CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Nas Ãltimas dÃcadas, as lectinas vegetais tÃm atraÃdo grande interesse devido Ãs suas diversas atividades biolÃgicas das quais se destaca a aÃÃo antitumoral in vivo e in vitro que, em geral, causa a inibiÃÃo do crescimento celular e a induÃÃo da morte celular por apoptose. No presente estudo, foi investigado o efeito da lectina de Dioclea altissima (DAL), uma lectina de leguminosa, alfa-D-manose ligante, sobre as linhagens tumorais A549 (carcinoma pulmonar), OVCAR-8 (carcinoma de ovÃrio) e PC3M (carcinoma de prÃstata) e linhagem normal CMSP (cÃlulas do tecido sanguÃneo). DAL foi isolada e purificada por cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-50 e sua citotoxicidade foi avaliada atravÃs do ensaio do MTT. DAL foi seletivamente citotÃxica para as cÃlulas cancerÃgenas A549, PC3M, apÃs 48 e 72 horas de incubaÃÃo, e para OVCAR-8, apÃs 72 horas de tratamento apresentando valores de CI50 entre 23,0 e 55,7 μg/mL, promovendo aglutinaÃÃo celular a partir de 24 horas de incubaÃÃo. DAL nÃo se mostrou citotÃxica para cÃlulas normais. O teste do cometa revelou que DAL nÃo causa dano direto ao DNA. A linhagem PC3M foi selecionada para anÃlise proteÃmica por espectrometria de massas (nanoUPLC nanoESI-MSE) por apresentar maior sensibilidade à DAL. ApÃs tratamento das cÃlulas com diversas concentraÃÃes de DAL, por 24, 48 e 72 horas, foi identificado um total de 837 proteÃnas vÃlidas, 140 (24h), 321 (48h) e 376 (72h). O estudo das proteÃnas diferencialmente expressas das cÃlulas tratadas com a lectina em relaÃÃo ao controle definiu o efeito citotÃxico de DAL em PC3M como apoptÃtico gerado, principalmente, via estresse do retÃculo endoplasmÃtico. / Recently, plant lectins have attracted great interest due to their several biological activities of which stands out the antitumoral action in vivo and in vitro that in general result in inhibition of cell growth and induction of cell death by apoptosis. In the present study, it was investigated the effect of the Dioclea altissima (DAL) lectin, a legume alfa-D-mannose ligand lectin on A549 (lung cancer), OVCAR-8 (ovarian cancer) and PC3M (prostate cancer) and normal line PBMC (cell blood tissue). DAL was isolated and purified by affinity chromatography on a Sephadex G-50 column and its cytotoxicity was evaluated by MTT assay. DAL was selectively cytotoxic to cancer cells A549, PC3M after 48 and 72 hours of incubation, and OVCAR-8 after 72 hours of treatment with DAL (CI50 values between 23.0 e 55.7 μg/mL). Moreover, it was observed cell agglutination from 24 hours of incubation. Comet assay revealed DAL does not cause direct DNA damage. The line PC3M was selected for proteomic analysis by mass spectrometry (nanoUPLC nanoESI-MSE) to present the best evidence of sensitivity to DAL. PC3M line was treated with various concentrations of DAL during 24, 48 e 72 hours, it was identified a total of 837 proteins, 140 (24h), 321 (48h) e 376 (72h). The study of differential protein expression of the DAL-treated PC3M cells compared to control demonstrated apoptotic effect generated, mainly, via ER stressed-dependent.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As sementes de Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff, uma espÃcie pertencente à famÃlia Leguminosae, subfamÃlia Papilionoideae, tribo Dalbergieae, possuem uma lectina glicose/manose especÃfica, que aglutina eritrÃcitos de coelhos nativos ou tratados com enzimas proteolÃticas. A lectina de sementes de Andira surinamensis foi purificada atravÃs de cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose seguida por cromatografia de troca iÃnica em matriz de DEAE-Sephacel. Esse procedimento resultou na lectina purificada, nomeada de ASL. O processo de purificaÃÃo da ASL foi monitorado pela atividade hemaglutinate especÃfica e SDS-PAGE, onde se observou que essa lectina à composta por seis bandas protÃicas, uma de maior peso molecular aparente de aproximadamente 20 kDa e outras cinco bandas de menor peso molecular aparente entre 15 e 12 kDa. A massa molecular intacta da lectina purificada foi determinada atravÃs da tÃcnica de espectrometria de massa com IonizaÃÃo por Eletrospray (ESI). A anÃlise do espectro de massa intacta mostrou a presenÃa de dois Ãons majoritÃrios de massa molecular de 12.220+ 2 e 13.258 + 2 Da. ASL tambÃm teve sua estrutura primÃria parcialmente sequenciada atravÃs de espectrometria de massa sequencial. Essa lectina à uma glicoproteÃna e demonstra elevada estabilidade, sendo capaz de manter sua atividade hemaglutinante em uma ampla faixa de pH e apÃs exposiÃÃo a temperaturas de atà 80 ÂC por 1hora. ApÃs diÃlise contra o agente quelante EDTA, ASL teve sua atividade hemaglutinante diminuÃda, porÃm recuperou sua atividade apÃs a adiÃÃo de metais, mostrando-se dependente de cÃtions metÃlicos divalentes. Foi avaliado tambÃm o efeito da ASL no crescimento planctÃnico bacteriano e na formaÃÃo de biofilmes e observou-se que ela interferiu no crescimento planctÃnico de duas diferentes cepas bacterianas gram-positivas (Streptococcus mitis e Streptococcus salivarius) e na formaÃÃo de biofilme por Staphylococcus aureus e Streptococcus salivarius. / Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff seeds, a species belonging to the Leguminosae family, Papilionoideae subfamily, Dalbergieae tribe, have a glucose/mannose specific lectin rabbit erythrocytes that agglutinate native or treated with proteolytic enzymes. The lectin from Andira surinamensis seeds was purified by affinity chromatography on Mannose-Sepharose matrix followed by ion exchange chromatography on DEAE-Sephacel matrix. This procedure resulted in a purified lectin, named ASL. ASL purification process was monitored by specific hemagglutinating activity and SDS-PAGE, where it was observed that this lectin is composed of six protein bands, a higher molecular weight of approximately 20 kDa and five other bands of lower apparent molecular weight between 15 and 12 kDa.The intact molecular mass of the purified lectin was determined by mass spectrometry with electrospray ionization (ESI). The analysis of the intact mass spectrum showed the presence of two majority ions of molecular mass 12.220+ 2 and 13.258 + 2 Da. ASL also had its primary structure partially sequenced by mass spectrometry sequence. This lectin is a glycoprotein and shows high stability, being able to maintain their hemagglutinating activity in a wide pH range and after exposure to temperatures up to 80 ÂC for 1 hour. After dialysis against the chelating agent EDTA, ASL had its hemagglutinating activity decreased, but recovered its activity after the addition of metals, being dependent on divalent metal cations. We also evaluate the effect of ASL on planktonic bacterial growth and biofilm formation and found that it interfered with the growth of two different planktonic gram-positive bacterial strains (Streptococcus mitis and Streptococcus salivarius) and biofilm formation by Stafilococcus aureus e Streptococcus salivarius.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectinas sÃo proteÃnas que tem a capacidade de se ligar especificamente e reversivelmente a carboidratos e glicoconjugados, sem alterar a estrutura do ligante. Elas sÃo encontradas em organismos tais como vÃrus, bactÃrias, plantas e animais, e tem sido demonstrado que possuem atividades biolÃgicas importantes. Clitoria fairchildiana R. A. Howard à uma espÃcie pertencente à famÃlia Fabaceae, nativa da AmÃrica do Sul. O objetivo deste estudo foi isolar e caracterizar uma lectina presente em sementes de Clitoria fairchildiana, avaliar o potencial fitoterÃpico e farmacolÃgico (antinociceptivo, prà e antiinflamatÃrio, hemolÃtico, antibacteriano e antifÃngico) desta lectina. Os resultados indicaram a presenÃa de uma lectina (CFAL) na fraÃÃo proteica glutelina Ãcida, que aglutina eritrÃcitos de coelho nativos, a qual nÃo foi inibida por monossacarÃdeos e glicoproteÃnas testadas, foi purificada por cromatografia em coluna de troca-iÃnica, DEAE-Sephacel. AnÃlise da lectina em SDS-PAGE indicou duas bandas com massa molecular de aproximadamente 100 e 116 kDa. As anÃlises em DLS apresentam uma amostra monomodal com raio hidrodinÃmico (RH) de 4,5 nm, indicando uma conformaÃÃo dependente de alta concentraÃÃo salina. A CFAL à uma glicoproteÃna PAS (+) capaz de ser inativada pelo tratamento com metaperiodato de sÃdio, porÃm resistente ao efeito de β-mercaptoetanol e urÃia. Esta lectina nÃo apresentou citotoxicidade significativa nÃo alterou a fragilidade osmÃtica, bem como nÃo apresentou efeitos oxidante/antioxidante significativos frente a hemÃcias humanas. A lectina apresentou atividade antiinflamatÃria em modelo de edema da pata induzido por carragenina, com diminuiÃÃo de 71% do edema. Efeitos antinociceptivos dose dependentes foram observados para CFAL no teste de contorÃÃes abdominais induzida por Ãcido acÃtico, com reduÃÃo do nÃmero de contorÃÃes em atà 72%. A lectina de C. fairchildiana foi capaz de reduzir o crescimento de Bacillus subtilis e nÃo afetou o crescimento dos fungos testados. Concluiu-se que a lectina purificada e caracterizada a partir das sementes de Clitoria fairchildiana à uma glicoproteÃna desprovida de pontes dissulfeto com atividade antiinflamatÃria e antinociceptiva e nÃo à citotÃxica para eritrÃcitos humanos. / Lectins are proteins that have the ability to bind specifically and reversibly to carbohydrates and glycoconjugates, without changing the structure of binder. They are found in organisms such as virus, bacterias, plants and humans, and has been shown to possess important biological activities. Clitoria fairchildiana R. A. Howard is a species belonging to the Fabaceae family, native to South America. The purpose of this study was to isolate and to characterize a lectin present in seeds of Clitoria fairchildiana, evaluate the herbal and pharmacological potential (antinociceptive, pro-and antiinflammatory, hemolytic, antibacterial and antifungal) of this lectin. The results indicated the presence of a lectin (CFAL) on protein fraction acid glutelin, CFAL binds native rabbit erythrocytes, was not inhibited by monosaccharides and glycoproteins tested and was purified by ion exchange chromatography, DEAE-Sephacel. Analysis of the lectin in SDS-PAGE showed two bands with molecular mass approximately 100 and 116 kDa. In DLS analyzes have a monomodal sample with hydrodynamic radius (RH) of 4.5 nm, showing a conformation high salt concentration dependent. The CFAL is a glycoprotein PAS (+) capable of being inactivated by treatment with sodium metaperiodate, but resistant to the effect of β-mercaptoethanol and urea. This lectin did not show significant cytotoxicity, did not change the osmotic fragility and not showed oxidant/antioxidant significant effects, compared to human erythrocytes. The lectin showed anti-inflammatory activity in models of paw edema induced by carrageenan, decreasing 71% of edema. Dose dependent antinociceptive effects were observed for CFAL on abdominal writhing test induced by acetic acid, reducing the number of writhes in up to 72%. The C. fairchildiana lectin was able to reduce the growth of Bacillus subtilis and did not affect growth of the fungi tested. It was concluded that the lectin purified and characterized from the seeds of Clitoria fairchildiana is a glycoprotein lacks disulfide bonds with antinociceptive and antiinflammatory activity, and is not cytotoxic to human erythrocytes.

A lectina da alga marinha vermelha Amansia multifida, foi investigada com respeito à sua especificidade e afinidade por estruturas de carboidratos complexos. A cinÃtica da interaÃÃo em tempo real da lectina solÃvel com vÃrias glicoproteÃnas imobilizadas, e a inibiÃÃo destas interaÃÃes por oligomanosÃdeos, foram analisadas atravÃs da tecnologia de ressonÃncia plasmÃnica de superfÃcie. A lectina exibiu uma certa preferÃncia pelo monossacarÃdeo manose e a sua interaÃÃo por di-tri e pentamanosÃdeos foi mais expressiva. A lectina de A. multifida interagiu com glicopeptÃdeos Man5 a Man8â asparagina, e a alta afinidade da lectina pelas referidas estruturas, foi evidenciada quando da anÃlise da interaÃÃo com glicoproteÃnas tais como: lactotransferrina bovina e ribonuclease b. De acordo com os resultados obtidos com a coluna de Sepharose6B com lectina de A. multifida imobilizada, o baixo reconhecimento sobre a aglutinina de soja, confirma o nÃo reconhecimento sobre a estrutura Man 9, e descarta a capacidade de associaÃÃo da lectina com uma estrutura que exiba trÃs resÃduos de manose ligados em -1,2 na extremidade do glicano. Estudos farmacolÃgicos envolvendo a lectina de A. multifida complementaram este trabalho, quando foram testadas as atividades analgÃsica e antiinflamatÃria em camundongos. Os resultados indicaram que essa proteÃna produziu um efeito analgÃsico nos trÃs tipos de modelo de dor utilizados. Nos testes das contorÃÃes abdominais e de formalina, um efeito dose dependente foi evidenciado. A administraÃÃo por via intraperitoneal e por via oral, apresentou resultados que mostraram ser a primeira via de tratamento a mais efetiva. Com o objetivo de comparar a aÃÃo analgÃsica da lectina de A. multifida com um narcÃtico analgÃsico de aÃÃo central, morfina, foi realizado o teste da placa quente utilizando um tratamento prÃvio com naloxona, um antagonista opiÃide. A lectina de A. multifida, mostrou reduÃÃo no seu efeito antinociceptivo na presenÃa de naloxona, sugerindo portanto, que sua atividade envolve a ativaÃÃo de receptores opiÃides à semelhanÃa da morfina. Um efeito antinociceptivo a nÃvel central, tambÃm foi observado quando a lectina aumentou a duraÃÃo do tempo de sono induzido por barbitÃrico. A aÃÃo antiinflamatÃria da lectina de A. multifida foi comprovada no teste de edema de pata utilizando carragenina e dextrano. A participaÃÃo de lectina nos efeitos analgÃsicos observados, foi avaliada com utilizaÃÃo prÃvia de D-manose e avidina, das quais D-manose suprimiu a nocicepÃÃo satisfatoriamente. A lectina de A. multifida mostrou possuir propriedades analgÃsicas de origem perifÃrica e central, sendo esses efeitos mais evidenciados na dor de origem inflamatÃria. / This study aimed to investigate the specificity for simple sugars or glycoproteins of the lectin from the red seaweed Amansia multifida. The interaction kinetics in real time of the soluble lectin with several immobilized glycoproteins and the inhibition of these interactions by oligomanosides were analyzed through surface plasmon resonance technology. The lectin showed somehow preference to the monosaccharide mannose and its interaction with di-tri and pentamanosides was more expressive. The lectin of A. multifida interacted with glycopeptides Man5 to Man8â asparagine, and the high affinity of the lectin for these structures was shown by analyzing the interaction with glycoproteins such as ribonuclease b and bovine lactotransferrin. The results obtained with Sepharose6B column containing immobilized A. multifida and the low recognition of soybean agglutinin corroborate the non-recognition of Man 9, and discard the capacity of association with a structure showing three residues of mannose linked in a-1,2 at the glycan extremity. The results of the pharmacological studies with three models of pain showed that A. multifida lectin caused analgesia. In the abdominal contorsion and formalin tests a dose-dependent effect was observed. The IP route was more effective than the oral route. In order to compare the analgesic action of A. multifida lectin with that of morfine, a narcotic with central action, the hot plate test was conducted after pre-treatment with the opioid antagonist naloxane. The antinociceptive effect of the lectin was reduced at the presence of naloxane, which suggests that its action involves activation of opioid receptors as occurs with morfine. An antinociceptive effect at central level was also observed when the lectin increased the duration of barbituric-induced sleep. The lectin showed anti-inflammatory action by the paw edema test with carrageenan and dextran. The involvement of the lectin in the observed antinociceptive effects was assessed by pre-treatment with D-mannose and avidin. The antinociceptive effect was suppressed by D-mannose. A. multifida lectin was shown to have antinociceptive properties of both central and peripheral origin, being these effects more evident for pain of inflammatory origin

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Atualmente à crescente o nÃmero de estudos com base na alteraÃÃo de perfis glicoproteÃmicos em diversas doenÃas, principalmente na busca de biomarcadores sÃricos para o cÃncer. A identificaÃÃo e quantificaÃÃo direta, de glicoproteÃnas sorolÃgicas pouco abundantes, sÃo difÃceis, pois proteÃnas muito abundantes no sangue podem dificultar a identificaÃÃo. Assim, ferramentas de fracionamento sÃo necessÃrias para isolar, eficientemente, glicoformas proteicas aberrantes no proteoma sanguÃneo. Tendo em vista a interaÃÃo especÃfica e reversÃvel de lectinas com glicoconjugados, o uso de lectinas imobilizadas em matriz cromatogrÃfica tem sido frequente, visando fracionar misturas complexas, envolvendo glicoproteÃnas, para posterior anÃlise por espectrometria de massas. Mediante este contexto, o objetivo do presente trabalho foi investigar o uso da lectina glucose/ manose ligante de sementes de Dioclea altÃssima (DaL) imobilizada em matriz cromatogrÃfica Sepharose 4B (DaL-Sepharose), no fracionamento de glicoproteÃnas sÃricas e na pesquisa de potenciais biomarcadores para o cÃncer de prÃstata (CaP). As glicoproteÃnas da fraÃÃo retida, obtidas pela cromatografia do soro sanguÃneo na matriz de DaL-Sepharose, foram identificadas e quantificadas, por espectrometria de massas, e assim, foi obtido o perfil proteico para os trÃs grupos estudados: controle, hiperplasia prostÃtica benigna e CaP. A identificaÃÃo das proteÃnas diferentemente expressas entre os grupos revelou 132 glicoproteÃnas, destas, 29 foram unicamente identificadas no grupo com cÃncer de prÃstata ou apresentaram uma razÃo de ln maior que 1,2, quando comparado à quantificaÃÃo no grupo controle. ApÃs uma anÃlise considerando a confiabilidade da identificaÃÃo, estimada pelo escore, e as evidencias na literatura que justifiquem um possÃvel envolvimento da proteÃna no cÃncer de prÃstata, destacaram-se: alfa-1-glicoproteÃna Ãcida, trombospondin-5, complemento C4 A, heptaglobina, pregnancy zone protein, isoforma 3 de alfa-1-antitripsina, alfa-2-glicoproteÃna rica em leucina e Zinc finger protein. A anÃlise do soro sanguÃneo fracionado pela matriz DaL-Sepharose, com prÃvia depleÃÃo de Albumina sÃrica humana e IgG, permitiu a identificaÃÃo de alfa-1-antitripsina e a proteÃna IGK âÃnicasâ no grupo com CaP e a pregnancy zone protein e a proteÃna like alfa 1 mieloma up reguladas no CaP quando comparadas ao grupo controle. A identificaÃÃo destas glicoproteÃnas gera novas perspectivas e servem de indicativo para nortear a pesquisa e desenvolvimento de mÃtodos de validaÃÃo destes resultados para usos clÃnicos. / Nowadays there are an increase number of studies based on the change of glycoproteomics profiles in several diseases, especially in the search for serum biomarkers for cancer. The direct identification and quantification of serum glycoprotein of low abundance are difficult, because proteins very abundance in the blood can difficult the identification. Thus, fractionation tools are necessary to isolate efficiently changed protein glycoforms on the blood proteome. Given the specific and reversible interaction of lectins to glycoconjugates, the use of immobilized lectins on chromatographic matrix has been frequent in order to fractionate complex mixtures, involving glycoprotein for analysis for mass spectrometry. In this context, the goal of this work was to investigate the use of binding glucose/ mannose lectin from Dioclea altÃssima seed (DaL) immobilized on Sepharose chromatography matrix 4B (DaL-Sepharose), on the fractionation of serum glycoproteins and research of potential biomarkers for prostate cancer (PC). Glycoproteins from the retained fraction obtained by chromatography of blood serum on DaL-Sepharose matrix were identified and quantified by mass spectrometry and it was obtained the protein profile to the three groups: control, benign prostatic hyperplasia and PC. The identification of differentially expressed proteins between the groups showed 132 glycoproteins, in which 29 were only identified on the group with prostate cancer or showed one reason of ln greater than 1.2 when compared to quantification on control group. After an analysis, considering the confiability of the identification, estimated by score, and the evidences on the literature that justified a possible involvement of the protein on prostate cancer, stood out: alpha-1-acid glycoprotein, thrombospondin-5 complement C4 A, haptoglobin, pregnancy zone protein, isoform 3 of alpha 1-antitrypsin, alpha-2 glycoprotein rich in leucine and Zinc finger protein. The analysis of fractionated bood serum by DaL-Sepharose matrix with prior depletion of Human Serum Albumin and IgG allowed the identification of alpha 1-antitrypsin and the IGK protein âonlyâ on the group with CaP and the pregnancy zone protein and protein like alfa-1 mieloma up regulated on CaP when compared to the control group. The identification of these glycoproteins generates new perspectives and suit as indicative for guiding research and validation methods development of these results for clinical uses.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Leguminosae is recognized by the large amount of isolated and characterized lectins, especially seeds. In this group stand out proteins extracted from species belonging to subtribe Diocleinae, the number of studies in different areas of knowledge. Lectins can be defined as proteins or glycoproteins which are not originated from a body's immune response and have the ability to recognize and bind reversibly to mono or oligosaccharides particular without, however, altering their chemical structures. Different works in our group are structurally haracterizing these proteins as well as elucidating some possible biotechnological applications for these molecules. In this sense, the objective of this study was to isolate and characterize lectins of different species of Leguminosae of Diocleinae subtribe and test them for toxicity to Artemia sp. naupilos, The effect on the smooth muscle of blood vessels and the detention lectin matrix agarose previously activated with cyanogenic bromide (CNBr). Were isolated and characterized the lectin Dioclea sclerocarpa, Dioclea lasiocarpa and Dioclea lasiophylla. Were also made circular dichroism studies on lectin Dioclea sclerocarpa and Dioclea lasiocarpa. The lectin Dioclea lasiophylla was tested against Artemia sp. order to assess their toxicity and was also immobilized on agarose matrix. We evaluated the effect of lectin Dioclea lasiocarpa in the smooth muscle of blood vessels. The knowledge gained from the three scientific articles published in this thesis is a major breakthrough in this promising field of study that has been continuously growing for biotechnological applications. / A famÃlia Leguminosae à reconhecida pela grande quantidade de lectinas isoladas e caracterizadas, especialmente de sementes. Neste grupo se destacam as proteÃnas extraÃdas de espÃcies pertencentes a subtribo Diocleinae, pela quantidade de estudos em diferentes Ãreas do conhecimento. Lectinas podem ser definidas como proteÃnas ou glicoproteÃnas que nÃo sÃo originadas a partir de uma resposta imunolÃgica do organismo e possuem a capacidade de reconhecer e se ligar reversivelmente a mono ou oligossacarÃdeos especÃficos sem, no entanto, alterar suas estruturas quÃmicas. Diferentes trabalhos no nosso grupo vÃm caracterizando estruturalmente essas proteÃnas, bem como elucidando algumas possÃveis aplicaÃÃes biotecnolÃgicas para essas molÃculas. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar lectinas de diferentes espÃcies de Leguminosae da subtribo Diocleinae e testa-las com relaÃÃo à toxicidade para naupilos de Artemia sp., o efeito na musculatura lisa de vasos sanguÃneos e a imobilizaÃÃo de lectina em matriz de agarose previamente ativada com brometo cianogÃnico (CNBr). Foram isoladas e caracterizadas as lectinas de Dioclea sclerocarpa, Dioclea lasiocarpa e Dioclea lasiophylla. TambÃm foram feitos estudos de dicroÃsmo circular na lectina de Dioclea sclerocarpa e Dioclea lasiocarpa. A lectina de Dioclea lasiophylla foi testada contra Artemia sp.de forma a avaliar sua toxicidade e tambÃm foi imobilizada em matriz de agarose. Foi avaliado o efeito da lectina de Dioclea lasiocarpa na musculatura lisa de vasos sanguineos. O conhecimento acumulado a partir dos trÃs artigos cientÃficos publicados nesta tese constitui um grande avanÃo no neste campo promissor de estudo que vem em contÃnuo crescimento para aplicaÃÃo biotecnolÃgica.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A grande diversidade biolÃgica das algas marinhas e sua ocorrÃncia em praticamente todos os ambientes do planeta demonstram a importÃncia desses seres para os ecossistemas. Um deles à a extraÃÃo de biomolÃculas potencialmente ativa como as lectinas, que sÃo proteÃnas que tÃm sido alvo de pesquisas no mundo inteiro. Isso se deve à sua impressionante capacidade de ligar-se especificamente a carboidratos ou a substÃncias que os contÃm, propiciando um imenso campo de aplicaÃÃo biolÃgica. O objetivo deste trabalho foi produzir a lectina da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum (Lec), avaliar sua estrutura secundÃria a partir de tÃcnicas espectroscÃpicas e investigar as suas propriedades anti-inflamatÃrias em camundongos. Primeiramente a lectina foi purificada por precipitaÃÃo com sulfato de amÃnio (0-60) e cromatografia de troca â iÃnica, sendo recolhido o primeiro pico (PI). Este pico foi selecionado atravÃs da atividade de hemaglutinaÃÃo obtendo assim a lectina pura a partir de Bryothamnion triquetrum, verificada por SDS-PAGE. A lectina foi analisada quanto a sua estrutura secundÃria por tÃcnicas espectroscÃpicas de dicroÃsmo circular, frente a extremos de pH (4,0 â 11,0) e comparada ao espectro da sua estrutura nativa, e fluorescÃncia frente a diferentes temperaturas que variaram de 25 a 75 em intervalo de 10Â. Na avaliaÃÃo das atividades biolÃgicas, grupos de animais foram submetidos ao prÃ-tratamento com a Lectina (1,5 e10mg/kg; i.p.) e indometacina (10mg/kg), 30 min antes do estÃmulo inflamatÃrio. A atividade anti-inflamatÃria em camundongos foi avaliada atravÃs dos ensaios de peritonite induzida por carragenina - Cg (500 μg/cav) e de edema de pata induzidos por Cg (500 μg/pata); dextrano (500 μg/pata). Extremos do pH (4,0 e 11,0) nÃo alterou a estrutura secundÃria da proteÃna. Os dados de fluorescÃncia (280nm e 295nm), mostraram tambÃm uma estabilidade, alÃm da presenÃa de aminoÃcidos aromÃticos na sua estrutura. A Lectina inibiu a migraÃÃo celular na peritonite induzida por Cg e os edemas de pata induzidos por Cg e dextrano. Deste modo, conclui-se que a Lectina obtida do PI da DEAE de Bryothamnion triquetrum apresentou estrutura estÃvel em relaÃÃo a variaÃÃo de pH e temperatura. Em relaÃÃo Ãs propriedades biolÃgicas testadas, a Lectina apresentou efeitos anti-inflamatÃrios nos modelos empregados, podendo ser considerada uma molÃcula com potencial para estudos mais aprofundados de inflamaÃÃo. / The great biodiversity of seaweeds and their occurrence in almost all environments on the planet demonstrate the importance of such beings to ecosystems. One example is the extraction of potentially active biomolecules such as lectins, which are proteins that have been subject of research worldwide. This is due to its impressive ability to bind specifically to carbohydrates or substances containing them, providing an immense field of biological application. This work purpose was to produce lectin from the red seaweed Bryothamnion triquetrum (Lec), evaluate its secondary structure using spectroscopic techniques, and investigate their anti-inflammatory properties in mice. Initially, the lectin was purified by precipitation with ammonium sulfate (0-60) and ion exchange chromatography, and obtained the first peak (PI). This peak was selected by hemagglutination activity thus obtaining pure lectin from Bryothamnion triquetrum, verified by SDS-PAGE. The secondary structure of lectin was analyzed by circular dichroism spectroscopic techniques, against to pH extremes (4.0 to 11.0), and compared to the spectrum of its native structure, and fluorescence against different temperatures, ranging from 25 to 75Â, each 10 interval. In biological activities assessment, groups of animals were subjected to pretreatment with the lectin (1.5 and 10mg/kg, ip) and indomethacin (10mg/kg) 30 min before the inflammatory stimulus. The anti-inflammatory activity in mice was evaluated through the assays of peritonitis induced by carrageenan - Cg (500 μg / cav) and paw edema induced by Cg (500 μg / paw), and dextran (500 μg / paw). Extremes of pH (4.0 and 11.0) did not alter the protein secondary structure. Fluorescence data (280nm and 295nm) also showed stability, and aromatic amino acids presence in their structure. Lectin inhibited cell migration in the induced peritonitis by Cg and induced paw edema by Cg and dextran. Thus, it is concluded that the lectin obtained from the Bryothamnion triquetrum DEAE PI shows stable structure related to pH and temperature variation. Regarding biological properties tested, the lectin showed anti-inflammatory effects in models used, and it can be considered a molecule with potential for further studies of inflammation.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectinas sÃo (glico) proteÃnas de origem nÃo imune e que podem reconhecer e se ligar reversivelmente a carboidratos ou a outras substÃncias derivadas de aÃÃcares. A lectina de sementes de Canavalia boliviana Piper (CboL) na forma de cristais apresenta-se como um dÃmero canÃnico  100 KDa e especificidade de ligaÃÃo a D-Glicose. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antiinflamatÃria e antinociceptiva da CboL. Para tal, utilizamos camundongos Swiss (25-35g) e ratos Wistar (150-220g). No estudo da atividade antiinflamatÃria, CboL (1, 5 e 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) reduziu a permeabilidade vascular e inibiu a migraÃÃo de neutrÃfilos (rolamento e adesÃo) para a cavidade peritoneal de animais estimulados com carragenina (Cg), e este efeito parece estar relacionado com a reduÃÃo da concentraÃÃo de citocinas prÃ-inflamatÃrias (TNF-, IL-1) e aumento da concentraÃÃo da citocina antiinflamatÃria (IL-10). A administraÃÃo conjunta de CboL com D-Glicose (aÃÃcar ligante) reverteu sua atividade antiinflamatÃria, sugerindo participaÃÃo do sÃtio lectÃnico nesta atividade; o aquecimento de CboL a 100oC, por 10 minutos, inibiu seu efeito antiinflamatÃrio, indicando a importÃncia de sua estrutura na atividade biolÃgica relatada. A lectina nÃo induziu a produÃÃo de Ãxido nÃtrico (reaÃÃo de Griess) no soro. Ainda em relaÃÃo à atividade antiinflamatÃria, CboL foi capaz de inibir a migraÃÃo de neutrÃfilos para a cavidade peritoneal de animais imunizados e estimulados com ovoalbumina (OVA), esta mesma lectina foi eficaz em inibir a migraÃÃo de neutrÃfilos in vitro estimulada por MIP-2, demonstrando entÃo um papel direto da CboL na inibiÃÃo da migraÃÃo. No estudo da atividade antinociceptiva, CboL (1, 5 e 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) reduziu as contorÃÃes abdominais induzidas por Ãcido acÃtico e diminuiu a primeira e segunda fase do teste da formalina, demonstrando uma atividade sobre a dor neurogÃnica e inflamatÃria. No teste da placa quente, CboL apresentou efeito possivelmente envolvendo receptores opiÃides confirmado pela modulaÃÃo com naloxona. Para avaliar a hipernocicepÃÃo foi utilizado o estesiÃmetro mecÃnico. Assim, CboL (1, 5 e 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) inibiu a hipernocicepÃÃo mecÃnica induzida por administraÃÃo intraplantar de Cg, prostaglandina E2 (PGE2) e OVA (animais imunizados). Este efeito foi correlacionado ao bloqueio do influxo de neutrÃfilos, sugerido pela reduÃÃo da atividade da mieloperoxidase nas patas de animais prÃ-tratados com CboL (5 mg/kg; e.v.; 15 minutos) e estimulados por Cg e OVA. Este efeito anti-hipernociceptivo nÃo parece estar envolvido com a reduÃÃo local das concentraÃÃes de TNF- e IL-1 ou aumento de IL-10, uma vez que CboL (5 mg/kg; e.v.; 15 minutos) nÃo reduziu os nÃveis destes mediadores no tecido da pata de animais estimulados com Cg. Outras vias de administraÃÃo foram investigadas para avaliar o efeito anti-hipernociceptivo da CboL: na via intratecal CboL (100 Âg/cav) foi ineficaz; na via intra-cerebro-ventricular CboL se mostrou eficiente. Em relaÃÃo a efeitos provocados por uma possÃvel atividade central, CboL (1, 5 e 10 mg/kg; e.v.) nÃo alterou a atividade motora e locomotora nos animais. A toxicidade subcrÃnica foi avaliada pelo tratamento de camundongos com CboL (5 mg/kg; e.v.), durante 14 dias consecutivos, atravÃs de vÃrios parÃmetros: funÃÃes do rim (peso Ãmido, dosagem de urÃia) e do fÃgado (peso Ãmido, avaliaÃÃo da cinÃtica da aspartato amino transaminase e alanina amino transaminase), coraÃÃo (peso Ãmido), estÃmago (peso Ãmido e avaliaÃÃo visual de possÃveis lesÃes), variaÃÃo de massa corporal e leucograma. Os resultados obtidos nÃo mostraram qualquer alteraÃÃo dos parÃmetros avaliados, demonstrando que a CboL nÃo apresenta toxicidade nos animais. Portanto, a atividade antiinflamatÃria e antinociceptiva da CboL està associada com a inibiÃÃo da migraÃÃo de neutrÃfilos, que provavelmente à reflexo da inibiÃÃo da liberaÃÃo de TNF- e IL-1 e aumento de IL-10 e que hà envolvimento de PGE2 e da via antigÃnica. O efeito central parece ocorrer via sistema opiÃide, confirmado pela aplicaÃÃo de CboL i.c.v. / Lectins are non-immune (glyco)proteins that can recognize and reversibly bind to carbohydrates or other substances derived from sugars. The lectin from seeds of Canavalia boliviana Piper (CboL) is a protein of aproximately  100 KDa with a binding specificity to D-Glucose. The aim of this work was to evaluate the anti-inflammatory and antinoceptive activity of lectin from Canavalia boliviana seeds. To this end, we used Swiss mice (25-35g) and Wistar rats (150-220g). In the study of anti-inflammatory activity, CboL (1, 5 and 10 mg / kg, and i.v. 15 minutes) reduced vascular permeability and inhibited the migration of neutrophils (rolling and adhesion) to the peritoneal cavity of animals stimulated with carrageenan (Cg), and this effect seems to be related to the reduction of the concentration of proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β) and the concentration of anti-inflammatory cytokine (IL-10). Co-administration of CboL with D-glucose (sugar ligand) reversed its anti-inflammatory activity, suggesting involvement of the lectin site in this activity. CboL heated at 100ÂC for 10 minutes inhibited the anti-inflammatory effect, indicating the importance of the reported biological structure activity. The lectin did not induce the production of nitric oxide in serum. What is more, in relation to anti-inflammatory activity, CboL was able to inhibit the migration of neutrophils into the peritoneal cavity of immunized animals and when stimulated with ovoalbumin (OVA), the same lectin was effective in inhibiting the migration of neutrophils in vitro stimulated by MIP-2, thus demonstrating a direct role of CboL inhibition in migration. In the study of antinociceptive activity, CbolL (1, 5 and 10 mg / kg, i.v.; 15 minutes) reduced the writhing induced by acetic acid and decreased the first and second phase of the formalin test, showing activity on pain and neurogenic inflammation. In the hot plate test, CboL had no effect involving opioid receptors, wich was confirmed by modulation with naloxone. To assess the hypernociception, esthesiometer mechanic was used. Thus CboL (1, 5 and 10 mg / kg, i.v.; 15 minutes) inhibited the induced mechanical hypernociception intraplantar administration of Cg, prostaglandin E2 (PGE2) and OVA (immunized animals). This effect correlated to the blockade of the influx of neutrophils, suggested by the decreased activity of myeloperoxidase in the legs of animals pretreated with CboL (5 mg / kg, and v, 15 minutes) and stimulated by Cg and OVA. This anti-hipernociception did not seem to be involved in the reduction of local concentrations of TNF-α and IL-1β or increase in IL-10 since CboL (5 mg / kg, i.v.; 15 minutes) did not reduce levels in these mediators in the paw tissue of animals stimulated with Cg. CboL was also able to establish itself in the model hypernociceptive effect. The intra-cerebro-ventricular CboL (10, 30 and 100 μg) proved effective in inhibiting the hypernociception induced by Cg, confirming once again the effect of opioid receptors by modulation with naloxone. Regarding the effects caused by central activity, CboL (1, 5 and 10 mg / kg) did not alter the locomotor and motor activity in animals. The subchronic toxicity was evaluated by treating mice with CboL (5 mg / kg, i.v.) for 14 consecutive days for several parameters of kidney function (blood urea nitrogen) and liver (evaluation of the kinetics of aspartate transaminase and alanine amino transaminase), heart, stomach (evaluation of possible injuries), body weight and leukogram. The results did not show any change in the parameters evaluated, demonstrating that the CboL did not show any toxicity in animals. Therefore, anti-inflammatory and antinociceptive CboL is associated with inhibition of neutrophil migration, which probably reflects the inhibition of the release of TNF- α and IL-1β and increased IL-10, and that there is involvement of PGE2 via antigen. The effect seems to occur via the central opioid system.

O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), doença endêmica na América Latina. A partir do reconhecimento de componentes fúngicos, macrófagos são ativados e adquirem propriedades que favorecem a eliminação do patógeno. Essas células produzem citocinas responsáveis pelo direcionamento da resposta adaptativa, sendo que o perfil Th1 é associado a proteção. Lectinas são proteínas que se ligam seletiva e reversivelmente a açúcares. Sua interação com glicanas da superfície de células da imunidade pode resultar em ativação e produção de citocinas, o que pode culminar em imunomodulação de efeito anti-infectivo. Nosso grupo trabalha com uma lectina de P. brasiliensis, denominada de Paracoccina (PCN) que se liga a N-acetilglicosamina. Assim, no presente trabalho objetivamos a produção de paracoccina recombinante (rPCN) expressa em Pichia pastoris e análise do papel ativador da rPCN em macrófagos. Demonstramos que esse organismo transformado secreta rPCN para o meio de cultura, com baixa contaminação de proteínas endógenas, o que possibilita o isolamento da proteína recombinante através de etapa cromatográfica única. Verificamos que a preparação obtida reproduz características da proteína nativa obtida de leveduras de P. brasiliensis e tem massa molecular aparente de 27 kDa. Demonstramos que rPCN estimula macrófagos murinos a produzirem citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12p40 e TNF-) e óxido nítrico (NO). Macrófagos estimulados com rPCN polarizam-se em direção ao perfil M1, como indicado pela maior expressão relativa de mRNA para iNOS2, SOCS3 e STAT1. Verificamos que TLR2 e TLR4 medeiam a ativação de macrófagos por rPCN, uma vez que a ausência de cada um desses receptores, com destaque para TLR4, afeta a produção de mediadores inflamatórios estimulada pelo componente fúngico. TLR4 é também responsável pela polarização de macrófagos em direção ao perfil M1, pois na ausência desse receptor não se detecta mensagem para iNOS2. Concluímos que o método de produção de rPCN via P. pastoris é eficiente e que a preparação obtida ativa macrófagos, levando-os a produzirem mediadores pró-inflamatórios e se polarizarem em direção ao perfil M1. Esses processos são essencialmente mediados por TLR4. Postula-se que paracoccina seja um agonista de TLR4 capaz de desencadear respostas que, sabidamente, conferem proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / The dimorphic fungus Paracoccidioiddes brasiliensis (P. brasiliensis) is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic disease in Latin America. From the recognition of fungal components, macrophages are activated and acquire properties that favor the elimination of the pathogen. These cells produce cytokines that are responsible for directing the adaptive response, wherein Th1 immunity is protective. Lectins are proteins that bind selectively and reversibly to sugars. Their interaction with glycans in the surface of immune cell can result in activation and cytokine production, which may result in immunomodulatory anti-infective effect. Our group has been working with a lectin from P. brasiliensis called paracoccin (PCN) which binds to N-acetylglucosamine. In the present work we aimed to produce recombinant paracoccin (rPCN) expressed in Pichia pastoris and analysis of the role of rPCN in macrophages activation. We have demonstrated that this transformed organism secret rPCN to the culture medium and presents low contamination with endogenous proteins, which allows the isolation of recombinant protein by a single chromatography step. We found that the obtained preparation reproduces characteristics of the native protein from P. brasiliensis yeast and has apparent molecular mass of 27 kDa. We demonstrated that rPCN stimulates murine macrophages to produce pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-12 p40, and TNF-) and nitric oxide (NO). Macrophages stimulated with rPCN polarize toward the M1 profile, as indicated by increased relative expression of iNOS2, SOCS3, and STAT1. We found that TLR2 and TLR4 mediate macrophage activation by rPCN, since the absence of each of these receptors, especially TLR4, affects the production of inflammatory mediators stimulated by the fungal component. TLR4 is also responsible for macrophage polarization toward the M1 profile, because in the absence of this receptor, the message to iNOS2 is not detected. We conclude that the method used to rPCN production, by P. pastoris, is efficient and that the obtained preparation is able to active macrophage, inducing them to produce pro-inflammatory mediators and polarize into the M1 profile. These processes are primarily mediated by TLR4. It is postulated that Paracoccin corresponds to a TLR4 agonist, able to trigger responses that are known to provide protection against infection with P. brasiliensis.

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