidos à DDJ ou a falsa operação, formando os grupos MSG-DDJ e MSG-FO, respectivamente. Dois após a cirurgia, foram avaliados os parâmetros séricos, a expressão de genes e proteínas do fígado e morfologia das ilhotas pancreáticas. Resultados: A cirurgia de DDJ normalizou as concentrações de triglicerídeos séricos (TG) e dos ácidos graxos não-esterificados em comparação aos animais MSG-FO, porém não alterou o conteúdo de TG no fígado, bem como, a expressão de genes e proteínas hepáticas envolvidas com o metabolismo lipídico. Além disso, a DDJ normalizou a insulinemia e a resistência à insulina, e restaurou a secreção de insulina pelas células-β na presença de 8,3 mM de glicose, independentemente da perda de peso. Ainda, ratos MSG-DDJ apresentaram redução nas áreas totais da ilhota e de células β (% área pâncreas) e na proliferação de células da ilhota (verificado pelo número de núcleos corados por Ki67). Conclusões: A cirurgia de DDJ não alterou o metabolismo lipídico no fígado, dois meses após a realização da cirurgia, sendo assim, a melhora na homeostase glicêmica nos animais pode estar associada a alterações na morfologia e proliferação das ilhotas pancreáticas

Algumas das estratégias utilizadas para entender a biologia de células tronco embrionária (CTE) são baseadas na identificação de cascatas de sinalização que induzem a diferenciação e auto-renovação das CTE através da interferência seletiva de processos específicos. A família das proteínas quinase C (PKC) é conhecida por participar dos processos de auto-renovação e diferenciação celular em CTE, entretanto, o papel específico das diferentes isoenzimas das PKCs ainda precisa ser elucidado. Desta forma investigamos. o papel das PKCs atípicas (aPKCs) em CTE indiferenciadas utilizando um inibidor específico para estas serina/ treonina quinases, o peptídeo pseudossubstrato das aPKCs, e fosfoproteômica. A maioria das proteinas identificadas cuja fosforilação reduziu após o tratamento com o inibidor das aPKC, são proteínas envolvidas com o metabolismo principalmente com a via glicolítica. Além disso, a inibição das aPKCs levou a redução do consumo de glicose, secreção de lactato, acompanhada da redução da atividade da lactato desidrogenase, e aumento da fosforilação oxidativa, sendo analisada através do consumo de oxigênio após o tratamento com oligomicina e FCCP. Verificamos também que as aPKCs são capazes de fosforilar diretamente a piruvato quinase. A glicólise aeróbica parece ser fundamental para a manutenção da indiferenciação das CTE, e demonstramos que as aPKCs participam deste processo auxiliando na auto-renovação das CTE indiferenciadas. Também observamos que as aPKCs assim como a PKCβI modulam a fosforilação da α-tubulina, porém ao passo que as aPKCs interagem com a α-tubulina durante a interfase, a PKCβI interage com a mesma apenas durate a mitose. Estes resultados motivaram a segunda parte da tese, na qual o papel da fosforilação da α-tubulina pela PKCβI foi investigado. O resíduo de treonina 253, conservado em diversas espécies de vertebrados e localizado na interface de polimerização entre a α- e a β-tubulina foi identificado, como um novo sítio de fosforilação da α-tubulina pela PKCβI. Este sítio não está em um consenso linear para a PKC, entretanto é um consenso formado estruturalmente, onde aminoácidos básicos distantes na sequência linear se tornam justapostos na estrutura terciária da proteína. Estudos de simulação por dinâmica molecular demonstraram que a interação entre a α e β-tubulina aumenta após esta fosforilação, uma vez que T253 fosforilada passa a interagir com K105, um residuo conservado na β-tubulina. A fosforilação in vitro de α-tubulina aumenta a taxa de polimerização da tubulina e a inibição da PKCβI em células reduziu a taxa de repolimerização do microtubulo após o tratamento com nocodazol. Além disso, a importância da fosforilação deste sítio foi demonstrada pelo fato de que um mutante fosfomimético GFP-α-tubulina, T253E ser mais incorporado no fuso mitótico ao passo que T253A foi menos incorporado do que a proteína selvagem. Nossos dados suportam a hipótese que os consensos estruturais formados podem ser importantes sítios de reconhecimento pelas quinases e que a fosforilação de T253 da α-tubulina afeta a estabilidade do polímero. Em conclusão, utilizando métodos de fosfoproteômica e interferência seletiva de vias de sinalização, combinados a validações experimentais dos alvos identificados podemos propor a importância funcional das aPKCs e PKCβI em CTE indiferenciadas. / Some of the strategies used to understand stem cell biology are based on the identification of signalling cascades that lead to differentiation and self-renewal of embryonic stem cells (ESC) by selective interference of specific signalling processes. The protein kinase C (PKC) family is known to participate in ESC self-renewal and differentiation, however, the specific role of the different PKC isoenzymes in these cells remains to be determined. Therefore, we investigated the role of atypical PKCs (aPKC) in undifferntiated ESC using a specific inhibitor for these serine/ threonine kinases, pseudo-substrate peptide of aPKCs, and phosphoproteomics. The majority of proteins whose phosphorylation decreased upon aPKC inhibition, are proteins involved in metabolism in particular with the glycolytic pathway. Besides that, inhibiton of aPKCs led to a decrease in glucose uptake and lactate secretion, followed by a decrease in lactate dehydrogenase activity, and an increase in mitochondrial activity as measured by oxygen consumption after treatment with olygomycin and a chemical uncoupler. We also verified that aPKCs are able to directly phosphorylated pyruvate kinase. Aerobic glicolysis seems to be fundamental for the maintainance of undifferentiated ESC, and we demonstrated that aPKCs participte in these processes helping to maintain self-renewal of undifferentiated ESC. We also observed that aPKCs as PKCβI modulate the phosphorylation of α-tubulin, however, while aPKCs interact with α-tubulin during interfase PKCβI interacts with α-tubulin only during mitosis. These results lead to the second part of this thesis. We investigated the role of α-tubulina phosphorylation by PKCβI. Indentifying threonine 253, a conserved residue in several vertebrate species, of localized at the polymerization interface between α- and β-tubulin, as a phosphorylation site of α-tubulin by PKCβI. This site is not in a linear consensus for PKC, however, it is in a structuraly formed consensus, where basic aminoacids distant in the linear sequence are juxtaposed in the three dimentional protein structure. Simulation studies by molecular dynamics show that the interaction between α and β-tubulin increases upon this phosphorylation, once, phosphorylated T253 interacts with com K105, a conserved residue in β-tubulin. The in vitro phosphorylation of α-tubulin increased tubulin polymerization rate and inhibiton of PKCβI in cells reduced repolimeration rate of microtubles upon treatment with nocodazole. Besides that, the importance of this phosphorylation site were demonstrated by the fact that a phosphomimetic mutant GFP-α-tubulina, T253E is more incorporated in mitotic fuses while T253A is less than wild type. Our data support the hypothesis that structural consensus may be important sites recognized and that T253 phosphorylation of α-tubulin afects the polymer stability. In conclusion, using phosphoproteomics methods and selective interference of signal transduction pathways combined with experimental validation studies of the identified targets we can propose roles for aPKCs and PKCβI in undifferentiated ESC.

O objetivo do estudo foi investigar o remodelamento tecidual e fatores modulados pela via do TGFβ no tecido adiposo subcutâneo na vigência da caquexia associada ao câncer gastrointestinal. O estudo incluiu 59 pacientes divididos em três grupos: Controle, Câncer de peso estável (WSC) e Câncer e Caquexia (CC). Foram observadas alterações morfológicas exclusivas ao tecido adiposo do grupo CC. Houve o aumento na deposição de colágeno, glicoproteínas associadas, e fibras do sistema elásticas. A imunohistoquímica revelou alterações no conteúdo dos colágenos do tipo I, III e VI, e da fibronectina no grupo CC em relação ao grupo Controle e WSC. A presença de miofibroblastos no grupo CC foi confirmada pela imunomarcação para αSMA, e o aumento de 20 vezes do gene FSP1 no tecido adiposo, em associação com expressiva marcação de vimentina em fibroblastos isolados. As concentrações do TGFβ3 estavam aumentadas no tecido adiposo, e TGFβ1 e TGFβ3 nos adipócitos, dos pacientes caquéticos. A imunolocalização revelou maior intensidade para SMAD3 e SMAD4 no grupo CC. Em conclusão, na caquexia associada ao câncer, a via do TGFβ contribui para o comprometimento da biologia do tecido adiposo e o desenvolvimento da fibrose. / Aim of the study was to investigate tissue remodelling and factors modulated by TGFβ pathway in the subcutaneous adipose tissue in gastrointestinal cancer cachexia. The study included 59 patients enrolled into three groups: Control, Weight-stable Cancer (WSC) and Cancer Cachexia (CC). Morphological alterations (HE) were observed in adipose tissue from CC group solely, with reduction in the content of fat cells (area, diameter and circumference). Markedly stain to collagens type I, III, IV and fibronectin by immunohistochemistry revealed changes in the CC group as compared to the control and WSC group. Presence of myofibroblasts in CC group was observed by immunostaining for αSMA, and 20-fold increase of the FSP1 gene in adipose tissue. In association, was reported higher expression for vimentin in isolated fibroblasts. TGFβ3 concentrations were enhanced in adipose tissue, and TGFβ1 and TGFβ3 in adipocytes of cachectic patients in relation to control group. Immunolocalization revealed greater intensity for SMAD3 and SMAD4 in the CC group. Thus, during cancer cachexia the TGFβ pathway contributes to disruption of adipose tissue biology and fibrosis development.