Diante da importância das lectinas no sistema imunológico avaliamos o papel da Nattectina, lectina tipo C identificada no veneno de Thalassophryne nattereri, no desenvolvimento das respostas imunes inata e específica. A Nattectina induziu peritonite em camundongos, caracterizada pelo influxo de neutrófilos e macrófagos, acompanhada da liberação de PGE2, LTB4, IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-6, KC, MCP-1, IL-10 e IL-12p70. A resposta imune específica induzida pela Nattectina foi caracterizada pela produção de anticorpos específicos IgG, IgG1 e principalmente IgG2a com síntese de IL-10 e IFN-<font face=\"symbol\">g pelas células esplênicas re-estimuladas in vitro. A incubação de células dendríticas imaturas com a Nattectina gerou maturação destas células com aumento da expressão de moléculas MHC classe II, CD40, CD80, CD86 e expressão de MMP-2 e MMP-9 distribuídas no núcleo e no citoplasma celular, produção das citocinas IL-10 e IL-12p70 e eficiente apresentação antigênica. Concluímos que a Nattectina é capaz de induzir inflamação e resposta imune específica do tipo Th1 mediante a ativação de células dendríticas. / Due to the importance of the lectins in the immunological system we evaluated the role of Nattectin a C-type lectin identified in the venom of Thalassophryne nattereri on development of the innate and specific immune responses. Nattectin induced a significant cellular recruitment into peritoneal cavity of mice, mainly by influx of neutrophils, followed by macrophages, with synthesis of PGE2, LTB4, IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-6, KC, MCP-1, IL-10, and IL-12p70. The specific immune response induced by Nattectin was characterized by the production of specific antibodies IgG, IgG1 and mainly IgG2a with IL-10 and IFN-<font face=\"symbol\">g synthesis by splenic cells. Incubation of immature dendritic cells with Nattectin resulted in maturation with up-regulation of MHC class II, CD40, CD80, CD86, and expression of MMP-2 e MMP-9 distributed in nucleus and cytoplasm. Mature dendritic cells produced and release IL-10 and IL-12p70 and present the antigen efficiently. We concluded that Nattectin is able to induce inflammation and Th1 specific immune response through the activation of dendritic cells.

Avaliou-se a expressão do gene mbl2 em 79 crianças e suas mães HIV positivas com o objetivo de avaliar a sua influência na transmissão vertical. Os pacientes divididos em dois grupos: crianças HIV positivas e suas mães (n=18) e crianças HIV negativas e suas mães (n=61) foram avaliados pelo CH50 e AP50 (ensaios hemolíticos), dosagem e avaliação funcional da MBL, ativação da cascata terminal do complemento (ELISA) e o gene mbl2 (PCR). Os resultados não mostraram diferença significante entre os níveis séricos, atividade funcional e o gene da MBL entre os grupos, excluindo a sua influência sobre a transmissão materno-fetal do HIV / It was evaluated the mbl2 gene expression in 79 children and their HIV positive mothers with the aim to evaluate its influence on mother-to-child HIV. The patients were divided in two groups: HIV positive children and their mothers (n=18) and HIV negative children and their mothers (n=61) were evaluated by CH50 and AP50 (hemolytic assays); levels and functional MBL and terminal complement cascade (ELISA) and mbl2 gene (PCR). The results didn't show significant difference amons serum levels, functional activities and MBL gene between the groups, excluding the influence in the mother-to child HIV transmission.

Avaliou-se a expressão do gene mbl2 em 79 crianças e suas mães HIV positivas com o objetivo de avaliar a sua influência na transmissão vertical. Os pacientes divididos em dois grupos: crianças HIV positivas e suas mães (n=18) e crianças HIV negativas e suas mães (n=61) foram avaliados pelo CH50 e AP50 (ensaios hemolíticos), dosagem e avaliação funcional da MBL, ativação da cascata terminal do complemento (ELISA) e o gene mbl2 (PCR). Os resultados não mostraram diferença significante entre os níveis séricos, atividade funcional e o gene da MBL entre os grupos, excluindo a sua influência sobre a transmissão materno-fetal do HIV / It was evaluated the mbl2 gene expression in 79 children and their HIV positive mothers with the aim to evaluate its influence on mother-to-child HIV. The patients were divided in two groups: HIV positive children and their mothers (n=18) and HIV negative children and their mothers (n=61) were evaluated by CH50 and AP50 (hemolytic assays); levels and functional MBL and terminal complement cascade (ELISA) and mbl2 gene (PCR). The results didn't show significant difference amons serum levels, functional activities and MBL gene between the groups, excluding the influence in the mother-to child HIV transmission.

Lectinas consistem de um vasto grupo de proteínas de origem não-imunológica e de caráter não enzimático, que reconhecem carboidratos de modo específico e não-covalente. Além disso, essas proteínas participam de vários eventos fisiológicos e patológicos, com embriogenese, resposta imunológica, apoptose, diferenciação celular e câncer. Recentemente, foi purificada da peçonha da serpente Bothrops atrox uma lectina do tipo-C, ligante de lactose, com propriedades bioquímicas e funcionais semelhantes à de outras lectinas de serpentes do gênero, denominada Galatrox. O presente projeto teve como objetivos a investigação do envolvimento da Galatrox no processo inflamatório agudo através de experimentos in vivo e in vitro e a produção de anticorpos policlonais anti-Galatrox. A lectina isolada foi obtida através de dois processos cromatográficos, apresentando um valor final de recuperação protéica de 0,3% (mg) em relação ao conteúdo protéico da peçonha bruta. De modo interessante, a Galatrox conjugada ao fluorocromo FITC (8µg/mL) foi capaz de ligar-se a superfície de neutrófilos (91,47%±0,5650). Além disso, está proteína reconheceu a laminina imobilizada, e não a fibronectina, uma glicoproteína da matriz extracelular que contém sequencias de poli-N-acetillactosamina. Avaliando seu potencial inflamatório, Galatrox mostrou-se capaz de induzir a migração de neutrófilos humanos in vitro de forma dose-dependente, tendo máxima atividade quimiotática na concentração de 32µg/mL (41,57±3,42 neutrófilos por campo). Apesar da Galatrox induzir um discreto nível de burst oxidativo em neutrófilos humanos não primados, ela apresentou um efeito três vezes maior quando essas células foram primadas com fMLP. Esta lectina quando injetada na cavidade peritoneal de camundongos Balb/C provocou migração leucocitária, sendo que na dose (50g/cavidade) e no tempo (4 horas) ótimos ocorreu um influxo celular de 2,05x106±0,101 leucócitos/mL. Ainda, esse infiltrado celular mostrou-se, basicamentre, composto por neutrófilos. Avaliando o perfil de mediadores da resposta inflamatória nesse ensaio in vivo, nos lavados peritoneais foi indicada a liberação máxima de IL-1 e IL-6 após 4 horas de tratamento, mas não foram detectadas a presença de TNF- e óxido nitrico em qualquer tempo de resposta. Células de baços murinos tratados com Galatrox produziram as citocinas pró-inflamatórias TNF- e IFN- e não produziram IL-10 ou NO. A produção de anticorpos policlonais foi realizada por imunização de camundongos e purificação cromatografia de afinidade em colunas com Galatrox imobilizada. A monitoração por ELISA e Western blot comprovaram a produção de anticorpos da classe IgG anti-Galatrox reconhecedores da lectina em sua forma nativa e desnaturada além de suas formas monoméricas e diméricas. Em todos os ensaios biológicos que a Galatrox foi testada na presença da lactose (carboidrato ligante da Galatrox, 20 mM) ocorreram inibições significativas das atividades dessa lectina, indicando que o seu domínio de reconhecimento de carboidrato participa das funções dessa molécula. Com base nos resultados obtidos é possível sugerir que a Galatrox participe da resposta imune inata por mediar eventos biológicos da resposta inflamatória aguda. No entanto, a lectina mostrou-se como um moderado agente pró-inflamatória, quando relacionada à peçonha bruta tendo em vista a fisiopatologia inflamatória do envenenamento. O anticorpo anti-Galatrox poderá ser usado como uma importante ferramenta estudos moleculares e funcionais dessa lectina de serpente. / Lectins are proteins with no enzymatic activity and are able to bind specifically and non-covalently (reversible manner) to carbohydrates. In addition, these proteins are involved in several physiological and pathological events, as embryogenesis, immune response, cancer, and others. Galatrox, a lactose-binding protein, was purified from Bothrops atrox snake venom and partially characterized concerning its biochemical and functional properties. The present work aimed to investigate the involvement of Galatrox in the inflammatory process. In addition, was carry out the production of a polyclonal antibody against Galatrox. This lectin was purified by one chromatographic step with yield around 0.3% (w/w) of total protein from Bothrops atrox crude venom. Interestingly, Galatrox-FITC (8g/mL) binds on human neutrophil surface (91.47% ± 0.5650). Also, this lectin recognized laminin, but not fibronectin, a glycoprotein of the extracellular matrix that contains poly-N-acetyllactosamine sequences. Galatrox was able to induce human neutrophils migration in vitro in a dose-dependent manner, with maximum chemotactic activity at 32g/mL (41.57 ± 3.42 neutrophils per well). Galatrox is more efficient to induce oxidative burst on fMLP primed neutrophils rather than non-primed neutrophils. When injected into mouse peritoneal cavity, Galatrox induced dose and time-dependent leukocyte migration, with optimal effect at 50g/animal after 4 hours of the injection (2.05x106±0.101 leukocytes/mL). Galatrox also induced release of IL-1 and IL-6 up to 12 hours after injection in the peritoneal cavity. However, TNF- and NO were not detected. The treatment of splenocytes with Galatrox in vitro promotes the production of INF- and TNF-. The biological activities of Galatrox were inhibited by lactose (specific sugar, 20 mM), indicating that its recognition carbohydrate domain participates of its functions. The production of polyclonal antibody anti-Galatrox was performed by immunization of mice and purified by affinity chromatography using immobilized Galatrox resin. Gamma-globulins against Galatrox were able to recognize this lectin under native and reduced conditions, using ELISA and Western-blot, respectively. The antibody anti-Galatrox can be use as important tool to further molecular and functional characterization of this snake venom lectin. These results suggest that Galatrox is immunogenic and may participate in the acute inflammatory process, acting as a pro-inflammatory agent through its lectin property.

Lectinas são proteínas que possuem pelo menos um domínio não catalítico que se liga reversível e especificamente a um monossacarídeo ou oligossacarídeo. A capacidade de ligação a diferentes tipos de açúcares torna essas moléculas ferramentas úteis no estudo de diversos processos celulares específicos. Embora as lectinas de plantas sejam amplamente estudadas, aquelas referentes à família Apocynaceae ainda são pouco exploradas. Resultados prévios obtidos pelo nosso grupo de pesquisa mostraram que extratos brutos de súber do caule da apocinácea Tabernaemontana hystrix Steud apresenta atividade hemaglutinante. Além de aglutinar eritrócitos do sistema ABO, a putativa aglutinina foi capaz de estimular a síntese de RNAm de IL-6 e TGF- beta em células esplênicas de camundongos. À vista disso, no presente projeto tivemos como objetivo identificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar o possível potencial imunoestimulador da aglutinina de T. hystrix. Os extratos de T. hystrix obtidos por meio da farinha de raspas do súber apresentaram atividade hemaglutinante, o que não foi observado no extrato do caule destituído de súber e no extraído das folhas. Para comprovar que se tratava da atividade observada anteriormente, obtivemos a inibição da hemaglutinação com a glicoproteína fetuína, mas não houve inibição por monossacarídeos. Foi determinado um protocolo de isolamento da hemaglutinina com precipitação do extrato do súber com sulfato de amônio, cuja atividade foi recuperada no material precipitado na faixa de 30 a 60% de saturação, seguido de cromatografias sequenciais por (1) interação hidrofóbica (HiTrap Octyl), (2) troca catiônica (HiTrap SP), (3) fase reversa (EC Nucleosil C18) e (4) afinidade (Blue Sepharose). Nessas colunas a atividade foi recuperada do (1) material não retido e dos eluatos (2 e 4) com 1M e 0,5M de NaCl, respectivamente, e (3) 83% de acetonitrila. Esse protocolo produziu uma preparação homogênea contendo um peptídeo cuja análise eletrofóretica revelou massa molecular (MM) aproximada de 3kDa e concentração hemaglutinante mínima de 50g/mL. A fim de determinar se esse peptídeo formava estrutura quaternária (dímeros, tetrâmetros, etc.), característica da maioria das lectinas de plantas, submeteu-se a preparação a uma eletroforese em gel nativo (PAGE), não sendo observadas mudanças na MM do peptídeo e nem a presença de outras moléculas com MM maiores que pudessem estar associadas a ele, o que sugere que a aglutinina de T. hystrix (denominado aqui de Tabhys) é um peptídeo de MM aproximada de 3kDa. O fato da heveína, um dos peptídeos lectínicos com atividade antifúngica mais estudado, ter especificidade por quitina nos motivou a tentar o isolamento do peptídeo em coluna desse polissacarídeo. Observou-se atividade hemaglutinante e presença de peptídeo com MM de 3kDa no material eluído com Ácido acético a 0,1M da coluna de quitina. Curiosamente, nenhuma de nossas preparações foram capazes de inibir o crescimento do fungo Trichophyton rubrum. O peptídeo purificado foi testado quanto a sua capacidade em induzir a proliferação celular e a produção de citocinas em células esplênicas murinas. Os resultados dos ensaios de RT-PCR em tempo real e citometria de fluxo demonstraram que o a aglutinina de T. hystrix não foi capaz de estimular a proliferação de linfócitos, entretanto, induziu o aumento de mensagem para a citocina TGF-beta, cujo pico de produção ocorreu em célula estimuladas com 37ng/mL. Neste estudo, relatamos a presença de um peptídeo no extrato de T. hystrix com atividade hemaglutinante, o que é relativamente raro e novo. Devido a isso, este estudo pode proporcionar novas perspectivas e paradigmas nos estudos das lectinas a nível molecular e estrutural. / Lectins are proteins that have at least one non-catalytic domain that binds specifically and reversibly to a monosaccharide or oligosaccharide. This ability to bind to different types of sugars makes these molecules useful tools in the study of various specific cellular processes. Although the plant lectins are widely studied, those belong to Apocynaceae family are still little explored. Previous results obtained by our research group showed that bark crude extracts from Tabernaemontana hystrix Steud (Apocynaceae) had hemagglutination activity. Besides to agglutinate erythrocytes from ABO blood group system, the putative agglutinin induced the synthesis of IL-6 and TGF-beta mRNA in mouse spleen cells. Here we aim to identify, characterize biochemically and evaluate the possible immunostimulatory potential of T. hystrix agglutinin. The haemagglutination activity was obtained from crude extracts of bark flour, but not of flours of stems without bark and leaves. The activity of the bark extract was similar to that from the previous study, since the haemagglutination was inhibited by the glycoprotein fetuin, but not by monosaccharides. An isolation protocol was determined by using ammonium sulfate precipitation, with haemagglutination activity recovered in the range of 30-60% of saturation, and sequential chromatography procedures: (1) hydrophobic interaction (HiTrap Octyl), (2) cation-exchange (HiTrap SP), (3) reverse phase (EC Nucleosil) and (4) affinity (BlueSepharose) chromatography. From these columns the activity was recovered in the (1) unbound material, and eluates (2 and 4) with 1M and 0,5M of NaCl, respectively, and (3) 83% acetonitrile. On the basis of electrophoresis analysis, the protocol produced a preparation comprised of only band corresponding a peptide with molecular weight (MW) of about 3-kDa, with minimum haemagglutination concentration of 50g/ml. To determine if this molecule arrangement had a quaternary structure arrangement, a feature of most known lectins, we submitted the preparation to a native electrophoresis. Because there was neither change in migration pattern nor presence of molecules of higher molecular mass, we suggested that T. hystrix peptide (Tabhys) is a peptide with MW of about 3-kDa. Since hevein, which is a most studied lectin-like peptide with antifungal activity, binds specifically to chitin, we performed an affinity chromatography in the chitin column with bark extract. We observed haemagglutination activity and the presence of peptide with MW of 3-kDa in the material bound to column and eluted with 0,1M acetic acid. Curiously, this peptide was not able to inhibit the growth of the fungus Trichophyton rubrum. Thereafter, when the purified peptide was used to stimulate murine spleen cells, we detected the expression of TGF-beta message, with a peak production obtained in cell stimulated with 37 ng/mL of Tabhys. In the current study, we isolated a peptide from crude extract of T. hystrix bark with haemagglutination activity, providing new perspectives in molecular and structural researches of peptide lectins.

A resistência aos antibióticos adquirida por micro-organismos patogênicos é um problema de saúde mundial e, por isso, o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos vem sendo amplamente estimulado. Sabendo que muitos peptídeos bioativos correspondem a fragmentos peptídicos de proteínas e/ou seus análogos, este trabalho teve o objetivo de desenvolver novos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a partir das sequências aminoacídicas e das estruturas 3D de proteínas possivelmente envolvidas na atividade antimicrobiana de venenos de serpentes pouco estudados. As etapas iniciais seguidas foram: a) escolher uma fosfolipase A2 (PLA2) de veneno de serpente peruana do gênero Bothrops da família Viperidae com sequência de aminoácidos conhecida e modelar por homologia a sua estrutura 3D; b) verificar atividade antimicrobiana em venenos de serpentes peruanas dos gêneros Bothrops e Bothriopsis da família Viperidae, selecionar um veneno ativo, fracioná-lo para isolar proteínas provavelmente envolvidas nessa atividade, tripsinizar as proteínas isoladas, sequenciar os fragmentos trípticos para identificá-las, localizar esses fragmentos em sequências aminoacídicas de proteínas com estruturas 3D disponíveis correlatas às proteínas isoladas/identificadas em classe, função e fonte natural. Em seguida, foram escolhidos fragmentos peptídicos da PLA2 (item a) e das proteínas isoladas do veneno ativo (item b) e/ou desenhados análogos que apresentassem características exibidas por AMPs conhecidos. Os peptídeos desenhados foram sintetizados, purificados, caracterizados e testados em suas atividades antimicrobianas. Os modelos estruturais 3D da PLA2 de Bothrops pictus e quatro peptídeos (PLA2-1 a -4) amidados derivados dela foram obtidos, sendo o PLA2-1 ativo frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis (MICs de 6,25-200 &#181;mol.mL-1). Dos três venenos de serpentes peruanas testados, Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti e Bothriopsis oligolepis, os dois últimos inibiram o crescimento de S. aureus (MICs 0,78-50 &#181;mol.mL-1), mas apenas B. oligolepis demonstrou espectro de ação amplo. O seu fracionamento sequencial, acompanhado de ensaios de inibição do crescimento de S. aureus, gerou frações ativas relativamente homogêneas que, tripsinizadas e os fragmentos trípticos sequenciados, continham metalo-peptidases do tipo III, serino-peptidase ou lectinas do tipo C. A verificação de atividade enzimática e de coagulação sanguínea nessas frações confirmaram as naturezas das proteínas isoladas. Dos três peptídeos amidados (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) desenhados a partir de suas estruturas, um deles foi ativo frente às leveduras C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (Bo-Met1; MIC de 6,25 - 200 &#181;mol.mL-1). Pela primeira vez, foi demonstrado que: a) os venenos das serpentes peruanas B. barnetti e B. oligolepis apresentam ação antimicrobiana, sendo o último de espectro amplo; b) que as proteínas acima citadas, que incluem uma serino-peptidase, estão envolvidas com essa propriedade do veneno de B. oligolepis; c) que as sequências aminoacídicas e modelo 3D de uma PLA2 ácida e de proteínas presentes nos venenos das serpentes peruanas B. pictus e Bothriopsis oligolepis podem funcionar como fontes naturais para o desenvolvimento de novos AMPs de ação potente em micro-organismos de interesse clínico e científico. / Resistance to antibiotics obtained by pathogenic microorganisms is a global health problem, so the search for new antimicrobial agents has been encouraged. Knowing that many protein fragments and analogues are bioactive peptides, the aim of this work was to develop new antimicrobial peptides (AMPs) based on the amino acid sequences and 3D structures of proteins apparently involved in the antimicrobial activity of snake venoms very little or not studied so far. The first steps taken were: a) selection of a phospholipase A2 (PLA2) present in the venom from a Peruvian Bothrops sp. belonging to the family Viperidae, whose amino acid sequence was known, to model by homology its 3D structure; b) detection of antimicrobial activity in venoms from other Peruvian Viperidae Bothrops and Bothriopsis snakes, selection of an active venom, fractionation of it for isolation of proteins possibly involved in the antimicrobial activity, trypsinization of the isolated proteins, sequencing of the tryptic fragments for protein identification, location of such fragments in the amino acid sequences and 3D structures of proteins directly related in class, function and natural source to the isolated proteins. Then, peptide fragments from the chosen PLA2 (item a) and from the isolated proteins (item b) that presented structural features found in the known AMPs were selected and/or their analogues were designed. Finally, synthesis, purification and characterization of the peptides with AMP potential, (viii) verification on whether or not they display antimicrobial activity. The 3D-structure models of Bothrops pictus PLA2 and four amidated peptides (PLA2-1 to -4) derived from it were obtained, being PLA2-1 active against Gram negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa as well as the yeasts Candida albicans, Candida krusei and Candida parapsilosis (MICs de 6.25-200 &#181;mol.mL-1). Among the three Peruvian snake venoms tested Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti and Bothriopsis oligolepis, the last two inhibited the growth of S. aureus (MICs 0.78-50 &#181;mol.mL-1) and B. oligolepis presented a wide spectrum of bacterial action. Sequential fractionation followed by S. aureus growth inhibition assays of the main fractions led to active relatively homogeneous ones. Their trypsinization and sequencing of the tryptic fragments indicated that they contained metalloproteinases type III, serine-proteinase or lectins type CTL. Enzymatic activity and blood coagulation assays confirmed the nature of the isolated proteins. From the three amidated peptides (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) derived from them, Bo-Met1 showed to be active against C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (MIC 6,25 - 200 &#181;mol.mL-1). In summary, for the first time, it was demonstrated that: a) the venoms of the Peruvian snakes B. barnetti and B. oligolepis display antimicrobial activity, being the last of wide spectrum of action, b) the proteins isolated from B. oligolepis snake venom, including a serine-peptidase, are involved in the antimicrobial activity of the B. oligolepis snake venom, c) the amino acid sequences and 3D structures of acidic PLA2 and of other proteins found in the venoms of the Peruvian B. pictus e Bothriopsis oligolepis snakes can be used as safe and natural sources for the development of new AMPs potent against microorganisms of clinical and scientific interest.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectins are proteins that bind carbohydrates specifically and reversibly. The legume lectins represent the best studied and established group, from the point of view of physical-chemical and biological and structural, where a well-studied group of these proteins involves lectin obtained from members of the subtribe Diocleinae. Lectins Diocleinae have a high degree of structural similarity, but the same was not true regarding biological activities. This variability, as a rule, is in the detail that can be analyzed in structures based studies. In this context, multiple cardiovascular disease and inflammatory processes, particularly chronic and recurrent nature, arouse the interest of the scientific community because they require a wider range of drugs for therapeutic alternatives. In this sense, they become important research seeking new compounds with vasorelaxant and anti-inflammatory action. The present paper describes the partial structural and biological characterization of two lectins present in Canavalia virosa and Canavalia oxyphylla seeds, belonging to the family Leguminosae, subfamily Papilionoideae, Phaseoleae tribe, subtribe Diocleinae. The lectin from Canavalia virosa seeds (ConV) was purified in a single step by affinity chromatography on mannose-Sepharose 4B column. ConV strongly agglutinated rabbit erythrocytes and was inhibited by monosaccharide (D-mannose, D-glucose and &#945;-methyl-D-manosÃdeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). SDS-PAGE revealed three bands, corresponding to three chains (&#945;, &#946;, &#947; and) confirmed by ESI mass spectrometry with masses of 25.480  2 Da, 12.864  1 Da and 12,633  1 Da, respectively. The hemagglutination activity of ConV is great in pH 7.0 to 9.0, stable at a temperature of 80 C, and is not affected by EDTA. ConV showed no toxicity against Artemia sp. and relaxed the endothelized rat aorta, with the participation of the lectin domain. In our tests, the lectin immobilized on CNBr-Sepharose was able to bind 0.8 mg of ovalbumin by chromatography, allowing the use of ConV as a tool to capture and purification of glycoproteins. Moreover, the lectin from Canavalia oxyphylla (CoxyL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. SDS-PAGE showed that pure lectin consists of a major band of 30 kDa (&#945; chain) and two minor components (&#946; and &#947; chains) of 16 and 13 kDa, respectively. These data were further confirmed by mass spectrometry via electrospray ionization. Compared to the average molecular weight of the &#945; chains, the partial amino acid sequence obtained corresponds to about 45% of the total sequence CoxyL. CoxyL showed hemagglutinating activity was specifically inhibited by monosaccharide (D-glucose, D-mannose and methyl-&#945;-D-manosÃdeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Furthermore, CoxyL proved to be heat stable at 60 C, and its activity is optimal at pH 7.0. CoxyL caused toxicity in Artemia sp. and induced paw edema in rats. / Lectinas sÃo proteÃnas que se ligam a carboidratos de forma especÃfica e reversÃvel. As lectinas de leguminosas representam o grupo mais bem estudado e estabelecido, tanto do ponto de vista de caracterizaÃÃo fÃsico-quÃmica e biolÃgica como estrutural, onde um grupo bem estudado destas proteÃnas envolve lectinas obtidas de membros da subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porÃm o mesmo nÃo se observa quanto Ãs atividades biolÃgicas. Esta variabilidade, via de regra, està em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. Neste contexto, mÃltiplos processos patolÃgicos cardiovasculares e inflamatÃrios, principalmente de natureza crÃnica e recorrente, despertam o interesse da comunidade cientÃfica por requererem uma maior variedade de fÃrmacos para alternativas terapÃuticas. Neste sentido, tornam-se importantes pesquisas que busquem novos compostos, com aÃÃo vasorrelaxante e anti-inflamatÃria. Assim, o presente trabalho descreve a caracterizaÃÃo estrutural parcial e biolÃgica de duas lectinas presentes em sementes de Canavalia virosa e Canavalia oxyphylla, pertencentes à famÃlia Leguminosae, subfamÃlia Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina de sementes de Canavalia virosa (ConV) foi purificada em uma Ãnica etapa atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sepharose-mannose 4B. ConV aglutinou fortemente eritrÃcitos de coelho e foi inibida por monossacarÃdeos (D-manose, D-glicose e &#945;-metil-D-manosÃdeo) e glicoproteÃnas (ovalbumina e fetuÃna). SDS-PAGE revelou trÃs bandas, correspondentes a trÃs cadeias (&#945;, &#946;, e &#947;) confirmadas por espectrometria de massas ESI com massas de 25,480Â2 Da, 12,864Â1 Da e 12,633Â1 Da, respectivamente. A atividade hemaglutinante da ConV à Ãtima nos pH 7.0 a 9.0, estÃvel a uma temperatura de 80 ÂC, e nÃo à afetada pelo EDTA. ConV nÃo demonstrou toxicidade contra nÃuplios de Artemia sp. e relaxou a aorta endotelizada de ratos, com a participaÃÃo do domÃnio da lectina. Em nossos testes, a lectina imobilizada em CNBr-Sepharose foi capaz de se ligar a 0,8 mg de ovalbumina por cromatografia, permitindo o uso de ConV como uma ferramenta para a captura e purificaÃÃo de glicoproteÃnas. Por outro lado, a lectina de Canavalia oxyphylla (CoxyL) foi purificada em um Ãnico passo atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50.SDS-PAGE mostrou que a lectina pura consiste de uma principal banda de 30 kDa (cadeia &#945;) e dois componentes menores (cadeias &#946; e &#947;) de 16 e 13 kDa, respectivamente. Estes dados foram adicionalmente confirmados por espectrometria de massas por ionizaÃÃo por eletropulverizaÃÃo. Em comparaÃÃo com a massa molecular mÃdia das cadeias &#945;, a sequÃncia parcial de aminoÃcidos obtida corresponde a aproximadamente 45% da sequÃncia total de CoxyL. CoxyL apresentou atividade hemaglutinante que foi especificamente inibida por monossacarÃdeos (D-glicose, D-manose, e &#945;-metil-D-manosÃdeo) e glicoproteÃnas (ovalbumina e fetuÃna). AlÃm disso, CoxyL mostrou ser termoestÃvel a 60 C, e sua atividade à Ãtima no pH 7,0. CoxyL causou toxicidade em nÃuplios de Artemia sp. e induziu edema de pata em ratos.

Malária é uma das principais causas de doença e morte no mundo, principalmente de crianças. É considerada a força de seleção evolucionária mais forte que se conhece na história recente do genoma humano. Além dos fatores ambientais e do próprio parasito, fatores genéticos do hospedeiro têm um papel fundamental tanto na suscetibilidade como na evolução clínica da infecção. O sistema imune inato reconhece os plasmódios através de um número limitado de receptores de reconhecimento padrão (PRRs) e inicia vários mecanismos de defesa que resultam no desenvolvimento de inflamação e resistência do hospedeiro à infecção. Mas, a eliminação completa do parasito requer respostas imunes adaptativas que são amplificadas pela ativação do sistema imune inato. As manifestações clínicas de malária são dependentes dos níveis de citocinas próinflamatórias circulantes produzidas, as quais em níveis altos contribuem para a imunopatologia da doença. O balanço entre respostas pró e antiinflamatórias dirigidas contra o parasito é considerado crítico para a proteção clínica, assim a resposta imune inata pode contribuir tanto para proteção da malária como para modular a resposta imune adaptativa. Neste estudo, nós investigamos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) dos genes de três PRRs: TLR, MBL e CR1 de indivíduos infectados por Plasmodium e residentes em áreas endêmicas de malária no Brasil. Os SNPs TLR1 (I602S), TLR4 (D229G), TLR6 (S249P), TLR9 (T-1237C/ -1486C), MBL [exon 1 nos códons 52, 54, e 57 (MBL2*A ou D, A ou B e A ou C, respectivamente); na região do promotor na posição -221 (*X ou *Y); e na posição +4 da região não traduzida (*P ou *Q)] e CR-1(C5507G) foram determinados por PCR-RFLP. Nós observamos associações entre os polimorfismos TLR1 I602S, TLR6 S249P e da região não traduzida +4 (*Q) e manifestações clínicas de malária e entre os polimorfismos TLR9 T-1486C, TLR T-1237C, MBL*D (códon 52) e do diplótipo de produção insuficiente de MBL (XA+O/O) e parasitemias mais altas. Nenhuma associação foi observada entre o polimorfismo CR-1 C5507G e manifestações clínicas de malária ou com parasitemia. Ao analisarmos juntos os polimorfismos de MBL e TLR, observamos que indivíduos com diplótipo de produção suficiente de MBL (YA/YA+YA/XA+YA/O+XA/XA) TLR1 I602S tinham menos manifestações clínicas de malária e indivíduos com diplótipo de produção suficiente de MBL e não carreadores do alelo TLR9 -1486C tinham parasitemias mais baixas do que os indivíduos com diplótipo de produção insuficiente de MBL e carreadores dos alelos variantes de TLR1 I602S e TLR9 -1486C, respectivamente. Juntos, nossos dados indicam que polimorfismos do promotor de TLR-9 e os diplótipos de produção insuficiente de MBL (XA+O/O) devem de algum modo controlar o nível de parasitemia por plasmódios enquanto a deficiência de TLR1 parece predispor para a presença de manifestações clínicas de malária. Também, podemos sugerir que existe uma cooperação entre TLR1, TLR9 e MBL na ativação da resposta imune inata na malária. Estes achados genéticos devem contribuir para o entendimento da patogênese da malária e levantar uma questão potencialmente interessante que é digna de investigações posteriores em outras populações a fim de validar a contribuição genética destes loci na patogênese da malária / Malaria is one of the major causes of disease and death worldwide, mainly of children. It is also the strongest known force for evolutionary selection in the recent history of the human genome. Besides environmental and parasite factors, host genetic factors play a major role in determining both susceptibility to malaria and the course of infection. Innate immune mechanisms directed against Plasmodium parasites both contribute to protection from malaria and modulate adaptive immune responses. The innate immune system recognizes Plasmodium via a limited number of pattern-recognition receptors (PRRs) and initiates a broad spectrum of defense mechanisms that result in the development of inflammation and host resistance to infection. But, the complete control of the infection requires adaptive immune responses; and the innate immune system is also very efficient in instructing the cellular mediators of adaptive immunity to lead a powerful additional strike force against the parasite. Clinical malaria is characterized by high levels of circulating proinflammatory cytokines, which are thought to contribute to the immunopathology of the disease. The balance between pro- and anti-inflammatory responses toward the parasite is considered critical for clinical protection. The innate immune system initiates and thus sets the threshold of immune responses. In this study, we investigated single nucleotide polymorphisms (SNP) in the genes of three PRRs: TLR, MBL and CR1 in Plasmodium-infected individuals living in endemic areas of Brazil. The SNPs TLR1 (I602S), TLR4 (D229G), TLR6 (S249P), TLR9 (T-1237C/ -1486C), MBL [in the coding sequence of exon 1 at codons 52, 54, and 57 (MBL2*A or D, A or B, and A or C, respectively); in the promoter region at position -221 (*X or *Y); and in the untranslated sequence at position +4 (*P or *Q)] and CR-1(C5507G) were determined by PCR-RFLP. We observed associations of the TLR1 I602S, TLR6 S249P and untranslated sequence at position +4 MBL (*Q) variants with clinical manifestations of malaria and of the TLR9 T-1486C, TLR9 T-1237C, MBL2*D and MBL-insufficient diplotype (XA+O/O) with higher parasitemias. No association was observed to the CR-1 C5507G ) and clinical manifestations of malaria or parasitemia. Also, we observed that individuals with MBLsufficient haplotype (YA/YA+YA/XA+YA/O+XA/XA) and not bearing the allele TLR1 I602S had less clinical manifestations of malaria and individuals with MBL-sufficient haplotype and not bearing TLR9 -1486C had lower parasitemias when compared to individuals with MBL-insufficient diplotype and bearing the variant alleles TLR1 I602S and TLR9 -1486C, respectively. Altogether, our data indicate that TLR-9 promoter and MBL-insufficient haplotype (XA+O/O) polymorphisms to some extent may control the level of Plasmodium parasitemia while TLR1 deficiency seems to predispose to mild malaria. Also, they could suggest cooperation among TLR1, TLR9 and MBL in the immune response against malaria. These genetic findings may contribute to the understanding of the pathogenesis of malaria and raise a potentially interesting issue that is worthy of further investigation in other population in order to validate the genetics contribution of these loci to the pathogenesis of malaria

BENEVIDES, Raquel Guimarães. Avaliação do potencial fungicida e termiticida de uma fração protéica lectínica de sementes de Platypodium elegans Vogel e obtenção da lectina purificada. 2008. 113 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2008. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-04T12:43:49Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_rgbenevides.pdf: 5092516 bytes, checksum: 86289fcb11e2cb709d80b92c6f7cd851 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:15:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_rgbenevides.pdf: 5092516 bytes, checksum: 86289fcb11e2cb709d80b92c6f7cd851 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:15:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_rgbenevides.pdf: 5092516 bytes, checksum: 86289fcb11e2cb709d80b92c6f7cd851 (MD5) Previous issue date: 2008 / Seeds of Platypodium elegans Vogel, belonging to the Fabaceae family, Papilionoideae sub-family, Dalbergiae Tribe, posses a specific mannose/glucose lectin. In the purification of the lectin in study, the total extract of seeds of P. elegans prepared in NaCl 0,15M had its active fraction isolated for affinity chromatography in chitin and exchange ionic chromatography in DEAE-Sephacel and HiTrap SP, this last one connected to the HPLC.The active fractions for hemmagutinant activity gotten in these procedures had been sequentially about its specific activity and homogeneity in SDS-PAGE. The lectin in the last step of purification presented apparent molecular mass of 55 kDa. The active fraction from DEAE-Sephacel was characterized about its termiticidal and fungicidal potential. The termiticidal activity against laborers and soldiers of Nasutitermes corniger, inducing 100% of mortality in both the classrooms, was better visualized with the concentrations of 1,0 and 0,8mg/mL, between 8 and 9 days for laborers and 7 and 8 days for soldiers, where it had not been registered mortality less than 50% in the negative control. The tested fraction did not present repellent effect. In relation to the fungicidal activity, 20 ug of the fraction arrived to inhibit considerably Fusarium lateritium (33%), F. oxysporum (19.4%) and F. solani (14.3%). F. decemcellulare had a inhibition of 4,8% and F. moniliforme, 3.3%. These two activities strengthen the participation of this lectin in the vegetal defense, making it a powerful biotechnological tool to be more deeply investigated and studied about its paper in the vegetal defense and the potential use in the resistance of susceptible wood to termites. / Sementes de Platypodium elegans Vogel, pertencente à Família Fabaceae, subfamília Papilionoideae, Tribo Dalbergiae possui uma lectina Manose/Glicose ligante. Na purificação da lectina em estudo, o extrato total de sementes de P. elegans preparado em NaCl 0,15M teve sua fração hemaglutinante isolada por cromatografia de afinidade em quitina, trocas iônica em DEAE-Sephacel e em HiTrap SP, essa última acoplada a HPLC. As frações ativas para atividade hemaglutinante obtidas sequencialmente nesses procedimentos foram avaliados quanto à sua atividade específica e homogeneidade em SDS-PAGE. A lectina em seu último passo de purificação apresentou massa molecular aparente de 55 kDa. A fração pré-purificada ativa obtida em DEAE-Sephacel foi caracterizada quanto ao seu potencial termiticida e fungicida. A atividade termiticida contra operários e soldados de Nasutitermes corniger, induzindo 100% de mortalidade em ambas as classes, foram melhor visualizadas com as concentrações 1,0 e 0,8mg/mL, entre 8 e 9 dias para operários e 7 e 8 dias para soldados, onde ainda não se havia registrado menos que 50% de mortalidade no controle negativo. A fração testada não apresentou efeito repelente. Em relação à atividade fungicida, 20 ug da fração chegou a inibir consideravelmente Fusarium lateritium (33%), F. oxysporum (19,4%) e F. solani (14,3%). F. decemcellulare teve uma inibição de 4,8% e F. moniliforme, 3,3%. Essas duas atividades reforçam a participação dessa lectina na defesa vegetal, fazendo-a uma potente ferramenta biotecnológica a ser mais profundamente investigada e estudada em relação a seu papel na defesa vegetal e na potencial utilização na resistência de madeiras susceptíveis a cupins.

SIMÕES, Rafael da Conceição. Caracterização de lectinas de leguminosas por espectrometria de massa. 2011. 91 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-29T13:14:44Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_rcsimoes.pdf: 16302885 bytes, checksum: aaccf965c78f4557403cda206b305a40 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:14:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_rcsimoes.pdf: 16302885 bytes, checksum: aaccf965c78f4557403cda206b305a40 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:14:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_rcsimoes.pdf: 16302885 bytes, checksum: aaccf965c78f4557403cda206b305a40 (MD5) Previous issue date: 2011 / Mass spectrometry is a technique widely used in all prod uctive sectors. Since the late '80s with the emergence of soft ionization techniques, mass spectrometry has been widely disseminated in the analysis of biopolymers such as fatty acids, nucleic acids, oligosaccharides and especially proteins. Lectins are proteins of nonimmune origin that have at least one specific and reversible binding carbohydrate domain, without the ability to modify them. These proteins are widely distributed in nature. Lectins isolated from seeds of legumes are among the most studied and have high homology degree, being an important molecular marker of evolution in this clade. This study aimed to characterize some legume lectins by m ass spectrometry. Lectin EVA and LAA with 240 and 237 amino acid residues respectively, were analyzed for native mass and sequence of amino acids determined, showing a high degree of homology with other legume lectins. Lectin ConGF, a ConA-like, was analyzed for protein content in the crystal. Was determined that bot h mature chain and proteolytic fragments are present to form crystal, which indicates no difference between the chains structure covalently linked together by weak interactions. The partial sequence shows that ConGF has several structural features within the subtribe Diocleinae. All results demonstrate that mass spectrometry is a versatile and robust tool for characterizing proteins and can be successfully used to obtain structural information of lectins. / A espectrometria de massa é uma técnica amplamente utilizada em todos os setores produtivos. Desde o final dos anos 80 com o surgimento de técnicas de ionização brandas, a espectrometria de massa vem sendo amplamente difundida na análise de biopolímeros como ácidos graxos, ácidos nucléicos, oligossacarídeos e principalmente proteínas. Lectinas são proteínas de origem não imune que possuem pelo menos um domínio de ligação específica e reversível a carboidratos, sem a capacidade de modificá-los. Estas proteínas são amplamente distribuídas na natureza. As lectinas isoladas de sementes de leguminosas estão entre as mais estudadas e possuem alta homologia, sendo importantes marcadores moleculares da evolução dentro desta família vegetal. Este trabalho teve como objetivo caracterizar lectinas da família Leguminosae através de espectrometria de massa. As lectinas de Erythrina velutina (EVA) e Luetzelburgia auriculata (LAA) com 240 e 237 resíduos de aminoácidos respectivamente foram analisadas quanto a massa molecular nativa e foi determinada a sequencia de aminoácidos. As estruturas primárias mostraram alto grau de homologia com outras lectinas de leguminosas. A lectina ConGF, uma ConA-Like, foi analisada quanto ao conteúdo protéico do cristal. O cristal está composto da cadeia madura alfa e seus os fragmentos proteolíticos, o que indica não haver diferença entre a estrutura ligada covalentemente e as cadeias unidas por interações fracas. A sequência parcial demonstra que ConGF possui características estruturais da subtribo Diocleinae. Todos os resultados demonstram que a técnica de espectrometria de massa é uma ferramenta versátil e robusta para caracterização de proteínas e pode ser usada com sucesso para obtenção de informações estruturais de lectinas.