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Les glicosidases que hidrolitzen els substrats amb retenció de configuració segueixen un mecanisme general en què després d'una primera etapa d'associació enzim-lligand s'encadenen dues etapes catalítiques que porten a la hidròlisi del substrat conservant la configuració del carboni anomèric en el nou extrem generat. En el present treball es comprova a través d'estudis mecanístics, principalment estudis en estat preestacionari i anàlisis de Hammett, que amb aquest mecanisme tan senzill no es pot descriure correctament l'activitat catalítica de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis, i es proposa el mecanisme que es mostra a continuació: on els complexos enzim-substrat adopten dues conformacions productives (SES* i SES**) i on el balanç entre aquestes dues conformacions en funció del substrat explica els diferents comportaments cinètics en estat estacionari i preestacionari.Un estudi en profunditat sobre la importància que exerceix la interacció entre l'enzim i l'hidroxil a C2 de la unitat de glucopiranosa que ocupa el subseti -1 demostra que en el cas de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis aquesta interacció no juga el paper rellevant que s'ha observat en altres β-glicosidases que actuen amb retenció de configuració.L'estudi de la reacció d'hidratació del glical G4G3G' catalitzada per la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis permet proposar que hi ha un canvi en el residu que fa el paper d'àcid general. De manera que es proposa que l'Asp136 que en la reacció d'hidròlisi de substrats ajuda al posicionament dels residus catalítics i juga un paper en la regulació dels seus pKa, és el residu que fa d'àcid general en la reacció d'hidratació de glicals. / Las glicosidasas que hidrolizan substratos con retención de configuración siguen un mecanismo general en que después de una primera etapa de asociación enzima-ligando se encadenan dos etapas catalíticas que llevan a la hidrólisis del substrato conservando la configuración del carbono anomérico en el nuevo extremo generado. En el presente trabajo se comprueba a través de estudios mecanísticos, principalmente estudios en estado pre-estacionario y análisis de Hammett, que con este mecanismo tan sencillo no se puede describir correctamente la actividad catalítica de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis, y se propone el mecanismo que se muestra a continuación: donde los complejos enzima-substrato adoptan dos conformaciones productivas (SES* y SES**) y donde el balance entre estas dos conformaciones en función del substrato explica los diferentes comportamientos cinéticos en estado estacionario y pre-estacionario.Un estudio en profundidad sobre la importancia que ejerce la interacción entre el enzima y el hidroxilo en C2 de la unidad de glucopiranosa que ocupa el subsitio -1 demuestra que en el caso de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis esta interacción no juega el papel relevante que se ha observado en otras β-glicosidasas que actuan con retención de configuración.El estudio de la reacción de hidratación del glical G4G3G' catalizada por la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis permite proponer que hay un cambio en el residu que ejerce el papel de ácido general. De manera que se propone que el Asp136 que en la reacción de hidrólisis de substratos ayuda en el posicionamiento de los resíduos catalíticos y juega un papel en la regulación de sus pKa, es el resíduo que actúa de ácido general en la reacción de hidratación de glicales. / Retaining glycosidases follow a general mechanism in which the first enzime-ligand association is followed by two catalytic steps that render the product of hydrolysis with the same anomeric configuration as the starting material. In the present work we demonstrate using mechanistic studies, basically pre-steady state kinetics and Hammett analysis, that this mechanism is too simple to properly describe the catalytic activity of Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase, and the following mechanism is proposed: In this mechanism, the enzim-substrate complexes adopt two productive conformations (SES* and SES**) and the balance between these two conformations depending on the nature of the substrate explains the diferent behaviours observed in pre-steady and steady state kinetics.A deep study on the importance of the interaction between the enzyme and the hydroxyl group at C2 of the glucopyranose residue that occupies the -1 subsite demonstrates that in Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase this interaction is not the key interaction observed in other retaining β-glycosidases.The study of the G4G3G' glical hydration catalysed by the Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase let us propose that there is a change in the residue that acts as a general acid. We propose that Asp136, that plays a role positioning the catalytic residues and modulating their pKa in the hydrolysis reaction, acts as the general acid in the hydration of glycals.

S'ha desenvolupat una nova estratègia per la síntesi ràpida i eficient de L-[metil-11C]metionina basada en el captive solvent method. La reacció de L-homocisteína (dissolució bàsica en aigua/etanol 1:1) amb [11C]CH3I en un loop de HPLC va permetre la formació del radiotraçador desitjat amb elevat rendiment radioquímic (38.4 ± 4.1%) en un temps curt (< 12 min). Tots el paràmetres analítics compleixen les especificacions requerides per la versió actual de la Farmacopea Espanyola, tot i que els valors d'activitat específica obtinguts van ser relativament baixos. Degut a això, es van estudiar i quantificar les principals fonts que contribueixen a la contaminació de carboni-12 durant les síntesis de [11C]CH3I efectuades segons el "wet" method. Es va observar que la principal font de contaminació de CO2 no radioactiu (contribució>90%) és el propi procés de bombardeig, probablement degut a la combustió (causada per les altes temperatures i pressions assolides durant la irradiació) dels compostos que contenen carboni i que es troben al gas irradiat (o a l'interior del blanc). Es van establir procediments generals per realitzar abans, durant i després de la radiosíntesi per prevenir la contaminació exterior i, d'aquesta manera, augmentar l'activitat específica dels radiotraçadors sintetitzats.En quant al marcatge amb nitrogen-13, s'ha desenvolupat un procés totalment automàtic per a la producció de [13N]NO2- a partir de [13N]NO3- generat en el ciclotró. El precursor radioactiu [13N]NO2- s'ha utilitzat per la radiosíntesi de compostos amb interès biològic com ara S-nitrosotiols (donadors de NO.), N-nitrosamines (molècules amb potencials efectes carcinogènics) i azo compostos (amb possible aplicació com a radiotraçadors per a la detecció in vivo de plaques de &#946;-amiloide). En tots els casos es van obtenir excel·lents conversions radioquímiques (48.7% - 74.5% per S-[13N]nitrosotiols, 45.6% - 53.4% per N-[13N]nitrosamines i 40.0% - 58.3% per 13N-azo compostos) i bons rendiments radioquímics (33.8% - 60.6% per S-[13N]nitrosotiols, 34.0% - 37.8% per N-[13N]nitrosamines i 20.4% - 47.2% per 13N-azo compostos). A més a més, s'ha dissenyat i implementat un mòdul automàtic amb control remot pel marcatge de molècules amb 13N. / Se ha desarrollado una nueva estrategia para la síntesis rápida y eficiente de L-[metil-11C]metionina basada en el captive solvent method. La reacción de L-homocisteína (disolución básica en agua/etanol 1:1) con [11C]CH3I en un loop de HPLC permitió la formación del radiotrazador deseado con elevado rendimiento radioquímico (38.4 ± 4.1%) en un tiempo corto (< 12 min). Todos los parámetros analíticos cumplían las especificaciones requeridas por la versión actual de la Farmacopea Española, aunque los valores de actividad específica obtenidos fueron relativamente bajos. Por ello, se estudiaron y cuantificaron las principales fuentes que contribuyen a la contaminación de carbono-12 durante las síntesis de [11C]CH3I efectuadas según el "wet" method. Se observó que la principal fuente de contaminación de CO2 no radiactivo (contribución>90%) es el propio proceso de bombardeo, probablemente debido a la combustión (causada por las altas temperaturas y presiones alcanzadas durante la irradiación) de los compuestos que contienen carbono y que se encuentran presentes en el gas irradiado (o en el mismo cuerpo del blanco). Se establecieron procedimientos generales para realizar antes, durante y con posterioridad a la radiosíntesis para prevenir la contaminación exterior y, de esta manera, aumentar la actividad específica de los radiotrazadores sintetizados.Respecto al marcaje con nitrógeno-13, se ha desarrollado un proceso totalmente automático para la producción de [13N]NO2- a partir del [13N]NO3- generado en el ciclotrón. El precursor radiactivo [13N]NO2- se ha utilizado para la radiosíntesis de compuestos con interés biológico tales como S-nitrosotioles (donadores de NO.), N-nitrosaminas (moléculas con potenciales efectos carcinogénicos) y azo compuestos (con posible aplicación como radiotrazadores para la detección in vivo de placas de &#946;-amiloide). En todos los casos se obtuvieron excelentes conversiones radioquímicas (48.7% - 74.5% para S-[13N]nitrosotioles, 45.6% - 53.4% para N-[13N]nitrosaminas y 40.0% - 58.3% para 13N-azo compuestos) y buenos rendimientos radioquímicos (33.8% - 60.6% para S-[13N]nitrosotioles, 34.0% - 37.8% para N-[13N]nitrosaminas y 20.4% - 47.2% para 13N-azo compuestos). Además, se ha diseñado e implementado un módulo automático con control remoto para el marcaje de moléculas con 13N. / A new strategy for the fast and efficient synthesis of L-[methyl-11C]methionine based on the captive solvent method has been developed. The in loop reaction of a basic water/ethanol 1:1 solution of L-homocysteine with [11C]CH3I led to the formation of the desired radiotracer with high radiochemical yield (38.4 ± 4.1%) in short production time (< 12 min). All analytical parameters were within the specifications of the current version of the Spanish Pharmacopoeia, although specific radioactivity values were relatively low. Thus, the main sources of carbon-12 during the synthesis of [11C]CH3I by the "wet" method were studied and the contribution attributable to each individual source was quantified. The most relevant contamination of non-radioactive CO2 (contribution>90%) was shown to be generated during the bombardment process, probably due to the combustion (caused by high temperature and pressure during irradiation) of carbon carrier compounds present in the irradiated gas (or target body). General procedures to be performed before, during and after the radiosynthesis were established to prevent external contamination and to improve the specific radioactivity of 11C-labeled radiotracers synthesized from [11C]CH3I produced via the "wet" method. Concerning 13N-labeling, a fully automatic process for the production of [13N]NO2- from cyclotron generated [13N]NO3- has been developed. The radioactive precursor [13N]NO2- has been used for the synthesis of biologically interesting 13N-labeled compounds such as S-nitrosothiols (well-known NO. donors), N-nitrosamines (molecules with potent carcinogenic effects) and azo compounds (with putative application as imaging probes for in vivo detection of &#946;-amyloid plaques). In all cases, excellent radiochemical conversion (48.7% - 74.5% for S-[13N]nitrosothiols, 45.6% - 53.4% for N-[13N]nitrosamines and 40.0% - 58.3% for 13N-labeled azo compounds) and good radiochemical yields (33.8% - 60.6% for S-[13N]nitrosothiols, 34.0% - 37.8% for N-[13N]nitrosamines and 20.4% - 47.2% for 13N-labeled azo compounds) were achieved. An automatic remote controlled synthesis module for the preparation of 13N-labeled structures has been designed and implemented.

En aquest treball de tesis doctoral s'estudia el paper de l'estrès oxidatiu tant a la etiologia com a la patofisiologia del dany vascular associat a la malaltia d'Alzheimer. Es demostra la capacitat de les cèl·lules musculars llises vasculars de produir pèptid &#946;-amiloide (A&#946;). L'estrès oxidatiu associat a edats avançades, estimula el processament amiloidogènic de l' APP a cèl·lules musculars llises vasculars portant a un augment de producció d' A&#946;1-40 i A&#946;1-42 contribuint així, a la formació dels depòsits amiloides vasculars. Alhora, els depòsits amiloides vasculars indueixen dany vascular a través d'estrès oxidatiu, a on la nitrotirosinació de proteïnes juga un paper clau en la inactivació d'enzimes essencials per la viabilitat cel·lular. La vitamina E i els estrogens tenen un efecte protector a neurones i cèl·lules musculars llises vasculars mentre que la vitamina E, però no els estrogens, és capaç de protegir les cèl·lules endotelials davant la toxicitat induïda pel pèptid A&#946;. / In this thesis we study the effect of oxidative stress in the etiology and pathophysiology of the vascular damage associated to Alzheimer's disease. We demonstrate the production of amyloid-&#946;-peptide (A&#946;) by vascular smooth muscle cells. Oxidative stress related to advance ages, induces the amyloidogenic APP cleavage producing an increase of A&#946;1-40 and A&#946;1-42 by vascular smooth muscle cells, which in tum contribute to vascular amyloid deposits generation. Vascular amyloid deposits induce oxidative stress, in which protein nitrotyrosination plays a key role in essential enzymes inactivation. Vitamin E and estrogens are able to protect neurons and vascular smooth muscle cells while vitamin E, but not estrogens, is able to protect endothelial cells against A&#946;-mediated toxicity.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia de sousa.pdf: 7071029 bytes, checksum: 82c8213b4442879d206467555a97c3c4 (MD5) Previous issue date: 2010-01-29 / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic disorder geographically restricted to Central and South America, and one of the most important endemic mycoses in these regions, especially among the male rural populations. The disease is most likely caused by the inhalation of asexual spores (conidia) produced by the mycelia form of the fungus, propagules that once in the lungs undergo differentiation towards the parasitic yeast form. The cell wall of P. brasiliensis is a dynamic structure, essentially composed of branched glucan (&#946;-1,3 and &#946;-1,6 glucans), chitin, lipids and mannoproteins. Many enzymes are responsible for cell wall remodeling. One of them is the Beta-1,3- glucanosyltransferase 2 (PbGel2p) presented here. The amino acid deduced sequence of PbGel2p presented similarity to others proteins involved in fungal cell wall biosynthesis and morphogenesis and it was characterized as a member of GH72 family, GH72_ subfamily. The recombinant rPbGel2p was overexpressed in Escherichia coli and the polyclonal antibody was obtained. The PbGel2p mRNA, as well as the protein, were detected at the highest level in the mycelium phase. The potencial role of PbGel2p in cell wall biosynthesis and morphogenesis was analyzed by assessing its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae GAS1&#916;. The results indicated that PbGel2p is a cell wall-associated protein that probably works as a &#946;-1,3-glucan elongase capable of mediating fungal cell wall integrity. In addition, predicted protein-protein interactions between PbGel2p and others proteins of the fungus P. brasiliensis were assessed by using a S. cerevisiae two hybrid system and pull-down assay. The proteins that were found to interact with PbGel2p are: anthranilate synthase component 2 (involved in the tryptophan pathway), MYND domain protein SamB (related to fungal morphogenesis), mitotic spindle checkpoint protein Mad2B (required of the organization of the cytoskeleton and control of cell cycle), G protein complex beta subunit CpcB (organize the cytoskeleton of actin), WD repeat protein (involved in the control of cell cycle), phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase its3 (required of the organization of the actin cytoskeleton), Hsp60 (related of stress conditions like temperature) and ATPase (localized in the plasma membrane / involved in the glucose metabolism). This suggested the relation of PbGel2p in other process to maintenance of cell wall integrity. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), prevalente em países da América Central e do Sul sendo considerada uma das mais importantes micoses endêmicas, especialmente entre a população rural masculina. A doença é causada pela inalação dos esporos assexuais (conídios) produzidos pela forma miceliana do fungo. Nos pulmões, os propágulos tendem à diferenciação para a forma leveduriforme parasitária. A parede celular de P. brasiliensis é uma estrutura dinâmica, composta essencialmente por glicanas ramificadas (ligações &#946;-1,3 e &#946;-1,6), quitina, lipídeos e manoproteínas. Muitas enzimas estão envolvidas no seu remodelamento. Uma delas é a Beta-1,3-glicanosiltransferase 2 (PbGel2p), apresentada aqui. A sequência deduzida de aminoácidos de PbGel2p mostrou similaridade com outras proteínas envolvidas na morfogênese e biossíntese da parede celular fúngica e foi caracterizada como parte da família GH72, subfamília GH72_ . A proteína recombinante rPbGel2p foi superexpressa em Escherichia coli e o anticorpo policlonal obtido. Os níveis de transcritos que codificam para PbGel2p, assim como os de proteína, foram detectados em maior teor na fase miceliana do fungo. O papel de PbGel2p na morfogênese e biossíntese da parede celular foi analisado pela habilidade da proteína em resgatar o fenótipo mutante para GAS1&#916; de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados indicaram que PbGel2p é uma proteína associada à parede celular que provavelmente atua no alongamento da &#946;-1,3- glicana mediando a integridade da parede celular. Ainda, as interações proteína-proteína preditas entre PbGel2p e outras proteínas de P. brasiliensis usando o sistema de duplo híbrido e pull-down foram: componente 2 da antranilato sintase (envolvida na via do triptofano), proteína SamB com domínio MYND (relacionada com a morfogênese fúngica), proteína Mad2B (requerida na organização do citoesqueleto e controle do ciclo celular), subunidade beta da CpcB (organiza o citoesqueleto de actina), proteína com repetição WD (envolvida no controle do ciclo celular), fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinase (requerida para organização do citoesqueleto de actina), Hsp60 (relacionada à condições de estresse como temperatura) e ATPase (localizada na membrana plasmática/ involvida no metabolismo de glicose). Essas interações sugerem a relação de PbGel2p em outros processos celulares para manutenção da integridade da parede celular.

O presente trabalho contempla o estudo das principais alterações macroscópicas e anatomopatológicas do sistema nervoso central (SNC) encontradas em animais que morreram em decorrência de traumatismo cranioencefálico (TCE). Além da determinação das lesões de golpe, contragolpe e padrão de lesão axonal difusa encontradas nesse tipo de trauma. Inicialmente realizou-se a necropsia dos animais com devido registro fotográfico, descrição das lesões macroscópicas e coleta de material para processamento histológico de rotina e confecção das lâminas coradas em hematoxilina-eosina (HE) para avaliação histopatológica. A imunohistoquímica foi realizada a partir dos mesmos segmentos utilizados nas lâminas de HE, com os anticorpos anti-proteína precursora do &#946;-amiloide (APP), para determinação da lesão axonal, e anti-GFAP e anti-vimentina para avaliação de respostas do tecido nervoso à injúria, como astrocitose e astrogliose. Macroscopicamente as principais lesões observadas caracterizaram-se por lesões focais decorrentes de traumatismo direto, com fraturas de ossos do crânio, laceração de neuroparênquima e contusões. No exame histopatológico as lesões principais caracterizaram-se por hemorragia subdural e em neuroparênquima, congestão, edema tecidual e necrose em variados graus de intensidade e regiões do encéfalo. A lesão axonal foi confirmada pela imunomarcação do &#946;APP que revelou marcação multifocal de axônios tumefeitos formando esferoides axonais, bulbos axonais ou axônios varicosos em alguns casos. Astrocitose, astrogliose e neovascularização foram observados na maioria dos casos através dos anticorpos GFAP e vimentina. Conclui-se no presente estudo que cães e gatos com TCE apresentaram lesões histologicamente caracterizadas por hemorragias multifocais em meninge e neuroparênquima em diversas regiões, além de edema, necrose e congestão, principalmente. A lesão axonal caracterizou-se pela formação de esferoides axonais, bulbos axonais e longos axônios varicosos. Esta característica foi observada em apenas 2 animais deste estudo, e destes apenas um animal (caso 6) apresentou um padrão de lesão axonal traumática difusa, confirmada pela presença de acentuada marcação pelo anticorpo &#946;APP. Adicionalmente, foi observada astrocitose e astrogliose em cinco animais, principalmente das áreas próximas às lesões, avaliadas pelos anticorpos GFAP e vimentina. / The present work contemplates the study of the main macroscopic and anatomopathological changes of the central nervous system (CNS) in animals that died due to traumatic brain injury (TBI). Besides the determination of the coup and countercoup and pattern of diffuse axonal injury in this type of trauma. Initially, the animals were necropsied and photographic recorded and macroscopic lesions were described and collect material for histological processing routine and the preparation of slides in hematoxylin-eosin (HE) staining for histopathological evaluation. Immunohistochemistry was performed from the same segments used in the HE slides, with anti-(&#946;-amyloid precursor protein antibodies (&#946;APP) for determination of axonal lesion, and anti-GFAP and anti-vimentin for evaluation of tissue responses to injury, such as astrocytosis and astrogliosis. Macroscopically, the main lesions observed were focal lesions due to direct trauma, such as skull fractures, neuroparenchyma laceration and contusions. In the histopathological evaluation, the main lesions were characterized by subdural hemorrhage and in neuroparenchyma, congestion, tissue edema and necrosis in varying degrees of intensity and regions of the encephalon. The axonal injury was confirmed by (&#946;APP immunostaining that revealed multifocal labeled of swellings axons forming axonal spheroids, axonal bulbs or varicose axons in some cases. Astrocytosis, astrogliosis and neovascularization were observed in most cases through the antibodies GFAP and vimentin. In conclusion the present study demonstrate that dogs and cats with TBI presented histologically lesions characterized by multifocal hemorrhage in meninge and neuroparenchyma in different areas, as well as edema, necrosis and congestion, mainly. Axonal injury was determined by axonal swelling, bulbs and varicosities. This characteristic was observed in only 2 animals in this study, and only one of those (case 6) presented pattern of diffuse traumatic axonal injury, confirmed by accentuated (&#946;APP labeling. Addiotionally, astrocytosis and astrogliosis was observed in five animals, mainly in areas close to lesions, evaluated by GFAP and vimentin antibodies.

Este trabalho, buscou comparar a biodisponibilidade do &#946;-caroteno sintético e de fonte natural (couve-manteiga), e verificar os efeitos da fibra alimentar (pectina cítrica) sobre a biodisponibilidade do &#946;-caroteno, dentro de 2 experimentos diferentes (ratos e coelhos). No Experimento I (ratos), um grupo de animais recebeu ração com &#946;-caroteno e isenta de pectina cítrica (GC) e outro recebeu ração com &#946;-caroteno e adição de pectina cítrica (GE). No Experimento II (coelhos), um grupo de animais recebeu ração com &#946;-caroteno sintético (GCP), outro recebeu &#946;-caroteno de fonte natural (couve-manteiga) (GV) e ainda outro não recebeu de &#946;-caroteno (GCN); todos os grupos de coelhos receberam pectina cítrica. Após 30 dias de experimento, os animais foram sacrificados para determinações plasmáticas e hepáticas de vitamina A e &#946;-caroteno, por HPLC. Dos resultados obtidos no estudo em ratos pode-se verificar que o grupo de animais que recebeu pectina (GE), apresentou menor (p<0,05) concentração hepática total de vitamina A (&#181;g/peso de fígado) (retinol: GC =47,61 ± 24,24 e GE =23,44 ± 9,68 e palmitato de retinila: GC =935,30 ± 428,19 e GE =282,34 ± 98,86) e &#946;-caroteno (&#181;g/peso de fígado) (GC =9,64 ± 3,07 e GE =1,01 ± 0,66) que o grupo que não recebeu pectina (GC). E dos resultados obtidos no experimento em coelhos, verificou-se que o grupo que recebeu &#946;-caroteno de fonte natural (GV), obteve concentração hepática total de vitamina A (mg/peso de fígado) (retinol: GV = 2,30 ± 0,67, GCP =2,07 ± 0,57 e GCN = 0,11 ± 0,08; palmitato de retinila: GV =4,42 ± 2,17, GCP =2,77 ± 0,73 e GCN =0,04 ± 0,02) e &#946;-caroteno (mg/peso de fígado) (GV =0,04 ± 0,01, GCP =0,03 ± 0,01 e GCN =não detectado), maior (p<0,05) que o grupo que recebeu &#946;-caroteno sintético (GCP). Conclui-se que no Experimento I (ratos), a pectina cítrica provavelmente interferiu na absorção do p-caroteno, e no Experimento II (coelhos), que o &#946;-caroteno de fonte natural (GV), foi melhor absorvido comparando-se com o &#946;-caroteno sintético, na presença de pectina cítrica. / This work, looked for to compare the bioavailability of synthetic p-carotene and of natural source (kale), and to verify the effects of the alimentary fiber (citrus pectin) on the bioavailability of &#946;-carotene, inside of 2 different experiments (rats and rabbits). In the Experiment I (rats), a group of animals received diet with &#946;-carotene and it exempts of citrus pectin (CG) and another received diet with &#946;-carotene and addition of citrus pectin (EG). In the Experiment II (rabbits), a group of animals received diet with synthetic &#946;-carotene (PCG), another received &#946;-carotene of natural source (kale) (VG) and still another didn\'t receive from &#946;-carotene (NCG); all the groups of rabbits received citrus pectin. After 30 days of experiment, the animals were sacrificed for determinations plasmatics and vitamin liverworts A and &#946;-carotene, by HPLC. Of the results obtained in the study in rats it can be verified that the group of animals that received pectin (EG), it presented smaller (p <0,05) concentration hepatic vitamin total A (liver mg/weight) (retinol: CG = 47.61 ± 24.24 and EG = 23.44 ± 9.68 and retinyl palmitate: CG = 935.30 ± 428.19 and EG = 282.34 ± 98.86) and &#946;-carotene (liver mg/weight) (CG = 9.64 ± 3.07 and EG = 1.01 ± 0.66) that the group that didn\'t receive pectin (CG). And of the results obtained in the experiment in rabbits, it was verified that the group that received &#946;-carotene of natural source (VG), obtained concentration hepatic vitamin total A (liver mg/weight) (retinol: VG = 2.30 ± 0.67, PCG = 2.07 ± 0.57 and NCG = 0.11 ± 0.08; retinyl palmitate: VG = 4.42 ± 2.17, PCG = 2.77± 0.73 and NCG = 0.04 ± 0.02) and &#946;-carotene (liver mg/weight) (VG = 0.04 ± 0.01, PCG = 0.03 ± 0.01 and NCG = not detected), larger (p <0,05) that the group that received synthetic &#946;-carotene (PCG). Ended that in the Experiment I (rats), the citrus pectin probably interfered in the absorption of the p-carotene, and in the Experiment II (rabbits), the &#946;-carotene of natural source (VG), it was absorbed being compared with the synthetic &#946;-carotene better, in the presence of citrus pectin.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O estado nutricional e hormonal em fases iniciais de desenvolvimento (gestação e lactação) está relacionado a alterações epigenéticas, que podem levar ao desenvolvimento de doenças. A obesidade infantil está relacionada com a ocorrência da obesidade na idade adulta, resistência à insulina e maior risco cardiometabólico. Em estudos experimentais, a superalimentação neonatal causa obesidade e aumenta o risco de doenças cardiovasculares. Estes animais apresentam obesidade visceral, hiperfagia, hiperleptinemia e hipertensão na idade adulta. Previamente, demonstramos que a hiperleptinemia neonatal causa hiperfunção da medula adrenal e microesteatose na idade adulta. No presente estudo avaliamos a função adrenal de ratos adultos obesos no modelo de superalimentação neonatal por redução do tamanho da ninhada e a sensibilidade as catecolaminas no tecido adiposo visceral (TAV) e no fígado. Ao nascimento todas as ninhadas tiveram seu número de filhotes ajustados para 10. Para induzir a superalimentação neonatal, o tamanho da ninhada foi reduzido de dez para três filhotes machos no terceiro dia de lactação até o desmame (SA), enquanto que o grupo controle permaneceu com 10 filhotes durante toda a lactação. Após o desmame, os ratos tiveram livre acesso à dieta padrão e água até 180 dias (1 animal de cada ninhada, n = 7). O TAV e as glândulas adrenais foram pesadas. As contrações hormonais séricas, o conteúdo hepático de glicogênio e triglicerídeos foram avaliados por kits comerciais. O conteúdo e a secreção de catecolaminas adrenais foram avaliados utilizando o método do trihidroxindol. O conteúdo dos hormônios eixo hipotálamo-hipófise-córtex adrenal, das enzimas da via de síntese das catecolaminas na glândula adrenal, ADRB2 no fígado e ADRB3 no TAV foram determinados por Western blotting ou imunohistoquímica. As diferenças foram consideradas significativas quando p <0,05. Aos 180 dias de vida, o grupo SA apresentou maior massa corporal (+15%), maior consumo alimentar (+15%) e maior adiposidade visceral (+79%). Os hormônios do eixo hipotálamo-hipófise-córtex-adrenal não foram alterados. O grupo SA apresentou maior expressão de tirosina hidroxilase e de DOPA descarboxilase (+31% e 90%, respectivamente); conteúdo de catecolaminas adrenais (absoluta: 35% e relativa: 40%), e secreção de catecolaminas, tanto basal quanto estimulada por cafeína (+35% e 43%, respectivamente). O conteúdo ADRB3 no TAV não foi alterado nos grupo SA, entretanto o ADRB2 no fígado apresentou-se menor (-45%). O grupo SA apresentou maior conteúdo de glicogênio e triglicerídeos no fígado (+79% e +49%, respectivamente), além de microesteatose. A superalimentação neonatal resulta em hiperativação adrenomedular e aparentemente está associada a preservação da sensibilidade às catecolaminas no VAT. Adicionalmente sugerimos que o maior conteúdo de glicogênio e triglicerídeos hepático seja devido a menor sensibilidade as catecolaminas. Tal perfil pode contribuir para a disfunção metabólica hepática e hipertensão arterial que são características deste modelo de obesidade programada. / Nutritional and hormonal status at early phases of development are related to epigenetic changes, promoting disease development. Childhood overweight is related with late obesity, insulin resistance and higher cardiometabolic risk. Rats overfed during lactation show higher visceral adiposity, hyperphagia, leptin resistance and hypertension in adulthood. Previously, we demonstrated that neonatal hyperleptinemia is associated with adrenal medullary hyperfunction and liver steatosis at adulthood. Here, we evaluated the adrenal function and liver tissue of adult obese rats that were overfed during lactation. To induce early overfeeding, the litter size was reduced from ten to three male pups at the third day of lactation until weaning (SL). Control group had ten rats per litter (NL). After weaning, rats had free access to standard diet and water until 180 days old (1 animal from each litter, n=7). Significant differences had p<0.05. The SL group presented higher adrenal catecholamine content (absolute: +35% and relative: +40%), tyrosine hydroxylase (+31%), DOPA decarboxylase (+90%) protein contents, basal and caffeine-induced catecholamine in vitro secretion (+35% and +43%, respectively). However, hormones of the hypothalamic-pituitary-adrenal cortex axis were unchanged. The &#946;3-adrenergic receptor content in visceral adipose tissue was unchanged in SL rats, but the &#946;2-adrenergic receptor in the liver was lower (-45%). SL group showed higher glycogen and triglycerides contents in liver (+79% and +49%, respectively), which showed microesteatosis. Although the neonatal overfeeding leads to higher adrenomedullary function, adult obese SL rats have a dysfunction in hepatic &#946;2-adrenergic receptor, which can contribute for the hepatic dysfunction characteristic of liver obesity complications.

A resistência aos antimicrobianos pela produção de &#946;-lactamases em enterobactérias é um problema adicional neste cenário. Staphylococcus spp é considerado um patógeno humano freqüentemente associado a infecções adquiridas no ambiente hospitalar. O objetivo desse trabalho foi estudar a resistência aos antimicrobianos em cepas de Enterobactérias e Staphylococcus spp. isoladas de equipamentos utilizados no preparo de dietas destinadas à pacientes internados em um hospital universitário no município do Rio de Janeiro, além de verificar a presença de genes codificadores de enterotoxinas nas cepas de Staphylococcus spp. As enterobactérias e os Staphylococcus spp. foram isolados e identificados por metodologia convencional. Para o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos foram utilizados discos contendo antimicrobianos clinicamente relevantes. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de microdiluição em caldo para os antimicrobianos clinicamente relevantes. A pesquisa de genes que codificam &#946;-lactamases em enterobactérias foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA-1 e blaCMY-2. Para Staphylococcus spp. foram pesquisados, através da PCR e sequenciamento, os genes de resistência a meticilina, gentamicina e eritromicina e os genes codificadores de enterotoxinas (sea-see, seg-sej, sen-ser e seu). Foram isoladas 97 cepas de enterobactérias, 40 de liquidificador e 57 de batedeira e 40 cepas de Staphylococcus spp., 20 de cada equipamento. Dentre as enterobactérias, o gênero Enterobacter foi isolado com maior frequencia (n=37, 38%). Foram ainda isoladas seis cepas de Salmonella spp. Das enterobactérias, 80% (n=79) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 38% (n=37) a três ou mais. A expressão fenotípica presuntiva de b-lactamases do tipo AmpC foi detectada em 32 cepas. O gene blaCMY-2 não foi encontrado. Doze cepas apresentaram halos de inibição com screaning positivo para a pesquisa de ESBL. Foi detectada a presença do gene blaSHV em K. pneumoniae subsp. pneumoniae. O sequenciamento desse gene permitiu identificá-lo como sendo blaSHV-36. Dentre os Staphylococcus spp., oito foram identificados como coagulase-positivas (SCP) e 32 como coagulase-negativas (SCN). As oito cepas de SCP foram identificadas como S. aureus subsp. aureus. Dentre os SCN, as espécies identificadas com maior frequência foram: S. caprae (n=7, 17,5%), S. simulans (n=5, 12,5%) e S. epidermidis (n=4, 10%). Destas, 83% (n=33) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 30% (n=12) foram resistentes a mais do que três. Duas cepas (5%) de S. epidermidis apresentaram perfil de resistência a até seis antimicrobianos e genes de resistência a meticilina, a eritromicina e a gentamicina. Todas as sete cepas que foram resistentes no TSA e na CIM a gentamicina, apresentaram o gene aac(2)/aph(6). O gene ermB foi observado ainda em uma S hominis subsp hominis que apresentou resistência na CIM e no TSA. Foi detectada a presença de pelo menos um gene codificador de enteroxotxina em 83% (n=33) das cepas. O gene seg foi detectado em 11 cepas, o gene sei em 17 cepas e o gene sen em 31 cepas. Os resultados encontrados implicam as dietas preparadas com esses equipamentos como veículo de disseminação de enteropatógenos e Staphylococcus spp. com marcadores de resistência e genes codificadores de enterotoxinas relevantes no ambiente hospitalar.