Lectinas são proteínas que possuem pelo menos um domínio não catalítico que se liga reversível e especificamente a um monossacarídeo ou oligossacarídeo. A capacidade de ligação a diferentes tipos de açúcares torna essas moléculas ferramentas úteis no estudo de diversos processos celulares específicos. Embora as lectinas de plantas sejam amplamente estudadas, aquelas referentes à família Apocynaceae ainda são pouco exploradas. Resultados prévios obtidos pelo nosso grupo de pesquisa mostraram que extratos brutos de súber do caule da apocinácea Tabernaemontana hystrix Steud apresenta atividade hemaglutinante. Além de aglutinar eritrócitos do sistema ABO, a putativa aglutinina foi capaz de estimular a síntese de RNAm de IL-6 e TGF- beta em células esplênicas de camundongos. À vista disso, no presente projeto tivemos como objetivo identificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar o possível potencial imunoestimulador da aglutinina de T. hystrix. Os extratos de T. hystrix obtidos por meio da farinha de raspas do súber apresentaram atividade hemaglutinante, o que não foi observado no extrato do caule destituído de súber e no extraído das folhas. Para comprovar que se tratava da atividade observada anteriormente, obtivemos a inibição da hemaglutinação com a glicoproteína fetuína, mas não houve inibição por monossacarídeos. Foi determinado um protocolo de isolamento da hemaglutinina com precipitação do extrato do súber com sulfato de amônio, cuja atividade foi recuperada no material precipitado na faixa de 30 a 60% de saturação, seguido de cromatografias sequenciais por (1) interação hidrofóbica (HiTrap Octyl), (2) troca catiônica (HiTrap SP), (3) fase reversa (EC Nucleosil C18) e (4) afinidade (Blue Sepharose). Nessas colunas a atividade foi recuperada do (1) material não retido e dos eluatos (2 e 4) com 1M e 0,5M de NaCl, respectivamente, e (3) 83% de acetonitrila. Esse protocolo produziu uma preparação homogênea contendo um peptídeo cuja análise eletrofóretica revelou massa molecular (MM) aproximada de 3kDa e concentração hemaglutinante mínima de 50g/mL. A fim de determinar se esse peptídeo formava estrutura quaternária (dímeros, tetrâmetros, etc.), característica da maioria das lectinas de plantas, submeteu-se a preparação a uma eletroforese em gel nativo (PAGE), não sendo observadas mudanças na MM do peptídeo e nem a presença de outras moléculas com MM maiores que pudessem estar associadas a ele, o que sugere que a aglutinina de T. hystrix (denominado aqui de Tabhys) é um peptídeo de MM aproximada de 3kDa. O fato da heveína, um dos peptídeos lectínicos com atividade antifúngica mais estudado, ter especificidade por quitina nos motivou a tentar o isolamento do peptídeo em coluna desse polissacarídeo. Observou-se atividade hemaglutinante e presença de peptídeo com MM de 3kDa no material eluído com Ácido acético a 0,1M da coluna de quitina. Curiosamente, nenhuma de nossas preparações foram capazes de inibir o crescimento do fungo Trichophyton rubrum. O peptídeo purificado foi testado quanto a sua capacidade em induzir a proliferação celular e a produção de citocinas em células esplênicas murinas. Os resultados dos ensaios de RT-PCR em tempo real e citometria de fluxo demonstraram que o a aglutinina de T. hystrix não foi capaz de estimular a proliferação de linfócitos, entretanto, induziu o aumento de mensagem para a citocina TGF-beta, cujo pico de produção ocorreu em célula estimuladas com 37ng/mL. Neste estudo, relatamos a presença de um peptídeo no extrato de T. hystrix com atividade hemaglutinante, o que é relativamente raro e novo. Devido a isso, este estudo pode proporcionar novas perspectivas e paradigmas nos estudos das lectinas a nível molecular e estrutural. / Lectins are proteins that have at least one non-catalytic domain that binds specifically and reversibly to a monosaccharide or oligosaccharide. This ability to bind to different types of sugars makes these molecules useful tools in the study of various specific cellular processes. Although the plant lectins are widely studied, those belong to Apocynaceae family are still little explored. Previous results obtained by our research group showed that bark crude extracts from Tabernaemontana hystrix Steud (Apocynaceae) had hemagglutination activity. Besides to agglutinate erythrocytes from ABO blood group system, the putative agglutinin induced the synthesis of IL-6 and TGF-beta mRNA in mouse spleen cells. Here we aim to identify, characterize biochemically and evaluate the possible immunostimulatory potential of T. hystrix agglutinin. The haemagglutination activity was obtained from crude extracts of bark flour, but not of flours of stems without bark and leaves. The activity of the bark extract was similar to that from the previous study, since the haemagglutination was inhibited by the glycoprotein fetuin, but not by monosaccharides. An isolation protocol was determined by using ammonium sulfate precipitation, with haemagglutination activity recovered in the range of 30-60% of saturation, and sequential chromatography procedures: (1) hydrophobic interaction (HiTrap Octyl), (2) cation-exchange (HiTrap SP), (3) reverse phase (EC Nucleosil) and (4) affinity (BlueSepharose) chromatography. From these columns the activity was recovered in the (1) unbound material, and eluates (2 and 4) with 1M and 0,5M of NaCl, respectively, and (3) 83% acetonitrile. On the basis of electrophoresis analysis, the protocol produced a preparation comprised of only band corresponding a peptide with molecular weight (MW) of about 3-kDa, with minimum haemagglutination concentration of 50g/ml. To determine if this molecule arrangement had a quaternary structure arrangement, a feature of most known lectins, we submitted the preparation to a native electrophoresis. Because there was neither change in migration pattern nor presence of molecules of higher molecular mass, we suggested that T. hystrix peptide (Tabhys) is a peptide with MW of about 3-kDa. Since hevein, which is a most studied lectin-like peptide with antifungal activity, binds specifically to chitin, we performed an affinity chromatography in the chitin column with bark extract. We observed haemagglutination activity and the presence of peptide with MW of 3-kDa in the material bound to column and eluted with 0,1M acetic acid. Curiously, this peptide was not able to inhibit the growth of the fungus Trichophyton rubrum. Thereafter, when the purified peptide was used to stimulate murine spleen cells, we detected the expression of TGF-beta message, with a peak production obtained in cell stimulated with 37 ng/mL of Tabhys. In the current study, we isolated a peptide from crude extract of T. hystrix bark with haemagglutination activity, providing new perspectives in molecular and structural researches of peptide lectins.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-10-06T17:20:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Denise Maria do Nascimento Costa.pdf: 2568349 bytes, checksum: 97687424c47175731885cd254c815ad4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-06T17:20:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Denise Maria do Nascimento Costa.pdf: 2568349 bytes, checksum: 97687424c47175731885cd254c815ad4 (MD5) Previous issue date: 2016-07-21 / Introdução: Glomerulopatia membranosa (GM) é uma causa de síndrome nefrótica cuja etiologia pode ser primária (GMP) ou secundária, dentre estas é frequente o Lúpus eritematoso sistêmico (LES). Trata-se de uma doença imunologicamente mediada, caracterizada pela deposição de imunocomplexos no espaço subepitelial glomerular. A maioria dos antígenos envolvidos identificados são alvos da imunoglobulina G4 (IgG4), subclasse predominante em imunofluorescências renais na GMP, em contraste com a GM secundária a LES (GMS) na qual IgG1, IgG2 e IgG3 prevalecem. Apesar da IgG4 ser um subtipo de imunoglobulina com baixa capacidade de ativação do complemento, há várias evidências deste envolvimento na GMP. Esses dados, em conjunto com achados de depósitos glomerulares de lectina ligadora de manose (MBL), um dos principais componentes da via das lectinas do complemento, podem sugerir que tanto a via da lectina como a IgG4 estão envolvidas nesta patologia. Sabe-se ainda que o desenvolvimento de GMP também está associado a alterações genéticas. Entretanto, a etiopatogenia da GMP ainda não é totalmente conhecida e estudos para avaliação gênica do MBL2 e dosagem sérica de IgG em GM são escassos. Assim, foi realizado este estudo com o objetivo de avaliar a frequência de polimorfismos do gene MBL2 em portadores de GM, comparados a indivíduos saudáveis. Um segundo objetivo foi comparar pacientes com GMP e GMS quanto a diferenças do percentual de IgG4 sérico em relação a IgG (%IgG4) e da frequência de polimorfismos do MBL2. Métodos: Estudo realizado entre 2014 e 2015, em Pernambuco - Brasil. A amostra incluiu 60 pacientes adultos com diagnóstico histopatológico de GMP ou GMS. Outras causas de GM secundárias foram excluídas. Foram avaliados 35 pacientes com GMP e 24 com GMS, e um grupo controle (GC), formado por 101 indivíduos saudáveis. Resultados: O alelo mutante O do gene MBL2 foi mais frequente no grupo com GM comparados aos GC (42% x 22%; p < 0,001). A heterozigose A/O, em relação ao genótipo A/A, predominou entre os pacientes comparados ao GC, associando-se a GM com OR = 11,16 (95% IC = 4,77 - 28,41). À análise comparativa entre os pacientes com GMP e GMS, não houve diferença das frequências dos polimorfismos genéticos entre os grupos. O grupo GMP apresentou menor mediana de IgG sérica total (p = 0,008) e maior %IgG4 (p = 0,016), comparado ao grupo GMS. Nível sérico de IgG4 não diferiu significativamente entre os grupos GMP e GMS (p = 0,289). Conclusão: O polimorfismo do éxon 1 do gene MBL2 associou-se à GM, comparado a indivíduos saudáveis, porém sem diferença entre as etiologias avaliadas. Já o %IgG4 sérico foi maior na GMP em relação a GMS. Estes resultados sugerem que esta mutação genética possa conferir maior vulnerabilidade a GMP e que o %IgG4 sérico possa ser utilizado como marcador adicional para diagnóstico diferencial entre as duas etiologias da GM. / Introduction: Membranous glomerulopathy (MG) is a cause of nephrotic syndrome whose etiology may be primary (PMG) or secondary, wich is frequent systemic lupus erythematosus (SLE). It is an immune-mediated disease characterized by the deposition of immune complexes in the glomerular subepithelial space. Most of the identified antigens are targets to immunoglobulin IgG4, most common subclass in renal immunofluorescence in GMP, in contrast to the SLE secondary MG (SMG) in which IgG1, IgG2 and IgG3 prevail. Although IgG4 is a immunoglobulin subtype with low complement activation capacity, there is abundant evidence of this involvement in PMG. These data, together with glomerular deposits of mannose-binding lectin (MBL), a major component of the lectin pathway of complement, may suggest that both the lectin pathway and IgG4 are involved in this pathology. It is also known that the development of PMG is associated with genetic alterations. As the pathogenesis of PMG is not yet fully known, and studies for genetic evaluation of MBL2 and serum IgG in MG are scarce, this study was conducted to evaluate the frequency of MBL2 gene polymorphisms in patients with MG, compared to healthy subjects. A second objective was to compare patients with PMG and SMG with respect to the percentage of serum IgG4 (IgG4%) and frequency MBL2 polymorphisms. Methods: This study was conducted between 2014 and 2015 in Pernambuco - Brazil. The sample included 60 adult patients with histopathologic diagnosis of PMG or SMG. Other causes of secondary MG were excluded. Thity five patients with PMG and 24 with SMG were evaluated, compared to a control group (CG) of 101 healthy subjects. Results: The mutant allele O was more frequent in the MG population compared to CG (42% vs. 22%; p <0.001). The heterozygous A/O, compared to genotype A/A, predominated among patients compared to the control group, and was associated with MG (OR = 11.16; 95% CI = 4.77 to 28.41). In the comparative analysis between patients with PMG and SMG, there was no difference in the frequency of genetic polymorphisms between groups. The PMG group had lower median total serum IgG (p = 0.008) and higher IgG4% (p = 0.016) compared to the SMG group. Serum IgG4 did not differ significantly between the groups PMG and SMG (p = 0,289). Conclusion: The polymorphism of exon 1 MBL2 gene was associated with MG, compared to healthy subjects, but no difference between the assessed etiologies. Serum IgG4% was higher in PMG relative to SMG. These results suggest that this gene mutation can confer increased vulnerability to PMG and the serum IgG4% may be used as an additional marker for the differential diagnosis between the two etiologies MG.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2018-11-13T12:41:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) resumo_dissertacao_juliana_oliveira_de_carvalho.pdf: 19466 bytes, checksum: 575be4d4f71c27a4d8e3c7e3d7bacb3a (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2018-11-13T15:59:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) resumo_dissertacao_juliana_oliveira_de_carvalho.pdf: 19466 bytes, checksum: 575be4d4f71c27a4d8e3c7e3d7bacb3a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-13T15:59:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) resumo_dissertacao_juliana_oliveira_de_carvalho.pdf: 19466 bytes, checksum: 575be4d4f71c27a4d8e3c7e3d7bacb3a (MD5) Previous issue date: 2018-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / O Rio Grande do Sul é considerado o maior produtor de arroz irrigado do Brasil. Contudo, devido às condições climáticas da região, o potencial produtivo da lavoura de arroz ainda é limitado pela incidência de doenças fúngicas. A utilização de cultivares resistentes ou tolerantes é uma forma alternativa sustentável para reduzir as perdas na produção orizícola. A transformação genética, aliada a cultura de tecidos, vem auxiliando os programas de melhoramento vegetal na geração de plantas resistentes e tolerantes a estresses bióticos e abióticos, contribuindo para a sustentabilidade da orizicultura. Lectinas são proteínas que se ligam a carboidrados e estão envolvidas em diferentes processos biológicos, inclusive na defesa de plantas contra diversos tipos de patógenos. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi introduzir o gene da lectina bvl de Bauhinia veriegata em diferentes explantes da cultivar IRGA 426 a fim de se obter plantas transformadas geneticamente com o gene bvl. Para a obtenção das plantas transformadas foram usados calos organogênicos, mesocótilos e a técnica de transformação de botões florais. No experimento para a obtenção de calos via organogênese indireta, o 2,4-D na concentração de 2,0 mg L-1 foi efetiva, induzindo uma média de 47,3 calos, sendo 89% calos organogênicos aptos para à regeneração. Na regeneração dos calos, observou-se a formação média de 12,73 brotações no meio com 0,5 mg L-1 de ANA e 2,5 mg L-1 de BAP. Já na regeneração do mesocótilo, o incremento de BAP no meio de cultivo reduziu diretamente o comprimento das brotações primárias, no entanto esse efeito foi compensado pelo aumento da multiplicação dos explantes, principalmente com 5 mg L-1 de BAP, onde observou-se uma média de 21,16 brotações. Após o processo de infecção com o vetor pH7WGD2::bvl e seleção com antibiótico, os calos da cv. IRGA 426 apresentaram hiperhidricidade e não foram regenerados. Dos mesocótilos que passaram pela transformação, 20,66% sobreviveram ao meio de seleção. A análise de PCR revelou uma eficiência de transformação de 6,35% em relação ao total de brotos e, a partir do Western Blot, confirmou-se que 3 plantas estavam expressando a lectina BVL. No método de transformação imersão floral, em todas as sementes putativamente transformadas o gene gfp estava ativo, sendo observada a expressão transiente. De acordo com os resultados obtidos, os protocolos de regeneração dos explantes foram eficientes. Análises moleculares das plantas transformadas deverão ser realizadas para determinar o número de cópias do transgene no gDNA e o papel da lectina BVL na fisiologia vegetal e defesa da planta de arroz. / Rio Grande do Sul is the largest producer of irrigated rice in Brazil. However, due to the region's climate, the productive potential of crop farms is still limited by fungal diseases. The use of tolerant or resistant cultivars is a sustainable alternative to reduce loss in rice production. Genetic transformation, coupled with tissue culture, has been assisting vegetable breeding in the production of crops resistant and tolerant to abiotic/biotic stress, contributing to the sustainability of rice culture. Lectins are proteins that bind to carbohydrates and are involved in several biological processes, including defense against diseases in plants. The main goal of this study was the insertion of the Bauhinia variegata BVL Lectin gene in different explants of cultivar IRGA 426 to obtain transformed plants with the BVL gene. To obtain the transformed plants, organogenic callus, mesocotyls and flower buds transformation technique were used. In the experiment for obtaining callus through indirect organogenisis, 2,4-D at 2,0 mg L-1 was effective, inducing the formation of an average of 47,3 calluses, of which 89% of embriogenic callus were apt for regeneration. In the regeneration step, an average of 12,73 sprouts in medium with 0,5 mg L-1 of ANA and 2,5 mg L-1 of BAP was observed. In the mesocotyls regeneration, the BAP increment in the growing medium directly reduced the length of primary shoots; however, this effect was compensated by the increse of explant multiplication, mainly with 5 mg L-1 of BAP, where an average of 21,16 sprouts were observed. After infection with the pH7WGD2::bvl vector and antibiotic selection, the callus of cv. IRGA 426 showed hyperhydricity and were not regenerated. Of the mesocotyls that went through transformation, 20,66% survived the selection medium. PCR analysis revealed a transformation efficiency of 6,35% in all sprouts and, through Western Blot, 3 plants were confirmed to express the BVL lectin. In the floral immersion transformation method, in all transformed seeds the GFP gene was active, with transient expression being observed. Based on the results obtained, the explant regeneration protocols were efficient. Molecular analysis of the transformed plants should be made to determine the number of copies of the transgene in gDNA and the role of BVL lectin in the plant physiology and its role in the plant's defense.

Lectinas consistem de um vasto grupo de proteínas de origem não-imunológica e de caráter não enzimático, que reconhecem carboidratos de modo específico e não-covalente. Além disso, essas proteínas participam de vários eventos fisiológicos e patológicos, com embriogenese, resposta imunológica, apoptose, diferenciação celular e câncer. Recentemente, foi purificada da peçonha da serpente Bothrops atrox uma lectina do tipo-C, ligante de lactose, com propriedades bioquímicas e funcionais semelhantes à de outras lectinas de serpentes do gênero, denominada Galatrox. O presente projeto teve como objetivos a investigação do envolvimento da Galatrox no processo inflamatório agudo através de experimentos in vivo e in vitro e a produção de anticorpos policlonais anti-Galatrox. A lectina isolada foi obtida através de dois processos cromatográficos, apresentando um valor final de recuperação protéica de 0,3% (mg) em relação ao conteúdo protéico da peçonha bruta. De modo interessante, a Galatrox conjugada ao fluorocromo FITC (8µg/mL) foi capaz de ligar-se a superfície de neutrófilos (91,47%±0,5650). Além disso, está proteína reconheceu a laminina imobilizada, e não a fibronectina, uma glicoproteína da matriz extracelular que contém sequencias de poli-N-acetillactosamina. Avaliando seu potencial inflamatório, Galatrox mostrou-se capaz de induzir a migração de neutrófilos humanos in vitro de forma dose-dependente, tendo máxima atividade quimiotática na concentração de 32µg/mL (41,57±3,42 neutrófilos por campo). Apesar da Galatrox induzir um discreto nível de burst oxidativo em neutrófilos humanos não primados, ela apresentou um efeito três vezes maior quando essas células foram primadas com fMLP. Esta lectina quando injetada na cavidade peritoneal de camundongos Balb/C provocou migração leucocitária, sendo que na dose (50g/cavidade) e no tempo (4 horas) ótimos ocorreu um influxo celular de 2,05x106±0,101 leucócitos/mL. Ainda, esse infiltrado celular mostrou-se, basicamentre, composto por neutrófilos. Avaliando o perfil de mediadores da resposta inflamatória nesse ensaio in vivo, nos lavados peritoneais foi indicada a liberação máxima de IL-1 e IL-6 após 4 horas de tratamento, mas não foram detectadas a presença de TNF- e óxido nitrico em qualquer tempo de resposta. Células de baços murinos tratados com Galatrox produziram as citocinas pró-inflamatórias TNF- e IFN- e não produziram IL-10 ou NO. A produção de anticorpos policlonais foi realizada por imunização de camundongos e purificação cromatografia de afinidade em colunas com Galatrox imobilizada. A monitoração por ELISA e Western blot comprovaram a produção de anticorpos da classe IgG anti-Galatrox reconhecedores da lectina em sua forma nativa e desnaturada além de suas formas monoméricas e diméricas. Em todos os ensaios biológicos que a Galatrox foi testada na presença da lactose (carboidrato ligante da Galatrox, 20 mM) ocorreram inibições significativas das atividades dessa lectina, indicando que o seu domínio de reconhecimento de carboidrato participa das funções dessa molécula. Com base nos resultados obtidos é possível sugerir que a Galatrox participe da resposta imune inata por mediar eventos biológicos da resposta inflamatória aguda. No entanto, a lectina mostrou-se como um moderado agente pró-inflamatória, quando relacionada à peçonha bruta tendo em vista a fisiopatologia inflamatória do envenenamento. O anticorpo anti-Galatrox poderá ser usado como uma importante ferramenta estudos moleculares e funcionais dessa lectina de serpente. / Lectins are proteins with no enzymatic activity and are able to bind specifically and non-covalently (reversible manner) to carbohydrates. In addition, these proteins are involved in several physiological and pathological events, as embryogenesis, immune response, cancer, and others. Galatrox, a lactose-binding protein, was purified from Bothrops atrox snake venom and partially characterized concerning its biochemical and functional properties. The present work aimed to investigate the involvement of Galatrox in the inflammatory process. In addition, was carry out the production of a polyclonal antibody against Galatrox. This lectin was purified by one chromatographic step with yield around 0.3% (w/w) of total protein from Bothrops atrox crude venom. Interestingly, Galatrox-FITC (8g/mL) binds on human neutrophil surface (91.47% ± 0.5650). Also, this lectin recognized laminin, but not fibronectin, a glycoprotein of the extracellular matrix that contains poly-N-acetyllactosamine sequences. Galatrox was able to induce human neutrophils migration in vitro in a dose-dependent manner, with maximum chemotactic activity at 32g/mL (41.57 ± 3.42 neutrophils per well). Galatrox is more efficient to induce oxidative burst on fMLP primed neutrophils rather than non-primed neutrophils. When injected into mouse peritoneal cavity, Galatrox induced dose and time-dependent leukocyte migration, with optimal effect at 50g/animal after 4 hours of the injection (2.05x106±0.101 leukocytes/mL). Galatrox also induced release of IL-1 and IL-6 up to 12 hours after injection in the peritoneal cavity. However, TNF- and NO were not detected. The treatment of splenocytes with Galatrox in vitro promotes the production of INF- and TNF-. The biological activities of Galatrox were inhibited by lactose (specific sugar, 20 mM), indicating that its recognition carbohydrate domain participates of its functions. The production of polyclonal antibody anti-Galatrox was performed by immunization of mice and purified by affinity chromatography using immobilized Galatrox resin. Gamma-globulins against Galatrox were able to recognize this lectin under native and reduced conditions, using ELISA and Western-blot, respectively. The antibody anti-Galatrox can be use as important tool to further molecular and functional characterization of this snake venom lectin. These results suggest that Galatrox is immunogenic and may participate in the acute inflammatory process, acting as a pro-inflammatory agent through its lectin property.

A resistência aos antibióticos adquirida por micro-organismos patogênicos é um problema de saúde mundial e, por isso, o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos vem sendo amplamente estimulado. Sabendo que muitos peptídeos bioativos correspondem a fragmentos peptídicos de proteínas e/ou seus análogos, este trabalho teve o objetivo de desenvolver novos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a partir das sequências aminoacídicas e das estruturas 3D de proteínas possivelmente envolvidas na atividade antimicrobiana de venenos de serpentes pouco estudados. As etapas iniciais seguidas foram: a) escolher uma fosfolipase A2 (PLA2) de veneno de serpente peruana do gênero Bothrops da família Viperidae com sequência de aminoácidos conhecida e modelar por homologia a sua estrutura 3D; b) verificar atividade antimicrobiana em venenos de serpentes peruanas dos gêneros Bothrops e Bothriopsis da família Viperidae, selecionar um veneno ativo, fracioná-lo para isolar proteínas provavelmente envolvidas nessa atividade, tripsinizar as proteínas isoladas, sequenciar os fragmentos trípticos para identificá-las, localizar esses fragmentos em sequências aminoacídicas de proteínas com estruturas 3D disponíveis correlatas às proteínas isoladas/identificadas em classe, função e fonte natural. Em seguida, foram escolhidos fragmentos peptídicos da PLA2 (item a) e das proteínas isoladas do veneno ativo (item b) e/ou desenhados análogos que apresentassem características exibidas por AMPs conhecidos. Os peptídeos desenhados foram sintetizados, purificados, caracterizados e testados em suas atividades antimicrobianas. Os modelos estruturais 3D da PLA2 de Bothrops pictus e quatro peptídeos (PLA2-1 a -4) amidados derivados dela foram obtidos, sendo o PLA2-1 ativo frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis (MICs de 6,25-200 &#181;mol.mL-1). Dos três venenos de serpentes peruanas testados, Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti e Bothriopsis oligolepis, os dois últimos inibiram o crescimento de S. aureus (MICs 0,78-50 &#181;mol.mL-1), mas apenas B. oligolepis demonstrou espectro de ação amplo. O seu fracionamento sequencial, acompanhado de ensaios de inibição do crescimento de S. aureus, gerou frações ativas relativamente homogêneas que, tripsinizadas e os fragmentos trípticos sequenciados, continham metalo-peptidases do tipo III, serino-peptidase ou lectinas do tipo C. A verificação de atividade enzimática e de coagulação sanguínea nessas frações confirmaram as naturezas das proteínas isoladas. Dos três peptídeos amidados (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) desenhados a partir de suas estruturas, um deles foi ativo frente às leveduras C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (Bo-Met1; MIC de 6,25 - 200 &#181;mol.mL-1). Pela primeira vez, foi demonstrado que: a) os venenos das serpentes peruanas B. barnetti e B. oligolepis apresentam ação antimicrobiana, sendo o último de espectro amplo; b) que as proteínas acima citadas, que incluem uma serino-peptidase, estão envolvidas com essa propriedade do veneno de B. oligolepis; c) que as sequências aminoacídicas e modelo 3D de uma PLA2 ácida e de proteínas presentes nos venenos das serpentes peruanas B. pictus e Bothriopsis oligolepis podem funcionar como fontes naturais para o desenvolvimento de novos AMPs de ação potente em micro-organismos de interesse clínico e científico. / Resistance to antibiotics obtained by pathogenic microorganisms is a global health problem, so the search for new antimicrobial agents has been encouraged. Knowing that many protein fragments and analogues are bioactive peptides, the aim of this work was to develop new antimicrobial peptides (AMPs) based on the amino acid sequences and 3D structures of proteins apparently involved in the antimicrobial activity of snake venoms very little or not studied so far. The first steps taken were: a) selection of a phospholipase A2 (PLA2) present in the venom from a Peruvian Bothrops sp. belonging to the family Viperidae, whose amino acid sequence was known, to model by homology its 3D structure; b) detection of antimicrobial activity in venoms from other Peruvian Viperidae Bothrops and Bothriopsis snakes, selection of an active venom, fractionation of it for isolation of proteins possibly involved in the antimicrobial activity, trypsinization of the isolated proteins, sequencing of the tryptic fragments for protein identification, location of such fragments in the amino acid sequences and 3D structures of proteins directly related in class, function and natural source to the isolated proteins. Then, peptide fragments from the chosen PLA2 (item a) and from the isolated proteins (item b) that presented structural features found in the known AMPs were selected and/or their analogues were designed. Finally, synthesis, purification and characterization of the peptides with AMP potential, (viii) verification on whether or not they display antimicrobial activity. The 3D-structure models of Bothrops pictus PLA2 and four amidated peptides (PLA2-1 to -4) derived from it were obtained, being PLA2-1 active against Gram negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa as well as the yeasts Candida albicans, Candida krusei and Candida parapsilosis (MICs de 6.25-200 &#181;mol.mL-1). Among the three Peruvian snake venoms tested Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti and Bothriopsis oligolepis, the last two inhibited the growth of S. aureus (MICs 0.78-50 &#181;mol.mL-1) and B. oligolepis presented a wide spectrum of bacterial action. Sequential fractionation followed by S. aureus growth inhibition assays of the main fractions led to active relatively homogeneous ones. Their trypsinization and sequencing of the tryptic fragments indicated that they contained metalloproteinases type III, serine-proteinase or lectins type CTL. Enzymatic activity and blood coagulation assays confirmed the nature of the isolated proteins. From the three amidated peptides (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) derived from them, Bo-Met1 showed to be active against C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (MIC 6,25 - 200 &#181;mol.mL-1). In summary, for the first time, it was demonstrated that: a) the venoms of the Peruvian snakes B. barnetti and B. oligolepis display antimicrobial activity, being the last of wide spectrum of action, b) the proteins isolated from B. oligolepis snake venom, including a serine-peptidase, are involved in the antimicrobial activity of the B. oligolepis snake venom, c) the amino acid sequences and 3D structures of acidic PLA2 and of other proteins found in the venoms of the Peruvian B. pictus e Bothriopsis oligolepis snakes can be used as safe and natural sources for the development of new AMPs potent against microorganisms of clinical and scientific interest.

Malária é uma das principais causas de doença e morte no mundo, principalmente de crianças. É considerada a força de seleção evolucionária mais forte que se conhece na história recente do genoma humano. Além dos fatores ambientais e do próprio parasito, fatores genéticos do hospedeiro têm um papel fundamental tanto na suscetibilidade como na evolução clínica da infecção. O sistema imune inato reconhece os plasmódios através de um número limitado de receptores de reconhecimento padrão (PRRs) e inicia vários mecanismos de defesa que resultam no desenvolvimento de inflamação e resistência do hospedeiro à infecção. Mas, a eliminação completa do parasito requer respostas imunes adaptativas que são amplificadas pela ativação do sistema imune inato. As manifestações clínicas de malária são dependentes dos níveis de citocinas próinflamatórias circulantes produzidas, as quais em níveis altos contribuem para a imunopatologia da doença. O balanço entre respostas pró e antiinflamatórias dirigidas contra o parasito é considerado crítico para a proteção clínica, assim a resposta imune inata pode contribuir tanto para proteção da malária como para modular a resposta imune adaptativa. Neste estudo, nós investigamos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) dos genes de três PRRs: TLR, MBL e CR1 de indivíduos infectados por Plasmodium e residentes em áreas endêmicas de malária no Brasil. Os SNPs TLR1 (I602S), TLR4 (D229G), TLR6 (S249P), TLR9 (T-1237C/ -1486C), MBL [exon 1 nos códons 52, 54, e 57 (MBL2*A ou D, A ou B e A ou C, respectivamente); na região do promotor na posição -221 (*X ou *Y); e na posição +4 da região não traduzida (*P ou *Q)] e CR-1(C5507G) foram determinados por PCR-RFLP. Nós observamos associações entre os polimorfismos TLR1 I602S, TLR6 S249P e da região não traduzida +4 (*Q) e manifestações clínicas de malária e entre os polimorfismos TLR9 T-1486C, TLR T-1237C, MBL*D (códon 52) e do diplótipo de produção insuficiente de MBL (XA+O/O) e parasitemias mais altas. Nenhuma associação foi observada entre o polimorfismo CR-1 C5507G e manifestações clínicas de malária ou com parasitemia. Ao analisarmos juntos os polimorfismos de MBL e TLR, observamos que indivíduos com diplótipo de produção suficiente de MBL (YA/YA+YA/XA+YA/O+XA/XA) TLR1 I602S tinham menos manifestações clínicas de malária e indivíduos com diplótipo de produção suficiente de MBL e não carreadores do alelo TLR9 -1486C tinham parasitemias mais baixas do que os indivíduos com diplótipo de produção insuficiente de MBL e carreadores dos alelos variantes de TLR1 I602S e TLR9 -1486C, respectivamente. Juntos, nossos dados indicam que polimorfismos do promotor de TLR-9 e os diplótipos de produção insuficiente de MBL (XA+O/O) devem de algum modo controlar o nível de parasitemia por plasmódios enquanto a deficiência de TLR1 parece predispor para a presença de manifestações clínicas de malária. Também, podemos sugerir que existe uma cooperação entre TLR1, TLR9 e MBL na ativação da resposta imune inata na malária. Estes achados genéticos devem contribuir para o entendimento da patogênese da malária e levantar uma questão potencialmente interessante que é digna de investigações posteriores em outras populações a fim de validar a contribuição genética destes loci na patogênese da malária / Malaria is one of the major causes of disease and death worldwide, mainly of children. It is also the strongest known force for evolutionary selection in the recent history of the human genome. Besides environmental and parasite factors, host genetic factors play a major role in determining both susceptibility to malaria and the course of infection. Innate immune mechanisms directed against Plasmodium parasites both contribute to protection from malaria and modulate adaptive immune responses. The innate immune system recognizes Plasmodium via a limited number of pattern-recognition receptors (PRRs) and initiates a broad spectrum of defense mechanisms that result in the development of inflammation and host resistance to infection. But, the complete control of the infection requires adaptive immune responses; and the innate immune system is also very efficient in instructing the cellular mediators of adaptive immunity to lead a powerful additional strike force against the parasite. Clinical malaria is characterized by high levels of circulating proinflammatory cytokines, which are thought to contribute to the immunopathology of the disease. The balance between pro- and anti-inflammatory responses toward the parasite is considered critical for clinical protection. The innate immune system initiates and thus sets the threshold of immune responses. In this study, we investigated single nucleotide polymorphisms (SNP) in the genes of three PRRs: TLR, MBL and CR1 in Plasmodium-infected individuals living in endemic areas of Brazil. The SNPs TLR1 (I602S), TLR4 (D229G), TLR6 (S249P), TLR9 (T-1237C/ -1486C), MBL [in the coding sequence of exon 1 at codons 52, 54, and 57 (MBL2*A or D, A or B, and A or C, respectively); in the promoter region at position -221 (*X or *Y); and in the untranslated sequence at position +4 (*P or *Q)] and CR-1(C5507G) were determined by PCR-RFLP. We observed associations of the TLR1 I602S, TLR6 S249P and untranslated sequence at position +4 MBL (*Q) variants with clinical manifestations of malaria and of the TLR9 T-1486C, TLR9 T-1237C, MBL2*D and MBL-insufficient diplotype (XA+O/O) with higher parasitemias. No association was observed to the CR-1 C5507G ) and clinical manifestations of malaria or parasitemia. Also, we observed that individuals with MBLsufficient haplotype (YA/YA+YA/XA+YA/O+XA/XA) and not bearing the allele TLR1 I602S had less clinical manifestations of malaria and individuals with MBL-sufficient haplotype and not bearing TLR9 -1486C had lower parasitemias when compared to individuals with MBL-insufficient diplotype and bearing the variant alleles TLR1 I602S and TLR9 -1486C, respectively. Altogether, our data indicate that TLR-9 promoter and MBL-insufficient haplotype (XA+O/O) polymorphisms to some extent may control the level of Plasmodium parasitemia while TLR1 deficiency seems to predispose to mild malaria. Also, they could suggest cooperation among TLR1, TLR9 and MBL in the immune response against malaria. These genetic findings may contribute to the understanding of the pathogenesis of malaria and raise a potentially interesting issue that is worthy of further investigation in other population in order to validate the genetics contribution of these loci to the pathogenesis of malaria

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_natalia_camacho.pdf: 752258 bytes, checksum: 4db6bde27e4ad1a1adedd5d44779d4aa (MD5) Previous issue date: 2007-06-01 / Lectins are proteins or glicoproteins of non-immune origin with binding specificities for carbohidrates, that interact with glicocomponents present in plant and animal cells, bacteria and viruses. This property makes lectins remarkable markers used in histochemical and biochemical studies, and for characterization and differentiation of cells. Leguminous plants are the major source of lectins, proteins that possess important biological activities, like insecticidal and antiproliferative against cancer cell lines. Thus, the aim of this work was to develop a heterologous expression system for a recombinant lectin from Bauhinia forficata, a leguminous plant popularly known as pata-de-vaca , in E. coli, to study its characteristics and biological activities. The lectin gene bfl was amplified by PCR from genomic DNA, and cloned to expression vectors pQE30 e pET32a(+). Recombinant BFL was expressed in E. coli in insoluble form by using the vector pET32a(+)/bfl. The lectin was purified by Ni +2 -Sepharose affinity chromatography, with a yield of 40 mg.L -1 . The sequence and carbohidrate specificity of rBFL is similar to other related lectins. The rBFL lectin presents in monomer and dimer forms, with aparent molecular mass of 44 and 94 kDa, respectively, shows biological activity in hemagglutination assay in the presence of divalent metal cations (Ca +2 and Mn +2 ) and antiproliferative effect on human cancer cell lines MCF-7 (breast cancer), HT-29 (colon cancer) and HL-60 (leukemia) according as the concentration used. The rBFL lectin showed dose-dependent inhibition in HT-29 cells, stimulatory effect on proliferation of MCF-7 cells in higher concentrations, and no induction of cell death was observed in any cancer cell line. The results obtained in this work, about rBFL lectin, never before isolated or produced in heterologous system, motivates the performance of new characterization assays to elucidate possible applications. / Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não imune com propriedade de ligação especifíca a carboidratos, capazes de interagir com glicocomponentes presentes em células de plantas, animais, bactérias e vírus. Essa propriedade faz das lectinas notáveis marcadores utilizados em estudos histoquímicos, bioquímicos e na caracterização e diferenciação de células. Plantas leguminosas constituem-se na maior fonte de lectinas, que possuem atividades biológicas importantes, como atividade inseticida e antiproliferativa sobre células tumorais. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema de expressão heteróloga para uma lectina de Bauhinia forficata (rBFL), popularmente conhecida como pata-de-vaca , em E. coli, com o intuito de elucidar suas características e atividades biológicas. O gene bfl da lectina foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico, e clonado nos vetores de expressão pQE30 e pET32a(+). A lectina rBFL foi expressa em larga escala pelo vetor pET32a(+)/bfl em E. coli, na forma insolúvel. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em coluna de Ni +2 -Sepharose, com rendimento de 40 mg.L -1 . A seqüência da lectina rBFL e sua especificidade por carboidrato é similar a de lectinas relacionadas. A lectina rBFL apresenta-se na forma de monômeros e dímeros, com massa molecular aparente de 44 e 94 kDa, respectivamente, possui atividade biológica em ensaio de hemaglutinação na presença de cátions divalentes (Ca +2 and Mn +2 ) e demonstra efeito antiproliferativo sobre as linhagens tumorais humanas MCF-7 (câncer de mama), HT-29 (câncer de cólon) e HL-60 (leucêmica), dependendo da concentração utilizada. A rBFL demonstrou efeito inibitório dose-dependente sobre HT-29, e efeito estimulatório sobre a proliferação da linhagem MCF-7 em altas concentrações, não induzindo morte celular em nenhuma das linhagens. Os resultados obtidos neste trabalho acerca da rBFL, nunca antes isolada ou produzida em sistema heterólogo, motivam a realização de novos ensaios de caracterização visando possíveis aplicações.

Cryptococcus sp é um fungo saprófita, cosmopolita, que causa micose sistêmica, geralmente, subaguda ou crônica, conhecida, sobretudo, por sua localização meníngea, após aquisição da infecção por via respiratória Embora seja ubíquo, a criptococose ocorre predominantemente em indivíduos imunodeficientes e podendo ocorrer, também, em indivíduos imunocompetentes. Os estudos experimentais e em humanos avaliando a ativação do sistema complemento e a produção de anticorpos específicos mostram que a resposta inata e de anticorpos são importantes para a delimitação do processo infeccioso por Cryptococcus sp, como também, a administração de anticorpos monoclonais podem induzir uma resposta eficaz na disseminação da doença. O sistema complemento contribui para a defesa do organismo contra o Cryptococcus sp de diferentes maneiras: secretando opsoninas e fatores quimiotáticos e colaborando com a ação dos anticorpos específicos, aumentando a interação entre a imunidade inata e adquirida. Os anticorpos antiglicuroxilomanana (GXM) possuem numerosas atividades biológicas: a) opsonização para fagocitose, b) ativação da via clássica do complemento resultando na deposição precoce de fragmentos de C3 no fungo, c) supressão do excesso de acúmulo de C3 pela via alternativa; d) facilitação do clareamento do GXM do soro in vivo, resultando no maior acúmulo de GXM nos tecidos ricos em células do sistema fagocítico mononuclear; e) proteção em modelos murinos da criptococose e f) facilitação de vários aspectos da imunidade celular ao Cryptococcus sp. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta humoral ao GXM e às proteínas da parede celular (Ag S) avaliando a atividade do sistema complemento como também a produção de anticorpos específicos em amostras séricas de adultos com e sem neurocriptococose. Foram coletadas 106 amostras de soro e divididas em 3 grupos: grupo 1- 21 indivíduos com neurocriptococose e baixa exposição a levedura, grupo 2- foi composto por 23 indivíduos saudáveis com alta exposição ao fungo e HIV negativos, granjeiros da cidade de Jumirim localizada a 164 km de São Paulo, na região de Sorocaba e, o grupo 3- 60 indivíduos saudáveis, HIV negativos e com baixa exposição ao Cryptococcus sp. Dois pacientes foram excluídos do estudo por apresentarem tumores (timona e câncer de pulmão). O sistema complemento foi avaliado por ensaio hemolítico (CH 50 e AP 50) e, a dosagem da proteína ligadora de manose (MBL) foi feita por ELISA. Os valores de CH 50 estiveram dentro da normalidade em 17/21, 13/23, 59/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. A média dos valores de CH 50 foi diferente significativamente entre o três grupos (P < 0,0001). O grupo 2 mostrou níveis reduzidos significantes em comparação aos dois outros grupos. Os valores de AP 50 estiveram dentro da normalidade em 11/21; 21/23 e 60/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. Houve diferença nos valores de AP 50 (P = 0,0005) e apenas um paciente do grupo 1 apresentou valores indetectáveis desta via. Houve diferença significante na dosagem de MBL entre os três grupos (P = 0,0277). Anticorpos IgG anti-GXM foram quantificados por ELISA e expressos por densidade óptica (DO). IgG anti GXM foi detectado em todos os grupos com diferença significante entre eles (P= 0,0127). As médias de IgG anti- GXM (DO) foram: 1.191 (0,49 a 1.217) no grupo 1, 1.572 (0,815 a 2.479) no grupo 2 e 0,965 (0,321 a 1.295) no grupo 3. Dois indivíduos assintomáticos do grupo 2 tiveram títulos de GXM detectáveis (1/256 e 1/32). Quatro pacientes com neurocriptococose faleceram (19%) e seus resultados mostravam: CH 50 normal, 2/4 tinham valores de AP 50 baixo (12 UI/mL) e indetectável; 3/4 tinham altos níveis de MBL e apenas um tinha baixa DO de IgG anti-GXM. Baseado em nosso estudo, podemos concluir que a resposta humoral (sistema complemento e anticorpos) não é suficiente para explicar a susceptibilidade a neurocriptococose, porém a alta e constante exposição ao Cryptococcus sp pode prevenir o desenvolvimento de doença, ou seja, a constante e intensa exposição ao fungo induz a produção de anticorpos que previnem a doença clínica mas não a infecção. Por outro lado fatores genéticos que determinam as concentrações de MBL podem influenciar na susceptibilidade a neurocriptococose. Os anticorpos contribuem para o clearence de GXM, entretanto as concentrações séricas não se correlacionam com resistência à doença / Cryptococcus sp is a fungal pathogen with a worldwide distribution. Although it is ubiquitous in the environment, cryptococcal disease occurs predominantly in immunocompromised hosts and can also occur in apparently immunocompetent individuals. The innate immunity is of special relevance for the antifungal reaction, as it allows an immediate reaction and recognizes a broad variety of fungal pathogens. The host immune response is a major determinant of the outcome of cryptococcal infection; however, the antibodies response is poorly understood. In addition, most of the studies are experimental and there is restricted knowledge concerning the human immune response. Complement system has soluble factors, restrictive regulator proteins and cellular receptors involved in defense mechanism. Glucuroxylomannan (GXM) monoclonal antibodies (MAbs) have numerous biological activities: a) opsonization for phagocytosis, b) activation of the classical complement pathway leading to early deposition of C3 fragments on the yeast, c) suppression overall accumulation of C3 via the alternative pathway; d) clearance facilitation of GXM from serum in vivo, leading to increased accumulation of GXM in tissues rich in mononuclear phagocyte system; e) protection in murine models of cryptococcosis and f) facilitation of various aspects of cellular immunity to Cryptococcus sp. The goal of our study was to evaluate if the antibody response to GXM and cell wall proteins regarding specific antibodies as well as complement system in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. The aim of our research was to evaluate classical and alternative complement system pathway, to quantify mannose-binding lectin (MBL) as well antibody response to GXM and cell wall proteins (AgS) regarding specific antibodies in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. One hundred and six samples were collected and classified in 3 groups: group 1- 21 individuals with neurocryptococcosis and low exposure to the yeast; group 2- was composed by 23 healthy individuals, chicken farmings from Jurumirim, a town 164 km to São Paulo, and with high exposure to Cryptoccocus spp and HIV negative. The third group included 60 healthy HIV negative individuals with presumed low exposure to Cryptococcus. Two patients were excluded by report of previous malignancies (timoma and pulmonary cancer). The complement system was evaluated by hemolytic assay and ELISA to MBL. CH 50 and AP 50 values were within the normal range in 17/21; 13/23; 59/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. Mean CH 50 values were significantly different among the three groups (P < 0,0001). Group 2 showed significantly reduced levels in comparison with groups 1 and 3. AP 50 values were within the normal range in 11/21; 21/23; 60/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. There was difference in the AP 50 values (P=0,0005) and one no activation of this pathway in group 1. There was significant difference in MBL among the groups (P = 0,0277). GXM antibodies IgG was measured by ELISA and expressed as optical density (OD). GXM- IgG was detected in all the groups with significant difference among them (P = 0,0127). The means of IgG anti-GXM (OD) were: 1.191 (range 0,49 to 1.217) in group 1, 1.572 (range 0,815 to 2.479) in group 2 and 0,965 (range 0,321 to 1.295) in the group 3. Two of the group 2 individuals had low GXM titers (1/256 and 1/32) and no symptoms. Four patients (4/21; 19%) with neurocryptococcosis died and the results showed: normal classical pathway activation, 2/4 had low (12 UI/mL) or undetectable alternative pathway values ; 3/4 had high MBL concentrations and only one had low OD for IgG anti-GXM. In conclusion, our results suggest that constant and high exposure to Cryptococcus sp can prevent the development of cryptococcosis, i.e. constant and intensive fungal exposition induces protective antibodies to clinical disease but not to the infection. In the other side, genetic factors which determine MBL concentrations could influence the susceptibility to neurocryptococcosis. The antibodies contribute to GXM clearance, however, the concentrations did not correlate with the resistance to the disease

Cryptococcus sp é um fungo saprófita, cosmopolita, que causa micose sistêmica, geralmente, subaguda ou crônica, conhecida, sobretudo, por sua localização meníngea, após aquisição da infecção por via respiratória Embora seja ubíquo, a criptococose ocorre predominantemente em indivíduos imunodeficientes e podendo ocorrer, também, em indivíduos imunocompetentes. Os estudos experimentais e em humanos avaliando a ativação do sistema complemento e a produção de anticorpos específicos mostram que a resposta inata e de anticorpos são importantes para a delimitação do processo infeccioso por Cryptococcus sp, como também, a administração de anticorpos monoclonais podem induzir uma resposta eficaz na disseminação da doença. O sistema complemento contribui para a defesa do organismo contra o Cryptococcus sp de diferentes maneiras: secretando opsoninas e fatores quimiotáticos e colaborando com a ação dos anticorpos específicos, aumentando a interação entre a imunidade inata e adquirida. Os anticorpos antiglicuroxilomanana (GXM) possuem numerosas atividades biológicas: a) opsonização para fagocitose, b) ativação da via clássica do complemento resultando na deposição precoce de fragmentos de C3 no fungo, c) supressão do excesso de acúmulo de C3 pela via alternativa; d) facilitação do clareamento do GXM do soro in vivo, resultando no maior acúmulo de GXM nos tecidos ricos em células do sistema fagocítico mononuclear; e) proteção em modelos murinos da criptococose e f) facilitação de vários aspectos da imunidade celular ao Cryptococcus sp. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta humoral ao GXM e às proteínas da parede celular (Ag S) avaliando a atividade do sistema complemento como também a produção de anticorpos específicos em amostras séricas de adultos com e sem neurocriptococose. Foram coletadas 106 amostras de soro e divididas em 3 grupos: grupo 1- 21 indivíduos com neurocriptococose e baixa exposição a levedura, grupo 2- foi composto por 23 indivíduos saudáveis com alta exposição ao fungo e HIV negativos, granjeiros da cidade de Jumirim localizada a 164 km de São Paulo, na região de Sorocaba e, o grupo 3- 60 indivíduos saudáveis, HIV negativos e com baixa exposição ao Cryptococcus sp. Dois pacientes foram excluídos do estudo por apresentarem tumores (timona e câncer de pulmão). O sistema complemento foi avaliado por ensaio hemolítico (CH 50 e AP 50) e, a dosagem da proteína ligadora de manose (MBL) foi feita por ELISA. Os valores de CH 50 estiveram dentro da normalidade em 17/21, 13/23, 59/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. A média dos valores de CH 50 foi diferente significativamente entre o três grupos (P < 0,0001). O grupo 2 mostrou níveis reduzidos significantes em comparação aos dois outros grupos. Os valores de AP 50 estiveram dentro da normalidade em 11/21; 21/23 e 60/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. Houve diferença nos valores de AP 50 (P = 0,0005) e apenas um paciente do grupo 1 apresentou valores indetectáveis desta via. Houve diferença significante na dosagem de MBL entre os três grupos (P = 0,0277). Anticorpos IgG anti-GXM foram quantificados por ELISA e expressos por densidade óptica (DO). IgG anti GXM foi detectado em todos os grupos com diferença significante entre eles (P= 0,0127). As médias de IgG anti- GXM (DO) foram: 1.191 (0,49 a 1.217) no grupo 1, 1.572 (0,815 a 2.479) no grupo 2 e 0,965 (0,321 a 1.295) no grupo 3. Dois indivíduos assintomáticos do grupo 2 tiveram títulos de GXM detectáveis (1/256 e 1/32). Quatro pacientes com neurocriptococose faleceram (19%) e seus resultados mostravam: CH 50 normal, 2/4 tinham valores de AP 50 baixo (12 UI/mL) e indetectável; 3/4 tinham altos níveis de MBL e apenas um tinha baixa DO de IgG anti-GXM. Baseado em nosso estudo, podemos concluir que a resposta humoral (sistema complemento e anticorpos) não é suficiente para explicar a susceptibilidade a neurocriptococose, porém a alta e constante exposição ao Cryptococcus sp pode prevenir o desenvolvimento de doença, ou seja, a constante e intensa exposição ao fungo induz a produção de anticorpos que previnem a doença clínica mas não a infecção. Por outro lado fatores genéticos que determinam as concentrações de MBL podem influenciar na susceptibilidade a neurocriptococose. Os anticorpos contribuem para o clearence de GXM, entretanto as concentrações séricas não se correlacionam com resistência à doença / Cryptococcus sp is a fungal pathogen with a worldwide distribution. Although it is ubiquitous in the environment, cryptococcal disease occurs predominantly in immunocompromised hosts and can also occur in apparently immunocompetent individuals. The innate immunity is of special relevance for the antifungal reaction, as it allows an immediate reaction and recognizes a broad variety of fungal pathogens. The host immune response is a major determinant of the outcome of cryptococcal infection; however, the antibodies response is poorly understood. In addition, most of the studies are experimental and there is restricted knowledge concerning the human immune response. Complement system has soluble factors, restrictive regulator proteins and cellular receptors involved in defense mechanism. Glucuroxylomannan (GXM) monoclonal antibodies (MAbs) have numerous biological activities: a) opsonization for phagocytosis, b) activation of the classical complement pathway leading to early deposition of C3 fragments on the yeast, c) suppression overall accumulation of C3 via the alternative pathway; d) clearance facilitation of GXM from serum in vivo, leading to increased accumulation of GXM in tissues rich in mononuclear phagocyte system; e) protection in murine models of cryptococcosis and f) facilitation of various aspects of cellular immunity to Cryptococcus sp. The goal of our study was to evaluate if the antibody response to GXM and cell wall proteins regarding specific antibodies as well as complement system in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. The aim of our research was to evaluate classical and alternative complement system pathway, to quantify mannose-binding lectin (MBL) as well antibody response to GXM and cell wall proteins (AgS) regarding specific antibodies in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. One hundred and six samples were collected and classified in 3 groups: group 1- 21 individuals with neurocryptococcosis and low exposure to the yeast; group 2- was composed by 23 healthy individuals, chicken farmings from Jurumirim, a town 164 km to São Paulo, and with high exposure to Cryptoccocus spp and HIV negative. The third group included 60 healthy HIV negative individuals with presumed low exposure to Cryptococcus. Two patients were excluded by report of previous malignancies (timoma and pulmonary cancer). The complement system was evaluated by hemolytic assay and ELISA to MBL. CH 50 and AP 50 values were within the normal range in 17/21; 13/23; 59/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. Mean CH 50 values were significantly different among the three groups (P < 0,0001). Group 2 showed significantly reduced levels in comparison with groups 1 and 3. AP 50 values were within the normal range in 11/21; 21/23; 60/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. There was difference in the AP 50 values (P=0,0005) and one no activation of this pathway in group 1. There was significant difference in MBL among the groups (P = 0,0277). GXM antibodies IgG was measured by ELISA and expressed as optical density (OD). GXM- IgG was detected in all the groups with significant difference among them (P = 0,0127). The means of IgG anti-GXM (OD) were: 1.191 (range 0,49 to 1.217) in group 1, 1.572 (range 0,815 to 2.479) in group 2 and 0,965 (range 0,321 to 1.295) in the group 3. Two of the group 2 individuals had low GXM titers (1/256 and 1/32) and no symptoms. Four patients (4/21; 19%) with neurocryptococcosis died and the results showed: normal classical pathway activation, 2/4 had low (12 UI/mL) or undetectable alternative pathway values ; 3/4 had high MBL concentrations and only one had low OD for IgG anti-GXM. In conclusion, our results suggest that constant and high exposure to Cryptococcus sp can prevent the development of cryptococcosis, i.e. constant and intensive fungal exposition induces protective antibodies to clinical disease but not to the infection. In the other side, genetic factors which determine MBL concentrations could influence the susceptibility to neurocryptococcosis. The antibodies contribute to GXM clearance, however, the concentrations did not correlate with the resistance to the disease

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