Made available in DSpace on 2014-09-24T12:58:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Tese Liliane Miyuki Seki.pdf: 11573378 bytes, checksum: 779d1d4b49bfc191eafe332410d9730b (MD5) Previous issue date: 2012 / Enterobactérias produtoras de p-Iactamases de espectro estendido (ESBL) e Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) são reconhecidas mundialmente como importantes problemasde resistência bacteriana nos hospitais. Neste estudo, foi avaliada a prevalência dos genes codificadores de ESBL, bem como a epidemiologia molecular em isolados de hemocultura,em enterobactérias coletadas entre Setembro de 2007 a Setembro de 2008, em cincohospitais localizados no Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Das 293 amostras coletadas, 121 foram caracterizadas fenotipicamente como produtores de ESBL sendo a maior prevalência de Klebsiella pneumoniae 63 (52,1%), Enterobacter cloacae 16 (13,2%), Escherichia coli 14 (11,6%), Proteus mtrabtlis 11 (9,1%), Serra tia marcescens 10 (8.3%), Morganella morganii 2 (1.7%), Enterobacter aerogenes 1 (0,8%), Klebsiella oxytoca 1 (0,8%), Providencia stuartii 1 (0,8%), Citrobacter freundii 1 (0,8%), Serratia rubidaea 1 (0,8%). Entre as produtoras de ESBL, 11 amostras de K. pneumoniae e 9 amostras de E cloacae mostraram resistência ou redução de susceptibilidade a pelo menos um dos carbapenemas. A detecção por PCR dos genes de p-Iactamase mostraram que 87,6% produziramblacTX_M, 65,3% blaTEM, 64,5% blaSHVe 9,1% blaxsc- O gene do grupo CTX-M-l foi predominante na maioria das espécies de enterobactérias, exceto para o P. mirabilis, onde 91% das amostras eram do gene do grupo CTX-M-2. Das amostras pertencentes ao grupo CTX-M-l, 88% das K. pneumoniae e 100% das Ecoli foram determinadas como CTX-M-15. A análise do polimorfismo genético, por PFGE, demonstrou a disseminação do gene CTX-M-15 em 10 genótipos para as amostras de K. pneumoniae e de 3 genótipos para Eco/i em diversos hospitais no Rio de Janeiro. (AU)

Objetivos: Avaliar o perfil de suscetibilidade, a prevalência da produção de AmpC, β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e Metalo-β-lactamase (M-βla) em Pseudomonas aeruginosa obtidas de dois hospitais universitários distintos (ISCMPA e HCPA) em Porto Alegre. Em adição, tipagem molecular por PFGE foi realizada entre os isolados produtores de M-βla para avaliar a relação clonal. Métodos: Foi determinada a suscetibilidade de 238 isolados de P. aeruginosa para 8 agentes antimicrobianos, através do teste de disco-difusão, usando agar Müller-Hinton (MH) de acordo com “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS) . Todos isolados foram avaliados para produção de AmpC com o disco de imipenem (indutor) próximo ao disco de cefepima/ceftazdima (substrato). Um achatamento no halo de cefepime/ceftazidima pela indução da enzima pelo imipenem, indicava resultado positivo para AmpC. Todos isolados forma avaliados para a presença de ESBL através do teste de aproximação de disco com ceftazidima, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona e ticarcilina-clavulanato como inibidor de β-lactamase. A produção de M-βla foi determinada através do teste de aproximação de discos de CAZ a discos impregnados com ácido2-mercatopropiônico (2-MPA). As taxas de resistência foram comparadas através do Teste Exato de Fisher. Valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Análise de macrorestrição com a enzima speI foi realizada em isolados produtores de M-βla. Resultados: As taxas de resistência para todos os agentes foram superiores entre os isolados obtidos na ISCMPA em relação aos do HCPA. A ceftazidima mostrou ser o antibiótico mais efetivo contra os isolados de ambos Hospitais (ISCMPA e HCPA) com taxa de resistência de 25,7% (ISCMPA) e 6,1% (HCPA). A expressão de AmpC foi observada em 190 isolados (83,7% HCPA e 77,1% ISCMPA). Não foi possível detectar a presença de ESBL entre todos as P. aeruginosa avaliadas em ambos hospitais. Foi observada a presença de M-βla em 28 isolados (20,0%) da ISCMPA. Mas não foi detectada M-βla em nenhuma P. aeruginosa do HCPA. A análise de macrorestrição mostrou que 14 de 16 P. aeruginosa Mβla positivas pertenciam a um clone (denominado clone A), e seus subclones. Apenas dois outros clones (B e C) foram identificados em um isolado cada. / Objectives: To evaluate susceptibility profile, the prevalence of extendedspectrum β-lactamases (ESBL) production, AmpC and Metallo-β-lactamases (M-βla) in Pseudomonas aeruginosa obtained from two distinct hospitals (ISCMPA and HCPA) in Porto Alegre, Brazil. In addiction, molecular typing by PFGE was perfomed among isolates producing M-βla in order to evaluate probably clonal relatedness. Methods: The susceptibility of 238 P. aeruginosa to 8 antimicrobial agents was determined by the disk diffusion method, using Müller-Hinton agar (MH) in accordance with “National Committee for Clinical Laboratory Standards” guidelines. All isolates were evaluated for AmpC production with the imipenem disk (strong inducer) near of the cefepime/ceftazidime disk (substrate). A blunting of the cefepime/ceftazidime zone by imipenem-induced enzyme, indicated positive result for AmpC. All isolates were evaluated for ESBL production by disk approximation test with ceftazdime, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone plus ticarcillin-clavulanate as inhibitor. M-βla production was determined by disk approximation test with disks containing CAZ and 2-mercatopropionic acid (2-MPA). The results were compared by the Fisher’s Exact Test. Macrorestriction analysis by SpeI, followed by PFGE, was perfomed in isolates M-βla positive. The resistance rates were compared by The Fisher’s Exact Test. P values < 0.05 were considered to be statistically significant. Results: The resistance rates to all antimicrobial agents were higher among isolates obtained from ISCMPA than those obtained from HCPA. The ceftazidime was the more active antibiotic against the isolates in both hospitals with resistance rates of 25,7% (ISCMPA) and 6,1% (HCPA). The derepression of AmpC was observed in 190 isolates (83,7% HCPA and 77,1% ISCMPA). It was not possible to detect the presence of ESBL among all P. aeruginosa evaluated in both hospitals. Positive results for M-βla production were observed in 28 isolates (20,0%) from ISCMPA. But none M-βla production was identified in P. aeruginosa from HCPA. The macrorestriction analysis by PFGE, showed that 14 of 16 M-βla positive P. aeruginosa beloneed to one clone (named clone A) and its subclones.Only two others clones (B and C) were identified in one isolate each.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In recent years, the isolation of bacteria producing β-lactamases has caused concern around the world, due to the fact these enzymes hydrolysis the ring β-lactam antimicrobials used in the main clinic. This aim of this study was asses the prevalence metallo-β-lactamases (MbL) in isolates of Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii obtained from patients admitted at the University Hospital of Santa Maria (HUSM). The profile of susceptibility for all isolates was evaluated by the disk diffusion method standardized by CLSI. The antimicrobial disks were distributed in a way that allows the identification of strains producers of AmpC and ESBL. For the identification of the producers of MbL the test of disk approximation with EDTA 0.1 M, EDTA 0,5M and acid 2-mercaptopropionic were performed. Isolates that did not have any of the mechanisms of resistance search were classified as multiresistant (MDR). The minimum inhibitory concentration (MIC) for ceftazidima, imipenem and polymyxin B was assessed by broth method microdilution for all isolated, according to CLSI. From January to June 2006, were obtained 32 isolates the P.aeruginosa and 41 the A. baumannii, the those 17 (23.29%) were β-lactamase AmpC-type producers, 11 (15.07%) were MbL producers, and 45 (61,64%) were classified as MDR. All strains producing MbL were Pseudomonas aeruginosa. The sensitivity of the isolates according to the CIM for antimicrobial evaluated were: 90,28% for polymyxin B, 36,11% for imipenem and 18% for ceftazidima. There was a high prevalence of MDR isolates and producers of β-lactamase-type AmpC and MbL in HUSM, this is extremely worrying once there is limiting therapy available. This situation becomes even more worrying with the find of isolates resistant the polymyxin B, witch is one of the last options of treatment for MDR isolates and producers of MbL. The detection of microorganisms is extremely important for the committees of infection hospital with the goal of preventing outbreaks, as well as guide the medical team on the conduct therapy, since there are few effective antimicrobial clinically for these pathogens and no prospects for development the new antimicrobial in the near future. / Nos últimos anos, o isolamento de bactérias produtoras de β-lactamases tem causado preocupação em todo o mundo, devido ao fato dessas enzimas hidrolisarem o anel β- lactâmico dos principais antimicrobianos utilizados na clínica. Este trabalho teve por objetivo avaliar a prevalência de metalo-β-lactamases (MbL) em isolados de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii obtidos de pacientes atendidos no Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). O perfil de sensibilidade para todos os isolados foi avaliado pelo método de disco difusão padronizado pelo CLSI. Os discos de antimicrobianos utilizados foram distribuídos de forma que permitisse a identificação dos isolados produtores de AmpC e ESBL. Para a identificação dos produtores de MbL utilizou-se o teste de disco aproximação com os seguintes agentes quelantes: EDTA 0,1M, EDTA 0,5 M e ácido 2-mercaptopropiônico. Os isolados que não possuíam nenhum dos mecanismos de resistência pesquisados foram classificados como multirresistentes (MDR). A concentração inibitória mínima (CIM) para ceftazidima, imipenem e polimixina B foi avaliada pelo método de microdiluição em caldo para todos os isolados, de acordo com o CLSI. Durante o período de janeiro a junho de 2006 foram obtidos 32 isolados de P.aeruginosa e 41 de A. baumannii, destes 17 (23,29%) foram produtores de β-lactamase do tipo AmpC, 11 (15,07%) foram produtores de MbL e 45 (61,64%) foram classificados como MDR. Todas as cepas produtoras de MbL foram de Pseudomonas aeruginosa. A sensibilidade dos isolados de acordo com a CIM para os antimicrobianos avaliados foram as seguintes: 90,28% para polimixina B, 36,11% imipenem e 18% ceftazidima. Observou-se uma alta prevalência de isolados MDR no HUSM, além de isolados produtores de β-lactamase do tipo AmpC e MbL, o que é extremamente preocupante devido limitar a terapia a poucos antimicrobianos. Esta situação torna-se ainda mais preocupante com a detecção de isolados resistentes a polimixina B, a qual é uma das últimas opções de tratamento para infecções causadas por isolados de P. aeruginosa e Acinetobacter baumannii MDR e produtores de MbL. A detecção desses microrganismos é de grande importância para as comissões de controle de infecção hospitalar com o objetivo de prevenir surtos, bem como orientar a equipe médica sobre a conduta terapêutica, uma vez que há poucos antimicrobianos efetivos clinicamente para esses patógenos e as perspectivas para o desenvolvimento de novos antimicrobianos em um futuro próximo são mínimas.

A presença de Pseudomonas aeruginosa resistentes a antimicrobianos no esgoto hospitalar contribui para sua disseminação em corpos d´água e possibilita o estabelecimento de reservatórios ambientais de resistência bacteriana. Os objetivos deste estudo foram comparar isolados de P. aeruginosa de amostras de esgoto hospitalar e água superficial quanto ao perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, a presença e diversidade de genes de metalo β-lactamases (MBLs) e a similaridade genética entre os isolados. Para isso, as amostras de esgoto hospitalar foram coletadas de cinco hospitais, localizados em Passo Fundo e Porto Alegre, RS, Brasil. As amostras de água superficial foram coletadas dos corpos d´água que recebem os esgotos de dois hospitais estudados. Os isolados foram identificados por provas bioquímicas clássicas e pela amplificação de um fragmento do rDNA 16S. O perfil de susceptibilidade foi avaliado pela técnica de disco-difusão. Os genes blaSPM-1, blaVIM e blaIMP foram pesquisados por PCR. A relação clonal entre os isolados foi avaliada pela ERIC-PCR e PFGE. A diversidade nos genes de MBLs encontrados foi avaliada pela DGGE. Foram analisados 614 isolados de P. aeruginosa, dos quais somente 5,0% apresentaram o gene blaSPM-1. Todos os isolados com este gene apresentaram fenótipo de multirresistência. A análise de similaridade genética pela ERIC-PCR e PFGE não mostrou relação clonal entre isolados de água superficial e esgoto hospitalar ou entre isolados provenientes de amostras de diferentes esgotos hospitalares. A presença de isolados resistentes e com o gene blaSPM-1, em amostras de esgoto hospitalar, atenta para o risco de disseminação ambiental de resistência bacteriana. / The presence of Pseudomonas aeruginosa resistant to antimicrobials in hospital sewage contributes to its dissemination into water bodies and may lead to the establishment of environmental reservoirs of bacterial resistance. The objectives of this study were to compare P. aeruginosa strains isolated from hospital sewage and superficial water samples, about the susceptibility profile to antimicrobials, the presence and diversity of the metallo β-lactamases (MBLs) genes and the genetic similarity among the strains. For this purpose, hospital sewage samples were collected from five hospitals located in Passo Fundo and Porto Alegre, RS, Brazil. The superficial water samples were collected from the water bodies where the sewage from two of the analyzed hospitals were discharged. The isolates were identified by classical biochemical tests and amplification of 16S rDNA fragment. The susceptibility was determined by the disk-diffusion method. The blaSPM-1, blaVIM e blaIMP genes were screened by PCR. The clonal relationship among the strains was evaluated by ERIC-PCR and PFGE. The diversity on MBL genes found was analyzed by DGGE. A total of 614 P. aeruginosa strains were analyzed, of which only 5,0 % showed the blaSPM-1 gene. All isolates with this gene showed the multirresistance phenotype. The genetic similarity analysis by ERIC-PCR and PFGE didn´t show clonal relationship between the strains from superficial water and hospital sewage or between the strains from samples of different hospital sewages. The presence of resistant isolates and isolates with the blaSPM-1 gene in hospital sewage samples call attention to the risk of environmental dissemination of bacterial resistance.

Objetivos: Padronizar uma técnica molecular, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar os genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 que conferem a Pseudomonas aeruginosa resistência a carbapenêmicos (imipenem e meropenem) através da produção das metalo-β-lactamases (MBL) SPM-1, VIM-2 e IMP-1. Comparar os resultados obtidos com a técnica de PCR com os obtidos através de uma técnica fenotípica para detecção desse mecanismo enzimático de resistência. Descrever a prevalência dos genes de MBL. Metodologia: Utilizando 48 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem sendo 37 caracterizadas como produtoras de MBL através de uma técnica fenotípica (aproximação de disco) e 11 como não produtoras pela mesma técnica. Esses isolados foram testados com três primers específicos para os seguintes genes: blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 Resultados e Discussão: Dos 37 isolados produtores de metalo-β-lactamase, 29 tiveram resultado positivo na PCR sendo 27 positivos para o gene blaSPM-1 e 2 positivos para o gene blaIMP-1 . Em nenhum isolado foi detectado o gene blaVIM-2 .Oito isolados caracterizados como produtores de MBL não tiveram nenhum produto amplificado com os três pares de primers. Os 11 isolados caracterizados como não produtores de MBL não tiveram produto amplificado. Assim, a sensibilidade da técnica molecular foi de 78,40% e a especificidade 100,0% considerando a técnica fenotípica de aproximação de disco como padrão ouro Conclusões: Foi possível a padronização da técnica de PCR para a detecção dos genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 bem como foi possível a comparação entre a técnica de PCR e a técnica fenotípica, sendo que a metodologia molecular apresentou 100% de especificidade e 78,40% de sensibilidade. O gene de MBL mais prevalente foi blaSPM-1 encontrado em 27/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaIMP-1 foi detectado em apenas 2/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaVIM-2 e não foi detectado nas amostras de P.aeruginosa analisadas neste estudo.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-05Bitstream added on 2014-06-13T19:55:50Z : No. of bitstreams: 1 polotto_m_me_sjrp.pdf: 775251 bytes, checksum: 14af3ff30a1888d1fbc13ef59a721f5b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Pseudomonas aeruginosa é um bacilo Gram-negativo, aeróbio, não formador de esporos encontrado no solo, água, plantas e animais, incluindo os seres humanos, onde provoca infecções oportunistas. Infecções causadas por P. aeruginosa são de difícil tratamento devido a sua virulência e resistência a vários antimicrobianos. Os carbapenêmicos são geralmente ativos contra P. aeruginosa multirresistentes, mas as altas taxas de resistência a estas drogas estão se tornando comuns e podem indicar a produção de metalo-betalactamases (MβLs). O propósito deste estudo foi detectar e identificar, em cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmicos genes que codificam a produção de MβLs (blaSPM, blaIMP e blaVIM) e ESBLs (blaCTX-M e blaGES), e avaliar a similaridade genética entre as cepas. Foram avaliadas sessenta cepas de P. aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos isoladas de pacientes do Hospital de Base de São José do Rio Preto, no período de junho de 2009 a dezembro de 2009. Os testes de sensibilidade foram realizados de acordo com a padronização do “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI) (2009) utilizando o método de disco-difusão. O teste fenotípico para a produção de MβLs foi realizado através do método de aproximação de discos, com os substratos ceftazidima e imipenem e com o inibidor de MβLs 2-MPA. A detecção dos genes de MβLs blaIMP, blaVIM e blaSPM e de ESBLs blaCTX-M e blaGES foi realizada por PCR, e a identificação através de seqüenciamento. A avaliação da similaridade genética entre as cepas foi realizada nas amostras produtoras de MβL e ESBLs do tipo CTX-M através de PFGE. No teste de suscetibilidade por disco-difusão 98,3% (59/60) das cepas apresentaram resistência ao imipenem e 75% (45/60) ao meropenem. Polimixina B foi o único agente a inibir o crescimento de 100% das amostras... / Pseudomonas aeruginosa is a versatile microorganism, with low nutritional demands and easy proliferation in culture medium. It’s a Gram-negative bacillus, aerobic, nonsporulated and it can be isolated from soil, water, plants and animals, including humans. P. aeruginosa infections are hard to treat because of its virulence and resistance to various antimicrobials. Carbapenens are usually active against multiresistant P. aeruginosa, but high levels of resistance to these antibiotics are becoming common and it can indicate metallo-beta-lactamases presence (MβLs). The purpose of this study was to detect and identify, in P. aeruginosa strains, MβL and ESBL encoding genes (blaSPM, blaIMP, blaVIM, blaCTX-M and blaGES) and to determine genetic similarity between the carrier strains. The study was done analyzing sixty P. aeruginosa strains resistant to carbapenens isolated at Hospital de Base de São José do Rio Preto, in the period of june/2009 to December/2009. The isolates were submitted to disc-diffusion susceptibility test, as standardized by the “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI) (2009). The phenotypic test for MβL production was performed by means of the double disk synergy method, having ceftazidime and imipenem used as substratum and 2-MPA as an inhibitor. The polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the MβLs genes (blaIMP, blaVIM, blaSPM) and the ESBL genes (blaCTX-M and blaGES) and sequencing was carried out for their identification. The genetic similarity between the strains was evaluated in samples which were positive for MβLs and ESBLs genes using the PFGE technique. In disc-diffusion susceptibility test, 98,3% (59/60) of the strains were imipenem resistant and 75% (45/60) were meropenem resistant. All isolates were inhibited by Polymixin B. Tracheal aspirate were the most frequent isolated clinic specimen, with 40% (24/60) of total.

Objetivos: Padronizar uma técnica molecular, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar os genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 que conferem a Pseudomonas aeruginosa resistência a carbapenêmicos (imipenem e meropenem) através da produção das metalo-β-lactamases (MBL) SPM-1, VIM-2 e IMP-1. Comparar os resultados obtidos com a técnica de PCR com os obtidos através de uma técnica fenotípica para detecção desse mecanismo enzimático de resistência. Descrever a prevalência dos genes de MBL. Metodologia: Utilizando 48 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem sendo 37 caracterizadas como produtoras de MBL através de uma técnica fenotípica (aproximação de disco) e 11 como não produtoras pela mesma técnica. Esses isolados foram testados com três primers específicos para os seguintes genes: blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 Resultados e Discussão: Dos 37 isolados produtores de metalo-β-lactamase, 29 tiveram resultado positivo na PCR sendo 27 positivos para o gene blaSPM-1 e 2 positivos para o gene blaIMP-1 . Em nenhum isolado foi detectado o gene blaVIM-2 .Oito isolados caracterizados como produtores de MBL não tiveram nenhum produto amplificado com os três pares de primers. Os 11 isolados caracterizados como não produtores de MBL não tiveram produto amplificado. Assim, a sensibilidade da técnica molecular foi de 78,40% e a especificidade 100,0% considerando a técnica fenotípica de aproximação de disco como padrão ouro Conclusões: Foi possível a padronização da técnica de PCR para a detecção dos genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 bem como foi possível a comparação entre a técnica de PCR e a técnica fenotípica, sendo que a metodologia molecular apresentou 100% de especificidade e 78,40% de sensibilidade. O gene de MBL mais prevalente foi blaSPM-1 encontrado em 27/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaIMP-1 foi detectado em apenas 2/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaVIM-2 e não foi detectado nas amostras de P.aeruginosa analisadas neste estudo.

A presença de Pseudomonas aeruginosa resistentes a antimicrobianos no esgoto hospitalar contribui para sua disseminação em corpos d´água e possibilita o estabelecimento de reservatórios ambientais de resistência bacteriana. Os objetivos deste estudo foram comparar isolados de P. aeruginosa de amostras de esgoto hospitalar e água superficial quanto ao perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, a presença e diversidade de genes de metalo β-lactamases (MBLs) e a similaridade genética entre os isolados. Para isso, as amostras de esgoto hospitalar foram coletadas de cinco hospitais, localizados em Passo Fundo e Porto Alegre, RS, Brasil. As amostras de água superficial foram coletadas dos corpos d´água que recebem os esgotos de dois hospitais estudados. Os isolados foram identificados por provas bioquímicas clássicas e pela amplificação de um fragmento do rDNA 16S. O perfil de susceptibilidade foi avaliado pela técnica de disco-difusão. Os genes blaSPM-1, blaVIM e blaIMP foram pesquisados por PCR. A relação clonal entre os isolados foi avaliada pela ERIC-PCR e PFGE. A diversidade nos genes de MBLs encontrados foi avaliada pela DGGE. Foram analisados 614 isolados de P. aeruginosa, dos quais somente 5,0% apresentaram o gene blaSPM-1. Todos os isolados com este gene apresentaram fenótipo de multirresistência. A análise de similaridade genética pela ERIC-PCR e PFGE não mostrou relação clonal entre isolados de água superficial e esgoto hospitalar ou entre isolados provenientes de amostras de diferentes esgotos hospitalares. A presença de isolados resistentes e com o gene blaSPM-1, em amostras de esgoto hospitalar, atenta para o risco de disseminação ambiental de resistência bacteriana. / The presence of Pseudomonas aeruginosa resistant to antimicrobials in hospital sewage contributes to its dissemination into water bodies and may lead to the establishment of environmental reservoirs of bacterial resistance. The objectives of this study were to compare P. aeruginosa strains isolated from hospital sewage and superficial water samples, about the susceptibility profile to antimicrobials, the presence and diversity of the metallo β-lactamases (MBLs) genes and the genetic similarity among the strains. For this purpose, hospital sewage samples were collected from five hospitals located in Passo Fundo and Porto Alegre, RS, Brazil. The superficial water samples were collected from the water bodies where the sewage from two of the analyzed hospitals were discharged. The isolates were identified by classical biochemical tests and amplification of 16S rDNA fragment. The susceptibility was determined by the disk-diffusion method. The blaSPM-1, blaVIM e blaIMP genes were screened by PCR. The clonal relationship among the strains was evaluated by ERIC-PCR and PFGE. The diversity on MBL genes found was analyzed by DGGE. A total of 614 P. aeruginosa strains were analyzed, of which only 5,0 % showed the blaSPM-1 gene. All isolates with this gene showed the multirresistance phenotype. The genetic similarity analysis by ERIC-PCR and PFGE didn´t show clonal relationship between the strains from superficial water and hospital sewage or between the strains from samples of different hospital sewages. The presence of resistant isolates and isolates with the blaSPM-1 gene in hospital sewage samples call attention to the risk of environmental dissemination of bacterial resistance.

Orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingos_DanielaFerreira_M.pdf: 1627311 bytes, checksum: ba7a6545a75d72a741bfe8d1cda234f4 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O número de animais de companhia tem crescido substancialmente na sociedade atual, com estimativas de 48 milhões de cães e gatos no Brasil. A relação entre animais de companhia e os humanos mudou radicalmente nos últimos anos, esses estão em contato mais próximo com humanos. Como consequência dessas mudanças, agentes antimicrobianos, incluindo antibióticos usados no tratamento de infecções humanas, tem sido utilizados em cães. O objetivo deste trabalho foi investigar fenotipicamente a ocorrência de ß-lactamase de espectro estendido (ESBL) em amostras de Escherichia coli isoladas de cães e identificar os genes de resistência nestas amostras. A presença e variedade de integrons nas amostras de E. coli foi analisada. A classificação das amostras nos grupos filogenéticos A, B1, B2 e D também foram investigadas. Dentre 158 amostras de E. coli isoladas de cães sendo 51 de ITU (infecção do trato urinário), 52 de piometra e 55 de fezes de cães sadios, foram selecionadas 67 amostras que apresentavam pelo menos uma marca de resistência aos ß-lactâmicos. As amostras selecionadas: 41 isoladas de ITU, 20 isoladas de piometra e seis isoladas de fezes de animais sadios, foram submetidas a testes de sensibilidade microbiana pelo método de difusão de disco. A produção de ESBL foi verificada pelo método de aproximação de disco. A identificação dos genes das ß-lactamases foi realizada em ensaios de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) com primers específicos para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaGES-1, blaOXA-10, ampC e cmy. A classificação filogenética (chuA, yjaA, TspE4.C2), bem como a detecção de integrons das classes 1 e 2 (intI1 e intI2) também foram realizadas por PCR. Os resultados dos antibiogramas mostraram elevada resistência aos ß-lactâmicos de 1ª geração, ampicilina (82,0%) e cefalexina (62,7%) entre as amostras selecionadas. Resistência aos antimicrobianos ß-lactâmicos de 3ª e 4ª geração e ao monobactam foi observada em 7,5% das amostras. As amostras também apresentaram resistência aos antimicrobianos tetraciclina (82,0%), trimetoprim-sulfametoxazol (62,7%), enrofloxacina (35,8%), florfenicol (34,3%) e ciprofloxacina (32,3%). A expressão fenotípica de ESBL foi observada em duas amostras (3,3%), ambas isoladas de animais sadios. Na análise genotípica, foram identificados os genes blaTEM, (98,5%), ampC (95,5%), blaCTX-M (35,8%), blaSHV (6%) e cmy (2,9%) destacando que os genes blaCTX-M, blaSHV e cmy apresentaram-se associados ao blaTEM e ao ampC. Pelo sequenciamento foi possível identificar as ß-lactamases do tipo TEM-1 e CTX-M-2. Na classificação filogenética as amostras foram agrupadas nos grupos B2 (59,7%), B1 (25,4%) e A (14,9%). Dentre as 67 amostras com marcas de resistência aos ß-lactâmicos, o gene int foi detectado em 26,9% , das quais 71,4% da classe 1 e 28,6% da classe 2. Por outro lado, dentre as 91 amostras sem marcas de resistência a à ß-lactâmicos, somente 3,3% apresentaram integrons, sendo todos da classe 1. As amostras com integrons foram mais comumente alocadas nos grupos filogenéticos A e B1. A presença de ESBL, de genes de resistência e integrons em E. coli isoladas de cães é um achado importante, uma vez que o contato íntimo entre humanos e cães oferece condições para a transmissão das amostras e ainda, que estes animais podem servir de reservatórios de genes de resistência. Esses resultados reforçam a necessidade de controle no uso de antimicrobianos em animais de companhia e bem como o papel dos animais domésticos como reservatório de genes de resistência bacteriana, precisa ser melhor investigado / Abstract: The number of cats and dogs has substantially increased in modern society, with an estimated population of above 48 million in Brazil. The relationship between companion animals and humans has radically changed throughout the years, and animals have become in closer contact with humans. As a consequence of these changes, antimicrobial agents, including antimicrobial preparations licensed for human use, are frequently used in dogs. The aim of this study was to investigate, in Escherichia coli strains isolated from dogs, the occurrence of ß-extended-spectrum ß-lactamase (ESBL) phenotype and to identify resistance genes in these samples. The presence and diversity of integrons in strains of E. coli was analyzed. The classification of microorganisms in the phylogenetic groups A, B1, B2 and D was also determined. Among 158 E.coli strains isolated from dogs (51 from UTI [urinary tract infection], 52 from piometra and 55 from faeces of healthy dogs) 67 strains were selected that had at least one sign of resistance to ß-lactams. The strains selected: 41 isolated from UTI, 20 isolated from piometra and six isolated from the faeces of healthy dogs, were tested for antibiotic sensitivity by the disk diffusion method. ESBL production was screened by the double-disk synergy method. The identification of ß-lactamases was performed by PCR (Polymerase Chain Reaction) using specific primers for blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaGES-1, blaOXA-10, ampC and cmy and, subsequently, sequencing of the PCR product of strains showing the ESBL phenotype was performed. The phylogenetic classification (chuA, yjaA, TspE4.C2), as well as the detection of class 1 and class 2 integrons, were also determined by PCR. The results of susceptibility tests showed high resistance to 1st generation ß lactams, ampicillin (82.0%) and cephalexin (62.7%), among the selected strains. Resistance to 3rd and 4th generation ß-lactam antibiotics and monobactam was observed in 7.5% of isolates. The strains also showed resistance to antimicrobial tetracycline (82%), trimethoprim-sulfamethoxazole (62.7%), enrofloxacin (35.8%), florfenicol (34.3%) and ciprofloxacin (32.3%). Phenotypic expression of ESBL was observed in 2 samples (3.3%), both isolated from healthy animals. In the genotypic analysis, were identified the genes, blaTEM, (98.5%), ampC (95.5%), blaCTX-M (35.8%), blaSHV (6%) and cmy (2.9%); the genes blaCTX-M, blaSHV and cmy were shown to be associated with blaTEM and ampC. By sequencing, it was possible to identify the TEM-1 and CTX-M-2 ß-lactamases. In the phylogenetic classification, strains were classified B2 (59.7%), B1 (25.4%) and A (14.9%) groups. Among the 67 strains with resistance markers to ß-lactams, the int gene was detected in 26.9% of the strains (71.4% of class 1 and 28.6% of Class 2). Moreover, among the 91 samples without a trace of resistance to ß-lactams, only 3.3% had integrons, all of class 1. Strains with integrons were more commonly housed in the phylogenetic groups A and B1. The presence of ESBL, resistance genes and integrons in E. coli isolated from dogs is an important finding, due to close contact between humans and dogs provides conditions for the transmission of microorganisms and these animals may also serve as reservoirs of isolates harboring resistance genes. These results emphasize the need to control the use of antimicrobials in companion animals and the role of livestock as a reservoir for genes of resistance should be further investigated / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

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We also aimed to detect co-colonization by Staphylococcus and Pseudomonas, as well as describe the profile socio-demographic, professional, disease/infection and behavioral of individuals colonized by Enterobacteriaceae. It was a descriptive cross-sectional epidemiological study conducted from May/2009 to November/2010 and saliva was collected a from each subjected. A total of 294 individuals participated in the research, being 149 healthcare members and 145 from the support team. The microbiological procedures were performed according to recommended techniques and data collection obtained by a questionnaire and analyzed through descriptive statistics. Among the participants, 55 (18.7%) were colonized by Enterobacteriaceae in the oral cavity. Were isolated 64 bacteria, including species potentially pathogenic. The most prevalent specie was gergoviae Enterobacter (17.2%). The highest rates of resistance were observed to β-lactams and 48.4% of isolates were considered multiresistant. The Extended Spectrum β-lactamases (ESBL) production was negative for the Enterobacteriaceae and none Klebsiella pneumoniae produced Carbapenemase (KPC). However, among the 43 CESP isolates group (Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Providencia), 51.2% produced AmpC β- lactamase by induction and 48.8% were hiper producers. Staphylococcus and Pseudomonas were detected in the saliva of 56.4% individuals. The majory of the healthcare workers colonized by Enterobacteriaceae was men over 40 years. The nursing technician was the professional category most colonized (52.7%), followed by the cleaning staff (23.6%). The cleaning and hygiene sector (23.6%) and nursing stations (18.2%) represented the largest number of workers colonized. Some professionals (27.3%) had second job in another health service, while 41.8% remained in the institution around 40 hours or more a week. Some infection was reported among carriers, as tonsillitis, sinusitis and pharyngitis, being the first the most frequent (52.7%). Enterobacteriaceae carriage (18.2%) reported the use of personal protective equipment (PPE) as unnecessary to their s activity, 7.3% did not use the mask as precautionary measure, 23.6% realized sporadically the exchange of mask and 1.8 % never changed. The use of oral antiseptics was observed in 29.1% of the workers, the recent use of antimicrobials in 16.4% and self-medication in 27.3%. Among the colonized persons was observed lack of knowledge about multiresistant microorganisms. The prevalence Enterobacteriaceae carriage is considered high and the resistance is a problem especially due to multidrug resistance and production of β-lactamase AmpC observed. The results of this research contribute with important subsidies to the programs for nosocomial infections prevention and control of, since knowledge of carrier status reduces the risk of transmission of microorganisms. / O ambiente da assistência à saúde apresenta inúmeros riscos que o torna um local insalubre, propício à colonização e ao desenvolvimento de infecções. Inseridos neste cenário estão os trabalhadores dos serviços de saúde, os quais são vulneráveis à condição de portador. A cavidade bucal representa assim um importante sítio de colonização. Este estudo buscou caracterizar o fenótipo de Enterobacteriaceae isoladas da cavidade bucal de trabalhadores de um hospital oncológico referência no Centro-Oeste brasileiro. Também fizeram parte dos objetivos desta pesquisa detectar co-colonização por Staphylococcus e Pseudomonas, bem como descrever o perfil sócio-demográfico, profissional, doença/infecção e comportamental dos indivíduos colonizados por Enterobacteriaceae. Estudo epidemiológico transversal do tipo descritivo realizado de maio/2009 a novembro/2010. Participaram 294 trabalhadores, sendo 149 membros da equipe de saúde e 145 da equipe de apoio. Os procedimentos microbiológicos foram realizados segundo técnicas padronizadas e a coleta de dados realizada por meio da aplicação de um formulário. Foi coletada uma amostra de saliva de cada sujeito Os dados foram analisados por meio de estatística descritiva. Dentre os participantes, 55 (18,7%) estavam colonizados por Enterobacteriaceae na cavidade bucal. Foram isoladas 64 bactérias, incluindo espécies potencialmente patogênicas. A espécie mais prevalente foi Enterobacter gergoviae (17,2%). As maiores taxas de resistências foram observadas para os β-lactâmicos e 48,4% dos isolados foram considerados multirresistentes. Para as enterobactérias pesquisadas, a produção de β-lactamase de Espectro Ampliado (ESBL) e Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) foi negativa. Porém, dentre os 43 isolados do grupo CESP (Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Providencia), 51,2% foram considerados produtores de β-lactamase AmpC por indução e 48,8% mutantes hiperprodutores. Staphylococcus e Pseudomonas estavam presentes na saliva de 56,4% dos sujeitos colonizados por Enterobacteriaceae. O maior número de portadores foi constituído por homens acima de 40 anos. Entre os técnicos de enfermagem, 52,7% estavam colonizados, seguidos dos auxiliares de limpeza (23,6%). O setor de higienização e limpeza (23,6%) e os postos de enfermagem (18,2%) contemplaram o maior número de trabalhadores colonizados. Alguns trabalhadores (27,3%) possuíam segundo emprego em outro serviço de saúde, enquanto que 41,8% permaneciam na instituição 40 horas ou mais na semana. Quadros frequentes de infecção foram relatados entre os portadores, como amigdalites, sinusites e faringites, sendo o primeiro o mais frequente (52,7%). Alguns portadores de Enterobacteriaceae (18,2%) relataram o uso de EPI como desnecessário à sua atividade, 7,3% não faziam o uso de máscara como medida de precaução, 23,6% realizavam a troca de máscara esporadicamente e 1,8% nunca trocava. O uso de antissépticos bucais foi observado em 29,1% dos trabalhadores, o uso recente de antimicrobianos em 16,4% e a prática da automedicação em 27,3%. A desinformação sobre micro-organismos multirresistentes foi comum entre os colonizados. A prevalência de portadores de Enterobacteriaceae foi elevada e o fenótipo de resistência dos isolados preocupante, especialmente pela multirresistência e produção de β-lactamases AmpC. As variáveis avaliadas revelaram realidades relevantes para o contexto da assistência à saúde e para a saúde do trabalhador. Os resultados desta pesquisa contribuíram com subsídios importantes para os programas de prevenção e controle das infecções nosocomiais, pois o conhecimento do estado portador reduz os riscos de transmissão de micro-organismos.