Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Les β-lactamases sont le principal mécanisme bactérien de défense contre les β-lactamines. Elles catalysent l’inactivation de ces antibiotique par le clivage de leur noyau β-lactame. Les β-lactamases les plus communes sont celles de la classe A, qui rassemble une grande variété d’enzymes aux spécificités de substrat variées. Ces protéines ont été l’objet de nombreuses recherches expérimentales et théoriques. Plusieurs études de dynamique par spectroscopie RMN ont été réalisées dans notre laboratoire sur les enzymes modèles TEM-1 et PSE-4. Le présent projet continue l’investigation de ces deux β-lactamases par des méthodes théoriques. Un protocole de simulation de DM a été établi et validé par comparaison avec des données de relaxation RMN. Une nouvelle technique d’analyse conjointe DM/RMN a également été développée, permettant de limiter les problèmes de sous et sur-ajustement présents dans l’analyse « model-free ». Pour comparer la dynamique des β-lactamases de classe A en présence et en absence de leur substrat, un potentiel pour les β-lactamines a été développé, en tenant compte de la géométrie et du potentiel chimique particuliers du noyau β-lactame. Ce champ de forces est transférable, permettant la construction d’une variété d’antibiotiques. Nos simulations, couplées aux précédentes études par RMN, démontrent qu’il existe une dualité dynamique dans les β-lactamases de classe A : elles sont hautement structurées à l’échelle ps-ns, mais aussi le siège de mouvements lents (µs-ms) aux abords du site actif et particulièrement dans la boucle qui borde le site catalytique. La rigidité ps-ns favorise un positionnement optimal des résidus du site actif pour une catalyse efficace, et permet la tolérance de mutations potentiellement déstabilisantes. Les mouvements à l’échelle µs-ms les plus intéressants sont localisés dans la boucle Ω et confirment son rôle régulatoire : elle permet l’ouverture du site actif pour l’entrée du substrat et le largage du produit. La liaison du substrat a des effets à longue portée rigidifiant TEM-1. On observe également un mouvement accru de la boucle Ω dans TEM-1 et PSE-4. Les interactions spécifiques menant à cette plus grande flexibilité varient toutefois d’une enzyme à l’autre : il y conservation des propriétés dynamiques. / β-Lactamases are the main bacterial mechanism of resistance against β-lactams. They inactivate these antibiotics by cleaving their β-lactam ring. Class A enzymes are the most prevalent, with a broad variety of substrate specificities. These proteins were studied by numerous experimental and theoretical studies. NMR spectroscopy measurements were performed in our laboratory on model enzymes TEM-1 and PSE-4. This project continues the investigation of the dynamic properties of these two β- lactamases using theoretical methods. An MD simulation protocol was established and validated using NMR relaxation data. A new joint MD/NMR analysis technique was developped, allowing a reduction of under- and over-fitting problems in model-free analysis. To compare class A β-lactamase dynamics in presence and absence of substrate, a potential was developped to describe β-lactams, taking into account the particular geometry and chemical potential of the β-lactam cycle. This force field is transferable, allowing the construction of a variety of antibiotics. Our simulations, along with past NMR studies, prove the existence of a dynamical duality in class A β-lactamases : they are highly structured on the ps-ns timescale, but also subjected to slow motions (µs-ms) in the vicinity of the active site, particularly in the Ω loop that borders the catalytic site. Ps-ns rigidity favors an optimal positioning of active site residues for an efficient catalysis, and allows the protein to tolerate potentially destabilizing mutations. The most interesting µs-ms motions are located in the Ω loop, confirming its regulatory role : it opens the active site for substrate entry and product release. Substrate binding has structuring long-range effects on TEM-1. Increased loop motions are also observed in both TEM-1 and PSE-4. However, specific interactions responsible for this higher flexibility vary between the two enzymes : protein dynamics properties are conserved.

Ce travail concerne la synthèse de courts glycopeptides pouvant adopter une structuration secondaire définie. Les chaînes b-peptidiques peuvent se structurer sur de courtes séquences oligomèriques. C’est pourquoi les b-peptides ont été choisis pour réaliser ce travail, de plus ils sont résistants aux peptidases et aux protéases. Nous nous sommes intéressés à la préparation de ce type d’oligomères artificiels modifiés en les liants à des unités sucres. Nous souhaitons étudier l’influence de la glycosylation de chaînes b-peptidiques, et déterminer si la structuration est conservée lorsque la chaîne est « décorée » par des résidus sucres. Dans ce contexte, nous avons présentés l’homo-oligomérisation de glyco-amino acide artificiel formant une nouvelle classe de carbopeptoïdes. Une analyse conformationnelle par modélisation moléculaire et par des techniques spectroscopiques (RMN, DC, IR) a été menée sur cette première classe d’oligomères. Un second aspect de notre travail à consisté à synthétiser des C-glycosyl-b3-amino acides et des O-glycosyl-b3-amino acides. Ces monomères sont, en effet, des unités centrales dans la formation de glycosyl-b-peptides. Finalement ; nous nous sommes intéressés à la synthèse d’une nouvelle classe d’analogues de glyco-b-amino acide appelée les Na-(C-glycosyl)-hydrazino acides. / The objective of this work was the design and synthesis of short glycopeptides that can fold into well defined and typical secondary structures. b-Peptides frameworks are capable of forming structurally well-defined and predictable structures on short sequences and were therefore chosen for our purpose. In addition, b-peptide backbones are resistant to peptidases and proteases. We were interested in preparing such artificial oligomers modified, like a vaste majority of proteins, by linkage to carbohydrates. The study of carbohydrate-functionalized b-peptides is expected to bring important information concerning the structural stability of such glycoconjugates. In this context, we have presented the homo-oligomerisation of the unnatural glyco-amino acid into a new class of carbopeptoïds. The conformational preference of this first class of oligomers has been assessed by spectroscopic techniques (NMR, IR, CD) and calculations. Another part of this work concerned the synthesis of C-glycosyl-b3-amino acids and O-glycosyl-b3-amino acids as building blocks in the construction of glyco-b-peptides. Finally, we were interested in the synthesis of a new class of glyco-b-amino acids analogues, which are called Na-(C-glycosyl)-hydrazino acids.

Une étude génomique réalisée dans notre laboratoire a identifié le facteur de transcription ST18 comme étant potentiellement un régulateur transcriptionnel important de la cellule pancréatique bêta. Nous avons donc voulu découvrir son rôle, selon l'hypothèse que ST18 pourrait servir de commutateur transcriptionnel liant la masse et la fonction de la cellule bêta à son statut nutritionnel. Nos résultats indiquent tout d'abord qu'au niveau du pancréas, l'expression de ST18 est restreinte au tissu endocrine. De plus, l'expression et l'activité de liaison à l'ADN de ST18 sont augmentées in vitro en présence de traitements délétères, tels que le palmitate et les cytokines. Aussi, notre étude démontre que ST18 induit l'apoptose de la cellule bêta, en plus de réduire la replication cellulaire ainsi que la sécrétion d'insuline. Somme toute, nos résultats identifient et caractérisent ST18 comme un régulateur négatif de la fonction et de la masse de cellules bêta.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Le TGFB(bêta) est un facteur clé dans l'homéostasie du réseau vasculaire. Le laboratoire a découvert que le TGFB(bêta) induit des podosomes dans les cellules endothéliales (CE) artérielles in vitro. Ces microdomaines riches en F-actine, sont capables de dégrader localement la matrice extracellulaire. Nous avons mis en évidence des structures de même type dans l’endothélium natif, démontrant la pertinence des observations in vitro. Les CE expriment 2 récepteurs de type I au TGFB(bêta), ALK5 et ALK1, dont les fonctions respectives sur les CE font l’objet de controverses. Nous montrons in vitro, que l’assemblage des podosomes est dépendant de ALK1 et est induit dans un contexte d'activation de la CE. La fibronectine, présente dans la matrice lors de situations d'activation de la CE, est régulée par TGFB(bêta) /ALK1 dans notre modèle et est essentielle à la formation des podosomes. L'ensemble des données obtenues laisse présager un rôle des podosomes endothéliaux dans le remodelage artériel en réponse au TGFB(bêta). / TGFB(beta), a pleiotrop cytokine, acts as an important regulator for the maintenance of vascular homeostasis. Our team has discovered, for the first time, that TGFB(beta) induces podosomes formation in aortic endothelial cells (EC) in vitro. Podosomes are highly dynamic adhesion microdomains formed at the ventral membrane, consisting of a core of F-actin and actin-associated proteins, surrounded by a ring structure which in turn is consisting of plaque proteins as well as signaling proteins. In addition to the presence of specific markers, they are distinguished from other adhesion structures by the presence of metalloproteases, endowing them with the ability to degrade the extracellular matrix locally. We have bringing to light these structures in the endothelium of native arterial vessel exposed to biologically active TGFB(beta), showing relevance of these structures. Endothelial cells express two types I receptors of TGFB(beta), ALK5 and ALK1, which relative function on EC are controversial. We show in our model in vitro, that podosomes formation is ALK1-dependent and are induced when EC are in an active background. Fibronectin, an extracellular matrix component which is present during active situation, is regulated by TGFB(beta)/ALK1 signaling pathway and is essential for podosomes formation. This work open up new avenues to study the role of podosomes in vascular pathophysiology. We propose that podosomes are involved in arterial vessel remodeling.

Les intéines sont des éléments protéiques qui sont excisés d'une séquence polypeptidique par un processus autocatalytique appelé épissage. Les intéines monomériques ou dimériques effectuent respectivement des réactions d'épissage intra- et intermoléculaires. L'objectif du travail est de mettre au point une technique pour la création de banques de mutants de grandes tailles en combinant deux banques de fragments protéiques. La protéine monomérique est restaurée par épissage d'une intéine dimérique. Comme les déterminants qui permettent l'épissage des intéines ne sont pas encore bien connus, il a été décidé d'étudier l'épissage d'une intéine introduite dans la bêta-lactamase. Des collections de mutants ont été construites et caractérisées par sélection in vivo. Parmi les clones sélectionnés tolérant l'insertion de l'intéine, mais incapables d'épisser, un grand nombre présentent, à la jonction N-terminale, deux cystéines de part et d'autre de la liaison peptidique à cliver. L'hypothèse est que la liaison entre les deux cystéines se trouve dans une conformation non coplanaire permettant ainsi la formation d'un pont disulfure entre ces deux résidus. Cette conformation est probablement imposée par l'intéine de manière à déstabiliser la liaison peptidique et à favoriser ainsi son clivage dans le mécanisme d'épissage. D'autre part, les mutants capables d'épisser possèdent tous une glycine du côté N-terminal de l'intéine et une sérine du côté C-terminal de l'intéine. Ces deux acides aminés sont donc les seuls requis pour permettre un épissage efficace. Afin de déterminer si l'épissage intermoléculaire est possible, une des enzymes sélectionnées a été fragmentée au niveau de l'intéine. Bien qu'aucun produit d'épissage n'ait été détecté par Western Blot, une faible activité bêta-lactamase in vivo permet de supposer que l'épissage a eu lieu.

L’Anémie de Fanconi est une pathologie génétique rare qui se caractérise par une anémie aplasique, des malformations congénitales de sévérité variable et un risque accrue au développement de cancers. En particulier, les patients atteints d’Anémie de Fanconi développent des carcinomes squameux de la tête et du coup. La protéine FANCC est l’une des 21 protéines Fanconi connues à ce jour. Il a déjà été montré que FANCC possède de nombreux rôles en dehors de celui de la réparation de l’ADN. Ici, nous nous sommes intéressés au rôle de FANCC dans la régulation de la voie Wnt/β-caténine. Cette voie de signalisation est souvent dérégulée dans les cancers. Nous avons pu montrer que des formes mutantes de FANCC régulent la quantité de β-caténine libre via son interaction avec le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine. En effet, en interagissant avec l’une des protéines du complexe, la protéine APC, les formes mutantes de FANCC permettent d’augmenter la quantité de cette protéine, ainsi que de la protéine d’assemblage du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine, Axin-1. On observe ainsi une diminution importante de la quantité de β-caténine libre, ainsi que de β-caténine au noyau, entrainant une perte d’activation des cibles transcriptionnelles de la β-caténine. Parmi ces cibles, l’oncogène c-Myc, codant pour un facteur de transcription connu pour réprimer la transcription de DKK1. Or, il a été montré que le niveau d’expression de DKK1 est plus élevé dans les cellules mutantes pur FANCC. Nous avons, effectivement, pu confirmer que l’expression de DKK1 est inverse de celle de la protéine c-Myc dans les fibroblastes de peau dérivés de patients Fanconi. De manière intéressante, si l’expression de la protéine c-Myc est diminué dans les fibroblastes mutants pour FANCC, en comparaison aux fibroblastes exprimant un FANCC sauvage, nous n’avons pas observé de variation dans l’expression de c-Myc dans des cellules de carcinomes squameux dérivées de patient mutant pour FANCC et complémentées en FANCC. Ainsi, la surexpression des protéines Axin-1 et APC dans les cellules mutantes pour FANCC induit un défaut d’accumulation de la β-caténine dans ces cellules, conduisant à une perte d’activation des cibles transcriptionnelles de cette protéine. De plus, la réexpression de la protéine c-Myc dans les cellules de carcinomes squameux dérivées de patient, mutées pour FANCC, permet d’envisager de nouvelles cibles thérapeutiques, comme la protéine CT120. Cette dernière est une protéine membranaire, régulée par c-Myc qui est impliquée dans 2 voies de signalisation fréquemment dérégulées dans des cancers, et en particulier dans les carcinomes squameux de la tête et du coup. Ce type de cancers est particulièrement problématique à la fois chez les patients Fanconi, mais également dans la population générale. En effet, les carcinomes squameux de la tête et du coup représentent la 5ième cause de mortalité causée par le cancer dans le monde. / Fanconi Anemia (FA) is a rare genetic disorder characterized by bone marrow failure, physicals abnormalities and a high risk of cancers. Specifically, the FA patients develop head and neck squamous cell carcinoma. The FANCC protein is one of the 21 FA proteins. It was already shown that FANCC have numerous functions in addition of the DNA repair. We investigate about the role of FANCC in the Wnt/β-catenin regulation. The signaling pathway is known for its involvement in carcinogenesis. We show that mutants of FANCC regulate the free β-catenin level, interacting with APC, a protein of the β-catenin degradation/neutralization complex. Indeed, this interaction leads to an increasing of the levels of APC and Axin-1, the scaffold protein of the β-catenin degradation/neutralization complex. The decreasing of free β-catenin leads to the loss of the transcriptional activation of the β-catenin targets, including c-Myc. The protein coded by c-Myc is a transcriptional factor known for repressing DKK1 expression. It was previously shown that there is an increase expression of DKK1 in FA mutant cells. And we show that the expression of DKK1 is opposite of the expression of c-Myc in FA patient derived fibroblasts. Interestingly, the expression of c-Myc is decreased in FANCC mutant patient derived fibroblasts, compare to the complemented cells, but there is no difference in the c-Myc level between patient derived squamous cell carcinoma cells mutant for FANCC and complemented cells. We hypothesize that the increased levels of APC and Axin-1, leading the decreased level of activated β-catenin and the loss of the transcriptional activation of the β-catenin targets in FANCC mutant cells is a protecting mechanism against the cells transformation. Furthermore, this expression of c-Myc in patient derived squamous cell carcinoma cells, open to new therapeutic targets, as CT120. This protein is a membranous protein, regulate by c-Myc, involved in 2 signalization pathways deregulated in cancers, including head and neck squamous cell carcinoma. This kind of cancer is a health care issue; indeed, this cancer is the 5th death cause related to cancer in the general population.