Os mecanismos imunológicos que governam a interação entre o fungo Paracoccidioides brasiliensis e o hospedeiro têm sido pouco estudados. Tanto os componentes do fungo como os receptores dos fagócitos envolvidos nesta interação são pouco conhecidos. Baseados nestes fatos, nosso trabalho teve por objetivo caracterizar in vitro e in vivo o envolvimento do receptor Toll Like-2 (TLR-2) e da proteína adaptadora MyD88 (myeloid differentiation primary response gene 88) na infecção de camundongos pelo P. brasiliensis. O TLR-2 é um receptor da imunidade inata envolvido no reconhecimento de PAMPs (padrões moleculares associados aos patógenos), enquanto que MyD88 é uma molécula envolvida na sinalização celular induzida por muitos TLRs e que culmina com a ativação de vários fatores de transcrição, entre eles o NFB, envolvidos na ativação de genes ligados à resposta inflamatória. Para tanto, utilizamos camundongos C57Bl/6 deficientes e normais para TLR-2 e para MyD88. Demonstramos que, comparado ao grupo controle, animais TLR2-/- apresentavam uma infecção pulmonar menos grave associada com menor síntese de óxido nítrico (NO). Resultados equivalentes foram obtidos com macrófagos peritoneais e alveolares infectados in vitro. Inesperadamente, apesar das diferenças na carga fúngica, ambas as linhagens apresentavam tempo médio de sobrevida semelhante e lesões pulmonares de gravidade equivalente. Os estudos com leucócitos infiltrantes de pulmão revelaram um aumento de leucócitos polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) nos animais TLR-2-/- associado com um menor número de linfócitos TCD4+ e TCD8+ ativados. Animais TLR-2-/- deficientes apresentaram uma discreta diferença quanto à síntese de citocinas pulmonares dos tipos Th1 e Th2, porém estes animais apresentaram maiores níveis de KC, uma quimiocina CXC envolvida na quimiotaxia de neutrófilos, assim com maiores níveis de citocinas Th17 (IL-6, IL-17, IL-23 e TGF-). Além disso, a resposta imune Th17 desenvolvida por animais TLR-2-/- esteve associada com menor expansão de células T regulatórias CD4+CD25+FoxP3+. Assim, o TLR-2 controla a imunidade inata e adaptativa frente ao P. brasiliensis e regula negativamente a resposta imune Th17 e a patologia pulmonar. Em relação aos estudos com animais deficientes para a proteína adaptadora MyD88 na paracoccidioimicose verificamos que sua ausência resultou numa produção deficiente in vitro e in vivo de NO, além de uma produção deficiente in vivo de citocinas do tipo Th1, Th2 e Th17. Animais MyD88-deficientes infectados desenvolveram uma resposta imune prejudicada, evidenciada pelo menor número de macrófagos ativados, assim como uma imunidade adaptativa menos eficiente, evidenciada pelo menor número de células T CD4 ativadas que afluíram aos pulmões. Este quadro culminou com uma carga fúngica maior nos pulmões dos animais MyD88- deficientes, como também permitiu uma exuberante disseminação do fungo para outros órgãos, como fígado e baço. Os pulmões e o fígado apresentaram graves lesões com a presença de granulomas coalescentes e ricos agregados fúngicos. Assim, camundongos MyD88-deficientes não foram capazes de controlar a doença e morreram em um tempo mais curto que os animais MyD88-competentes, como evidenciado em experimentos de sobrevida. Assim, nossos achados demonstram que a sinalização intracelular mediada pela proteína MyD88 é importante para a ativação dos mecanismos fungicidas, assim como para a ativação das respostas imunes inata e adaptativa contra o P. brasiliensis. Em conjunto, nosso trabalho demonstra que tanto o TLR-2 quanto a molécula adaptadora MyD88 desempenham um papel relevante no controle da infecção, assim como na indução da resposta imune contra este patógeno fúngico primário. / The immunological mechanisms that govern the interaction between hosts and the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis have been scarcely studied. Both, fungal and phagocyte receptors involved in this interaction are poorly understood. Based on these facts, the aim of our study was to characterize in vitro and in vivo the role played by Toll Like Receptor-2 (TLR-2) and the adaptor protein MyD88 (myeloid differentiation primary response gene 88) in murine pulmonary paracoccidioidomycosis. The TLR-2 is a receptor of innate immunity involved in the recognition of PAMPs (pathogen associated molecular patterns), whereas MyD88 is a molecule involved in cell signaling induced by many TLRs . TLR-mediated activation results in the production of several nuclear transcription factors, including NFB, which activate important genes of the inflammatory response. Wild-type (WT) besides TLR- 2- and MyD88-deficient C57Bl/6 mice were used in our investigation. We showed that, compared to control animals, TLR2-/- mice developed a less severe pulmonary infection associated with reduced synthesis of nitric oxide (NO). Equivalent results were obtained with in vitro infected peritoneal and alveolar macrophages. Unexpectedly, despite the differences in fungal loads, TLR-2-/- and WT mice showed equivalent survival times and pulmonary lesions. Studies with lung infiltrating leukocytes revealed an increase of polymorphonuclear neutrophil leukocytes (PMNs) in TLR-2-/- mice associated with a low number of activated T CD4 and T CD8+ lymphocytes. Compared with WT mice, the TLR-2-deficient mice showed slight differences in the production of pulmonary Th1 and Th2 cytokines, but presented higher levels of KC, a CXC chemokine involved in neutrophil chemotaxis, besides increased levels of Th17 cytokines ( IL-6, IL-17, IL-23 and TGF-). Furthermore, the prevalent Th17 immune response developed by TLR-2-/- mice was associated with lower expansion of regulatory T cells CD4+CD25+FoxP3+. Thus, TLR-2 controls the innate and adaptive immunity against the P. brasiliensis infection and negatively regulates Th17 immune response and pulmonary pathology. Studies with MyD88-deficient mice showed an impaired production of NO in vivo and in vitro, and a deficient in vivo production of Th1, Th2 and Th17 cytokines. In addition, infected MyD88-deficient mice developed an impaired immune response, evidenced by poorly activated macrophages, as well as by an inefficient adaptive immunity mediated by a diminished influx of activated CD4+ T cells to the lungs. These events led to increased fungal loads in the lungs of MyD88-deficient mice and allowed a marked dissemination of the fungus to other organs such as liver and spleen, which presented severe lesions composed by coalescent granulomas containing high numbers of fungal cells. As consequence, MyD88-deficient mice were unable to control fungal growth and presented a decreased survival time. Our findings demonstrate that MyD88 signaling is important to the activation of fungicidal mechanisms and to the induction of the innate and adaptive immunity against P. brasiliensis. Altogether, our work shows that both TLR-2 and the adapter molecule MyD88, play an important role in controlling of P. brasiliensis infection, as well as in the induction of immune responses against this primary fungal pathogen.

La nature du lien qui unit les deux aspects du système immunitaire, que sont la défense de l’hôte contre les agressions extérieures et la genèse des maladies auto- immunes, n’a pas été élucidée. L’axe IL-23/Th17 joue un rôle dans les deux versants, ce qui le place en bonne position pour être un potentiel chaînon manquant. Objectif : connaître l’implication de cet axe dans un modèle infectieux, Mycoplasma hominis, et un modèle de maladie auto-immune, la sclérodermie systémique (ScS), dans lesquels il n’a pas encore été étudié. Les lipoprotéines membranaires de M. hominis sont capables d’induire une maturation des cellules dendritiques humaines. Elle s’accompagne d’une sécrétion d’IL-23 variable selon l’origine clinique des isolats, via TLR2, et d’une polarisation vers la voie Th17. Nous avons observé une augmentation de la fréquence des cellules Th17 et Th22 dans le sang périphérique des patients ScS, potentialisée par l’iloprost, via entre autres la production monocytaire d’IL-23. Dans la peau des patients ScS, il existe une augmentation des cellules produisant l’IL-17 inversement corrélé au score de fibrose cutanée. In vitro, l’IL-17 est capable d’inhiber partiellement l’expression d’α-SMA induite par le TGF-ß et d’induire la sécrétion de MMP1 par des fibroblastes dermiques humains. L’axe IL-23/IL-17 et les cellules Th17 jouent un rôle dans la défense contre M. hominis et dans la physiopathologie de la ScS. / Relationship between both aspects of the immune system, ie host defense against external aggression and genesis of autoimmune diseases, has not been elucidated. IL-23/Th17 axis plays a role in both sides, which puts him in a good position to be a potential missing link. Objective: To understand the implication of this axis in a model of infection, Mycoplasma hominis, and a model of autoimmune disease, systemic sclerosis (SSc), in which it has not yet been studied.
The membrane lipoproteins of M. hominis are capable of inducing human dendritic cell maturation. It occurs along with an IL-23 secretion changing with the clinical origin of isolates, via TLR2, and a T cell polarization towards Th17. Then we observed an increase in the Th17 and Th22 cell frequency in peripheral blood of SSc patients, further enhanced by iloprost via monocyte production of IL-23 among others. In the skin of SSc patients, we showed an increase in IL-17-producing cells with an inverse correlation to the skin fibrosis score. In vitro, IL-17 is able to partially inhibit the expression of α-SMA induced by TGF-ß and to induce the secretion of MMP1 in human dermal fibroblasts. The IL-23/IL-17 axis and Th17 cells play a role in defense against M. hominis and in the pathogenesis of SSc.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas resultante da interação entre as diferentes espécies de Leishmania e os mecanismos de resposta imune do hospedeiro. Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis são as espécies de maior potencial patogênico para o homem e de importância médica no Brasil. As células TCD4, quando ativadas por antígenos via MHC II podem se diferenciar em linhagens de células efetoras como Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras (Treg). IL-23 é indispensável para as funções efetoras e manutenção de células Th17. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de Foxp3, IL-17 e IL-23 em lesões cutâneas de pacientes com diferentes formas clínicas da LTA. Biópsias parafinadas de 44 pacientes foram submetidas à imunoistoquímica, sendo 6 casos de leishmaniose cutânea anérgica difusa (LCADIDRM-) e leishmaniose cutânea disseminada borderline (LCDBIDRM-), ambas causadas por L.(L) amazonensis e 16 casos de leishmaniose cutânea localizada (LCLIDRM+) também causada por L.(L.) amazonensis; 9 casos de LCLIDRM+, 2 casos de LCDBIDRM- e 5 casos de leishmaniose cutâneo-mucosa (LCMIDRM+), todos causados por L.(V.) braziliensis. A densidade de células Tregs Foxp3+ no espectro clínico da LTA mostrou um aumento progressivo partindo das formas centrais LCL causadas por L.(V.) braziliensis (170mm2) e L.(L) amazonensis (140mm2) para as formas polares, LCADIDRM- (289mm2) e LCDBIDRM- (183mm2) causada por L.(L) amazonensis, LCDBIDRM- (189mm2) e LCMIDRM+, causadas por L.(V.) braziliensis (158mm2). A comparação entre as densidades de células IL-17+ nas diferentes formas clínicas da LTA mostrou um perfil semelhante também com um aumento progressivo da expressão de IL-17 partindo das formas centrais LCLIDRM+ causadas por L.(V.) braziliensis (232mm2) e L.(L) amazonensis (197mm2) em direção as formas polares, LCADIDRM- (470mm2) e LCDBIDRM- (340mm2) causada por L.(L.) amazonensis, LCDBIDRM- (431mm2) e LCMIDRM+ (372mm2) causada por L.(V.) braziliensis. A densidade de células IL-23+ mostrou perfil similar ao de IL-17 como no espectro de doença causada por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis: LCADIDRM- (687mm2), LCDBIDRM- (518mm2) e LCLIDRM+ (348mm2) por L.(L.) amazonensis, LCLIDRM+ (457mm2), LCDBIDRM- (609mm2) e LCMIDRM+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. Diante dos nossos achados, observa-se que as células Foxp3+, IL-17+ e IL-23+ desempenham um papel importante na imunopatogênese das diferentes formas clínicas da LTA causadas por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis, caracterizada por uma resposta imune polarizada de diferente expressão patológica / The American cutaneous leishmaniasis (ACL) presents a wide spectrum of clinical and immunopathological manifestations resulting from the interaction between the different species of Leishmania and the mechanisms of the host immune response. Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonensis are the species with the largest pathogenic potential for humans and medical importance in Brazil. The CD4+ T cells can be differentiated into effector cell lines as Th1, Th2, Th17 and regulatory T cells (Treg). IL-23 is essential for effector functions and maintenance of Th17 cells, that produces IL-17. The aim of this study was to evaluate the expression of Foxp3, IL-17 and IL-23 in cutaneous lesions of patients with different clinical forms of ACL. Paraffin embedded biopsies from 44 patients were submitted to immunohistochemistry, there were 6 cases of anergic diffuse cutaneous leishmaniasis (ADCLDTH-) and borderline disseminated cutaneous leishmaniasis (BDCLDTH-) both caused by L. (L.) amazonensis 16 cases of cutaneous leishmaniasis (LCLDTH+) caused by L. (L.) amazonensis, 9 cases of LCLDTH+, 2 cases of BDCLDTH- and 5 cases of mucocutaneous leishmaniasis (MCLDTH+) all caused by L. (V.) braziliensis. The density of Treg Foxp3+ cells in the clinical spectrum of ACL showed a progressive increase starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (170mm2) and L. (L) amazonensis (140mm2) towards the polar forms ADCLDTH- (289mm2). The intermediate clinical forms BDCLDTH- (183mm2) caused by L. (L) amazonensis and BDCLDTH-(189mm2) by L. (V.) braziliensis as well as, MCLDTH+(158mm2) did not present any significant differences. The comparison between the densities of IL-17+ cells in different clinical forms of ACL showed progressive increasing starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (232mm2) and L. (L) amazonensis (197mm2) towards the polar forms, ADCLDTH-(470mm2) and BDCLDTH-(340mm2) caused by L. (L.) amazonensis BDCLDTH- (431mm2) and MCLDTH+ (372mm2) caused by L. (V.) braziliensis. The density of IL-23+ cells showed a similar profile to that of IL-17 at the disease spectrum caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis: ADCLDTH-(687mm2) BDCLDTH-(518mm2) and LCLDTH+ (348mm2) by L. (L.) amazonensis; LCLDTH+ (457mm2) LCDBDTH-(609mm2) and MCLDTH+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. In view of our findings, we notice that the Foxp3+, IL-17+ and IL-23+ cells play an important role in the immunopathogenesis of different clinical forms of ACL caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis, characterized by an immune polarized response with different pathological expression

INTRODUÇÃO: A inflamação desempenha um papel central no desenvolvimento da asma, que é considerada uma doença alérgica com um perfil inflamatório clássico Th2. No entanto, as citocinas de perfil IL-17 tem sido estudadas para melhor compreender sua participação na fisiopatologia desta doença. Pacientes asmáticos graves apresentam exacerbações freqüentes, sendo a causa infecciosa um dos principais desencadeantes e que podem perpetuar as respostas inflamatórias. A resposta Th17 pode estar claramente associada a esses eventos. OBJETIVO: Este estudo avaliou os efeitos da terapia com anticorpo monoclonal anti-IL-17 nas alterações presentes nos septos alveolares em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica exacerbado por LPS. MÉTODOS: Foram utilizados 60 camundongos macho da espécie BALB/c, sendo sensibilizados com ovoalbumina intraperitoneal e repetidamente expostos à inalação com ovoalbumina, seguidos por tratamento com ou sem anti-IL-17. Vinte e quatro horas antes do final do protocolo experimental de 29 dias, dois grupos receberam LPS intratraqueal (0,1 mg/ml, sendo os grupos OVA-LPS e OVA-LPS anti-IL-17). Posteriormente, avaliamos o fluido do lavado broncoalveolar (FLBA), por morfometria quantificamos o recrutamento das células apresentadoras de antígenos (FOXP3 e células dendríticas), de eosinófilos, a expressão celular de citocinas próinflamatórias (TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL13 e IL-17), anti-inflamatórias (IL-10), quimiocina (TARC), além da quantificação de IL-6 por RT-PCR. Avaliamos também elementos da matriz extracelular (fibras colágenas tipo I e III, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, TGF-beta, actina, decorina, lumicam, biglicano, fibronectina e integrina), edema dos septos alveolares, resposta das vias de estresse oxidativo através dos marcadores iNOS e 8-iso-PGF2alfa e as vias sinalizadoras NF-kB e Rho quinase, além da avaliação do diâmetro alveolar médio. RESULTADOS: Os animais do grupo OVA-LPS apresentaram uma potencialização de todas as respostas (p < 0,05) comparativamente ao grupo OVA, exceto para: expressão de IL-17, TNF-alfa, NF-kB, TIMP-1 e na fração de volume de fibras colágenas tipo I, decorina, lumicam e actina. No grupo OVA-anti-IL17 houve atenuação de todos os parâmetros quando comparado ao grupo OVA (p < 0,05). Nos animais do modelo de inflamação alérgica crônica exacerbado pelo LPS e tratado com anti-IL-17 (grupo OVA-LPS anti-IL-17) houve diminuição comparativamente ao grupo OVA-LPS dos seguintes parâmetros: número de células totais do lavado broncoalveolar, de células positivas para FOXP3 e células dendríticas, número de CD4+ e CD8+, de células positivas para IL-10 anti-inflamatória e citocinas pró-inflamatórias (TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 e IL-17); quimiocinas (TARC), expressão gênica de IL-6, edema nos septos alveolares; elementos da matriz extracelular (fração de volume de fibras colágenas tipo I e III, actina, decorina, biglicano, lumicam, fibronectina, integrina e expressão de células positivas para TGF-beta, MMP-9, MMP-12 e TIMP-1), da resposta das vias de estresse oxidativo: (células positivas para iNOS e fração de volume de isoprostano PGF-2alfa; da expressão celular de NF-kB, e das proteínas Rho quinase 1 e 2 (p < 0,05). Não houve diferenças no diâmetro alveolar médio entre todos os grupos experimentais. CONCLUSÃO: Esses dados sugerem que a inibição da IL-17 pode ser uma via terapêutica promissora para o tratamento da inflamação alérgica crônica, mesmo durante uma exacerbação e pode contribuir para o controle da inflamação Th1/ Th2/Th17, da expressão de quimiocinas, do remodelamento da matriz extracelular e do estresse oxidativo. As vias sinalizadoras de NF-kB e Rho-quinase estão envolvidas no controle dessas respostas neste modelo de inflamação alérgica crônica exacerbado pelo LPS / INTRODUCTION: Inflammation plays a central role in the development of asthma, which is considered an allergic disease with a classic Th2 inflammatory profile. However, IL-17 profile cytokines have been studied to better understand their involvement in the pathophysiology of this disease. Severe asthmatic patients have frequent exacerbations, the infectious cause being one of the main triggers and that can perpetuate the inflammatory responses. The Th17 response may be clearly associated with these events. OBJECTIVE: This study evaluates the effects of anti-IL-17 monoclonal antibody therapy on alveolar septa in an experimental model of chronic allergic lung inflammation of asthma exacerbated by LPS. METHODS: Sixty male BALB / c mice were used, being sensitized with intraperitoneal ovalbumin and repeatedly exposed to inhalation with ovalbumin, followed by treatment with or without anti-IL-17. Twenty-four hours before the end of the 29-day experimental protocol, two groups received intratracheal LPS (0.1 mg / ml, OVA-LPS and anti-IL-17 OVA-LPS groups). Afterwards, we evaluated bronchoalveolar lavage fluid (BALF), by morphometry we quantified the recruitment of antigen-presenting cells (FOXP3 and dendritic cells), eosinophils, the cellular expression of proinflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-2, IL IL-5, IL-6, IL-13 and IL-17), anti-inflammatory cytokines (IL-10), chemokine (TARC), and quantification of IL6 by RT-PCR. We also evaluated elements of the extracellular matrix (collagen fibers type I and III, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, TGF-beta, actin, decorin, lumicam, biglican and fibronectin), alveolar septum edema, oxidative stress through the marker iNOS and 8-iso-PGF2? and the signaling pathways NF-kB and Rho kinase. In addition, we evaluated of the mean alveolar diameter. RESULTS: The animals of the OVA-LPS group presented a potentiation of the all responses compared to OVA (p < 0.05), except for: expression of IL-17, TNFalpha, NF-kB, TIMP-1 and in the volume fraction of type I collagen fibers, decorin, lumicam and actin. Treatment with anti-IL-17 (OVA-anti-IL17 group) attenuated all parameters compared to OVA group (p < 0.05). The animals of the chronic allergic inflammation model exacerbated by LPS and treated with anti-IL-17 (OVA-LPS anti-IL-17 group) had a decreased of the following parameters compared to OVA-LPS: total bronchoalveolar lavage cells number, FOXP3 and dendritic positive cells, CD4 + and CD8 + numbers, of cells positive for IL-10 antiinflammatory, and pro-inflammatory cytokines (TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 13 and IL-17); chemokine (TARC), genic expression IL6; edema in the alveolar septum; extracellular matrix elements (volume fraction of collagen fibers type I and III, actin, decorin, biglican, lumicam, fibronectin, and expression of TGF-beta, MMP-9, MMP-12 and TIMP-1 positive cells) of the oxidative stress pathways response (iNOS positive cells and isoprostane volume fraction 8-isoPGF-2alfa) NFkB and Rho kinase 1 and 2 positive cells (p < 0.05). There were no differences in mean alveolar diameter among all experimental groups. CONCLUSION: These data suggest that inhibition of IL-17 may be a promising therapeutic pathway for the treatment of chronic allergic inflammation, even during an exacerbation, and may contribute to the control of Th1 / Th2 / Th17 inflammation, chemokine expression, extracellular matrix remodeling and oxidative stress. Signaling pathways of NF-kB and Rho-kinase are involved in the control of these responses in this model of chronic allergic inflammation exacerbated by LPS

Abscessos e granulomas periapicais são considerados lesões inflamatórias relacionadas a elementos dentários, com origem em infecções do tecido pulpar e periapical. É pouco conhecido o papel da interleucina 17 (IL-17) nessas lesões, uma citocina que participa ativamente de uma classe de resposta imunológica recentemente descrita, denominada Th17. A resposta Th17 tem sido caracterizada pela produção de IL-17 por linfócitos CD4+ e tem sido associada à instalação e perpetuação do processo inflamatório, bem como a intenso recrutamento de neutrófilos. Este estudo tem como foco investigar a expressão dessa citocina em lesões de abscesso e granuloma periapicais, com a intenção de verificar se há diferenças de expressão entre essas duas lesões, já que a presença de infiltrado neutrofílico difere bastante entre elas. Testes imuno-histoquímicos para IL-17, CD4 (para identificação de linfócitos T CD4+), CD8 (para identificação de linfócitos T CD8+) e elastase (para identificação de células inflamatórias polimorfonucleadas) foram realizados em casos de abscesso (n=25) e granuloma (n=25) periapicais, selecionados do acervo do Serviço de Patologia Cirúrgica da Disciplina de Patologia Bucal da FOUSP. Foi obtida a porcentagem da área de células com expressão positiva para os marcadores citados. Também foi realizada a quantificação de células CD4+/IL-17+ e CD8+/IL-17+ detectadas por imunofluorescência nessas mesmas biópsias. Foram realizados testes estatísticos de Friedman e Mann-Whitney, para se verificarem as diferenças entre as porcentagens de marcação imuno-histoquímica obtidas para o abscesso e o granuloma, bem como teste de correlação de Spearman, para se verificar se havia correlação entre a expressão de IL-17 e os demais marcadores. Nos casos de abscesso periapical, houve expressão intensa de elastase, seguida de IL-17 e CD8, cujas respectivas porcentagens de expressão não diferiram estatisticamente entre si, mas foram significativamente maiores do que a da expressão do CD4 (p<0,0001). No teste de correlação de Spearman, houve correlação positiva significante entre IL-17 e CD8 (rs = 0,5944, p=0,0415), mas não entre IL-17 e elastase e IL-17 e CD4. Na quantificação de células duplamente positivas pela técnica da imunofluorescência houve significantemente mais células CD4+/IL-17+ do que CD8+/IL-17+ (p=0,0250). Nos casos de granuloma periapical, observou-se que a porcentagem de área de marcação do CD4 foi significativamente maior em relação a da elastase (p=0,0055), do CD8 (p=0,0200) e da IL-17 (p=0,0210). Houve correlação positiva significativa entre IL-17 e elastase (rs = 0,5604, p=0,0463), mas não entre IL-17 e os demais marcadores. Na quantificação de células duplamente positivas pela técnica da imunofluorescência houve significância maior para células CD4+/IL-17 do que de células CD8+/IL-17+ (p=0,0470). Na comparação da porcentagem de área de marcação entre abscesso e granuloma, a porcentagem de IL-17 foi significativamente maior nos abscessos (p=0,0114). Concluiu-se que há maior expressão da IL-17 em abscessos do que em granulomas e que, nesses últimos, essa citocina é mais expressa quando há maior expressão de células polimorfonucleadas. Isso parece evidenciar a participação da resposta Th17 em fases agudas do processo inflamatório. Apesar de haver diferenças significativas entre as lesões quanto ao predomínio das subpopulações de linfócitos T, em ambas as lesões há maior co-expressão da IL-17 em linfócitos CD4+, indicando que provavelmente essa população linfocitária seja a principal responsável pela secreção dessa citocina nas lesões estudadas. / Periapical abscess and periapical granulomas are considered inflammatory lesions related to dental infections originated from pulpal and periodontal tissues. There is little information about the role of interleukin 17 (IL-17) on these lesions. IL-17 is a cytokine pertaining to a new class of immunological response termed Th17. Th17 response has been characterized by the IL-17 release by CD4+ lymphocytes and has been associated to stabilization and perpetuation of the inflammatory process, as well as to neutrophil recruitment. The present study focused on the investigation of the IL-17 expression in periapical abscess and periapical granuloma, in order to verify if there are differences between the lesions that could be related to level of neutrophil infiltrate. Immunohistochemical tests to IL-17, CD4 and CD8 (to identify different lymphocyte population) and elastase (to detect neutrophils) were performed in the periapical abscess (n=25) and granuloma (n=25) biopsies, selected from the collection of Surgical Pathology Service of the Department of Oral Pathology FOUSP. Percentage of the labeling area showing positive expression was obtained for the all cited markers. Counting of CD4+/IL17+ and CD8+/IL7+ cells detected by immunofluorescence was also performed. Friedman´s and Mann-Whitney non-parametric statistical tests were applied for the labeling area percentages in order to detect the significant differences between abscess and granuloma. Spearman´s correlation test was adopted to verify whether there was a correlation between IL-17 and the other markers. In the periapical abscess biopsies, elastase, IL-17, and CD8 were intensively labeled, with area percentage significantly higher than that observed for CD4 (p<0.0001). By the Spearman correlation test, there was significant positive correlation between IL-17 and CD8 (rs = 0.5944, p=0.0415), but not between IL-17 and elastase, and IL-17 and CD4. In the double staining by immunofluorescence there was significantly more CD4+/IL17+ cells than CD8+/IL17+ cells (p=0.0250). In the periapical granulomas, CD4 labeling area percentage was significantly higher than those for elastase (p=0.0055), CD8 (p=0.0200), and IL-17 (p=0.0210). There was significant positive correlation between IL-17 and elastase (rs = 0.5604, p=0.0463), but not between IL-17 and the other markers. The most frequent double staining cells were CD4+/IL17+ cells in the comparison with CD8+/IL17+ cells (p=0.0114). In conclusion, IL-17 labeling area percentage is higher in the abscess than in the granuloma; in the granulomatous lesions the IL-17 expression is directly proportional to the neutrophil infiltration. These results may indicate that the Th17 response participates to the acute phase of the apical inflammatory process. Although there were significant differences regarding the predominant T lymphocytes types, the co-expression of IL-17 and CD4 in the both inflammatory processes may suggest that this CD4+ lymphocytes are the main responsible for IL-17 release in the analyzed periapical lesions.

Introdução: As citocinas desenvolvem papel importante na fisiopatologia da DPOC. Estudos sugerem que a IL-17 modula respostas inflamatórias e infecciosas, podendo ser alvo para o tratamento da inflamação pulmonar. Objetivos: Avaliar os efeitos preventivos e terapêuticos do anti IL-17 num modelo de lesão pulmonar induzida pela elastase em camundongos C57Bl6. Métodos: Foram utilizados 32 camundongos C57Bl6, machos, com idade entre 6 e 8 semanas e peso médio de 20-28 gramas, divididos em 4 grupos: 1. GRUPO SAL: os animais receberam solução salina intra-peritoneal (IP) 3 horas antes de serem submetidos à instilação intra-traqueal (IT) de salina, e salina IP nos dias 25, 26 27 e 28 pós instilação IT de salina; 2. GRUPO ELASTASE CONTROLE (EC): receberam salina IP 3 horas antes de receberem elastase IT, e salina IP nos dias 25, 26, 27 e 28 pós instilação de elastase; 3. GRUPO ELASTASE + ANTI IL-17 PREVENTIVO (EP): receberam anti IL-17 IP 3 horas antes de receberem elastase IT, e salina IP nos dias 25, 26, 27 e 28 pós instilação de elastase; 4. GRUPO ELASTASE + ANTI IL-17 TERAPÊUTICO (ET): receberam salina IP 3 horas antes de receberem elastase IT, e anti IL-17 IP nos dias 25, 26, 27 e 28 pós instilação de elastase. No 29º dia, os animais foram anestesiados, traqueostomizados, conectados ao aparelho FlexiVent (Scireq, Montreal, Canadá), e foram avaliados: resistência do sistema respiratório (Rrs), elastância do sistema respiratório (Ers), resistência de vias aéreas (Raw), resistência do parênquima pulmonar (Gtis), elastância do parênquima pulmonar (Htis), óxido nítrico exalado (NOex), e obtida a contagem das células totais do fluido do lavado broncoalveolar (FLBA). Depois, os animais foram exsanguinados, coração e pulmão foram retirados em bloco. Os pulmões foram fixados com formaldeído 4% a uma pressão constante de 20 cmH2O, por 24 horas. Após esse período, os pulmões foram mantidos em álcool 70% por até 36 horas, e em seguida foram preparados para o processamento histológico para avaliação de MMP9, MMP12, TIMP-1, TGF-beta, lumican, biglicano, decorina, fibronectina, iNOS, eNOS, isoprostano 8-iso-PGF-2alfa, NF-Kb, IL-17, IL-1beta, IL-8, TNF-alfa, neutrófilos, e fibras colágenas e elásticas em vias aéreas e septos alveolares. Foi analisado também o intercepto linear médio (Lm). Resultados: Em relação aos parâmetros Rrs, Ers, Raw, Htis, NOex e número de células totais no FLBA houve aumento no grupo EC em comparação ao grupo SAL (p < 0,05). O tratamento preventivo e terapêutico com anti IL-17 diminuiu os valores de Rrs, Ers, Raw e Htis (p < 0,05). Não houve diferença entre os grupos em relação ao Gtis. Em ambos os tratamentos houve redução do NOex comparados ao grupo EC (p < 0,05). Quanto ao número de células totais no FLBA, houve redução no grupo ET em relação ao EC e EP (p < 0,05), porém não houve diferença entre os grupos EC e EP. Ao realizar a contagem do diferencial de células do FLBA, houve redução apenas no número de macrófagos no grupo ET (p < 0,05). O tratamento preventivo e terapêutico com anti IL-17 também diminuiu o número de células positivas para NF-kb, iNOS, MMP9, MMP12, TGF-beta, isoprostano 8-iso-PGF-2alfa, TNF-alfa,IL-8, IL-1beta e IL-17, e contagem de neutrófilos em vias aéreas e nos septos alveolares quando comparados do grupo EC (p < 0,05), assim como a fração de volume de fibras colágenas, decorina e lumican em vias aéreas, e fibras elásticas e fibronectina no parênquima pulmonar (p < 0,05). Houve aumento do intercepto linear médio no grupo EC comparado ao SAL, e o tratamento com anti IL-17 diminuiu esses valores nos grupos EP e ET (p < 0,05). Houve redução de fibras colágenas em septos alveolares e biglicano em vias aéreas no grupo EP, e redução de células positivas para eNOS em vias aéreas somente no grupo ET em relação ao grupo EC (p < 0,05). Não houve diferença entre os grupos EC, EP e ET nos resultados de TIMP-1, fibronectina em vias aéreas e lumican nos septos alveolares. Conclusão: O anticorpo monoclonal anti IL-17 neste modelo de tratamento, tanto administrado de forma preventiva (atuando no bloqueio imediato da ação da elastase) quanto de forma terapêutica (depois das alterações estabelecidas pelas lesões iniciais), contribuiu para melhora da maioria dos parâmetros funcionais avaliados na mecânica pulmonar, inflamação, remodelamento da matriz extracelular e a resposta ao estresse oxidativo nos septos alveolares e nas paredes das vias aéreas neste modelo de lesão pulmonar induzida pela elastase administrada por via intra-traqueal / Introduction: Cytokines play an important role in the pathophysiology of COPD. Studies suggest that IL-17 modulates inflammatory and infectious responses and may be targeted for treatment of pulmonary inflammation. Objectives: To evaluate preventive and therapeutic effects of antiIL-17 in a model of lung injury induced by elastase in C57Bl6 mice. Methods: Thirtytwo male C57Bl6 mice, aged 6 to 8 weeks and mean weight of 20-28 grams, were divided into 4 groups: 1. SAL GROUP: animals received intra-peritoneal saline (IP) 3 hours before being submitted to intra tracheal (IT) instillation of saline, and IP saline on days 25, 26, 27 and 28 after saline IT instillation; 2. ELASTASE CONTROL (EC) GROUP: received IP saline 3 hours prior to IT elastase, and IP saline on days 25, 26, 27 and 28 post elastase instillation; 3. ELASTASE + PREVENTIVE ANTI IL-17 (EP) GROUP: received anti IL-17 IP 3 hours before receiving IT elastase, and IP saline on days 25, 26, 27 and 28 post elastase instillation; 4. ELASTASE + THERAPEUTIC ANTI IL-17 (ET) GROUP: received IP saline 3 hours before receiving elastase IT, and anti IL- 17 IP on days 25, 26, 27 and 28 post elastase instillation. On 29th day, the animals were anesthetized, tracheostomized, connected to FlexiVent apparatus (Scireq, Montreal, Canada), and evaluated: respiratory system resistance (Rrs), respiratory system elastance (Ers), airway resistance (Raw), pulmonary parenchyma resistance (Gtis), pulmonary parenchyma elastance (Htis), exhaled nitric oxide (NOex), and total bronchoalveolar lavage fluid (FLBA) cell count. Afterwards, the animals were exsanguinated, heart and lung were removed in block. The lungs were fixed with 4% formaldehyde at a constant pressure of 20 cmH2O for 24 hours, maintained in 70% alcohol for up to 36 hours and then prepared for histological processing for MMP9, MMP12, TIMP-1, TGF-Beta, lumican, biglycan, decorin, fibronectin, iNOS, eNOS, isoprostane 8-iso-PGF-2Alpha, NF-kb, IL-17, IL-1Beta, IL- 8, TNF-Alpha, neutrophils, and collagen and elastic fibers in airways and alveolar septa. The mean linear intercept (Lm) was also analyzed. Results: In relation to the parameters Rrs, Ers, Raw, Htis, NOex and number of total cells in FLBA, there was an increase in EC group compared to SAL group (p < 0.05). Preventive and therapeutic treatment with anti IL-17 decreased the values of Rrs, Ers, Raw and Htis (p < 0.05). There was no difference between groups regarding to Gtis. In both treatments there was NOex reduction compared to EC group (p < 0.05). Regarding the number of total cells in FLBA, there was reduction in ET group in relation to EC and EP (p < 0.05), but there was no difference between EC and EP groups. When counting the FLBA cell differential, there was reduction only in number of macrophages in ET group (p < 0.05). Preventive and therapeutic treatment with anti IL-17 also decreased the number of positive cells for NF-kb, iNOS, MMP9, MMP12, TGF-Beta, isoprostane 8-iso-PGF-2Alpha, TNF-Alfa, IL-8 , IL-1Beta and IL-17, and number of neutrophils, in airways and alveolar septa when compared to EC group (p < 0.05), as well as the volume fraction of collagen fibers, decorin and lumican in airways, and elastic fibers and fibronectin in alveolar septa (p < 0.05). There was increase in mean linear intercept in EC group compared to SAL, and treatment with anti IL-17 decreased the values of Lm in EP and ET groups (p < 0.05). There was reduction of collagen fibers in alveolar septa and biglycan in airways in EP group, and reduction of positive cells for eNOS in airways only in ET group in relation to EC group (p < 0.05). There was no difference between EC, EP and ET groups in results of TIMP-1, fibronectin in airways and lumican in alveolar septa. Conclusion: Anti IL-17 monoclonal antibody in this treatment model, both administered as a preventive way (acting on the immediate block of elastase action) and therapeutically (after changes established by the initial lesions), contributed to improvement of most functional parameters evaluated in pulmonary mechanics, inflammation, remodeling of extracellular matrix and response to oxidative stress in alveolar septa and airways in this model of lung injury induced by intratracheal elastase.

INTRODUÇÃO: Indivíduos com asma possuem infiltração aumentada de células inflamatórias, produção de quimiocinas e hiperresponsividade de vias aéreas. Estes apresentam níveis aumentados de interleucina (IL)-17, importante na regulação da expressão de mediadores inflamatórios e recrutamento de células inflamatórias, outra característica é aumento da atividade da proteína Rho-quinase em suas vias aéreas. A modulação da IL-17 e da proteína Rho-quinase pode ser promissora para o tratamento desta doença. OBJETIVO: Estudar os efeitos dos tratamentos realizados com anticorpo neutralizador anti-IL17 e do inibidor da Rho-quinase, associados ou não, em camundongos com inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Foram utilizados 64 camundongos BALB/c, divididos em 8 grupos (8 animais por grupo): SAL (solução salina); OVA (ovoalbumina), SAL-RHOi (salina e inibidor de Rho-quinase), OVA - RHOi (ovoalbumina e inibidor de Rho-quinase), SAL - anti-IL17 (salina e anti-IL17), OVA - anti-IL17 (ovoalbumina e anti-IL17), SAL - RHOi - anti-IL17 (salina, anti-IL17 e inibidor de Rho-quinase), OVA - RHOi - anti-IL17 (ovoalbumina, anti-IL17 e inibidor de Rho-quinase). O protocolo de sensibilização e indução da inflamação pulmonar por ovoalbumina teve duração de 28 dias. O Anti-IL17A (clone 50104 - 7,5 ug por dose) foi administrado via intraperitoneal e inibidor de Rho-quinase (Y-27632) intranasal (10 mg/kg), 1h antes de cada desafio com ovoalbumina (22, 24, 26 e 28 dias). RESULTADOS: Houve um aumento na resistência do sistema respiratório e na elastância, nos marcadores inflamatórios CD4+, CD8+, ROCK1 e ROCK2, IL-1-beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNFalfa, em vias sinalizadoras NF-kappaB, FOXP-3 e células dendríticas, em marcadores de remodelamento MMP9, MMP12, TIMP1, iNOS, TGF-beta, no conteúdo de isoprostano, decorina, biglicano, fibronectina e fibras colágenas e na expressão gênica de VAChT, IL-17 e arginase, no grupo OVA em comparação com o grupo controle. O tratamento dos animais sensibilizados, de forma individualizada ou a associação dos dois, atenuou estas respostas quando comparados ao grupo sensibilizado com ovoalbumina e não tratado (p < 0,05). O tratamento do inibidor de Rho-quinase associado ao anti-IL17 gerou potencialização do controle da resposta de hiperresponsividade à metacolina, assim como nas vias aéreas a redução do número de células positivas TNF-alfa, IL-4, IL-5 e nos septos alveolares o número de células positivas IL-4, IL-5, TGF-beta, FOXP3, ROCK1 e ROCK2 (p < 0,05). CONCLUSÃO: O tratamento com anti-IL17 associado ao inibidor da Rho-quinase modula a hiperresponsividade das vias aéreas, inflamação, e remodelamento e estresse oxidativo em animais com inflamação pulmonar alérgica crónica / RATIONALE: Individuals with asthma have increased infiltration of inflammatory cells, chemokines production, and airway hyperresponsiveness. Asthmatics have elevated levels of interleukin (IL)-17, which plays an important role in regulating the expression of inflammatory mediators and recruitment of inflammatory cells, these individuals also have increased Rho-kinase protein activity in their airways. The modulation of IL-17 and Rho-kinase protein may be promising for the treatment of this disease. OBJECTIVE: To study the effects of anti-IL17 neutralizing antibody and Rho-kinase inhibitor treatments, associated or not, on mice with chronic allergic lung inflammation. METHODS: Were used 64 BALB/c mice, divided into eight groups (n=8 in each group): SAL (saline-instilled); OVA (exposed-ovalbumin); SAL-RHOi (saline and Rho-kinase inhibitor), OVA-RHOi (exposed-ovalbumin and Rho-kinase inhibitor); SAL - anti-IL17 (saline and anti-IL17), OVA - anti-IL17 (exposed-ovalbumin and anti-IL17); SAL - RHOi -anti-IL17(saline, Rho-kinase inhibitor and anti-IL17), OVA - RHOi - anti-IL17 (exposed-ovalbumin, anti-IL17 and Rho kinase inhibitor). The protocol for sensitization and induction of pulmonary inflammation by ovalbumin has the duration of 28 days. The Anti-IL17A neutralizing antibody (clone 50104-7.5 ug per dose) was administered via the intraperitoneal, and Rho-kinase inhibitor (Y-27632) intranasal (10 mg/kg), 1h before each ovalbumin challenge (22, 24, 26 and 28 day). RESULTS: There was an increase in respiratory system resistence and elastance, in the positive cells evaluated CD4+, CD8+, ROCK1 and ROCK2, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNFalpha, TGF-beta, MMP9, MMP12, TIMP1 and isoprostane, decorin, biglican, fibronectin, collagen fibers content, signaling pathways NF-kappaB, FOX-P3, dendrict cells and gene expression of VAChT, IL-17 and arginase in the OVA group compared to the control group. Treatment of the sensitized animals with the Rho-kinase inhibitor or with the anti-IL17 or with the combination of the two, attenuated these responses when compared to the ovalbumin-sensitized and untreated group (p < 0,05). The treatment of the anti-IL17 associated Rho-kinase inhibitor generated potentiation of the hyper responsiveness response to methacholine, as well as in the airways the reduction of the number of TNF-alpha, IL-4, IL-5 positive cells and in the alveolar septa the number of IL-4, IL-5, FOXP3, TGF-beta, ROCK1 and ROCK2 (p < 0.05). CONCLUSION: Anti-IL17 treatment associated with the Rho-kinase inhibitor modulates airway hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress in animals with chronic allergic pulmonary inflammation

INTRODUÇÃO: Indivíduos com asma possuem infiltração aumentada de células inflamatórias, produção de quimiocinas e hiperresponsividade de vias aéreas. Estes apresentam níveis aumentados de interleucina (IL)-17, importante na regulação da expressão de mediadores inflamatórios e recrutamento de células inflamatórias, outra característica é aumento da atividade da proteína Rho-quinase em suas vias aéreas. A modulação da IL-17 e da proteína Rho-quinase pode ser promissora para o tratamento desta doença. OBJETIVO: Estudar os efeitos dos tratamentos realizados com anticorpo neutralizador anti-IL17 e do inibidor da Rho-quinase, associados ou não, em camundongos com inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Foram utilizados 64 camundongos BALB/c, divididos em 8 grupos (8 animais por grupo): SAL (solução salina); OVA (ovoalbumina), SAL-RHOi (salina e inibidor de Rho-quinase), OVA - RHOi (ovoalbumina e inibidor de Rho-quinase), SAL - anti-IL17 (salina e anti-IL17), OVA - anti-IL17 (ovoalbumina e anti-IL17), SAL - RHOi - anti-IL17 (salina, anti-IL17 e inibidor de Rho-quinase), OVA - RHOi - anti-IL17 (ovoalbumina, anti-IL17 e inibidor de Rho-quinase). O protocolo de sensibilização e indução da inflamação pulmonar por ovoalbumina teve duração de 28 dias. O Anti-IL17A (clone 50104 - 7,5 ug por dose) foi administrado via intraperitoneal e inibidor de Rho-quinase (Y-27632) intranasal (10 mg/kg), 1h antes de cada desafio com ovoalbumina (22, 24, 26 e 28 dias). RESULTADOS: Houve um aumento na resistência do sistema respiratório e na elastância, nos marcadores inflamatórios CD4+, CD8+, ROCK1 e ROCK2, IL-1-beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNFalfa, em vias sinalizadoras NF-kappaB, FOXP-3 e células dendríticas, em marcadores de remodelamento MMP9, MMP12, TIMP1, iNOS, TGF-beta, no conteúdo de isoprostano, decorina, biglicano, fibronectina e fibras colágenas e na expressão gênica de VAChT, IL-17 e arginase, no grupo OVA em comparação com o grupo controle. O tratamento dos animais sensibilizados, de forma individualizada ou a associação dos dois, atenuou estas respostas quando comparados ao grupo sensibilizado com ovoalbumina e não tratado (p < 0,05). O tratamento do inibidor de Rho-quinase associado ao anti-IL17 gerou potencialização do controle da resposta de hiperresponsividade à metacolina, assim como nas vias aéreas a redução do número de células positivas TNF-alfa, IL-4, IL-5 e nos septos alveolares o número de células positivas IL-4, IL-5, TGF-beta, FOXP3, ROCK1 e ROCK2 (p < 0,05). CONCLUSÃO: O tratamento com anti-IL17 associado ao inibidor da Rho-quinase modula a hiperresponsividade das vias aéreas, inflamação, e remodelamento e estresse oxidativo em animais com inflamação pulmonar alérgica crónica / RATIONALE: Individuals with asthma have increased infiltration of inflammatory cells, chemokines production, and airway hyperresponsiveness. Asthmatics have elevated levels of interleukin (IL)-17, which plays an important role in regulating the expression of inflammatory mediators and recruitment of inflammatory cells, these individuals also have increased Rho-kinase protein activity in their airways. The modulation of IL-17 and Rho-kinase protein may be promising for the treatment of this disease. OBJECTIVE: To study the effects of anti-IL17 neutralizing antibody and Rho-kinase inhibitor treatments, associated or not, on mice with chronic allergic lung inflammation. METHODS: Were used 64 BALB/c mice, divided into eight groups (n=8 in each group): SAL (saline-instilled); OVA (exposed-ovalbumin); SAL-RHOi (saline and Rho-kinase inhibitor), OVA-RHOi (exposed-ovalbumin and Rho-kinase inhibitor); SAL - anti-IL17 (saline and anti-IL17), OVA - anti-IL17 (exposed-ovalbumin and anti-IL17); SAL - RHOi -anti-IL17(saline, Rho-kinase inhibitor and anti-IL17), OVA - RHOi - anti-IL17 (exposed-ovalbumin, anti-IL17 and Rho kinase inhibitor). The protocol for sensitization and induction of pulmonary inflammation by ovalbumin has the duration of 28 days. The Anti-IL17A neutralizing antibody (clone 50104-7.5 ug per dose) was administered via the intraperitoneal, and Rho-kinase inhibitor (Y-27632) intranasal (10 mg/kg), 1h before each ovalbumin challenge (22, 24, 26 and 28 day). RESULTS: There was an increase in respiratory system resistence and elastance, in the positive cells evaluated CD4+, CD8+, ROCK1 and ROCK2, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNFalpha, TGF-beta, MMP9, MMP12, TIMP1 and isoprostane, decorin, biglican, fibronectin, collagen fibers content, signaling pathways NF-kappaB, FOX-P3, dendrict cells and gene expression of VAChT, IL-17 and arginase in the OVA group compared to the control group. Treatment of the sensitized animals with the Rho-kinase inhibitor or with the anti-IL17 or with the combination of the two, attenuated these responses when compared to the ovalbumin-sensitized and untreated group (p < 0,05). The treatment of the anti-IL17 associated Rho-kinase inhibitor generated potentiation of the hyper responsiveness response to methacholine, as well as in the airways the reduction of the number of TNF-alpha, IL-4, IL-5 positive cells and in the alveolar septa the number of IL-4, IL-5, FOXP3, TGF-beta, ROCK1 and ROCK2 (p < 0.05). CONCLUSION: Anti-IL17 treatment associated with the Rho-kinase inhibitor modulates airway hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress in animals with chronic allergic pulmonary inflammation

INTRODUÇÃO: A inflamação desempenha um papel central no desenvolvimento da asma, que é considerada uma doença alérgica com um perfil inflamatório clássico Th2. No entanto, as citocinas de perfil IL-17 tem sido estudadas para melhor compreender sua participação na fisiopatologia desta doença. Pacientes asmáticos graves apresentam exacerbações freqüentes, sendo a causa infecciosa um dos principais desencadeantes e que podem perpetuar as respostas inflamatórias. A resposta Th17 pode estar claramente associada a esses eventos. OBJETIVO: Este estudo avaliou os efeitos da terapia com anticorpo monoclonal anti-IL-17 nas alterações presentes nos septos alveolares em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica exacerbado por LPS. MÉTODOS: Foram utilizados 60 camundongos macho da espécie BALB/c, sendo sensibilizados com ovoalbumina intraperitoneal e repetidamente expostos à inalação com ovoalbumina, seguidos por tratamento com ou sem anti-IL-17. Vinte e quatro horas antes do final do protocolo experimental de 29 dias, dois grupos receberam LPS intratraqueal (0,1 mg/ml, sendo os grupos OVA-LPS e OVA-LPS anti-IL-17). Posteriormente, avaliamos o fluido do lavado broncoalveolar (FLBA), por morfometria quantificamos o recrutamento das células apresentadoras de antígenos (FOXP3 e células dendríticas), de eosinófilos, a expressão celular de citocinas próinflamatórias (TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL13 e IL-17), anti-inflamatórias (IL-10), quimiocina (TARC), além da quantificação de IL-6 por RT-PCR. Avaliamos também elementos da matriz extracelular (fibras colágenas tipo I e III, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, TGF-beta, actina, decorina, lumicam, biglicano, fibronectina e integrina), edema dos septos alveolares, resposta das vias de estresse oxidativo através dos marcadores iNOS e 8-iso-PGF2alfa e as vias sinalizadoras NF-kB e Rho quinase, além da avaliação do diâmetro alveolar médio. RESULTADOS: Os animais do grupo OVA-LPS apresentaram uma potencialização de todas as respostas (p < 0,05) comparativamente ao grupo OVA, exceto para: expressão de IL-17, TNF-alfa, NF-kB, TIMP-1 e na fração de volume de fibras colágenas tipo I, decorina, lumicam e actina. No grupo OVA-anti-IL17 houve atenuação de todos os parâmetros quando comparado ao grupo OVA (p < 0,05). Nos animais do modelo de inflamação alérgica crônica exacerbado pelo LPS e tratado com anti-IL-17 (grupo OVA-LPS anti-IL-17) houve diminuição comparativamente ao grupo OVA-LPS dos seguintes parâmetros: número de células totais do lavado broncoalveolar, de células positivas para FOXP3 e células dendríticas, número de CD4+ e CD8+, de células positivas para IL-10 anti-inflamatória e citocinas pró-inflamatórias (TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 e IL-17); quimiocinas (TARC), expressão gênica de IL-6, edema nos septos alveolares; elementos da matriz extracelular (fração de volume de fibras colágenas tipo I e III, actina, decorina, biglicano, lumicam, fibronectina, integrina e expressão de células positivas para TGF-beta, MMP-9, MMP-12 e TIMP-1), da resposta das vias de estresse oxidativo: (células positivas para iNOS e fração de volume de isoprostano PGF-2alfa; da expressão celular de NF-kB, e das proteínas Rho quinase 1 e 2 (p < 0,05). Não houve diferenças no diâmetro alveolar médio entre todos os grupos experimentais. CONCLUSÃO: Esses dados sugerem que a inibição da IL-17 pode ser uma via terapêutica promissora para o tratamento da inflamação alérgica crônica, mesmo durante uma exacerbação e pode contribuir para o controle da inflamação Th1/ Th2/Th17, da expressão de quimiocinas, do remodelamento da matriz extracelular e do estresse oxidativo. As vias sinalizadoras de NF-kB e Rho-quinase estão envolvidas no controle dessas respostas neste modelo de inflamação alérgica crônica exacerbado pelo LPS / INTRODUCTION: Inflammation plays a central role in the development of asthma, which is considered an allergic disease with a classic Th2 inflammatory profile. However, IL-17 profile cytokines have been studied to better understand their involvement in the pathophysiology of this disease. Severe asthmatic patients have frequent exacerbations, the infectious cause being one of the main triggers and that can perpetuate the inflammatory responses. The Th17 response may be clearly associated with these events. OBJECTIVE: This study evaluates the effects of anti-IL-17 monoclonal antibody therapy on alveolar septa in an experimental model of chronic allergic lung inflammation of asthma exacerbated by LPS. METHODS: Sixty male BALB / c mice were used, being sensitized with intraperitoneal ovalbumin and repeatedly exposed to inhalation with ovalbumin, followed by treatment with or without anti-IL-17. Twenty-four hours before the end of the 29-day experimental protocol, two groups received intratracheal LPS (0.1 mg / ml, OVA-LPS and anti-IL-17 OVA-LPS groups). Afterwards, we evaluated bronchoalveolar lavage fluid (BALF), by morphometry we quantified the recruitment of antigen-presenting cells (FOXP3 and dendritic cells), eosinophils, the cellular expression of proinflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-2, IL IL-5, IL-6, IL-13 and IL-17), anti-inflammatory cytokines (IL-10), chemokine (TARC), and quantification of IL6 by RT-PCR. We also evaluated elements of the extracellular matrix (collagen fibers type I and III, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, TGF-beta, actin, decorin, lumicam, biglican and fibronectin), alveolar septum edema, oxidative stress through the marker iNOS and 8-iso-PGF2? and the signaling pathways NF-kB and Rho kinase. In addition, we evaluated of the mean alveolar diameter. RESULTS: The animals of the OVA-LPS group presented a potentiation of the all responses compared to OVA (p < 0.05), except for: expression of IL-17, TNFalpha, NF-kB, TIMP-1 and in the volume fraction of type I collagen fibers, decorin, lumicam and actin. Treatment with anti-IL-17 (OVA-anti-IL17 group) attenuated all parameters compared to OVA group (p < 0.05). The animals of the chronic allergic inflammation model exacerbated by LPS and treated with anti-IL-17 (OVA-LPS anti-IL-17 group) had a decreased of the following parameters compared to OVA-LPS: total bronchoalveolar lavage cells number, FOXP3 and dendritic positive cells, CD4 + and CD8 + numbers, of cells positive for IL-10 antiinflammatory, and pro-inflammatory cytokines (TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 13 and IL-17); chemokine (TARC), genic expression IL6; edema in the alveolar septum; extracellular matrix elements (volume fraction of collagen fibers type I and III, actin, decorin, biglican, lumicam, fibronectin, and expression of TGF-beta, MMP-9, MMP-12 and TIMP-1 positive cells) of the oxidative stress pathways response (iNOS positive cells and isoprostane volume fraction 8-isoPGF-2alfa) NFkB and Rho kinase 1 and 2 positive cells (p < 0.05). There were no differences in mean alveolar diameter among all experimental groups. CONCLUSION: These data suggest that inhibition of IL-17 may be a promising therapeutic pathway for the treatment of chronic allergic inflammation, even during an exacerbation, and may contribute to the control of Th1 / Th2 / Th17 inflammation, chemokine expression, extracellular matrix remodeling and oxidative stress. Signaling pathways of NF-kB and Rho-kinase are involved in the control of these responses in this model of chronic allergic inflammation exacerbated by LPS

Abscessos e granulomas periapicais são considerados lesões inflamatórias relacionadas a elementos dentários, com origem em infecções do tecido pulpar e periapical. É pouco conhecido o papel da interleucina 17 (IL-17) nessas lesões, uma citocina que participa ativamente de uma classe de resposta imunológica recentemente descrita, denominada Th17. A resposta Th17 tem sido caracterizada pela produção de IL-17 por linfócitos CD4+ e tem sido associada à instalação e perpetuação do processo inflamatório, bem como a intenso recrutamento de neutrófilos. Este estudo tem como foco investigar a expressão dessa citocina em lesões de abscesso e granuloma periapicais, com a intenção de verificar se há diferenças de expressão entre essas duas lesões, já que a presença de infiltrado neutrofílico difere bastante entre elas. Testes imuno-histoquímicos para IL-17, CD4 (para identificação de linfócitos T CD4+), CD8 (para identificação de linfócitos T CD8+) e elastase (para identificação de células inflamatórias polimorfonucleadas) foram realizados em casos de abscesso (n=25) e granuloma (n=25) periapicais, selecionados do acervo do Serviço de Patologia Cirúrgica da Disciplina de Patologia Bucal da FOUSP. Foi obtida a porcentagem da área de células com expressão positiva para os marcadores citados. Também foi realizada a quantificação de células CD4+/IL-17+ e CD8+/IL-17+ detectadas por imunofluorescência nessas mesmas biópsias. Foram realizados testes estatísticos de Friedman e Mann-Whitney, para se verificarem as diferenças entre as porcentagens de marcação imuno-histoquímica obtidas para o abscesso e o granuloma, bem como teste de correlação de Spearman, para se verificar se havia correlação entre a expressão de IL-17 e os demais marcadores. Nos casos de abscesso periapical, houve expressão intensa de elastase, seguida de IL-17 e CD8, cujas respectivas porcentagens de expressão não diferiram estatisticamente entre si, mas foram significativamente maiores do que a da expressão do CD4 (p<0,0001). No teste de correlação de Spearman, houve correlação positiva significante entre IL-17 e CD8 (rs = 0,5944, p=0,0415), mas não entre IL-17 e elastase e IL-17 e CD4. Na quantificação de células duplamente positivas pela técnica da imunofluorescência houve significantemente mais células CD4+/IL-17+ do que CD8+/IL-17+ (p=0,0250). Nos casos de granuloma periapical, observou-se que a porcentagem de área de marcação do CD4 foi significativamente maior em relação a da elastase (p=0,0055), do CD8 (p=0,0200) e da IL-17 (p=0,0210). Houve correlação positiva significativa entre IL-17 e elastase (rs = 0,5604, p=0,0463), mas não entre IL-17 e os demais marcadores. Na quantificação de células duplamente positivas pela técnica da imunofluorescência houve significância maior para células CD4+/IL-17 do que de células CD8+/IL-17+ (p=0,0470). Na comparação da porcentagem de área de marcação entre abscesso e granuloma, a porcentagem de IL-17 foi significativamente maior nos abscessos (p=0,0114). Concluiu-se que há maior expressão da IL-17 em abscessos do que em granulomas e que, nesses últimos, essa citocina é mais expressa quando há maior expressão de células polimorfonucleadas. Isso parece evidenciar a participação da resposta Th17 em fases agudas do processo inflamatório. Apesar de haver diferenças significativas entre as lesões quanto ao predomínio das subpopulações de linfócitos T, em ambas as lesões há maior co-expressão da IL-17 em linfócitos CD4+, indicando que provavelmente essa população linfocitária seja a principal responsável pela secreção dessa citocina nas lesões estudadas. / Periapical abscess and periapical granulomas are considered inflammatory lesions related to dental infections originated from pulpal and periodontal tissues. There is little information about the role of interleukin 17 (IL-17) on these lesions. IL-17 is a cytokine pertaining to a new class of immunological response termed Th17. Th17 response has been characterized by the IL-17 release by CD4+ lymphocytes and has been associated to stabilization and perpetuation of the inflammatory process, as well as to neutrophil recruitment. The present study focused on the investigation of the IL-17 expression in periapical abscess and periapical granuloma, in order to verify if there are differences between the lesions that could be related to level of neutrophil infiltrate. Immunohistochemical tests to IL-17, CD4 and CD8 (to identify different lymphocyte population) and elastase (to detect neutrophils) were performed in the periapical abscess (n=25) and granuloma (n=25) biopsies, selected from the collection of Surgical Pathology Service of the Department of Oral Pathology FOUSP. Percentage of the labeling area showing positive expression was obtained for the all cited markers. Counting of CD4+/IL17+ and CD8+/IL7+ cells detected by immunofluorescence was also performed. Friedman´s and Mann-Whitney non-parametric statistical tests were applied for the labeling area percentages in order to detect the significant differences between abscess and granuloma. Spearman´s correlation test was adopted to verify whether there was a correlation between IL-17 and the other markers. In the periapical abscess biopsies, elastase, IL-17, and CD8 were intensively labeled, with area percentage significantly higher than that observed for CD4 (p<0.0001). By the Spearman correlation test, there was significant positive correlation between IL-17 and CD8 (rs = 0.5944, p=0.0415), but not between IL-17 and elastase, and IL-17 and CD4. In the double staining by immunofluorescence there was significantly more CD4+/IL17+ cells than CD8+/IL17+ cells (p=0.0250). In the periapical granulomas, CD4 labeling area percentage was significantly higher than those for elastase (p=0.0055), CD8 (p=0.0200), and IL-17 (p=0.0210). There was significant positive correlation between IL-17 and elastase (rs = 0.5604, p=0.0463), but not between IL-17 and the other markers. The most frequent double staining cells were CD4+/IL17+ cells in the comparison with CD8+/IL17+ cells (p=0.0114). In conclusion, IL-17 labeling area percentage is higher in the abscess than in the granuloma; in the granulomatous lesions the IL-17 expression is directly proportional to the neutrophil infiltration. These results may indicate that the Th17 response participates to the acute phase of the apical inflammatory process. Although there were significant differences regarding the predominant T lymphocytes types, the co-expression of IL-17 and CD4 in the both inflammatory processes may suggest that this CD4+ lymphocytes are the main responsible for IL-17 release in the analyzed periapical lesions.