O objetivo do estudo foi investigar o remodelamento tecidual e fatores modulados pela via do TGFβ no tecido adiposo subcutâneo na vigência da caquexia associada ao câncer gastrointestinal. O estudo incluiu 59 pacientes divididos em três grupos: Controle, Câncer de peso estável (WSC) e Câncer e Caquexia (CC). Foram observadas alterações morfológicas exclusivas ao tecido adiposo do grupo CC. Houve o aumento na deposição de colágeno, glicoproteínas associadas, e fibras do sistema elásticas. A imunohistoquímica revelou alterações no conteúdo dos colágenos do tipo I, III e VI, e da fibronectina no grupo CC em relação ao grupo Controle e WSC. A presença de miofibroblastos no grupo CC foi confirmada pela imunomarcação para αSMA, e o aumento de 20 vezes do gene FSP1 no tecido adiposo, em associação com expressiva marcação de vimentina em fibroblastos isolados. As concentrações do TGFβ3 estavam aumentadas no tecido adiposo, e TGFβ1 e TGFβ3 nos adipócitos, dos pacientes caquéticos. A imunolocalização revelou maior intensidade para SMAD3 e SMAD4 no grupo CC. Em conclusão, na caquexia associada ao câncer, a via do TGFβ contribui para o comprometimento da biologia do tecido adiposo e o desenvolvimento da fibrose. / Aim of the study was to investigate tissue remodelling and factors modulated by TGFβ pathway in the subcutaneous adipose tissue in gastrointestinal cancer cachexia. The study included 59 patients enrolled into three groups: Control, Weight-stable Cancer (WSC) and Cancer Cachexia (CC). Morphological alterations (HE) were observed in adipose tissue from CC group solely, with reduction in the content of fat cells (area, diameter and circumference). Markedly stain to collagens type I, III, IV and fibronectin by immunohistochemistry revealed changes in the CC group as compared to the control and WSC group. Presence of myofibroblasts in CC group was observed by immunostaining for αSMA, and 20-fold increase of the FSP1 gene in adipose tissue. In association, was reported higher expression for vimentin in isolated fibroblasts. TGFβ3 concentrations were enhanced in adipose tissue, and TGFβ1 and TGFβ3 in adipocytes of cachectic patients in relation to control group. Immunolocalization revealed greater intensity for SMAD3 and SMAD4 in the CC group. Thus, during cancer cachexia the TGFβ pathway contributes to disruption of adipose tissue biology and fibrosis development.

Introdução e objetivos: β-glicosidases da família GH1 das glicosil-hidrolases possuem um dobramento do tipo barril (β/α)8. Propõe-se que proteínas com este dobramento, que usualmente classificam-se como tendo um único domínio, na verdade são compostas por dois domínios, cada um deles correspondendo a um \"meio barril\" (β/α)4. Assim, as proteínas com dobramento barril (β/α)8 seriam provenientes de uma duplicação e fusão gênica de um ancestral \"meio barril\" (β/α)4. O objetivo geral deste projeto é investigar a existência de dois domínios (β/α)4, as metades N- e C-terminal, na estrutura (β/α)8 barril da β-glicosidase A de Thermotoga maritima (bglTm) e β-glicosidase B de Paenibacillus polymyxa (bglB) por meio de análise da desnaturação térmica e química dessas enzimas. Resultados: Para atingir esse objetivo foram introduzidas mutações que rompem contatos não covalentes entre os supostos domínios destas β-glicosidases. Os segmentos de DNA que codificam as enzimas selvagem e mutantes foram clonados em plasmídeo de expressão pLATE51 e as enzimas recombinantes expressas em Escherichia coli BL21(DE3). Foram purificadas com sucesso as enzimas selvagens e duas mutantes de bglTm, denominadas T1 e T2, que possuem 2 e 4 mutações respectivamente em resíduos na interface inter-metades. Para confirmar o enovelamento destas proteínas recombinantes foi empregada a análise de estruturas secundárias por dicroísmo circular, também o espectro de fluorescência intrínseca de triptofano e sua supressão por acrilamida e finalmente foram determinados parâmetros cinéticos. Observou-se que não houve mudanças significativas na exposição dos triptofanos das proteínas recombinantes, sugerindo que se encontram enoveladas, o que está de acordo com a observação de que as proteínas recombinantes mantêm sua atividade catalítica. Já pela análise de dicroísmo circular concluiu-se que a mutante T1 possui dobramento semelhante à selvagem bglTm e que T2 apresenta diferenças significativas, sendo as porcentagens de α-hélice de 21%, 22% e 10% para bglTm, T1 e T2, respectivamente. Em seguida demonstrou-se que T1 mantém a termo estabilidade semelhante à selvagem, enquanto que T2 tem termo estabilidade reduzida, apresentando kobs de 0,3 min-1 em 80°C e de 0,06 min-1 em 75 °C.. O cálculo de Tm através de Differential Scanning Fluorimetry foi feito para bglB e T2 (42 e 81.7 °C respectivamente), enquanto que bglTm e T1 mantiveram-se estáveis na faixa de temperatura analisada (até 95°C). Na análise do efeito da temperatura sobre a estrutura das mutantes T1 e T2 não se observou nenhuma evidência da presença dos dois supostos domínios (β/α)4. A análise da desnaturação por cloreto de guanidina mostrou que o c50 diminuiu para T2 (2,4 M), mas não mostrou alteração para T1 (4,5 M) em comparação à bglTm (4,3 M). Coerentemente, a estabilidade da enzima selvagem e de T1 na ausência de desnaturante é a mesma (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol), mas se reduziu para a T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). Os cálculos do parâmetro m mostraram uma cooperatividade semelhante na desnaturação de bglTm, T1 e T2, não evidenciando independência entre os dois supostos domínios (β/α)4. Em conclusão, a análise estabilidade da β-glicosidase bglTm frente à temperatura e ao cloreto de guanidina não revelaram a presença dos domínios (β/α)4 que correspondem às metades N- e C-terminal desta β-glicosidase. / Introduction and Aims: β-glucosidases from the family GH1 of the glycosil-hidrolases presents a (β/α)8 barrel folding. These proteins are usually classified as single domain, however it has been alternatively proposed that they actually are formed by two \"half barrel\" (β/α)4. Thus, (β/α)8 barrel proteins had evolved from an \"half barrel\" ancestor that underwent a duplication-fusion event. The general goal of this project is the search for the two putative (β/α)4 domains, which form the N- and C-terminal ends of the β-glucosidase A from Thermotoga maritima (bglTm) and β-glucosidase B from Paenibacillus polymyxa (bglB), detecting their presence through the thermal and chemical stability of these (β/α)8 barrel proteins. Results: Site-directed mutagenesis was employed to replace residues forming non-covalent interaction between the putative (β/α)4 domains. DNA segments coding for bglB, bglTm and mutant bglTm were cloned into the pLATE51 expression vector and produced as recombinant proteins in E. coli BL21(DE3). The bglB, bglTm and two mutant bglTm, hereafter called T1 and T2, with 2 and 4 mutations respectively on residues in the interface between the protein halves, were purified. They were stable folded as shown by detecting their catalytic activity upon two different substrates and also by circular dichroism (CD) and tryptophan fluorescence analysis. Nevertheless, T2 showed a decrease in the α-helix content (10 %) in the CD analysis, whereas bglTm and T1 are similar (22 %). The wild-type bglTm and T1 are thermostable, whereas T2 was inactivated after pre-incubation at high temperature (kobs = 0,3 min-1 at 80 °C and 0,06 min-1 at 75 °C). The Differential Scanning Fluorimetry experiments revealed Tm of 42 e 81.7 °C for bglB and T2, respectively, whereas wild-type bglTm and mutant T1 did not showed any thermal transition up to 95 °C. Indeed, the analysis of the thermal stability of T1 and T2 did not reveal any evidence of the putative (β/α)4 domains. Following that, the analysis of the protein denaturation by guanidine hydrochloride showed that the c50 for T2 was reduced (2.4 M), whereas no modification was observed for bglTm and T1 (4,3 and 4,5 M, respectively). In agreement the stability of bglTm and T1 (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol) is similar, but it was reduced for T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). The m parameter showed a similar cooperative denaturation for wild-type bglTm and mutants T1 and T2, but no evidence of the independent unfolding of the putative (β/α)4 domains was found. Conclusion: In conclusion, the analysis of the thermal and chemical stability of the bglTm did not reveal the presence of the putative (β/α)4 domains that form the N- and C-terminal end of these β-glucosidase.

Embora já tenha sido comprovada a ação adjuvante da SBA-15, pouco se sabe sobre o seu mecanismo molecular que leva a modulação positiva da resposta imunológica. Foi avaliada a ativação do inflamassoma NLRP3, sobre estímulos de SBA-15, em macrófagos de camundongos C57BL/6. Como parâmetro dessa ativação, foi analisada a produção de IL-1β por ELISA. A SBA-15 foi capaz de induzir a produção de IL-1β a níveis semelhantes quando comparado com um agonista de NLRP3 (Nano-SiO2), sugerindo a ativação do inflamassoma. Para avaliar o envolvimento da caspase-1, nos resultados obtidos com a SBA-15, os macrófagos foram estimulados com sílica na presença do inibidor de caspase-1, e como esperado, a produção de IL-1β foi restaurada para o seu nível basal. A ativação do inflamassoma, por estímulos da SBA-15, parece ser parcialmente dependente da fagocitose e da produção das espécies reativas do oxigênio. Além disso, foi visto que a SBA-15 não induz a produção de IL-6, confirmando que essa sílica está envolvida na via do inflamassoma e não em outras vias, como por exemplo, NF-κB. / Although it has already been proven adjuvant action of SBA-15, little is known about its molecular mechanism leading to positive modulation of the immune response. NLRP3 inflammasome activation was evaluated on SBA-15 stimulation in C57BL/6 mice macrophages. As this parameter activation, it analyzed the production of IL-1β by ELISA. The SBA-15 was able to induce the production of IL-1β at levels similar when compared to an agonist of NLRP3 (Nano-SiO2), suggesting the activation of the inflammasome. To assess the involvement of caspase-1, the results obtained with SBA-15, the macrophages were stimulated with silica in the presence of caspase-1 inhibitor, and as expected, IL-1β production was restored to its baseline level. Activation of the inflammasome, by stimuli of SBA-15, appears to be partly dependent on phagocytosis and production of reactive oxygen species. In addition, it was seen that the SBA-15 does not induce IL-6 production, confirming that silica is involved inflammasome the path of and not in other ways, eg, NF-κB.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:12:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Fernanda Dias Silva.pdf: 112667 bytes, checksum: 9ef746769100aea66ac5ebc1d67874c6 (MD5) Previous issue date: 2006-03-17 / The production of industrial foods derived from tomato generates high levels of rejects that are composed basically of seeds and tomato peels. This reject it is rich in carotenoids, especially lycopene and β-carotene, which are pigments whose ingestion is directly linked to the decrease of the risk of chronic-degenerative diseases. The present study has as objective develops simplified and efficient extraction and analysis methods of lycopene and β-carotene starting from this reject using palm oil as coadjutant, seeking the subsequent use of this extract for enrichment of products of easy access to classes economically inferior of the population and as a vehicle of medicines. Initially it was developed the chromatographic analysis method for three columns of RP-HPLC: C18 Chromolith SpeedROD (50 mm x 4,6 mm), C18 Nova-Pack (300 mm x 3,9 mm x 4 µm) and C30 YMC Carotenoid (250 mm x 4,6 mm x 5 µm). All the columns present a considerable reduction in the time of analysis and efficient separation between lycopene and β-carotene, when compared to the analysis reported on scientific literature. Later it was done a study of the thermal stability of the pigments by means of TG, DSC and RP-HPLC seeking to evaluate the maximum temperature which the reject can be heated without the occurrence of considerable losses of the pigments. The thermogravimetric curves demonstrated that the loss of mass happens to temperatures higher than those observed by the degradations of the pigments by RP-HPLC. It means that occurs the transformation of lycopene and β-carotene in intermediary compounds which are volatilized in higher temperatures. For the development of the extraction method several variables were tested being obtained the following optimized condition: 25 g of sample was dissolved in 50 mL of hexane and 0.1 mL of palm oil, shaking by 90 minutes under 50ºC. The proposed method demonstrated to be viable once it happens in only one stage, with the use of only an solvent which can be used again after the process. The time of extraction is completely acceptable, as well as the amount of solvent used, being all the parameters compatible with industrial implementation. The oily extract was still characterized with regard to the tocopherols and tocotrienols levels in the palm oil as well as the fatty acid and triacylglicerol compositions. It was obtained the prevalence of y-tocotrienol, oleic and palmitic acids and POO and POP triacylglicerides. / A produção de alimentos industriais derivados do tomate gera elevados níveis de rejeitos que são compostos basicamente de sementes e cascas de tomate. Este rejeito é extramente rico em carotenóides, especialmente licopeno e β-caroteno, pigmentos cuja ingestão está diretamente ligada à diminuição do risco de doenças crônico-degenerativas. O presente estudo tem como objetivo desenvolver métodos de extração e análise simplificados e eficientes de licopeno e β-caroteno a partir deste rejeito utilizando azeite de dendê como coadjuvante, visando a posterior utilização deste extrato para enriquecimento de produtos de fácil acesso ás camadas economicamente inferiores da população e como veículo de medicamentos. Inicialmente, foi desenvolvido o método cromatográfico de análise para três colunas de RP-HPLC: C18 Chromolith SpeedROD (50 mm x 4,6 mm), C18 Nova-Pack (300 mm x 3,9 mm x 4 µm) e C30 YMC Carotenoid (250 mm x 4,6 mm x 5 µm). Todas as colunas apresentaram uma redução considerável no tempo de análise e eficiente separação entre licopeno e β-caroteno, quando comparadas as análises publicadas na literatura científica. Posteriormente, foi realizado um estudo da estabilidade térmica dos pigmentos através de TG, DSC e RP-HPLC visando avaliar a máxima temperatura na qual o rejeito pode ser aquecido sem que ocorram perdas consideráveis de pigmentos. As curvas termogravimétricas demonstraram que o inicio da perda de massa ocorre à temperaturas muito superiores aquelas observadas para a degradação dos pigmentos via RP-HPLC. Isso significa que ocorre a transformação do licopeno e β-caroteno em compostos intermediários que serão volatilizados somente em temperaturas superiores. Para o desenvolvimento do método de extração foram testadas diversas variáveis sendo obtida a seguinte condição otimizada: 12,5 g de amostra solubilizada em 25 mL de hexano e 0,1 mL de azeite de dendê, com agitação de 90 minutos à 50ºC. O método proposto demonstrou ser viável uma vez que ocorre em uma única etapa, e com a utilização de um único solvente passível de reutilização após o processo. O tempo de extração é completamente aceitável, assim como a quantidade de solvente utilizada, sendo todos os parâmetros compatíveis com a implementação industrial. O extrato oleoso foi ainda caracterizado com respeito aos teores de tocoferóis e tocotrienóis no azeite de dendê, bem como sua composição em ácidos graxos e triacilglicerídeos. Obteve-se o predomínio de y-tocotrienol, ácidos oléico (O) e palmítico (P) e triacilglicerídeos POO e POP.

Nesta monografia foram desenvolvidas metodologias sintéticas para a funcionalização das 2-(S)-isopropil-5-iodo-pirimidinonas, utilizando a reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura e a reação de cicloadição azida-acetileno com cobre, através de estratégias simples e eficientes que permitiram a preparação de uma série de compostos com grande diversidade estrutural. Inicialmente descreve-se a síntese da 2-(S)-isopropil-5-iodo-pirimidinona (S)- 3, a partir da (S)-asparagina enantiomericamente pura 1, um aminoácido barato e de fácil acesso, produzindo na primeira etapa o 2-(S)-isopropil-peridropirimidinona-6- ácido carboxílico (2S,6S)-2, que reagindo com diacetoxiiodo benzeno/iodo e BF3.OEt2, gera a pirimidinona (S)-3. Em seguida, preparou-se uma série de 2-(S)-isopropil-5-aril-pirimidinonas (S)- 6a-q e 2-(S)-isopropil-5-alquinil-pirimidinonas (S)-7a-q, através da reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura, sob catálise de paládio, utilizando aril- (4aq) e alquiniltrifluoroboratos de potássio (5a-q), respectivamente. Desta forma sintetizou-se uma variedade de pirimidinonas com alterações programadas de substituintes na posição 5 do anel, com rendimentos de 15% a 95%. Ainda a fim de obter algumas pirimidinonas com substituintes acetilênicos alquílicos 9a-f, utilizou-se a metodologia de acoplamento de Sonogashira. Em todos os casos obtiveram-se bons rendimentos. Dando sequência ao projeto, sintetizou-se as 2-(S)-isopropil-pirimidinonas funcionalizadas na posição C5 com anéis triazólicos substituídos na posição N1 (S)- 11a-k, através da reação de cicloadição azida-acetileno utilizando CuI como fonte de cobre e ondas ultra-sônicas como fonte de energia. Preparou-se diversos compostos, todos com rendimentos variando de 79% a 87% em 5 minutos de reação. Por último, através da redução da dupla ligação endocíclica dos compostos (S)-6a, 6b, 6g, 6l e 6n e posterior hidrólise utilizando radiação microondas proporcionou a obtenção de α-aril β-aminoácidos altamente enantioenriquecidos. / This monograph shows the development of a synthetic methodology for the functionalization of 2-(S)-isopropyl-5-iodo-pyrimidinones using either Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions or cycloaddition reactions of azide-acetylenes with copper, through a simple and efficient pathway enabling the preparation of a series of structurally diverse compounds. This paper begins by describing the synthesis of 2-(S)-isopropyl-5-iodopyrimidinones (S)-3, from enantiomerically pure (S)-asparagine 1. This inexpensive and readily available amino acid forms 2-(S)-isopropyl-perhidropyrimidinone-6- carboxylic acid (2S, 6S)-2, which is reacted with DIB / iodine and BF3·OEt2 to form pyrimidinone (S)-3. Using palladium-catalyzed Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions, a series of 2-(S)-isopropyl-5-arylpyrimidinones (S)-6a-q and 2-(S)-isopropyl-5- alkynylpyrimidinones (S)-7a-q were prepared using potassium aryl- (4a-q) and alkynyltrifluoroborates (5a-q), respectively. With this reaction, a variety of pyrimidinones with different substituents at position 5 of the ring were synthesized, with yields ranging from 15% to 95%. The Sonogashira coupling reaction was used to prepare pyrimidinones with alkyl acetylenic substituents (S)-9a-f, giving good yields in all cases. 2-(S)-Isopropylpyrimidinones were then functionalized in the C5 position with N1 (S)-11a-k substituted triazole rings. These functionalizations were performed by the cycloaddition of azide-acetylenes using CuI and ultrasonic waves, which provided enough energy to reduce the reaction time to only five minutes. Several different variations of this compound were prepared, all with yields between 78% and 87%. Finally, the endocyclic double bonds in compounds (S)-6a, 6b, 6g, 6l and 6n were reduced, followed by a hydrolysis using microwave radiation to afford the highly enantioenriched α-aryl β-amino acids.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:23:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Adilson Bosetto 2015 PDF.pdf: 2419034 bytes, checksum: 3fdc9e711199e04fe0746f89b07c4bea (MD5) Previous issue date: 2015-03-10 / The application of enzymes in industrial processes, in its broad sense, has shown the market evolution for innovative alternatives for preserving the environment. Brazil has a great potential to develop some technologies, which allow the use of such materials as substratum for products with higher added value, due to the large amount of lignocellulose as waste that comes from agriculture. Therefore, the analysis of genes expression related to microbial degradation of plant cell wall has caught the researchers attention, mainly because it is associated to the possibility of controlled large-scale synthesis of enzymes applied in biofuel production. In this context, the Gram-negative bacterium C. crescentus is found as a promising microorganism for biotechnological exploitation due to its ability on degrading xylan, the major component of plant hemicellulose. There are several genes in the bacterial genome that codify to Xylanases and β-Xylosidases. In order to purify and biochemically characterize the β-Xylosidase III protein of C. crescentus, xynB3 gene (CCNA_00856) that contains 1,623 nucleotides and encodes a protein with conserved domains of β-Xylosidase with 540 amino acid residues has been studied. Therefore, xynB3 gene was isolated from genomic DNA of C. crescentus NA1000 by Polymerase Chain Reaction (PCR) using specific primers. The single amplification product was cloned into pJet1.2Blunt vector in non-cohesive sites and reintroduced in vector of pTrcHisA expression within the reading frame to produce a histidine tag at the amino-terminus area of fusion protein. The obtained construction was denominated pTrcHis-xynB3 and the confirmation of its gene identification was figured out by the DNA sequence after insertion into the TOP10 E. coli strain and subsequent experimental tests of expression in different temperature of growth, IPTG concentrations and induction times. The recombinant protein was overexpressed into inclusion bodies, thus, in a non-soluble form. Different induction and purification protocols were used to obtain the β-xylosidase III pure of C. crescentus, in native or non-native form. However, assays of enzymatic activity with different substrates neither demonstrated β-xylosidase activity nor detectable levels of the protein. These results suggest that the enzyme was not active during the assays, due its expression in inclusion bodies. This suggests that this protein may have a toxic effect on E. coli when expressed at high levels. Thus, this trial contributes to additional data about the xylanolytic complex concerning the aquatic bacterium C. crescentus. / A utilização de enzimas em processos industriais, no seu sentido mais amplo, demonstra a evolução do mercado em relação a alternativas inovadoras de preservação do meio ambiente. Devido à grande quantidade de material lignocelulósico residuário, proveniente da agricultura, o Brasil é um país com elevado potencial para o desenvolvimento de tecnologias que possibilitem a utilização desses materiais como substrato para produtos de maior valor agregado. Dessa forma, o estudo da expressão de genes microbianos relacionados com a degradação da parede celular vegetal tem despertado a atenção de pesquisadores, principalmente pelo fato de estar relacionado com a possibilidade de síntese controlada e em larga escala de enzimas utilizadas na produção de biocombustíveis. Neste contexto, a bactéria gram-negativa Caulobacter crescentus encontra-se como um microrganismo promissor para a exploração biotecnológica em função da capacidade que tem de degradar o xilano, principal componente hemicelulósico das plantas. Essa bactéria contém em seu genoma vários genes que codificam para xilanases e β-xilosidases. Dentre eles o gene xynB3 (CCNA_00856), que apresenta 1623 nucleotídeos e codifica uma proteína contendo domínios conservados de β-xilosidase, com 540 resíduos de aminoácidos, denominada neste trabalho como β-xilosidase III de C. crescentus. Com o objetivo de possibilitar em estudos futuros a caracterização bioquímica dessa proteína, foi estudado o gene xynB3. Para isso, xynB3 foi isolado a partir do DNA genômico de C. crescentus NA1000 por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando oligonucleotídeos específicos. O único produto de amplificação foi clonado no vetor pJet1.2blunt em sítios não coesivos e reintroduzido no vetor de expressão pTrcHisA dentro do quadro de leitura para a produção de uma cauda de histidinas na região amino-terminal da proteína de fusão. A construção obtida foi denominada pTricHis-xynB3 e após confirmação da identidade da mesma por sequenciamento de DNA foi inserida na cepa TOP10 de Escherichia coli e submetida a ensaios experimentais de expressão com diferentes temperaturas de crescimento, concentrações de IPTG e tempos de indução. A proteína recombinante foi super-expressa em corpos de inclusão, portanto, em uma forma não solúvel. Diferentes protocolos de indução e purificação foram empregados para obtenção da β-xilosidase III de C. crescentus pura, em forma nativa ou não nativa. Entretanto, nos ensaios de atividade enzimática, com diferentes substratos, foram obtidos níveis de atividade de β-xilosidase não detectáveis pelas ferramentas utilizadas. Esses resultados sugerem que a enzima não se mostrou ativa durante os ensaios, em função da formação de corpos de inclusão. Isso leva a crer que essa proteína pode apresentar efeito tóxico para E. coli quando expressa em níveis elevados. Assim, este trabalho contribui com dados adicionais a cerca do complexo xilanolítico da bactéria aquática C. crescentus.

A furosemida é um fármaco de ação diurética e amplamente utilizado em tratamentos de doenças renais, cardíacas e pulmonares. Sua absorção é problemática e de alta variabilidade inter e intraindividual. Este fármaco tem sido classificado como pertencente às classes II (baixa solubilidade e alta permeabilidade) ou IV (baixa permeabilidade e baixa solubilidade) do Sistema de Classificação de Biofarmacêutica (SCB). Em estudos anteriores da equipe de pesquisa, SPRICIGO e colaboradores (2008) e SILVA (2014) desenvolveram complexos de furosemida com hidroxipropil-&#946;-ciclodextrina que permitiram a otimização da solubilidade deste fármaco. Entretanto, dados sobre a sua permeabilidade intestinal, quando complexado, não foram determinados. Somando-se a isto, a literatura apresenta informações distintas em relação a este parâmetro, o que corrobora a importância de se avaliar a permeabilidade deste fármaco. Diversas técnicas têm sido empregadas para a avaliação da permeabilidade intestinal dos fármacos. No presente trabalho empregou-se o modelo de perfusão in situ de passagem tripla, cuja técnica possibilita avaliar a permeabilidade em três segmentos diferentes em um mesmo animal e ainda, apresenta características interessantes, pois trata-se de um método que proporciona, durante todo o experimento, condições mais próximas daquelas encontradas durante o processo in vivo de absorção de fármacos no intestino tais como: suprimento sanguíneo, inervação intacta, preservação das proteínas transportadoras de membranas e presença da camada de muco. O presente trabalho foi dividido nas seguintes etapas: (i) obtenção da furosemida complexada com hidroxipropil-&#946;-ciclodextrina, (ii) caracterização dos fármacos utilizando técnicas de análises térmicas, (iii) estudo de perfusão in situ de passagem tripla nos três segmentos intestinais (duodeno, jejuno e íleo) de ratos machos Wistar na ausência e na presença de inibidores da glicoproteína P e de enzimas metabolizadoras CYP3A4 com posterior análise estatística do impacto da ciclodextrina e inibidores na permeabilidade da furosemida e; (iv) análise histológica das microvilosidades intestinais após o ensaio de perfusão in situ nos três segmentos intestinais. Os valores encontrados em cada segmento para furosemida complexada foram: 8,58 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1; 9,15 ± 0,003 x10-5 cm.s-1 e; 8,06 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1, respectivamente para duodeno, jejuno e íleo enquanto que para furosemida pura encontraram-se os seguintes: 3,42 ± 0,08 x 10-5 cm.s-1 para duodeno; 3,87 ± 0,11 x 10-5 cm.s-1 para jejuno e 3,08 ± 0,001 x 10-5 cm.s-1 para íleo. Assim sendo, os valores obtidos para a permeabilidade da furosemida complexada foram significativamente superiores (p < 0,05) aos da furosemida pura, sugerindo que, a ciclodextrina pode ter influência no mecanismo de transporte da furosemida, que é via passiva paracelular. Quanto aos mecanismos envolvidos na permeabilidade da furosemida através dos enterócitos, pode-se sugerir que observou-se pouca influência dos inibidores da glicoproteína P (P-gp) e da enzima CYP3A4, sugerindo que não há uma participação importante destes mecanismos em sua absorção intestinal. / Furosemide, which is a diuretic drug, is widely used in heart, kidney and pulmonary disease treatments. The absorption is problematic with high variability inter and intra individuals. This drug has been classified as belonging to class II (low solubility and high permeability) or IV (low permeability and low solubility) of the Biopharmaceutical Classification System (BCS). In previous studies of the research team, Spricigo and colleagues (2008) and Silva (2014) developed complex of furosemide with hydroxypropyl-&#946;-cyclodextrin which allowed the optimization of the solubility of this drug. However, datas concerning it\'s intestinal permeability, when complexed, have not been determined. Addicted to this, the literature shows many information regarding to this parameter, which confirms the importance of the evaluation of the permeability of this drug. Some techniques have been employed in order to evaluate the intestinal permeability of drugs. In the present work, a triple single-pass intestinal perfusion technique was used for three different segments. This technique enables the evaluation of the permeability of different segments in the same animal and also has interesting features such as: it provides during all the experiment conditions closer to those found in in vivo process of a drug absorption in the gut; blood supply; intact innervations; preservation of membrane transporter proteins and presence of mucus layer. This study was divided into the following steps: (i) obtaining furosemide complexed with hydroxypropyl-&#946;-cyclodextrin, (ii) characterization of drugs using techniques of thermal analysis, (iii) perfusion study in situ triple passage in three segments (duodenum, jejunum and ileum) from male Wistar rats in the absence and presence of inhibitors of P-glycoprotein and metabolizing enzymes CYP3A4 and subsequential statistical analysis of the impact of the cyclodextrin and the inhibitors in the permeability of furosemide and (iv) histological analysis of intestinal microvilli after in situ perfusion assay in three segments. The values found in each segment for complexed furosemide were: 8,58 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1; 9,15 ± 0,003 x 10-5 cm.s-1; 8,06 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1, respectively for duodenum, jejunum and ileum while for pure furosemide, the values were: 3,42 ± 0,08 x 10-5 cm.s-1 to duodenum; 3,87 ± 0,11 x 10-5 cm.s-1 to jejunum and 3,08 ± 0,001 x 10-5 cm.s-1 to ileum. Thus, the values obtained for the permeability of the complexed furosemide were significantly higher (p < 0,05) than those found for pure furosemide, suggesting that the cyclodextrin might have an influence on the transport mechanism of furosemide, which is passive paracellular route. About the mechanisms involved in the permeability of furosemide through the enterocytes, it can be suggested that there was little effect of P-glycoprotein (P-gp) inhibitors and CYP3A4 enzyme, suggesting that there is an important role of these mechanisms in the furosemide intestinal absorption.

O trabalho de tese é dividido em dois capítulos e visou explorar a química das diazocetonas &#945;,&#946;-insaturadas bem como dos ilídeos &#946;-cetosulfoxônios. No primeiro capítulo é apresentado o emprego das diazocetonas &#945;,&#946;-insaturadas como novos aceptores em reações de aza-Michael. A adição conjugada de aminas primárias e secundárias foi explorada, assim como o uso de aminas quirais para avaliar a versão assimétrica da reação. Além da formação desses adutos, também foram investigadas estratégias para a construção de heterocíclicos nitrogenados a partir destes ou via protocolos \"one-pot\" (partindo das diazocetonas &#945;,&#946;-insaturadas) levando à formação de 2- e 3-pirrolidinonas. Por fim, foi avaliada a aplicação da metodologia desenvolvida na síntese do produto natural Barmumicina. O segundo capítulo se dispôs a investigar o emprego dos ilídeos &#946;-cetosulfoxônios como substitutos de compostos diazocarbonílicos em reações de inserção. Num primeiro momento, avaliaram-se reações de inserção S-H intermolecular, visando a construção do fragmento &#946;-cetotioéter. Alguns estudos competitivos e mecanísticos, bem como estratégias assimétricas também compõem o escopo. Num segundo momento, os ilídeos foram empregados em reações de inserção N-H intramolecular, no qual, a partir de sulfoxônios derivados de aminoácidos, vislumbrou-se a formação de 3-azetidinonas. / This thesis is divided into two chapters which are related to the chemistry of &#945;,&#946;-unsaturated diazoketones and &#946;-ketosulfoxonium ylides. The first chapter presents the utility of &#945;,&#946;-unsaturated diazoketones as new aza-Michael acceptors. Conjugate addition of primary and secondary amines was explored, as well as the use of chiral amines to evaluate the asymmetric version of the reaction. In addition to the formation of these adducts, it was also investigated some strategies for the synthesis of 2- and 3-pyrrolidinones via the \"one-pot\" protocols (starting directly from the &#945;,&#946;-unsaturated diazoketones). Finally, the synthesis of the natural product Barmumicyn was evaluated from this methodology. The second chapter aimed to investigate the use of &#946;-ketosulfoxonium ylides as diazocarbonyl compounds substitutes in insertion reactions. At first, the intermolecular S-H insertion reaction was studied aiming the construction of the &#946;-ketothioether fragment. Some competitive and mechanistic studies, as well as asymmetric versions are also part of the scope. Secondly, some ylides were also employed in intramolecular N-H insertion reactions (from sulfoxonium amino acid derivatives) aiming the formation of 3-azetidinones.

A causa de morte da maioria das pacientes com câncer de mama se deve à doença metastática desenvolvida a partir do tumor primário. A degradação dos componentes da matriz extracelular (MEC), um dos principais eventos do processo metastático, é regulada pelo balanço entre as atividades das metaloproteinases de matriz (MMPs) e dos seus inibidores, tanto os inibidores teciduais (TIMPs) como o inibidor associado à membrana (RECK). Contudo, ainda existe pouca informação sobre os mecanismos moleculares responsáveis pela manutenção deste balanço. No presente trabalho, foi investigado o envolvimento de TGF-&#946;1 (Transforming Growth Factor-&#946;1), uma citocina multifuncional é capaz tanto de inibir o crescimento celular, quanto de promover invasão e metástase, dependendo do estadiamento e do tipo de tumor, na regulação da expressão de MMPs, TIMPs e RECK, em modelo de câncer de mama. Primeiramente, examinou-se os níveis de expressão de mRNA das isoformas e receptores de TGF-&#946;, em um painel de cinco linhagens de carcinoma mamário humano, com diferentes potenciais invasivos e metastáticos, por qRT-PCR. Os resultados obtidos demonstraram uma correlação positiva entre a expressão dessas moléculas, e a progressão do caráter invasivo e metastático celular. Em seguida, a linhagem altamente invasiva, MDA-MB-231, foi tratada com diferentes concentrações de TGF-&#946;1 recombinante. Esta citocina foi capaz de modular a expressão gênica de MMPs (MMP-2 e MMP-9) e de seus inibidores (TIMP- 2 e RECK). Tanto ERK½, quanto p38MAPK mostraram-se envolvidas neste mecanismo. Foi demonstrado que a inibição da atividade de ERK½ alterou a expressão das proteínas MMP-9, TIMP-2 e RECK, enquanto o bloqueio de p38 MAPK afetou os níveis protéicos de MMP-2 e TIMP-2. O aumento do potencial migratório e invasivo da linhagem MDA-MB-231, induzido por TGF-&#946;1, mostrou-se também dependente da atividade de MMPs, ERK½ e p38MAPK. Dada a ausência de informações sobre o papel de RECK em modelo mamário, a função deste inibidor de MMPs também foi investigada. Primeiramente, analisou-se a expressão de RECK ao longo do desenvolvimento da mama e, posteriormente, em 1040 amostras tumorais de mama humana, através da metodologia de Tissue Microarray, tendo sido possível demonstrar que a alta expressão de RECK associa-se a menor tempo de sobrevida global e livre de doença em 10 anos. Os resultados obtidos indicaram que a expressão da proteína RECK, em oposição ao verificado em outros tipos de tumores, está relacionada ao fenótipo mais agressivo de tumores de mama. Entretanto, a análise funcional de RECK, realizada por meio da utilização de vetores shRNA específicos para a inibição desta proteína, demonstrou que RECK também atua como um inibidor de invasão celular e da expressão de MMP-9, na linhagem MDA-MB-231. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para a elucidação dos mecanismos moleculares de regulação de RECK, por clássicas moléculas associadas ao processo de tumorigênese (TGF-&#946;1 e MAPKs), bem como para o esclarecimento de suas funções em modelo mamário, sugerindo-o como mais um promissor candidato a marcador prognóstico e alvo molecular para a terapia do câncer de mama. / The metastatic disease is the main mortality cause of breast cancer patients. The metastatic process involves a complex cascade of events, including the organized breakdown of the extracellular matrix (ECM) compounds. The degradation of ECM is tightly regulated by the balance between the activities of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors, the tissue inhibitors (TIMPs) and the membrane-associated inhibitor (RECK). Among the several molecules released and activated by ECM remodeling, TGF-&#946;1 (Transforming Growth Factor-&#946;1) is a multifunctional cytokine able to regulate both cell growth inhibition and invasion and metastasis promotion, depending on the tumor stage and type. Since the molecular mechanisms involved in the ECM remodeling control are still not completed understood, in this study, we investigated the involvement of TGF-&#946;1 in regulating of MMPs, TIMPs and RECK expression, in the breast cancer model. By qRT-PCR, we first examined the gene expression levels of TGF-&#946; isoforms and receptors, in a panel of five human breast cancer cell lines displaying different degrees of invasiveness and metastatic potential. Our results suggest a positive correlation between the mRNA expression of these molecules and the breast cancer progression. Moreover, the highly invasive breast cancer cell line MDA-MB-231 was treated with different concentrations of recombinant TGF-&#946;1. We described that this cytokine was able to modulate the gene expression of MMPs (MMP-2 and MMP-9) and MMPs inhibitors (TIMP-2 and RECK) at both the mRNA and protein levels, with ERK½ and p38 MAPK being involved in this molecular mechanism. However, while ERK½ activity inhibition altered MMP-9, TIMP-2 and RECK expression, the p38 MAPK blockage affected the protein levels of MMP-2 and TIMP-2. Finally, we reposted that the TGF-&#946;1-enhanced migration and invasion capacities of MDA-MB- 231 cells were blocked by MMPs, ERK½ and p38 MAPK inhibitors. Analysis of the RECK function in the breast model was also an objective of this study. We analyzed RECK expression during mammary gland development. We evaluated the RECK protein profile in 1040 breast tumor tissue samples using Tissue Microarray assays. We demonstrated that high expression levels of RECK were associated with shorter overall and disease-free survival in 10 years. Moreover, we verified that RECK is a biomarker of poor prognosis mainly for patients diagnosed with less aggressive breast tumor. Therefore, in contrast to other tumor types, our results indicate that high protein expression levels of RECK are related to a more aggressive phenotype. In fact, the RECK functional analysis, performed by using of shRNA vectors, showed that RECK function remains as an inhibitor of cellular invasion and MMP-9 expression, in MDA-MB-231 cells. Taken together, our results contribute to better understanding of the molecular mechanisms associated to RECK regulation by TGF-&#946;1 and MAPK as well as to clarify its role in breast model. Thus, we suggests RECK as a new and promising prognostic marker and molecular target candidate for breast cancer therapy.

Algumas das estratégias utilizadas para entender a biologia de células tronco embrionária (CTE) são baseadas na identificação de cascatas de sinalização que induzem a diferenciação e auto-renovação das CTE através da interferência seletiva de processos específicos. A família das proteínas quinase C (PKC) é conhecida por participar dos processos de auto-renovação e diferenciação celular em CTE, entretanto, o papel específico das diferentes isoenzimas das PKCs ainda precisa ser elucidado. Desta forma investigamos. o papel das PKCs atípicas (aPKCs) em CTE indiferenciadas utilizando um inibidor específico para estas serina/ treonina quinases, o peptídeo pseudossubstrato das aPKCs, e fosfoproteômica. A maioria das proteinas identificadas cuja fosforilação reduziu após o tratamento com o inibidor das aPKC, são proteínas envolvidas com o metabolismo principalmente com a via glicolítica. Além disso, a inibição das aPKCs levou a redução do consumo de glicose, secreção de lactato, acompanhada da redução da atividade da lactato desidrogenase, e aumento da fosforilação oxidativa, sendo analisada através do consumo de oxigênio após o tratamento com oligomicina e FCCP. Verificamos também que as aPKCs são capazes de fosforilar diretamente a piruvato quinase. A glicólise aeróbica parece ser fundamental para a manutenção da indiferenciação das CTE, e demonstramos que as aPKCs participam deste processo auxiliando na auto-renovação das CTE indiferenciadas. Também observamos que as aPKCs assim como a PKC&#946;I modulam a fosforilação da &#945;-tubulina, porém ao passo que as aPKCs interagem com a &#945;-tubulina durante a interfase, a PKC&#946;I interage com a mesma apenas durate a mitose. Estes resultados motivaram a segunda parte da tese, na qual o papel da fosforilação da &#945;-tubulina pela PKC&#946;I foi investigado. O resíduo de treonina 253, conservado em diversas espécies de vertebrados e localizado na interface de polimerização entre a &#945;- e a &#946;-tubulina foi identificado, como um novo sítio de fosforilação da &#945;-tubulina pela PKC&#946;I. Este sítio não está em um consenso linear para a PKC, entretanto é um consenso formado estruturalmente, onde aminoácidos básicos distantes na sequência linear se tornam justapostos na estrutura terciária da proteína. Estudos de simulação por dinâmica molecular demonstraram que a interação entre a &#945; e &#946;-tubulina aumenta após esta fosforilação, uma vez que T253 fosforilada passa a interagir com K105, um residuo conservado na &#946;-tubulina. A fosforilação in vitro de &#945;-tubulina aumenta a taxa de polimerização da tubulina e a inibição da PKC&#946;I em células reduziu a taxa de repolimerização do microtubulo após o tratamento com nocodazol. Além disso, a importância da fosforilação deste sítio foi demonstrada pelo fato de que um mutante fosfomimético GFP-&#945;-tubulina, T253E ser mais incorporado no fuso mitótico ao passo que T253A foi menos incorporado do que a proteína selvagem. Nossos dados suportam a hipótese que os consensos estruturais formados podem ser importantes sítios de reconhecimento pelas quinases e que a fosforilação de T253 da &#945;-tubulina afeta a estabilidade do polímero. Em conclusão, utilizando métodos de fosfoproteômica e interferência seletiva de vias de sinalização, combinados a validações experimentais dos alvos identificados podemos propor a importância funcional das aPKCs e PKC&#946;I em CTE indiferenciadas. / Some of the strategies used to understand stem cell biology are based on the identification of signalling cascades that lead to differentiation and self-renewal of embryonic stem cells (ESC) by selective interference of specific signalling processes. The protein kinase C (PKC) family is known to participate in ESC self-renewal and differentiation, however, the specific role of the different PKC isoenzymes in these cells remains to be determined. Therefore, we investigated the role of atypical PKCs (aPKC) in undifferntiated ESC using a specific inhibitor for these serine/ threonine kinases, pseudo-substrate peptide of aPKCs, and phosphoproteomics. The majority of proteins whose phosphorylation decreased upon aPKC inhibition, are proteins involved in metabolism in particular with the glycolytic pathway. Besides that, inhibiton of aPKCs led to a decrease in glucose uptake and lactate secretion, followed by a decrease in lactate dehydrogenase activity, and an increase in mitochondrial activity as measured by oxygen consumption after treatment with olygomycin and a chemical uncoupler. We also verified that aPKCs are able to directly phosphorylated pyruvate kinase. Aerobic glicolysis seems to be fundamental for the maintainance of undifferentiated ESC, and we demonstrated that aPKCs participte in these processes helping to maintain self-renewal of undifferentiated ESC. We also observed that aPKCs as PKC&#946;I modulate the phosphorylation of &#945;-tubulin, however, while aPKCs interact with &#945;-tubulin during interfase PKC&#946;I interacts with &#945;-tubulin only during mitosis. These results lead to the second part of this thesis. We investigated the role of &#945;-tubulina phosphorylation by PKC&#946;I. Indentifying threonine 253, a conserved residue in several vertebrate species, of localized at the polymerization interface between &#945;- and &#946;-tubulin, as a phosphorylation site of &#945;-tubulin by PKC&#946;I. This site is not in a linear consensus for PKC, however, it is in a structuraly formed consensus, where basic aminoacids distant in the linear sequence are juxtaposed in the three dimentional protein structure. Simulation studies by molecular dynamics show that the interaction between &#945; and &#946;-tubulin increases upon this phosphorylation, once, phosphorylated T253 interacts with com K105, a conserved residue in &#946;-tubulin. The in vitro phosphorylation of &#945;-tubulin increased tubulin polymerization rate and inhibiton of PKC&#946;I in cells reduced repolimeration rate of microtubles upon treatment with nocodazole. Besides that, the importance of this phosphorylation site were demonstrated by the fact that a phosphomimetic mutant GFP-&#945;-tubulina, T253E is more incorporated in mitotic fuses while T253A is less than wild type. Our data support the hypothesis that structural consensus may be important sites recognized and that T253 phosphorylation of &#945;-tubulin afects the polymer stability. In conclusion, using phosphoproteomics methods and selective interference of signal transduction pathways combined with experimental validation studies of the identified targets we can propose roles for aPKCs and PKC&#946;I in undifferentiated ESC.