A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência, representando cerca de 80% dos casos. A DA é caracterizada por um processo de declínio progressivo e irreversível das funções cognitivas e da memória, que se estende para a desorganização do comportamento. Atualmente, 46,8 milhões de pessoas em todo o mundo foram diagnosticadas com demência. Embora vários fatores tenham sido implicados na DA, sua etiologia ainda não é completamente conhecida. Do ponto de vista neuropatológico, é observado no cérebro de indivíduos com DA atrofia cortical difusa, presença de grande número de placas senis, emaranhados neurofibrilares, processo inflamatório e perda neuronal. A progressão dos sintomas está associada a mudanças estruturais nas sinapses colinérgicas em certas regiões do cérebro, que consequentemente, apresentam neurotransmissão colinérgica reduzida. Os vários eventos patológicos interligados contribuem para o avanço da doença e direcionam diversas pesquisas na busca por tratamentos multialvos com base no processo multifatorial de DA. Assim o presente trabalho descreve a síntese de derivados híbridos dual binding site de donepezila-tacrina (fármacos inibidores de acetilcolinesterase), com potencial para agir em dois alvos terapêuticos pela (i) inibição da acetilcolinesterase em ambos os sítios ativo e periférico, como demonstrado pelos estudos de modelagem molecular, e (ii) na agregação do peptídeo A? neurotóxico induzido pela acetilcolinesterase, na tentativa de interromper a progressão da doença. A estratégia sintética envolveu a condensação da 5,6-dimetóxiindanona com a unidade 4-piperidinil carbaldeído, a qual forneceu o intermediário 5,6- dimetóxindan-1-ona-4-piperidinil-metileno-1-[(4-cloroquinolin-2-il)metil], seguido de redução da dupla ligação, gerada na reação de condensação anterior, e substituição do átomo de cloro-quinolina por amino para obtenção do produto final, ou manutenção da função olefina, seguido de substituição do átomo de cloro-quinolina por azido ou amino, gerando cinco híbridos estruturalmente correlacionados. Os híbridos foram testados em ensaio de inibição de acetilcolinesterase e butirilcolinesterase pelo método de Ellman, e o híbrido insaturado, contendo a função amino-quinolina foi o mais ativo da série com IC50 na faixa de nanomolar (0,014 ?M). Futuramente, os intermediários da reação e produto final serão submetidos ao ensaio de inibição da agregação do peptídeo A? neurotóxico pelo método da tioflavina T. Neste trabalho, também são descritos os testes de predição in vitro para permeação pela barreira hematoencefálica, bem como sua absorção intestinal, pelo método PAMPA. / Alzheimer\'s disease (AD) is the most commom form of dementia in almost 80% of the cases. AD is a process that causes a progressive and irreversible decline of cognitive functions, memory and includes disorganized behavior. Currently, 46.8 million people live with dementia around the world. Although several factors have been implicated in AD, its etiology is not fully understood. In the point of neuropathologic view, diffuse cortical atrophy, presence of senile plaques, neurofibrillary tangles, inflammatory process and neuronal loss are observed in the brain of the patients with AD. The progression of the disease symptoms is associated with structural changes in cholinergic synapses in certain brain regions and consequent impairment of cholinergic neurotransmission. The various interconnected pathological events contribute for the progression of the disease and drive several studies in the search for multitarget treatments based on the multifactorial process of AD. Therefore, this work describes the synthesis of dual binding site tacrine-donepezil hybrids, with the potential to act in two therapeutics targets by: (i) inhibition of the acetylcholinesterase in both peripheral and active sites, as demonstrated in molecular modeling studies, and (ii) the peptide A? neurotoxic aggregation induced by acetylcholinesterase, in an attempt to stop the progression of the disease. The synthetic strategy was based on the condensation between 5,6- dimethoxy-indanone and the 4-piperidinyl carbaldehyde core, which afforded the 5,6- dimethoxy-indanone-4-piperidinyl-methylene-1-[(4-chloroquinolin-2-yl)methyl] intermediate, followed by the reduction of the olefinic bond, formed in the previous condensation, and substitution of the chloro-quinoline atom by amine group to give the final product, or keeping the olefin function, followed by replacement of the chloro-quinoline atom by azide or amine to produce five structural related hybrids. The hybrids were tested in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibition assays using Ellman method, and the unsaturated hybrid containing the amino-quinoline function was the most active of the series with IC50 in a nanomolar range (0,014 ?M). The ability of the hybrids to inhibit protein A? neurotoxic aggregation will be assessed by thioflavin T method. In addition, the blood brain and intestinal barrier permeation by PAMPA methodology were also predicted.

A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima essencial que encerra a transmissão colinérgica através de uma rápida hidrólise do neurotransmissor, acetilcolina (ACh). Uma ampla série de evidências mostraram que os inibidores da AChE podem interferir com a progressão da doença de Alzheimer (DA). O desenvolvimento bem sucedido de compostos inibidores da AChE foi baseado na teoria de que o declínio nas funções cognitivas e mentais associadas a DA está relacionado com a perda da neurotransmissão cortical colinérgica, sendo assim, esses compostos podem ser usados para tratar as deficiências colinérgicas. Uma coleção de moléculas orgânicas foi escaneada para ser avaliada a capacidade dessas moléculas em inibir a atividade enzimática da AChE com o objetivo de se encontrar compostos líderes para posteriores otimizações, conduzindo a fármacos com aumento da eficácia e/ou menores efeitos adversos. As estratégias aplicadas incluem o screening ou triagem virtual baseado na estrutura e também no ligante, modelagem farmacofórica, docking molecular e buscas por similaridade (forma e eletrostática). Os estudos foram também concentrados na descoberta de novas classes de inibidores da AChE, tendo como molécula de referência o fármaco donepezil, o qual inaugurou uma nova classe de inibidores da AChE com a ação mais longa e mais seletiva com efeitos adversos manejáveis. Do total de compostos triados, 50 foram selecionados com adequadas propriedades físico-químicas e ADME/Tox. Em geral, esses compostos possuem substancial interação com o sítio periférico aniônico (PAS) da AChE e a maioria deles faz interações adicionais com o sítio catalítico (CAS) e com outros resíduos de aminoácidos importantes ao longo da enzima. Destes 50 compostos, oito foram comercialmente adquiridos e os ensaios enzimáticos revelaram que estes compostos exibem uma alta afinidade pela AChE. Os resultados apontam, ainda, que o composto entitulado ZINC30019441 exibiu a mais potente atividade inibitória para a AChE, com 1,8 micromolar de concentração, e os demais ficaram ainda situados em baixo micromolar, de 2 a 3 micromolar de concentração. Estes resultados, além das modificações químicas ora propostas in silico para estes inibidores protótipos, apontam para o desenvolvimento de uma nova e promissora série de potentes anticolinesterásicos, contendo propriedades de fármacos, as quais são ainda apropriadas para atuarem no Sistema Nervoso Central e interagirem com o peptídeo beta-amiloide, com vistas ao tratamento quimioterápico da doença de Alzheimer. A perspectiva imediata inclui os ensaios de anti-agregação do peptídeo com os oito inibidores já testados com a Acetilcolinesterase. / Acetylcholinesterase (AChE) is an essential enzyme that terminates cholinergic transmission by rapid hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine (ACh). A wide range of evidence shows that AChE inhibitors may interfere with the progression of Alzheimer\'s disease (AD). The successful development of AChE inhibitor compounds was based on the theory that the decline in cognitive and mental functions associated with AD is related to the loss of cortical cholinergic neurotransmission, thus, these compounds can be used for treating cholinergic deficiencies. A collection of organic molecules has been scanned to evaluate the ability of these molecules to inhibit the enzymatic activity of AChE in order to find lead compounds for further optimization, leading to drugs with increased efficacy and/or fewer adverse effects. The strategies applied include structure-based virtual screening and also in ligand-based virtual screening, pharmacophoric modeling, molecular docking and similarity searches (shape and electrostatic). Studies have also focused on the discovery of new classes of AChE inhibitors, having as a reference molecule the drug donepezil, which has opened a new class of AChE inhibitors with longer and more selective action with manageable side effects. 50 of the compounds screened, were selected with appropriate physical and chemical properties and ADME/Tox. In general, these compounds possess substantial interaction with the peripheral anionic site (PAS) of AChE and most of them make further interact with the catalytic site (CAS) and other key amino acid residues throughout the enzyme. Out of these 50 compounds, eight were commercially purchased and the enzyme assays have shown that these compounds exhibit a high affinity for AChE. The results show also that the compound titled ZINC30019441 exhibited the most potent inhibitory activity for AChE, with 1.8 micromolar concentration, and the rest were still located in low micromolar, 2-3 micromolar concentration. These results as well as chemical modifications herein proposed for these prototypes, indicate the development of a new and promising series of potent anticholinesterase containing drug properties, which are still suitable to act on the central nervous system and interact with the ?-amyloid peptide, for chemotherapy treatment of Alzheimer\'s disease. The immediate prospect includes the peptide anti-aggregation assays with the eight inhibitors already tested against acetylcholinesterase

La hipótesis amiloide de la enfermedad de Alzheimer fue la base, hace algunos años, para el desarrollo de una línea de investigación cuyo objetivo principal es la obtención de pequeñas moléculas peptídicas capaces de interferir en la formación de fibras amiloides de la proteína beta-amiloide, pretendiendo reducir de esta manera la toxicidad de la misma. Así mismo, se quiere verificar la existencia de una correlación entre la presencia de fibras amiloides y la neurotoxicidad de la proteína beta-amiloide.Como pequeñas moléculas peptídicas, nos planteamos inicialmente el diseño y síntesis de una serie de N-metilpéptidos con capacidad inhibidora de la toxicidad de beta-amiloide. Esta colección de compuestos, además, se enfocó de forma que permitiese identificar los factores que favorecen la interacción proteína-inhibidor y el carácter de dicha interacción, estudiando entre otros aspectos el papel que juega la esteroquímica de los aminoácidos de estos inhibidores (L ó D) en el reconocimiento molecular. Se planteó correlacionar la inhibición de la toxicidad con la formación/ausencia de fibras amiloides. Para ello se decidió evaluar y utilizar algunos de los métodos descritos en la bibliografía para la detección y cuantificación de fibras amiloides. Para la evaluación de los inhibidores, se decidió obtener un modelo simplificado del proceso de fibrilogénesis de la proteína que tiene lugar durante la enfermedad de Alzheimer. La puesta a punto del mismo ha de permitir ensayar de forma paralela la capacidad de diversos compuestos para inhibir la toxicidad de la proteína in vitro.Por último se planteó la puesta a punto de ensayos de estabilidad de los péptidos sintetizados frente a la acción de proteasas. Este tipo de experimentos permite predecir, de forma aproximada, la biodisponibilidad relativa de diferentes péptidos en medios biológicos, pudiéndose así extrapolar su comportamiento en condiciones in vivo.

La malaltia d'Alzheimer (MA) es caracteritza per la presència a l'hipocamp i l'escorça de plaques senils de la proteïna β-amilode (Aβ), cabdells neurofibrilars de la proteïna tau hiperfosforilada i pèrdua de sinapsis. La hipòtesi neurovascular de la MA dóna una especial importància a les alteracions de la Barrera Hematoencefàlica (BHE) i els increments de la proteïna β-amilode (Aβ). Els ratolins modificats genèticament són els models animals més utilitzats en la investigació de la MA. Tanmateix, aquests ratolins imiten aspectes de la MA de tipus familiar, on alteracions genètiques predisposen a patir la malaltia. Els ratolins d'edat avançada poden ajudar a discernir la frontera entre l'envelliment normal i el patològic. En aquest context prenen especial rellevància els ratolins amb senescència accelerada SAMP8. Aquesta soca ja ha estat descrita com a model de MA i presenta vàries característiques de la MA com dèficits en l'aprenentatge i la memòria, alteracions emocionals, nivells elevats d'APP i Aβ, patologia neuronal associada a tau, alteracions en el sistema colinèrgic, neurodegeneració i estrès oxidatiu entre d'altres. En aquesta tesi hem investigat: 1-Les alteracions i l'evolució temporal de les modificacions en la integritat de la BHE en escorça i hipocamp de ratolins SAMP8; 2-La presència de dipòsits amiloides en aquests ratolins a les zones cerebrals abans esmentades així com el seu increment amb l'edat i 3-La relació temporal i en la localització de les alteracions de la BHE i els dipòsits d'Aβ d'aquests ratolins. Les conclusions que hem estret són que en ratolins SAMP8: 1- Presenten alteracions de la BHE a partir dels 9 mesos d'edat. 2- Presenten acumulacions d'Aβ a partir de 6 mesos d'edat. 3- Presenten nivells més elevats d'angiopatia amiloïdal cerebral (CAA) a partir dels 3 mesos d'edat. 4- Tots els vasos amb CAA mostren també alteracions de la BHE, tot i que hi ha altres basos amb la BHE alterada sense CAA. 5- No hi ha relació directa entre la localització dels dipòsits amiloides i la localització dels vasos sanguinis, els vasos amb CAA ni amb els vasos amb la BHE alterada.

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-16T14:24:58Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_FrancineRodriguesIaniski.pdf: 3871772 bytes, checksum: ea06b31c8ed51f3bf9a88cbfb0d4956c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-16T14:24:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_FrancineRodriguesIaniski.pdf: 3871772 bytes, checksum: ea06b31c8ed51f3bf9a88cbfb0d4956c (MD5) Previous issue date: 2011-12-02 / Alzheimer's disease (AD) is a chronic neurodegenerative pathologic process associated with aging. This disease causes cognition deterioration and memory loss. The formation of senile plaques containing amyloid-β peptide (aβ) is the main characteristic of this disease. Also, AD related with the inflammation and oxidative stress. The lack of drugs used in the prevention and treatment of AD has stimulated the search for new agents that may represent a novel therapeutic alternative. In the present study, we investigated the beneficial effect of meloxicam-loaded nanocapsules in a model of AD induced by intracerebroventricular (i.c.v.) injection of aβ peptide (fragment 25-35) in mice, comparing the effect with free meloxicam. Mice were divided into six groups: (I) control, (II) aβ, (III) Nano, (IV) Free, (V) Nano + aβ and (VI) Free + aβ. Mice were treated with meloxicam-loaded nanocapsules (5 mg/kg, by gavage), free-meloxicam (5 mg/kg, by gavage) or blank nanocapsules. Thirty minutes after treatments, aβ (3 nmol) or filtered water were i.c.v. injected (day 1). Learning and memory were assessed with the Morris water-maze and step-down-type passive-avoidance tasks at the days 4–7 and 7–8 after the aβ injection, respectively. At the end of the experimental protocol, animals were died and brains were removed for determination of reactive species (RS) and non-protein thiols (NPSH) levels, and superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferase (GST) activities. The results demonstrated that aβ injection caused learning and memory deficits in mice, which were verified using the Morris water-maze and step-down-type passiveavoidance tasks. Furthermore, this study showed that oxidative stress was increased in mice that received aβ. The most important findings of the present study was that meloxicam-loaded nanocapsules protected the learning and memory impairments induced by aβ. Moreover, meloxicam-loaded nanocapsules also protected against the increase of oxidative stress. However, free-meloxicam did not have protective effect. All these findings support the beneficial role of meloxicam-loaded nanocapsules in a model of AD induced by aβ. We can suggest that nanocapsules favor the passage of meloxicam through the blood-brain barrier and entry of the drug in the central nervous system. / A doença de Alzheimer (DA) é um processo patológico neurodegenerativo crônico associado ao envelhecimento. Essa patologia ocasiona deterioração da cognição e perda da memória. A formação de placas senis contendo o peptídeo β-amiloide (βa) é a principal característica dessa doença, que também está associada à inflamação e ao estresse oxidativo. A falta de fármacos empregados na prevenção e no tratamento da DA tem estimulado a pesquisa por novos agentes que possam representar uma inovadora alternativa terapêutica. No presente estudo, investigamos o efeito benéfico das nanocápsulas contendo meloxicam sobre o déficit de aprendizagem e de memória em um modelo da DA induzido pela injeção intracerebroventricular (i.c.v.) do peptídeo βa (fragmento 25-35) nos camundongos, comparando o efeito com o fármaco na forma livre. Os camundongos foram divididos em seis grupos: (I) Controle, (II) βa, (III) Nano, (IV) Livre, (V) Nano + βa, (VI) Livre + βa. Os camundongos foram pré-tratados com as nanocápsulas contendo meloxicam (5 mg/kg, por gavagem), ou com o fármaco na forma livre (5 mg/kg, por gavagem), ou com as nanocápsulas brancas. Trinta minutos após os tratamentos, foram injetados i.c.v. o peptídeo βa (3 nmol) ou água filtrada (dia 1). A aprendizagem e a memória foram avaliadas através dos testes do labirinto aquático de Morris e da esquiva passiva, nos dias 4-7 e 7-8 após a injeção do peptídeo βa, respectivamente. No final dos testes comportamentais, os animais foram mortos e os cérebros removidos para a determinação dos níveis de espécies reativas (ER) e tióis nãoproteicos (SHNP), e a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST). Os resultados demonstraram, através dos testes do labirinto aquático de Morris e da esquiva passiva, que a injeção i.c.v. do peptídeo βa causou um déficit na aprendizagem e na memória dos camundongos. Além disso, esse estudo demonstrou que o estresse oxidativo foi aumentado nos camundongos que receberam a injeção i.c.v. do peptídeo βa. Os achados mais importantes desse estudo foram que as nanocápsulas contendo meloxicam protegeram o déficit de aprendizado e de memória induzidas pela injeção i.c.v. do peptídeo βa, assim como foram capazes de proteger contra o aumento do estresse oxidativo. No entanto, o meloxicam na forma livre não apresentou esse efeito protetor. Todos esses achados reforçam o papel benéfico do meloxicam nanoencapsulado em um modelo da DA induzido pela injeção i.c.v. do peptídeo βa, sugerindo que as nanocápsulas favorecem a passagem do meloxicam através da barreira hematoencefálica (BHE) e a entrada do fármaco no sistema nervoso central (SNC)

Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T11:17:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cepeda_AnaOlivaTiroli_D.pdf: 3942958 bytes, checksum: 940e4a499333daa56fd9a4fc5899919c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As proteínas estão envolvidas com as mais diversas funções biológicas. No entanto, para realizar sua função adequadamente, uma proteína deve estar enovelada, ou seja, em sua conformação nativa. Para garantir isso, existe nas células, um elaborado sistema que envolve chaperones moleculares, capaz de auxiliar na prevenção do enovelamento incorreto e da agregação de proteínas Chaperones, de uma maneira geral, são proteínas que ligam e estabilizam polipeptídeos, facilitando seu enovelamento correto sem contribuir com informações conformacionais. O aumento no número de doenças provocadas pelo enovelamento incorreto de proteínas que se depositam nos tecidos na forma de amilóides (também chamadas de doenças conformacionais), tem chamado a atenção para estudos de agregados protéicos, que outrora foram considerados artefatos quando se trabalhava com esse tipo de macromolécula. Nesse sentido, o estudo de chaperones tem ganhado um interesse particular, já que são fortes candidatos ao combate de doenças amiloloidogênicas. Neste trabalho, são apresentados estudos sobre duas famílias de chaperones, a Hsp40 da subfamília A humana e duas sHsps de classe I de cana-de-açúcar, as quais estão envolvidas com o reconhecimento e a apresentação de substratos (proteínas parcialmente desenoveladas) para outras famílias de chaperones responsáveis pelo processo de reenovelamento. Essas duas famílias de chaperones em particular são também conhecidas como 'holdases¿, e são muito diversas, característica necessária para interagir com a grande diversidade de substratos em potencial que existe na célula. As duas sHsps estudadas aqui, as mais expressas em cana-de-açúcar, e a caracterização de suas estruturas e suas eficiências como chaperones, tornou possível a elaboração de uma hipótese sobre o mecanismo de ação dessas proteínas em função do aumento de temperatura. Nesse sentido, é mostrado neste trabalho que sHsps, respondem ao aumento de temperatura passando por expansão conformacional, provavelmente para aumentar a superfície hidrofóbica para a interação com os substratos. O efeito do calor sobre a Hsp40 também foi estudado e os resultados mostraram que essa proteína forma agregados com propriedades amiloidogênicas. Esta é a primeira vez que tais características são descritas para um chaperone de eucarioto. De maneira geral, as implicações dos resultados apresentados aqui podem aumentar o conhecimento geral sobre chaperones e sobre a pesquisa de tratamentos para as doenças conformacionais / Abstract: Proteins are involved with a large variety of biological functions. However, to function properly, proteins must be folded, i.e., they must reach their native conformation. According to that, an elaborated system involving molecular chaperones exists in the cell that helps to prevent the incorrect folding of proteins and also their aggregation. Chaperones, in a general way, are proteins that bind and stabilize polypeptides, facilitating its correct folding without contributing with conformational information. The increasing number of diseases caused by the incorrect folding of proteins that deposit in the form of amyloids (also called conformational diseases) has raised the interest in the study of protein aggregates, which, not long ago, where considered just purification artifacts. In this way, the study of chaperones has gained particular interest because they are potential candidates against amyloidogenic diseases. In this work, we present studies on two families of chaperones, a human Hsp40 from subfamily A and two sugar cane sHsps from class I, which are involved in substrate (partially unfolded proteins) recognition and presentation to other chaperone families that are more active in the protein refolding process. These particular chaperones are also know as 'holdases¿ and they are usually diverse, a characteristic necessary to interact with a large variety of substrate in the cell. The two sHsps studied here are the most expressed in sugar cane and their structure and chaperone efficiency characterization made possible to elaborate a hypothesis on the mechanism of action of these proteins when temperature increases. In that matter, we were able to show that sHsps respond to an increase in temperature by undergoing conformational expansion, likely to increase the hydrophobic area for substrate interaction. The effect of heat on Hsp40 has also been studied and our results showed that this protein form aggregates with amyloidogenic properties. To our knowledge, this is the first time that such characteristics are described for an eukaryotic chaperone. To sum up, we believe that the implications of the results shown here may add to the general knowledge on chaperones and to the search of a treatment for conformational diseases / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Concentrações séricas basais da proteína amiloide sérica A (SAA) estão significativamente aumentadas em pacientes com câncer e alguns autores sugerem uma relação causal. Trabalho anterior do grupo mostrou que a SAA induz a proliferação de duas linhagens de glioblastoma humano e afeta os processos de invasividade in vitro, sustentando um papel pró-tumoral para esta proteína. Com base nesse trabalho, investigamos a abrangência dos efeitos de SAA para outro tipo de célula tumoral e para isso escolhemos um painel de linhagens de melanoma humano e uma linhagem primária obtida a partir de aspirado de linfonodo de paciente com melanoma, por nós isolada. Observamos que apesar da célula precursora de melanomas, isto é, melanócito, não produzir SAA, todas as linhagens de melanoma produziram a proteína e expressaram alguns dos seus receptores. Além disso, quando estas células foram estimuladas com SAA houve uma inibição da proliferação em tempos curtos de exposição (48 horas) e efeitos citotóxicos após um tempo maior (7 dias). A SAA também afetou processos de invasividade e a produção das citocinas IL-6, IL-8 e TNF-α. Aos avaliarmos o efeito da SAA na interação das células de melanoma com células do sistema imune, vimos que a SAA ativou uma resposta imune anti-tumoral aumentando a expressão de moléculas co-estumolatórias, como CD69 e HLA-DR, e sua função citotóxica. Ainda, vimos que a produção de TNF-α, IFN-&#947, IL-10, IL-1β e IL-8 estimuladas por SAA podem contribuir com os efeitos desta. De forma geral estes resultados nos levam a crer que a SAA tem atividade anti-tumoral em melanomas. Finalizando, com base na importância do desenvolvimento da resistência às terapias atuais para o melanoma, observamos que em células resistentes ao PLX4032, um inibidor de BRAF, os efeitos imunomodulatórios induzidos pela SAA estão abolidos, possivelmente identificando um novo componente da resistência. / Basal serum concentrations of the protein serum amyloid A are significantly increased in cancer patients and some authors suggest a causal relationship. Previous work of our research group showed that SAA induces proliferation of two cell lines of human glioblastoma and affects invasiveness processes in vitro, supporting a pro-tumor role for this protein. Based on this work, we investigated the extent of SAA effects to another type of tumor cell and we chose a panel of human melanoma cell lines and primary line obtained from a patient with melanoma by lymph node aspirate. Melanoma cells were isolated by us. We observed that while the precursor cells of melanoma, melanocytes, do not produce SAA, all melanoma cell lines expressed the protein and produced some of their receptors. Moreover, when these cells were stimulated with SAA there was an inhibition of proliferation in short exposure times (48 hours) and cytotoxic effects after a longer period (7 days). SAA also affected invasive procedures and the production of the cytokines IL-6, IL-8 and TNF-α. To evaluate the SAA effect in the interaction of melanoma cells with immune system cells, we found that SAA activated an anti-tumor immune response by increasing the expression of co-estimulatory molecules such as CD69 and HLA-DR, and their cytotoxic function. Furthermore, we found that the production of TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-1β and IL-8 stimulated by SAA can contribute to this effect. In general these results lead us to believe that the SAA has anti-tumor activity in melanomas. Finally, based on the importance of the resistance development to current therapies for melanoma we observed that in cells resistant to PLX4032, a BRAF inhibitor, the immunomodulatory effects induced by SAA are abolished, possibly identifying a new resistance component.

A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência, representando cerca de 80% dos casos. A DA é caracterizada por um processo de declínio progressivo e irreversível das funções cognitivas e da memória, que se estende para a desorganização do comportamento. Atualmente, 46,8 milhões de pessoas em todo o mundo foram diagnosticadas com demência. Embora vários fatores tenham sido implicados na DA, sua etiologia ainda não é completamente conhecida. Do ponto de vista neuropatológico, é observado no cérebro de indivíduos com DA atrofia cortical difusa, presença de grande número de placas senis, emaranhados neurofibrilares, processo inflamatório e perda neuronal. A progressão dos sintomas está associada a mudanças estruturais nas sinapses colinérgicas em certas regiões do cérebro, que consequentemente, apresentam neurotransmissão colinérgica reduzida. Os vários eventos patológicos interligados contribuem para o avanço da doença e direcionam diversas pesquisas na busca por tratamentos multialvos com base no processo multifatorial de DA. Assim o presente trabalho descreve a síntese de derivados híbridos dual binding site de donepezila-tacrina (fármacos inibidores de acetilcolinesterase), com potencial para agir em dois alvos terapêuticos pela (i) inibição da acetilcolinesterase em ambos os sítios ativo e periférico, como demonstrado pelos estudos de modelagem molecular, e (ii) na agregação do peptídeo A? neurotóxico induzido pela acetilcolinesterase, na tentativa de interromper a progressão da doença. A estratégia sintética envolveu a condensação da 5,6-dimetóxiindanona com a unidade 4-piperidinil carbaldeído, a qual forneceu o intermediário 5,6- dimetóxindan-1-ona-4-piperidinil-metileno-1-[(4-cloroquinolin-2-il)metil], seguido de redução da dupla ligação, gerada na reação de condensação anterior, e substituição do átomo de cloro-quinolina por amino para obtenção do produto final, ou manutenção da função olefina, seguido de substituição do átomo de cloro-quinolina por azido ou amino, gerando cinco híbridos estruturalmente correlacionados. Os híbridos foram testados em ensaio de inibição de acetilcolinesterase e butirilcolinesterase pelo método de Ellman, e o híbrido insaturado, contendo a função amino-quinolina foi o mais ativo da série com IC50 na faixa de nanomolar (0,014 ?M). Futuramente, os intermediários da reação e produto final serão submetidos ao ensaio de inibição da agregação do peptídeo A? neurotóxico pelo método da tioflavina T. Neste trabalho, também são descritos os testes de predição in vitro para permeação pela barreira hematoencefálica, bem como sua absorção intestinal, pelo método PAMPA. / Alzheimer\'s disease (AD) is the most commom form of dementia in almost 80% of the cases. AD is a process that causes a progressive and irreversible decline of cognitive functions, memory and includes disorganized behavior. Currently, 46.8 million people live with dementia around the world. Although several factors have been implicated in AD, its etiology is not fully understood. In the point of neuropathologic view, diffuse cortical atrophy, presence of senile plaques, neurofibrillary tangles, inflammatory process and neuronal loss are observed in the brain of the patients with AD. The progression of the disease symptoms is associated with structural changes in cholinergic synapses in certain brain regions and consequent impairment of cholinergic neurotransmission. The various interconnected pathological events contribute for the progression of the disease and drive several studies in the search for multitarget treatments based on the multifactorial process of AD. Therefore, this work describes the synthesis of dual binding site tacrine-donepezil hybrids, with the potential to act in two therapeutics targets by: (i) inhibition of the acetylcholinesterase in both peripheral and active sites, as demonstrated in molecular modeling studies, and (ii) the peptide A? neurotoxic aggregation induced by acetylcholinesterase, in an attempt to stop the progression of the disease. The synthetic strategy was based on the condensation between 5,6- dimethoxy-indanone and the 4-piperidinyl carbaldehyde core, which afforded the 5,6- dimethoxy-indanone-4-piperidinyl-methylene-1-[(4-chloroquinolin-2-yl)methyl] intermediate, followed by the reduction of the olefinic bond, formed in the previous condensation, and substitution of the chloro-quinoline atom by amine group to give the final product, or keeping the olefin function, followed by replacement of the chloro-quinoline atom by azide or amine to produce five structural related hybrids. The hybrids were tested in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibition assays using Ellman method, and the unsaturated hybrid containing the amino-quinoline function was the most active of the series with IC50 in a nanomolar range (0,014 ?M). The ability of the hybrids to inhibit protein A? neurotoxic aggregation will be assessed by thioflavin T method. In addition, the blood brain and intestinal barrier permeation by PAMPA methodology were also predicted.

Introdução: Estudos prévios com leveduras evidenciaram um importante papel de substâncias amiloide (SA) na regulação da gametogênese, questionando seu potencial como marcador da qualidade gamética. Contudo, até o presente momento, nenhum estudo avaliou a presença de SA em óocitos e embriões de mamíferos. Objetivos: Descrever a presença, caracterizar o padrão de distribuição e comparar os níveis das SA em óocitos maduros e embriões pré-implantação, utilizando modelo murino. Identificar, caracterizar o padrão de distribuição e quantificar SA em oócitos humanos em diferentes estágios de desenvolvimento (VG- vesícula germinativa, MI- metáfase I e MII- metáfase II) e estabelecer a correlação entre os níveis de SA nos oócitos e as características clínicas de pacientes submetidas a estimulação ovariana controlada (EOC) para fertilização in vitro (FIV). Metodologia: Realizou-se um estudo piloto experimental, prospectivo, utilizando 20 oócitos maduros e 200 embriões pré-implantação de camundongos (1 célula, 2 células, 4 células, 8 células e blastocistos) e 46 oócitos humanos imaturos e in vitro maturados, doados por 11 pacientes submetidas à EOC para FIV. Oócitos em MII e embriões pré-implantação de camundongos congelados, imediatamente após o descongelamento, foram fixados para imunocoloração para visualização de SA por microscopia confocal e por microscopia imunoeletrônica de transmissão. Oócitos humanos imaturos (VG e MI) e maturados in vitro (VG Parado, MI, MI Parado e MII) também foram fixados e imunocorados para avaliação de SA, utilizando o mesmo anticorpo, por microscopia confocal. Para quantificar a imunocoloração de SA, nos oócitos e ao longo do desenvolvimento embrionário inicial, foi utilizado o programa ImageJ. Resultados: Em todas as amostras (camundongos e humanos), a imunocoloração para SA aparece por toda a zona pelúcida, bem como no citoplasma e no núcleo de oócitos, corpúsculos polares e embriões pré- implantação. Em camundongos, o estágio embrionário de 2 células apresentou níveis mais elevados de SA (69000187,4 DP 6733098,1 a.u.), quando comparado aos outros estágios de desenvolvimento (p <0,0001). A microscopia imunoeletrônica confirmou a presença de SA em oócitos e embriões pré- implantação. Em humanos, oócitos no estágio de VG, frescos, apresentaram níveis mais elevados de substância amiloide (4164.7 DP 1573.5 a.u.), quando comparados a oócitos em MI e MII (p = 0,008). Foi encontrada uma associação negativa entre níveis de SA e o índice de massa corporal (IMC) (-0,54; p = 0,0007), o número de dias de estimulação ovariana (-0,44; p = 0,002), a dose de hMG (-0,44; p = 0,002), o tempo entre a captação dos oócitos e a fixação das amostras (-0,33; p = 0,02) e o tempo decorrido após o trigger (-0,33; p = 0,02). Níveis elevados de SA foram encontrados em oócitos de pacientes que apresentaram valores de hormônio anti-mülleriano (AMH) entre 1 e 3 ng/ml, quando comparados a <1 ng/ml (4592,7 DP 2126,3 a.u vs. 737,3 DP 14,7 a.u.; p = 0,0002) e > 3 ng/ml (4592,7 DP 2126,2 a.u. vs. 3197,3 DP 895,0 a.u ; p = 0,006).16 Conclusões: Nós demonstramos pela primeira vez que as SA estão presentes no citoplasma e núcleo de oócitos murinos e humanos e embriões pré- implantação de camundongos. Também mostramos que as SA se distribuem de forma heterogênea ao longo do processo de maturação de oócitos humanos e do desenvolvimento pré-implantacional de embriões de camundongos. Embriões murinos no estágio de 2 células e oócitos humanos no estágio de VG apresentaram os maiores níveis de SA. Evidenciamos também uma correlação entre os níveis de SA nos oócitos humanos e características clínicas de bom prognóstico em pacientes submetidas a FIV, como por exemplo, baixo IMC e valores normais de AMH. Levando em conta que as SA estão envolvidas em mecanismos fundamentais relacionados a alterações celulares patológicas, bem como no processo de divisão celular, estudos futuros devem investigar o seu possível papel como biomarcador do envelhecimento e/ou da qualidade oocitária / Introduction: Previous studies with budding yeasts evidenced an important role of amyloid substances (AS) in the regulation of gametogenesis, questioning its potential as a marker of gametic quality. However, to date, no study has evaluated the presence of AS in mammalian oocytes and embryos. Objectives: To describe the presence, to characterize the distribution pattern and to compare AS levels in mature oocytes and preimplantation embryos using murine model. Identify, characterize the distribution pattern and quantify AS in human oocytes at different stages of development (GV- germinal vesicle, MImetaphase I and MII-metaphase II) and establish the correlation between oocytes AS levels and clinical characteristics of patients undergoing control ovarian stimulation (COE) for in vitro fertilization (IVF). Methods: An experimental prospective pilot study was carried out using 20 mature oocytes and 200 preimplantation mouse embryos (1-cell, 2-cell, 4-cell, 8- cell and blastocysts) and 46 immature and in vitro mature human oocytes donated from 11 consenting patients submitted to COE for IVF. Frozen MII oocytes and mouse preimplantation embryos, immediately after thawing, were fixed for immunostaining for visualization of AS by confocal microscopy and by transmission electron microscopy. Immature (GV and MI) and in vitro mature (GV Arrested, MI, MI Arrested and MII) human oocytes were also fixed and immunostained for AS evaluation, using the same antibody, by confocal microscopy. Fluorescence intensity from immunofluorescent staining and data from confocal microscopy were quantified using ImageJ program. Results: In all samples (mice and humans), immunostaining for AS appears throughout the zona pellucida, as well as in the cytoplasm and nucleus of oocytes, polar bodies, and preimplantation embryos. In mouse, 2-cell embryos exhibited higher levels of AS (69000187,4 SD 6733098,1 a.u.) when compared to the other stages of development (p <0.0001). Electron microscopy confirmed the presence of AS in mouse oocytes and preimplantation embryos. In humans, fresh GV stage oocytes exhibited higher levels of AS (4164.7 SD 1573.5 a.u.) when compared to MI and MII oocytes (p = 0.008). A negative association was found between levels of AS and patient body mass index (BMI) (-0.54; p = 0.0007), number of days of control ovarian stimulation (-0.44; p = 0.002); (-0.34, p = 0.002), dose of gonadotropin used, time between oocyte retrieval and fixation (-0.33; p = 0.02) and time after the hCG trigger (-0.33; p = 0.02). Significantly higher levels of AS were found in patients with AMH between 1 and 3 ng/ml, compared to <1 ng/ml (4592.7 SD 2126.3 a.u. vs. 737, 3 SD 14.7 a.u.; p = 0.0002) and > 3 ng/ml (4592.7 SD 2126.2 a.u. vs. 3197.3 SD 895.0 a.u.; p = 0.006). Conclusions: We demonstrate for the first time the presence, distribution, and change in AS throughout mouse and human oocyte maturation, and mouse embryonic development. Two-cell mouse embryos and GV human oocytes had the highest levels of AS. We also determine associations between AS in human oocytes with good prognosis clinical characteristics in patients submitted to IVF, such as low BMI and normal AMH values. Considering that AS are involved in fundamental mechanisms related to pathological cell changes, as well as in the19 conclusion of cell division process, future studies should investigate their possible role as a biomarker of oocyte aging and/or quality

Dentro de la superfamilia de los canales iónicos activados por ligando (LGIC) se encuentra la familia de los receptores Cys-loop que incluye a canales catiónicos, como los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) y los receptores 5-HT3 de serotonina; y canales aniónicos, como los activados por GABA (GABAA) y glicina. Estos receptores revisten importancia tanto en la fisiología normal como así también en diversas y muy variadas patologías, entre las que se pueden mencionar las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA). Este hecho los posiciona como blancos moleculares importantes para el desarrollo de nuevos fármacos, y es por esto que el conocimiento de su función y modulación resulta un aspecto clave. Los receptores Cys-loop son proteínas transmembrana, por lo que su función se encuentra condicionada por su entorno lipídico y estímulos propios de la membrana celular, además de por distintos estímulos o factores externos a ella. Están formados por 5 subunidades organizadas pseudo-simétricamente alrededor de un poro o canal central. En estos receptores pueden distinguirse un dominio extracelular (ECD, del inglés extracellular domain), donde se encuentran los sitios de unión al agonista y/o antagonistas, un dominio transmembrana (TMD, del inglés transmembrane domain), que contiene el canal iónico y que se encuentra en extenso contacto con los lípidos de la membrana, y un dominio pequeño intracelular (ICD, del inglés intracellular domain), que contiene distintos sitios de regulación y señalización intracelular. En esta Tesis Doctoral se profundizó en el estudio de la función y modulación de 2 receptores de neurotransmisores pertenecientes a los receptores Cys-loop: los nAChRs, muscular y α7 neuronal, y los receptores 5-HT3. En el capítulo I se estudió la modulación del nAChR muscular por el entorno lipídico de la membrana en la que se encuentra. Se hizo foco especialmente en el colesterol (Col), lípido clave para el correcto funcionamiento del nAChR y que presenta distintas asimetrías laterales y transmembrana en diferentes momentos de la vida y en condiciones de salud o enfermedad. Se trabajó con distintos sistemas modelo: vesículas unilamelares grandes (LUVs), vesículas unilamelares gigantes (GUVs), membranas ricas en nAChR de T. californica o células BOCSC 23 expresando heterologamente el nAChR muscular. A cada uno se le realizaron distintos tratamientos para modificar las condiciones de Col con el fin de obtener sistemas que presenten: i) un aumento del contenido de Col, ii) un aumento de esteroles en la hemicapa externa (por agregado de colesterol hemisuccinato (CHEMS)), o iii) transformación de parte del Col a colestenona (por la enzima colesterol oxidasa (Cox)). Mediante estudios de fluorescencia utilizando las sondas DPH, TMA-DPH y Laurdan se determinó que el orden de membrana aumentó cuando se incorporó CHEMS. Mediante estudios de espectrofotometría utilizando la sonda cristal violeta (CrV) y la técnica de patch-clamp se detectaron, respectivamente, modificaciones conformacionales en el nAChR y cambios en la activación del mismo cuando los diferentes sistemas habían sido incubados con CHEMS o Cox, no así con Col. Tratando LUVs con Tritón, y posterior centrifugación y separación por SDS-PAGE, se determinó que luego de la incorporación de Col o CHEMS al sistema, el nAChR se localizó mayoritariamente en fracciones ordenadas, mientras que cuando se produjo la transformación del Col a colestenona el receptor se localizó principalmente en fracciones desordenadas. Por último, estudios de microscopía confocal utilizando GUVs mostraron que alteraciones en el Col causaron cambios significativos en la presencia y distribución de dominios ordenados y desordenados; y que la presencia de un componente proteico en el sistema, como es un péptido representativo del segmento transmembrana yTM4 del nAChR, alteró las características de la membrana, llevando a todo el sistema a un mayor orden. De acuerdo con estos resultados, distintas modificaciones del Col en la membrana llevan a cambios de su orden y asimetría, y al mismo tiempo a cambios en la localización del nAChR en un determinado entorno, hecho que repercute directamente en su funcionalidad. Su localización en dominios ordenados ocasiona una disminución de su actividad, mientras que su presencia en dominios más desordenados lleva a un aumento de su función. De esta manera, la localización del nAChR en uno u otro dominio podría explicar los cambios en la señal colinérgica reportados en situaciones de envejecimiento y/o patologías como la EA. Existen numerosas evidencias de interacciones funcionales entre los péptidos β-amiloide (Aβ), involucrados en la enfermedad de Alzheimer, y el nAChR α7. En el capítulo II se estudió la modulación del nAChR α7 neuronal por oligómeros de Aβ1-40 y Aβ1-42. Se ha postulado que la acumulación excesiva de estos péptidos en el cerebro provoca la formación de placas seniles, directamente relacionadas con el proceso de neurodegeneración e inflamación característico de esta enfermedad. Sin embargo, evidencias más recientes sugieren que las especies más neurotóxicas serían las formas oligoméricas de Aβ. Mediante estudios de fluorescencia utilizando la sonda CrV se demostró que los oligómeros de Aβ provocan cambios conformacionales en el receptor α7. Utilizando la técnica de patch clamp se determinó que dichos oligómeros son capaces de activar al receptor α7 en muy bajas concentraciones y que, a concentraciones más altas, disminuyen la potenciación de α7 por moduladores alostéricos positivos (PAMs, positive allosteric modulators). Estos resultados muestran un rol dual de los oligómeros de Aβ dependiente de su concentración, como agonistas y como moduladores negativos de α7. El efecto agonista, potenciador de la señal colinérgica, podría tener un rol importante en la fisiología normal del individuo, mientras que el efecto inhibitorio, dado por su exacerbada producción, podría contribuir a la deficiencia en la memoria y cognición asociada a la EA. Teniendo en cuenta las características multifactoriales de la EA, la estrategia de búsqueda de nuevas moléculas apunta al descubrimiento y desarrollo de “multitarget drugs”, es decir de moléculas activas en varios blancos moleculares, por lo que el capítulo III se centró en el descubrimiento y optimización de nuevas moléculas bifuncionales que sean capaces de activar al nAChR e inhibir a la acetilcolinesterasa (ACE). Partiendo de un screening de extractos obtenidos de distintas plantas medicinales, mediante técnicas cromatográficas y de resonancia magnética nuclear se identificó a la molécula de cafeína como una molécula sumamente interesante para la EA. Además de confirmar su ya conocida actividad inhibidora de la ACE, utilizando técnicas de espectrofotometría con la sonda fluorescente CrV y de patch-clamp, en este trabajo se postula su actividad agonista sobre los nAChRs muscular y α7 neuronal. Caracterizada la actividad de la cafeína sobre el sistema colinérgico, se obtuvieron luego 5 análogos sintéticos de esta molécula mediante diseño racional. Se determinó que todos los análogos presentan actividad sobre ambos blancos moleculares, la ACE y los nAChRs, y cuya potencia es mayor a la de la cafeína. Mediante estudios de modelado molecular y docking se identificaron los sitios de inhibición de los análogos de la cafeína en la ACE y de interacción con el nAChR permitiendo postular a estos compuestos como agonistas parciales. Estos hallazgos resultan prometedores en la búsqueda de nuevos fármacos como una estrategia terapéutica para la EA. El otro receptor estudiado en este trabajo de Tesis fue el receptor 5-HT3, uno de los menos conocidos de la familia de los Cys-loop, el cual a nivel presináptico participa de la finalización de la señal nerviosa, tornándose un blanco molecular novedoso tanto en la EA como en otras patologías neurodegenerativas que requieran una potenciación de dicha señal. En el capítulo IV, utilizando el receptor de alta conductancia 5-HT3AHC, se descifraron por primera vez las diferencias entre la activación ortostérica del mismo y su activación alostérica por timol y carvacrol. Mediante la técnica de patch clamp, combinando registros de corrientes macroscópicas en la configuración whole-cell y de canal único en la configuración cell-attached, se caracterizó en primer lugar la activación del receptor humano 5-HT3AHC por los agonistas ortostericos 5-HT y triptamina, y luego la activación alostérica mediada por 2 terpenoides, carvacrol y timol. Se confirmó que tanto el carvacrol como el timol se comportan macroscópicamente como agonistas menos eficaces que 5-HT. Sin embargo, a nivel de canal único, estos 2 terpenoides activan a los receptores 5-HT3A con mayor eficacia que 5-HT. Más aún, se determinó que además de actuar como agonistas, el carvacrol y el timol actúan como modulares alostéricos positivos del receptor 5-HT3AHC humano, y que el efecto potenciador es evidente a concentraciones menores que el efecto agonista. De esta manera, los resultados de este capítulo permitieron definir las bases mecanísticas que subyacen a las diferencias entre la activación y potenciación alostérica u ortostérica del receptor humano 5-HT3A. En resumen, en este trabajo de Tesis se profundizó en el conocimiento de distintas formas de modulación de los nAChRs y del receptor 5-HT3, ya sea por moléculas exógenas o por el entorno lipídico en el que se encuentran, brindando bases moleculares para el entendimiento de su función, su modulación y su afección en determinadas patologías como la EA. En este trabajo se lograron avances significativos, con resultados de gran relevancia, ya sea para el estudio o tratamiento de esta enfermedad. / The Cys-loop receptor family, which belongs to the Ligand-gated ion channel (LGIC) superfamily, includes cation channels, such as nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) and serotonin 5-HT3 receptors, and anion channels, such as those activated by GABA (GABAA) and glycine. These receptors are important in normal physiology and in various pathologies, among which neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD), are included. They are therefore important molecular targets for the development of new drugs, this being the reason why the knowledge of their function is indeed a very interesting aspect worth exploring. Cys-loop receptors are integral membrane proteins whose function is conditioned by their lipid environment as well as by different extrinsic factors. These receptors are formed by five subunits organized pseudo-symmetrically around a central pore. Three different domains can be distinguished: an extracellular domain (ECD), where the agonist and/or antagonist binding sites are localized, a transmembrane domain (TMD), which contains the ion pore and is in extensive contact with membrane lipids, and a small intracellular domain (ICD), which is important for the conductance of the channel and modulation. In this Doctoral Thesis, the function and modulation of two neurotransmitter receptors that belong to the Cys-loop receptor family, nAChRs and 5-HT3 receptors, were explored by using a large variety of fluorescence, confocal microscopy and electrophysiological approaches. In Chapter I, modulation of the muscle nAChR by its lipid environment was studied. Special attention was put on cholesterol (Chol), which displays different lateral and transmembrane asymmetries all throughout life as well as under health and disease conditions. This lipid is crucial for the proper functioning of the nAChR. Different model systems were used: large unilamellar vesicles (LUVs), giant unilamellar vesicles (GUVs), T. californica nAChR rich membranes and BOSC 23 cells heterologously expressing the muscle nAChR. The experimental systems were subjected to different treatments to modify their Chol conditions resulting in: i) an increment in Chol content, ii) an increment in sterols in the outer layer (after addition of cholesteryl hemisuccinate (CHEMS)), and iii) conversion of part of the Chol to cholestenone (through the enzyme Cholesterol Oxidase (ChOx)). Through fluorescence studies using DPH, TMA-DPH and Laurdan probes it was determined that the membrane order increased when CHEMS was incorporated. By using the fluorescent probe Crystal Violet (CrV) and patch-clamp recordings, conformational changes of the nAChR associated to changes in its activation properties were detected after incubation with either CHEMS or ChOx, but not with Chol. By treating LUVs with Triton, and subsequent centrifugation and separation by SDS-PAGE, it was determined that after incorporation of Chol or CHEMS to the system the nAChR was located mostly in ordered fractions, while after the conversion of Chol to cholestenone the receptor was found in disordered fractions. Confocal microscopy studies using GUVs showed that Chol alterations caused significant changes in the presence and distribution of ordered and disordered domains, and that the mere presence of a protein component in the system, specifically a peptide corresponding to the forth transmembrane segment of the nAChR (M4), led to a higher order of the entire system. According to our results, we conclude that modifications of membrane Chol lead to changes in membrane order and asymmetry, and, at the same time, in the location of the nAChR, a fact that would directly affect its functionality. The location of the nAChR in ordered domains causes a decrease in its activity whereas its location in more disordered domains enhances its function. In this way, the location of the nAChR in one or another domain fine-tunes its function and could explain the changes in the cholinergic signal reported in situations of aging and/or pathologies, such as AD. There is increasing evidence of functional interactions between β-Amyloid (Aβ) peptides, involved in Alzheimer's disease, and α7 nAChR. In Chapter II, modulation of α7 nAChR by Aβ1-40 and Aβ1-42 oligomers was studied. It has been postulated that the accumulation of these peptides in the brain causes the formation of senile plaques, which are directly related to the neurodegeneration and inflammation observed in AD. However, more recent evidence suggests that the most neurotoxic species are the oligomeric forms of Aβ. Fluorescence studies using the CrV probe demonstrated that Aβ oligomers cause conformational changes in the α7 receptor, which were dependent on the concentration. Accordingly, single channel recordings revealed that whereas at very low concentrations (pM to nM range) these oligomers are capable of activating the α7 receptor, at higher concentrations, which are compatible with those found in AD patients, they decrease the enhancement of α7 by positive allosteric modulators (PAMs). These results show a dual role of Aβ oligomers depending on their concentration, as agonists and as negative modulators of α7. The agonist effect, which enhances the cholinergic signal, could have an important role in normal physiology, while the inhibitory effect, given by the exacerbated production of Aβ, could contribute to the failure in memory and cognition associated with AD. Taking into account that Alzheimer’s is a multifactorial disease, the search for new molecules aims at discovering and developing “multitarget drugs”. Chapter III is focused on the discovery and optimization of new bifunctional molecules capable of activating the nAChR and inhibiting the AChE. Starting from a screening of extracts obtained from different medicinal plants and using chromatographic techniques and nuclear magnetic resonance, the caffeine molecule was identified as a highly interesting molecule for AD. In addition to its already known AChE inhibitory activity, using CrV fluorescence probe and patch-clamp techniques we postulated its agonist activity in the muscle and α7 nAChRs. After having characterized the activity of caffeine in the cholinergic system, five synthetic analogs of this molecule were obtained by rational design. It was determined that all the analogs have activity in both molecular targets, the AChE and the nAChRs, and that they have a greater potency than caffeine. Through docking studies, the sites of inhibition of caffeine analogs in the AChE and the sites of interaction with the nAChRs were proposed. These compounds are promising as new drugs for a therapeutic strategy for AD. The other receptor explored in this Thesis was the 5-HT3 receptor, one of the least known of the Cys-loop family, which has been recently proposed as a novel molecular target both in AD and in other neurodegenerative pathologies. In Chapter IV, by taking advantage of the high-conductance receptor 5-HT3AHC, differences between orthosteric and allosteric activation of the human 5-HT3A receptor were deciphered for the first time. By using the patch clamp technique, and combining macroscopic current recordings in the whole-cell configuration and single channel recordings in the cell-attached configuration, the activation of the human 5-HT3AHC receptor by the orthosteric agonists, 5-HT and tryptamine, and the allosteric activation, by carvacrol and thymol, were described. Both carvacrol and thymol were less effective agonists than 5-HT at the macroscopic level. However, at the single channel level, these two terpenoids activated 5-HT3A receptors more efficiently than 5-HT. Furthermore, it was demonstrated that in addition to acting as agonists, carvacrol and thymol behave as positive allosteric modulators of the human 5-HT3AHC receptor at low concentrations. In this way, these results made it possible to define the mechanistic bases underlying the differences between orthosteric and allosteric activation and potentiation of the human 5-HT3A receptor. Summing up, in this Doctoral Thesis we deepened into the knowledge of modulation of the nAChRs and the 5-HT3 receptor, either by extrinsic molecules or by the lipid environment in which they are located. Our findings provide molecular bases for the understanding of the function and modulation of these receptors and their implication in certain pathologies, such as AD. In this work, significant advances with highly relevant results were made for the study or treatment of this disease.