O presente trabalho é composto por 4 capítulos distintos. No primeiro intitulado \"Ciclodextrinas: tecnologia para melhoria da solubilidade de fármacos pouco solúveis\" aborda-se uma revisão das ciclodextrinas e de seus derivados, como também a formação dos complexos de inclusão. No segundo capítulo, \"Obtenção e caracterização de complexos ternários de saquinavir, β-ciclodextrina e polivinilpirrolidona\", foram avaliadas condições que poderiam influenciar na obtenção dos complexos, tais como: tempo de agitação na formação dos complexos, proporção equimolar de fármaco e ciclodextrina, solvente para solubilização do fármaco e porcentagem de polímero hidrossolúvel, concluindo-se que as melhores condições para obtenção dos complexos são 48 horas de agitação, razão equimolar 1:2 e 1:4, água para solubilização do fármaco e acréscimo de1% de polímero ao sistema. O terceiro capítulo, \"Influência do método de secagem na obtenção de complexos ternários de saquinavir\", teve o objetivo de obter e caracterizar complexos ternários de saquinavir, β-ciclodextrina e polivinilpirrolidona pelos métodos de secagem em estufa e liofilização, bem como, comparar a influência dos métodos de obtenção na solubilidade do fármaco, chegando-se ao aumento de 44 vezes da solubilidade do fármaco quando na forma de complexo SAQ:βCD:PVP de proporção equimolar 1:2 obtido por liofilização. O quarto, \"Perfil de dissolução de cápsulas e comprimidos contendo complexos ternários de saquinavir, ciclodextrina e polivinilpirrolidona\", teve o objetivo de comparar o perfil de dissolução de cápsulas de gelatina dura e comprimidos contendo sistemas ternários SAQ:βCD:PVP, obtidos pelos métodos de secagem em estufa e liofilização e o produto referência (Fortovase®). Os resultados indicam que os perfis de dissolução das formas farmacêuticas contendo complexos liofilizados apresentaram melhores resultados de eficiência de dissolução e que as cápsulas liberam mais prontamente o ativo que os comprimidos. / The present study has 4 captions. The first is called \"Cyclodextrins: Technology to improve the solubility of the little soluble drugs\" show a review of the cyclodextrins and its derivates, as well the formations of inclusion complexes. At the second caption, \"Preparation and characterization of the ternary complexes of the saquinavir, &#946-cyclodextrin and polyvinylpyrrolidone\", were evaluated some conditions that could influence in an obtention of the complexes like stirring time at the formation of the complexes, equimolar ratio of the drug and cyclodextrin, solvent for the solubility of the drug and percentage of the hydrosoluble polymer concluding that the best conditions for the formation of the complexes are: 48 hours of the stirring, equimolar ratio 1:2 and 1:4, water to solubilize the drug and addition of 1% of the polymer in the system. The third caption, \"Influence of the drying method at the formation of the ternary complexes of the saquinavir\", had the aim to prepare and characterize ternary complexes of the saquinavir, &#946-cyclodextrin and polyvinylpyrrolidone by the method of drying in equipment and lyophilization, as well to compare the influence of the methods of the obtention at the solubility of the drug, reaching the increasing of 44 times the solubility of the drug when at the form of the ternary inclusion complex (SAQ:βCD:PVP) at the equimolar ratio 1:2 obtained by lyophilization. The fourth and the last caption, \"Dissolution rate of the capsules and tablets of ternary complex of the saquinavir, cyclodextrin and polyvinylpyrrolidone, had the aim to compare the dissolution profile of capsules of the hard gelatine and tablets of ternary complexes SAQ:βCD:PVP obtained by the method of drying in equipment and lyophilization and the reference product (Fortovase®). The results indicate that the dissolution profiles of the pharmaceutical forms of lyophilized complexes show better results of the efficience of the dissolution and that the capsules liberate more efficient the active than the tablets.

A lesão tecidual é um dos efeitos locais descritos nos envenenamentos botrópicos. Toxinas isoladas, como: a jararagina (JAR) e bothropstoxina-I (BthTX-I), obtidas dos venenos de B. jararaca e B. jararacussu, respectivamente, induzem intensa resposta inflamatória e lesão tecidual, porém apresentam diferentes mecanismos de ação. Como descrito, a resolução da lesão tecidual envolve a interação entre mecanismos de reparo do tecido e o sistema imune. Neste contexto, a resposta inflamatória é iniciada por meio da detecção de sinais de dano tecidual agudo devido a distúrbios da homeostasia resultantes ou não de agentes microbianos (DAMPs) e/ou por reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Uma vez induzida, a resposta inflamatória está envolvida tanto no processo de lesão visando a eliminação do agente indutor, assim como no reparo tecidual. Diversos receptores estão envolvidos no reconhecimento de PAMPs e DAMPs como os transmembrânicos representados pelos do tipo Toll, e os citosólicos que compreendem complexos proteicos que formam os inflamassomas. Estes complexos multiproteicos citosólicos podem participar da indução da resposta imune inata por ativação de caspase-1 com consequente liberação de IL-1&#946, que pode resultar em morte celular. Considerando o exposto, o objetivo deste trabalho foi estudar a participação de inflamassoma na resposta inflamatória no tecido muscular de injeção das toxinas, a capacidade da BthTX-I e JAR de induzir a ativação de inflamassoma em macrófagos e os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. O estudo da migração de neutrófilos e macrófagos para o músculo gastrocnémio de animais C57BL/6 ou deficientes em caspase 1/11 (Caspase 1/11-/-) ou NLRP3 (NLRP3-/-) injetados com JAR e BthTX-I permitiu verificar que o inflamassoma NLRP3 participa da migração destas células inflamatórias para local de injeção das toxinas. A análise da produção de IL-1&#946 nas culturas de macrófagos peritoneais incubados com JAR e BthTX-I (6 e 24h) mostrou que somente a BthTX-I foi capaz de induzir a secreção desta citocina por um mecanismo dependente de caspase 1/11, ASC e NLRP3 e independente de IPAF. A incubação de macrófagos humanos com as toxinas permitiu verificar que ambas as toxinas induziram a secreção de IL-1&#946 dependente de caspase 1, porém esta produção foi significativamente maior em resposta à BthTX-I. Nos macrófagos peritoneais de camundongos observamos a relação entre a secreção de IL-1&#946 e morte celular em ensaio de incorporação do brometo de etídio nas culturas incubadas com BthTX-I por 24h e não com a JAR. Visto que ambas as toxinas injetadas via intramuscular induzem resposta inflamatória intensa, foi analisado o efeito delas sobre a viabilidade e secreção de IL-6 e MCP-1 em miotubos C2C12. Os resultados mostraram que somente a BthTX-I induz efeito miotóxico sobre esta linhagem celular. Além disso, pudemos verificar que BthTX-I induz altos níveis de IL-6 e MCP-1 quando comparados aos obtidos com a JAR. Visto que a BthTX-I induziu alta secreção de MCP-1 pelos miotubos C2C12, em experimento in vivo realizado em camundongos C57BL/6 ou deficientes em CCR2 (CCR2-/-) pode ser observada a dependência da interação entre MCP-1 e o CCR2 para a migração dos macrófagos em resposta a injeção de BthTX-I. Em culturas de miotubos incubados com as toxinas pôde ser observada alta liberação de ATP induzida pela BthTX-I in vitro. Em outros experimentos foi estudada a capacidade do sobrenadante de miotubos incubados com BthTX-I de induzir a secreção de IL-1&#946 pelos macrófagos in vitro. Os resultados mostraram a produção de IL-1&#946 nessas culturas de macrófagos, assim como a produção desta citocina em macrófagos incubados com BthTX-I juntamente com ATP. A hidrólise do ATP no sobrenadante da cultura de C2C12 estimulada com BthTX-I aboliu a secreção de IL-1 pelos macrófagos in vitro. Além disso, foi observada a inibição da produção de IL-1&#946 nas culturas de macrófagos primados com LPS e incubados com a BthTX-I em condições de altas concentrações de KCl sugerindo papel relevante do efluxo de K+ na produção de IL-1&#946 induzida pela BthTX-I. Em conjunto, os resultados acrescentam novas informações sobre o potencial inflamatório da JAR e BthTX-I, quanto à ação destas toxinas em macrófagos, ativação de inflamassoma e células musculares. / Tissue damage is one of the local effects described in bothropic envenomations. Isolated toxins, such as jararhagin (JAR) and bothropstoxin-I (BthTX-I), obtained from B. jararaca and B. jararacussu venoms, respectively, induce intense inflammatory response and tissue injury, however mediated by distinct mechanisms. As described, resolution of tissue injury involves the interaction between mechanisms of tissue repair and the immune system. In this context, the inflammatory response is initiated by detecting of signs of acute tissue damage due to disorders of homeostasis resulting from distinct agents (DAMPs) and / or recognition of pathogens associated molecular patterns (PAMPs). Once induced, the inflammatory response is involved both in the injury process for the elimination of the pathogenic agent, as well as in the tissue repair. Several receptors are involved in the recognition of PAMPs and DAMPs as the transmembrane receptors such as the Toll-like, and the cytosolic ones that comprise protein complexes - inflammasomes. These cytosolic multiprotein complexes may participate in the induction of the innate immune response by activation of caspase-1 with consequent release of IL-1&#946, which may result in cell death. Thus, we aimed to study the role of inflammasome on the inflammatory response in muscular tissue of JAR and BthTX-I injection, the ability of BthTX-I and JAR to induce the activation of inflammasome in macrophages and the molecular mechanisms involved in this process. The analyses of the neutrophils and macrophages migration in gastrocnemius muscle of C57BL/6 or Caspase 1/11 (Caspase 1/11-/-) or NLRP3 (NLRP3-/-) deficient mice injected with JAR e BthTX-I allow us to verify that NLRP3 inflammasome participates in these cells migration for the local of the toxins injection. The detection of IL-1&#946 on supernatants from macrophage cultures incubated with JAR or BthTX-I (6 e 24h) showed that only BthTX-I was able to induce this cytokine secretion by a mechanism dependent of caspase 1/11, ASC and NLRP3 and independent of IPAF. The incubation of human macrophages with the toxins demonstrated that both toxins induced IL-1&#946 secretion, however this production was significantly higher in response to BthTX-I. On murine macrophage cultures it was verified the correlation between the IL-1&#946 secretion and the cell death in the incorporation of ethidium bromide assay of cultures incubated with BthTX-I during 24h and not with JAR. Since that both toxins injected in the muscle induced intense inflammation, it was analyzed the effect of both toxins on the viability and the secretions of IL-6 and MCP-1 by C2C12 myotubes. The results showed that only BthTX-I induces a myotoxic effect on this cell line. Furthermore, it was verified that BthTX-I induces high secretion of IL-6 and MCP-1 when compared with those induced by JAR. Considering that BthTX-I induces high levels of MCP-1, in in vivo experiment using C57BL/6 and CCR2 deficient (CCR2-/-) mice it was observed that the interaction of MCP-1 and CCR2 is essential for the macrophage recruitment for the toxin injection. High release of ATP was detected in C2C12 myotube cultures incubated with BthTX-I but not with JAR. In another experiments it was studied the ability of the supernatants of C2C12 myotubes incubated with BthTX-I to induce the IL-1&#946 secretion by peritoneal macrophages in vitro. The results showed the IL-1&#946 secretion in the macrophage cultures as well as the cytokne secretion in macrophages incubated with BthTX-I and ATP independent of the priming with LPS. The hydrolysis of the ATP on the supernatants of C2C12 incubated with the BthTX-I abolished the IL-1&#946 production by macrophages in vitro. In addition, it was not observed IL-1&#946 production by macrophages primed with LPS and incubated with BthTX-I in the presence of high concentration of KCl suggesting a relevant role of K&#43 efflux for this cytokine secretion in response to BthTX-I. Taken together, the results show new findings about the inflammatory effect of JAR and BthTX-I, concerning about the action of these toxins on macrophages, inflammasome activation and muscle cell.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fabiola G_ Nesello Vieira.pdf: 1352690 bytes, checksum: dde9077ce35994c9a408a58112929a03 (MD5) Previous issue date: 2014-06-10 / The abundant lignocellulosic biomass in agro-industrial waste can be reused as an inexpensive substrate for inducing the production of enzymes such as &#946;-xylosidases. The purpose of this study was to analyze the production of &#946;-xylosidase from Aspergillus fumigatus (PC-7S-2 M), isolated from the Atlantic Forest of the Dog Head State Park (Paraná, Brazil) and later identified by morphological and molecular (ITS) methods. The mesophilic fungus was grown at 28 °C in liquid culture media containing Czapeck and 1% of different agroindustrial residues (w/v): passion fruit peel, Ponkan peel, barley brewing residue, soy flakes and ripe banana peel. Inoculants of 105 conidia ml-1 were incubated for 7 days, filtered and assayed for &#946;-xylosidase intracellular activity obtaining a maximum value of 15 U ml-1 of the enzyme in the presence of barley brewing residue after 4 days of cultivation. Then, it was used a Central Composite Rotational Design (CCRD) to optimize the production of &#946;-xylosidase, using barley brewing residue as carbon source at a significance level of p<0.10 which generated a predicted model of 245.04 U ml-1. Model validation provided an average optimized result equal to 229.06 U ml-1 for the enzyme. Thus, the production of &#946;-xylosidase increased in 1,500% over the initially obtained for A. fumigatus in the presence of the barley brewing residue, therefore, achieving 93.47% of the predicted model. This finding emphasizes the availability of A. fumigatus &#946;-xylosidase production with possible applications in several biotechnological process. / A biomassa lignocelulósica abundante nos resíduos agroindustriais, pode ser reutilizada como substrato barato para induzir a produção de enzimas, como &#946;-Xilosidases. O objetivo deste trabalho foi analisar a produção de &#946;-Xilosidase de Aspergillus fumigatus (PC-7S-2 M), isolado da Mata Atlântica do Parque Estadual Cabeça do Cachorro (Paraná, Brasil) e posteriormente identificado por métodos morfológicos e moleculares (ITS). O fungo mesofílico foi cultivado à temperatura de 28 °C em meios líquidos de cultura Czapeck, contendo 1% de diferentes resíduos agroindustriais (w/v): casca de maracujá, casca de pokan, bagaço de cevada, flocos de soja e casca de banana madura. Inóculos de 105 conídios mL-1 foram incubados durante 7 dias, filtrados e submetidos a dosagem de &#946;-Xilosidase intracelular, obtendo-se um valor máximo de 15 U ml-1 para a enzima na presença de bagaço de cevada com 4 dias de cultivo. Assim, utilizou-se um delineamento composto central rotacional (DCCR) para otimizar a produção de &#61538;-Xilosidase, usando o bagaço de cevada como fonte de carbono em um nível de significância p < 0,10, o qual gerou um modelo predito de 245,04 U ml-1. A validação do modelo forneceu um resultado otimizado médio igual a 229,06 U ml-1 para a enzima. Assim, a produção de &#946;-Xilosidase aumentou em 1.500% em relação à obtida inicialmente para o fungo A. fumigatus na presença de bagaço de cevada como fonte de carbono (15 U ml-1), permitindo, deste modo, alcançar 93,47 % do modelo predito. Este achado ressalta a viabilidade de produção de &#946;-Xilosidase de A. fumigatus com possíveis aplicações em vários processos biotecnológicos.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JULIANA_ MOCO CORREA (2).pdf: 1734110 bytes, checksum: 24beceb790c634d766ff59c9de448991 (MD5) Previous issue date: 2014-11-27 / PAPER 1 Depletion of the xynB2 gene upregulates &#946;-Xylosidase expression in C. crescentus. Caulobacter crescentus is able to express several enzymes involved in the utilization of lignocellulosic biomasses. Five genes, xynB1-5, that encode &#946;-xylosidases are present in the genome of this bacterium. In this study, the xynB2 gene, which encodes &#61538;- xylosidase II (CCNA_02442), was cloned under the control of the PxylX promoter to generate the O-xynB2 strain, which overexpresses the enzyme in the presence of xylose. In addition, a null mutant strain, &#61508;-xynB2, was created by two homologous recombination events where the chromosomal xynB2 gene was replaced by a copy that was disrupted by the spectinomycin-resistant cassette. It was demonstrated that C. crescentus cells lacking &#61538;-xylosidase II up-regulates the xynB genes inducing &#946;- xylosidase activity. Transcriptional analysis revealed that xynB1 (RT-PCR analysis) and xynB2 (lacZ transcription fusion) gene expression was induced in the &#61508;-xynB2 cells, and high &#61538;-xylosidase activity was observed in the presence of different agroindustrial residues in the null mutant strain, a characteristic that can be explored and applied in biotechnological processes. In contrast, overexpression of the xynB2 gene caused down-regulation of the expression and activity of the &#61538;-xylosidase. For example, the &#946;-xylosidase activity that was obtained in the presence of sugar cane bagasse was 7-fold and 16-fold higher than the activity measured in the C. crescentus parental and O-xynB2 cells, respectively. Our results suggest that &#61538;-xylosidase II may have a role in controlling the expression of the xynB1 and xynB2 genes in C.crescentus. PAPER 2 - OPTIMIZATION OF THE PRODUCTION &#946;-XYLOSIDASE: A NEW Thermomyces lanuginosus ISOLATED FROM ATLANTIC FOREST BIOME. The successful production of enzymes for the deconstruction of plant biomass depends not only on the isolation and identification of new microorganism producers of hemicellulases, but also on the implementation and improvement of experimental strategies that lead to maximal induction of enzymatic activities. In this work, a new strain of Thermomyces lanuginosus (T. lanuginosus) was isolated from the Atlantic Forest biome in Brazil, and its &#946;-xylosidase activity in response to agro-industrial residues was tested. Using the (CCRD) statistical approach as a strategy for optimization, the induction of &#946;-xylosidase activity was evaluated in residual corn straw, which was used as a carbon source, and improved so that the optimum condition achieved high &#946;-xylosidase activity (1,003 U ml -1; specific activity = 1.683 U mg-1) with 214 U ml -1. The optimal conditions for the crude enzyme extract were pH 5.5 and 60° C showing better thermostability at 55° C. The saccharification ability of &#946;-xylosidase in the presence of hemicellulose obtained from corn straw and xylan from beechwood substrates showed a xylo-oligosaccharide to xylose conversion yield of 80 and 50%, respectively, at 50° C. These data suggest that &#946;-xylosidase from T. lanuginosus isolated from the Atlantic Forest can be used for the saccharification of hemicellulose derived from corn straw, an abundant residue in the American continents, thus providing an interesting alternative for future tests for energy production that relies on the conversion of plant biomass. / RESUMO GERAL As Beta-D-Xilosidases (1,4-&#946;-D-xilano xilohidrolase; EC 3.2.1.37) são glicosídeo hidrolases que tem papel crucial em catalizar a liberação de unidades de xilose a partir de xilo-oligossacarídeos derivados da degradação do xilano. A completa degradação do xilano é um passo chave do ciclo do carbono na natureza e é um processo também realizado por microrganismos. A bioconversão de materiais lignocelulósicos é vantajosa não somente do ponto de vista ambiental mais também econômico o que é recebido nos setores produtivos com um considerável interesse, pois esses materiais representam vasta fonte de carbono, que podem ser empregados no desenvolvimento de bioprocessos que resultam em produtos de alto valor agregado; entre os quais estão os açúcares fermentáveis, combustíveis, fármacos, enzimas e substâncias de interesse industrial, além de fazer uma gestão integrada do efluente que por não haver um desenvolvimento biotecnológico adequado é descartado e acumulado na natureza. Em face disso, o presente trabalho teve por objetivos estudar a regulação gênica do gene xynB2 da bactéria Caulobacter crescentus que codifica para a Beta-xilosidase II através de abordagens moleculares e otimizar a produção enzimática de Betaxilosidases de Thermomyces lanuginosus na presença de diferentes resíduos de biomassa vegetal por delineamento experimental. No primeiro artigo exploramos a bactéria aquática Caulobacter crescentus por possuir várias enzimas envolvidas na utilização de biomassas lignocelulósicas; contendo em seu genoma cinco genes que codificam &#946;-xilosidases. A partir do gene xynB2, que codifica para enzima &#61538;-xylosidase II (CCNA_02442), desenvolvemos duas linhagens mutantes denominadas O-xynB2, que super-expressa a enzima na presença de xilose e &#61508;-xynB2 que tem o gene xynB2 interrompido, o que possibilitou avaliar que a ausência da enzima &#61538;-xylosidase II em células de C. crescentus regula positivamente os genes xynB, induzindo a atividade global de &#946;-xilosidases, revelando um papel regulatório para a mesma. No segundo trabalho um fungo da linhagem Thermomyces lanuginosus isolado de bioma de Mata Atlântica foi identificado e analisado quanto à capacidade de produzir Beta-xilosidases na presença de diferentes resíduos vegetais; em decorrência disso foi otimizado a produção enzimática com delineamento experimental DCCR, o que permitiu alcançar altos níveis de atividade enzimática beta-xilosidásica na presença de palha de milho.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 parte I regiane.pdf: 912177 bytes, checksum: 0b47e257840020aec3acb3cb01014dba (MD5) Previous issue date: 2008-05-29 / The &#946;-1.3-glucanases have several functions in the cell as fungal metabolic in hydrolysis of polysaccharides for possible cellular assimilation; morphogenetic function in the hydrolysis or modifications of the cell wall, which includes growth and extension of the wall, altering the structure and composition of the wall and autolysis. In addition to presenting ecological importance, since these enzymes are involved in biological control, through the process of mycoparasitism. The gender Trichoderma comprises a group of filamentous fungi, saprophytic soil, found on decomposing organic matter in the rhizosphere, and some plants. Considering the importance of &#946;-1.3 glucanases proposing in this study to evaluate the production of &#946;-1.3 - glucanases by T. asperellum using different sources of carbon and nitrogen. The enzyme was produced using cell wall of Rizoctonia solani (PCRS), chitin, chitosan, starch, cellulose, sucrose, maltose, lactose, celobiose and glucose. The best production of enzymes was obtained in the middle containing PCRS, with two bands of activity of polyacrylamide gel were found. Furthermore, the effect of varying concentrations of ammonium sulfate (2, 4, 6, 8, 20, 40 and 60 mM) in the production of &#946;-1.3-glucanase was evaluated during the growth of the fungus in PCRS. A great increase in activity of the enzyme was detected in the presence of nitrogen source. We can see that there was a considerable increase in the expression of the enzyme of low molecular weight at this culture conditions. / As b-1,3-glucanases apresentam diversas funções na célula fúngica como metabólica, na hidrólise de polissacarídeos para eventual assimilação celular; função morfogenética, na hidrólise ou modificações da parede das células, que inclui o crescimento e extensão da parede, alterando sua estrutura e sua composição e autólise. Além de apresentar importância ecológica estas enzimas estão envolvidas no controle biológico, através do processo de micoparasitismo. O gênero Trichoderma compreende um grupo de fungos filamentosos saprófitas de solo, encontrados sobre matéria orgânica em decomposição e na rizosfera de algumas plantas. Considerando a importância das b-1,3-glucanases propõe-se neste trabalho a avaliação da produção de b-1,3-glucanases por T. asperellum utilizando diferentes fontes de carbono e nitrogênio. A enzima foi produzida utilizando parede celular de Rizoctonia solani (PCRS), quitina, quitosana, amido, celulose, sacarose, maltose, lactose, celobiose e glicose. A melhor produção de enzimas foi obtida n o meio contendo PCRS, sendo detectadas duas bandas de atividade em gel de poliacrilamida. Além disto, o efeito de concentrações variadas de (NH4) 2SO4 (2, 4, 6, 8, 20, 40 e 60 mM) na produção de b-1,3-glucanases foi avaliado durante o crescimento do fungo em PCRS. Um aumento considerável na atividade da enzima foi detectado na presença desta fonte de nitrogênio. Pode - se observar que houve um aumento considerável na expressão da enzima de menor massa molecular nestas condições de cultivo.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:23:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JULIANA_ MOCO CORREA (2).pdf: 1734110 bytes, checksum: 24beceb790c634d766ff59c9de448991 (MD5) Previous issue date: 2014-11-27 / PAPER 1 Depletion of the xynB2 gene upregulates &#946;-Xylosidase expression in C. crescentus. Caulobacter crescentus is able to express several enzymes involved in the utilization of lignocellulosic biomasses. Five genes, xynB1-5, that encode &#946;-xylosidases are present in the genome of this bacterium. In this study, the xynB2 gene, which encodes &#61538;- xylosidase II (CCNA_02442), was cloned under the control of the PxylX promoter to generate the O-xynB2 strain, which overexpresses the enzyme in the presence of xylose. In addition, a null mutant strain, &#61508;-xynB2, was created by two homologous recombination events where the chromosomal xynB2 gene was replaced by a copy that was disrupted by the spectinomycin-resistant cassette. It was demonstrated that C. crescentus cells lacking &#61538;-xylosidase II up-regulates the xynB genes inducing &#946;- xylosidase activity. Transcriptional analysis revealed that xynB1 (RT-PCR analysis) and xynB2 (lacZ transcription fusion) gene expression was induced in the &#61508;-xynB2 cells, and high &#61538;-xylosidase activity was observed in the presence of different agroindustrial residues in the null mutant strain, a characteristic that can be explored and applied in biotechnological processes. In contrast, overexpression of the xynB2 gene caused down-regulation of the expression and activity of the &#61538;-xylosidase. For example, the &#946;-xylosidase activity that was obtained in the presence of sugar cane bagasse was 7-fold and 16-fold higher than the activity measured in the C. crescentus parental and O-xynB2 cells, respectively. Our results suggest that &#61538;-xylosidase II may have a role in controlling the expression of the xynB1 and xynB2 genes in C.crescentus. PAPER 2 - OPTIMIZATION OF THE PRODUCTION &#946;-XYLOSIDASE: A NEW Thermomyces lanuginosus ISOLATED FROM ATLANTIC FOREST BIOME. The successful production of enzymes for the deconstruction of plant biomass depends not only on the isolation and identification of new microorganism producers of hemicellulases, but also on the implementation and improvement of experimental strategies that lead to maximal induction of enzymatic activities. In this work, a new strain of Thermomyces lanuginosus (T. lanuginosus) was isolated from the Atlantic Forest biome in Brazil, and its &#946;-xylosidase activity in response to agro-industrial residues was tested. Using the (CCRD) statistical approach as a strategy for optimization, the induction of &#946;-xylosidase activity was evaluated in residual corn straw, which was used as a carbon source, and improved so that the optimum condition achieved high &#946;-xylosidase activity (1,003 U ml -1; specific activity = 1.683 U mg-1) with 214 U ml -1. The optimal conditions for the crude enzyme extract were pH 5.5 and 60° C showing better thermostability at 55° C. The saccharification ability of &#946;-xylosidase in the presence of hemicellulose obtained from corn straw and xylan from beechwood substrates showed a xylo-oligosaccharide to xylose conversion yield of 80 and 50%, respectively, at 50° C. These data suggest that &#946;-xylosidase from T. lanuginosus isolated from the Atlantic Forest can be used for the saccharification of hemicellulose derived from corn straw, an abundant residue in the American continents, thus providing an interesting alternative for future tests for energy production that relies on the conversion of plant biomass. / RESUMO GERAL As Beta-D-Xilosidases (1,4-&#946;-D-xilano xilohidrolase; EC 3.2.1.37) são glicosídeo hidrolases que tem papel crucial em catalizar a liberação de unidades de xilose a partir de xilo-oligossacarídeos derivados da degradação do xilano. A completa degradação do xilano é um passo chave do ciclo do carbono na natureza e é um processo também realizado por microrganismos. A bioconversão de materiais lignocelulósicos é vantajosa não somente do ponto de vista ambiental mais também econômico o que é recebido nos setores produtivos com um considerável interesse, pois esses materiais representam vasta fonte de carbono, que podem ser empregados no desenvolvimento de bioprocessos que resultam em produtos de alto valor agregado; entre os quais estão os açúcares fermentáveis, combustíveis, fármacos, enzimas e substâncias de interesse industrial, além de fazer uma gestão integrada do efluente que por não haver um desenvolvimento biotecnológico adequado é descartado e acumulado na natureza. Em face disso, o presente trabalho teve por objetivos estudar a regulação gênica do gene xynB2 da bactéria Caulobacter crescentus que codifica para a Beta-xilosidase II através de abordagens moleculares e otimizar a produção enzimática de Betaxilosidases de Thermomyces lanuginosus na presença de diferentes resíduos de biomassa vegetal por delineamento experimental. No primeiro artigo exploramos a bactéria aquática Caulobacter crescentus por possuir várias enzimas envolvidas na utilização de biomassas lignocelulósicas; contendo em seu genoma cinco genes que codificam &#946;-xilosidases. A partir do gene xynB2, que codifica para enzima &#61538;-xylosidase II (CCNA_02442), desenvolvemos duas linhagens mutantes denominadas O-xynB2, que super-expressa a enzima na presença de xilose e &#61508;-xynB2 que tem o gene xynB2 interrompido, o que possibilitou avaliar que a ausência da enzima &#61538;-xylosidase II em células de C. crescentus regula positivamente os genes xynB, induzindo a atividade global de &#946;-xilosidases, revelando um papel regulatório para a mesma. No segundo trabalho um fungo da linhagem Thermomyces lanuginosus isolado de bioma de Mata Atlântica foi identificado e analisado quanto à capacidade de produzir Beta-xilosidases na presença de diferentes resíduos vegetais; em decorrência disso foi otimizado a produção enzimática com delineamento experimental DCCR, o que permitiu alcançar altos níveis de atividade enzimática beta-xilosidásica na presença de palha de milho.

O presente trabalho é composto por 4 capítulos distintos. No primeiro intitulado \"Ciclodextrinas: tecnologia para melhoria da solubilidade de fármacos pouco solúveis\" aborda-se uma revisão das ciclodextrinas e de seus derivados, como também a formação dos complexos de inclusão. No segundo capítulo, \"Obtenção e caracterização de complexos ternários de saquinavir, &#946;-ciclodextrina e polivinilpirrolidona\", foram avaliadas condições que poderiam influenciar na obtenção dos complexos, tais como: tempo de agitação na formação dos complexos, proporção equimolar de fármaco e ciclodextrina, solvente para solubilização do fármaco e porcentagem de polímero hidrossolúvel, concluindo-se que as melhores condições para obtenção dos complexos são 48 horas de agitação, razão equimolar 1:2 e 1:4, água para solubilização do fármaco e acréscimo de1% de polímero ao sistema. O terceiro capítulo, \"Influência do método de secagem na obtenção de complexos ternários de saquinavir\", teve o objetivo de obter e caracterizar complexos ternários de saquinavir, &#946;-ciclodextrina e polivinilpirrolidona pelos métodos de secagem em estufa e liofilização, bem como, comparar a influência dos métodos de obtenção na solubilidade do fármaco, chegando-se ao aumento de 44 vezes da solubilidade do fármaco quando na forma de complexo SAQ:&#946;CD:PVP de proporção equimolar 1:2 obtido por liofilização. O quarto, \"Perfil de dissolução de cápsulas e comprimidos contendo complexos ternários de saquinavir, ciclodextrina e polivinilpirrolidona\", teve o objetivo de comparar o perfil de dissolução de cápsulas de gelatina dura e comprimidos contendo sistemas ternários SAQ:&#946;CD:PVP, obtidos pelos métodos de secagem em estufa e liofilização e o produto referência (Fortovase®). Os resultados indicam que os perfis de dissolução das formas farmacêuticas contendo complexos liofilizados apresentaram melhores resultados de eficiência de dissolução e que as cápsulas liberam mais prontamente o ativo que os comprimidos. / The present study has 4 captions. The first is called \"Cyclodextrins: Technology to improve the solubility of the little soluble drugs\" show a review of the cyclodextrins and its derivates, as well the formations of inclusion complexes. At the second caption, \"Preparation and characterization of the ternary complexes of the saquinavir, &#946-cyclodextrin and polyvinylpyrrolidone\", were evaluated some conditions that could influence in an obtention of the complexes like stirring time at the formation of the complexes, equimolar ratio of the drug and cyclodextrin, solvent for the solubility of the drug and percentage of the hydrosoluble polymer concluding that the best conditions for the formation of the complexes are: 48 hours of the stirring, equimolar ratio 1:2 and 1:4, water to solubilize the drug and addition of 1% of the polymer in the system. The third caption, \"Influence of the drying method at the formation of the ternary complexes of the saquinavir\", had the aim to prepare and characterize ternary complexes of the saquinavir, &#946-cyclodextrin and polyvinylpyrrolidone by the method of drying in equipment and lyophilization, as well to compare the influence of the methods of the obtention at the solubility of the drug, reaching the increasing of 44 times the solubility of the drug when at the form of the ternary inclusion complex (SAQ:&#946;CD:PVP) at the equimolar ratio 1:2 obtained by lyophilization. The fourth and the last caption, \"Dissolution rate of the capsules and tablets of ternary complex of the saquinavir, cyclodextrin and polyvinylpyrrolidone, had the aim to compare the dissolution profile of capsules of the hard gelatine and tablets of ternary complexes SAQ:&#946;CD:PVP obtained by the method of drying in equipment and lyophilization and the reference product (Fortovase®). The results indicate that the dissolution profiles of the pharmaceutical forms of lyophilized complexes show better results of the efficience of the dissolution and that the capsules liberate more efficient the active than the tablets.

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The Polycomb group (PcG) family of proteins form chromatin-modifying complexes essential for embryonic development, and stem cell renewal and are commonly deregulated in cancer. There are several reports that address the possible implication of PcG proteins in tumor progression and metastasis, but very little is known about the specific role of these proteins in tumor progression and invasion. On the other hand, the molecular processes of the worst cancer prognosis, metastasis, which leads to an incurable disease, are yet incompletely elucidated. Here we show a role for Ring1B, a PcG protein, in three processes related to metastasis: in the Epithelial-mesenchymal transition (EMT), a critical morphogenic event that occurs during embryonic development and during the progression of various epithelial tumors, an in the migration and the invasion of mammary epithelial cells. / Las proteínas del grupo Polycomb (PcG) forman complejos modificadores de la cromatina esenciales en el desarrollo embrionario y en la renovación de las células madre, y su desregulación ha sido asociada al cáncer. Varios estudios muestran la posible implicación de las proteínas de PcG en la progresión tumoral y en la metástasis, pero a pesar de ello se sabe muy poco de los procesos moleculares en los que estas proteínas están participando. Por otro lado, los procesos moleculares responsables del peor pronóstico en cáncer, la metástasis, que continua siendo una enfermedad incurable, siguen sin estar completamente elucidados. En esta disertación mostramos el papel de Ring1B, una proteína del PcG, en tres procesos implicados en la metástasis: en la transición epitelio-mesénquima (EMT), un proceso morfogénico crítico en el desarrollo embrionario y durante la progresión de varios cánceres epiteliales, y en la migración y la invasión de las células epiteliales mamarias.