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The aim of this thesis is the characterization of a protein involved in apoptosis. Our group has identified an early step common to different forms of intrinsic apoptosis stimuli. This step requires de novo synthesis of a novel Cyclin, Cyclin O, that upon apoptosis induction in lymphoid cells forms active complexes, primarily with Cdk2. Cyclin O expression precedes glucocorticoid and gamma radiation-induced apoptosis in vivo in mouse thymus and its overexpression induces apoptosis in cultured cells. Knocking down the endogenous expression of Cyclin O by shRNA leads to the inhibition of glucocorticoid and DNA damage-induced apoptosis while leaving CD95 death receptor mediated apoptosis intact. This data demonstrates that apoptosis induction in lymphoid cells is one of the physiological roles of Cyclin O and it does not act by perturbing a normal cellular process such as the cell cycle. In addition we have identified c-Myb a substrate of Cdk2-Cyclin O complexes and we show that c-Myb is downregulated during apoptosis of lymphoid cells. / L'objectiu d'aquesta tesi és la caracterització d'una proteïna involucrada en l'apoptosi. El nostre grup ha identificat un pas primerenc comú en diversos estímuls apoptòtics de la ruta intrínseca. Aquest pas requereix la síntesi de novo d'una nova Ciclina, Ciclina O, que quan s'indueix apoptosi en cèl·lules limfoides forma complexes actius majoritàriament amb Cdk2. L'expressió de la Ciclina O és prèvia a l'apoptosi induïda per glucocorticoids i radiació gamma i la seva sobreexpressió indueix apoptosi en cultius cel·lulars. La baixada dels nivells d'expressió de la Ciclina O endògena amb shRNA provoca una inhibició de l'apoptosi induïda per glucocorticoids o agents que danyen el DNA, mentre que l'apoptosi mediada pel receptor CD95 es manté intacta. Aquests resultats demostren que la inducció d'apoptosi en cèl·lules limfoides és una de les funcions fisiològiques de la Ciclina O i que no es deu a una pertorbació de processos cel·lulars normals com ara el cicle cel·lular. A més a més, hem identificat c-Myb com a substrat dels complexes Cdk2-Ciclina O i demostrem que els nivells de c-Myb baixen durant l'apoptosis de cèl·lules limfoides.

Une mémoire émotionnelle normale se base sur la sélection de stimuli prédictifs d’un événement important pour l’individu. Cependant, ce processus de sélection peut être compromis en situation de forte intensité émotionnelle. En particulier, la sélection d’un élément saillant non nécessairement prédictif, associée à une amnésie de type déclaratif pour les éléments contextuels, caractérise les altérations mnésiques de l’état de stress post-traumatique (ESPT). Les données de la littérature suggèrent que l’action de glucocorticoïdes dans l’hippocampe serait l’une des causes possibles du développement de troubles mnésiques de type ESPT. Nos travaux ont porté sur les conditions dans lesquelles les glucocorticoïdes dans l’hippocampe peuvent altérer les fonctions mnésiques chez la souris.En utilisant des procédures de conditionnement classique aversif, nous montrons que l’injection post-apprentissage de corticostérone dans l’hippocampe dorsal, en situation de forte intensité émotionnelle, conduit (1) à une sélection incorrecte du stimulus saillant non prédictif du choc électrique au détriment des éléments contextuels (2) et à des dysfonctionnements d’activité neuronale au sein du circuit hippocampo-amygdalien (expression de c-Fos). De façon intéressante, par une action sur le même type de récepteurs (aux glucocorticoïdes, GR), l’injection de corticostérone dans l’hippocampe ventral conduit également à un processus incorrect de sélection du stimulus prédictif mais en faveur des éléments contextuels. Enfin, un apprentissage en labyrinthe radiaire révèle que l’injection de corticostérone dans l’hippocampe dorsal altère spécifiquement la mémoire relationnelle, analogue de la mémoire déclarative humaine, uniquement chez les animaux ayant été au préalable exposés à un stress.L’ensemble de nos données révèlent qu’un excès de glucocorticoïdes dans l’hippocampe contribue (1) à des déficits de mémoires émotionnelle et relationnelle, (2) à la sélection inadaptée de stimuli non prédictifs d’un événement aversif (3) reposant sur des dysfonctionnements du circuit hippocampo-amygdalien, le tout, correspondant à des altérations mnésiques de type ESPT. / Normal emotional memory is based on the selection of cues predicting threatening events. However, exposure to extreme threatening situation can compromise the selection of the correct cues. In particular, selection of a salient not necessarily predictive cue, associated with declarative amnesia for peritraumatic contextual cues, characterizes the memory disturbances of posttraumatic stress disorder (PTSD). Accumulating evidence suggest that action of glucocorticoids into the hippocampus could be a potential mechanism for PTSD-related memory disturbances. Hence, we studied the conditions for which glucocorticoids into the hippocampus can alter memory functions in mice.Using Pavlovian fear conditioning, we showed that post-training infusion of glucocorticoids in the dorsal hippocampus, in stressful situation, resulted in (1) selection of a salient non predictive cue instead of contextual cues and in (2) dysfunctions of neural activity of the hippocampal-amygdalar circuit (c-Fos expression). Interestingly, via action on the same receptor subtype (glucocorticoid receptors, GR), infusion of glucocorticoids in the ventral hippocampus also resulted in incorrect selection of predictive cue but in favor of contextual cues. Finally, using radial-maze task, we showed that infusion of glucocorticoids in the dorsal hippocampus specifically impaired relational declarative-like memory, only in mice previously exposed to stress.Altogether, our findings reveal that excess glucocorticoids in the hippocampus contributes to (1) deficits in emotional and relational memories, (2) incorrect selection of predictive cues (3) based to dysfunctions of the hippocampal-amygdalar circuit, all, corresponding to PTSD-related memory disturbances.

L’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien joue un rôle essentiel dans l’adaptation et la réponse au stress. Toutefois, l’hyperactivation de cet axe ou des niveaux chroniquement élevés de glucocorticoïdes (GC) entraînent des conséquences pathologiques. Le système dopaminergique mésocortical, qui se projette dans le cortex préfrontal médian (CPFm), joue un rôle adaptatif en protégeant contre le stress. Jusqu’à présent, les interactions fonctionnelles entre les GC (ex : corticostérone) et le système dopaminergique mésocortical ne sont pas élucidées. Dans ce mémoire, nous avons évalué les effets des GC sur les fonctions dopaminergiques préfrontales en élevant chroniquement, à l’aide de minipompes osmotiques, les niveaux de corticostérone aux concentrations physiologiques maximales (1 mg/kg/h pendant 7 jours). Ce traitement n’a pas modifié significativement, chez les rats stressés ou non, les niveaux post mortem de dopamine et de son métabolite dans le tissu du CPFm. Toutefois, l’évaluation par voltamétrie in vivo des changements de dopamine extracellulaire dans le CPFmv a permis d’observer que la corticostérone augmente significativement la libération de dopamine en réponse à l’exposition à l’odeur de renard et au pincement de la queue. Nos études nous permettent de conclure que la corticostérone potentialise la fonction dopaminergique mésocorticale qui, à son tour, facilite la régulation négative en période de stress. / The hypothalamic-pituitary-adrenal axis plays an essential role in responding and adapting to stress, however overactivation of this axis or chronically high levels of glucocorticoids lead to pathological outcomes. The mesocortical dopamine (DA) system, terminating in the medial prefrontal cortex (mPFC), plays an adaptive role in protecting against stress, yet the functional interactions between glucocorticoids (eg. corticosterone) and the mesocortical DA system are not clear. In the present studies, we investigated the effects of glucocorticoids on prefrontal DA function using osmotic minipumps to chronically elevate corticosterone levels in the high physiological range (1 mg/kg/hr for 7 days). Chronic corticosterone treatment did not significantly affect post mortem levels of DA and its metabolites in PFC tissue in either unstressed or stressed rats. However, using in vivo voltammetry to monitor changes in extracellular DA release in PFC, corticosterone significantly increased DA release in response to both types of stress examined, exposure to predator odor and tail pinch stress. We conclude that corticosterone indeed potentiates mesocortical DA function, which in turn facilitates negative feedback regulation in times of stress.

L’activation du système rénine-angiotensine-aldostérone peut entraîner le développement d’une hypertension artérielle et de la fibrose cardiaque. Toutefois, au cours de la grossesse, malgré une hausse substantielle des niveaux d’aldostérone, ces effets délétères ne sont pas observés. L’aldostérone exerce ses effets via les récepteurs des minéralocorticoïdes, les MR, qui peuvent également lier le cortisol avec une affinité similaire. La régulation des niveaux locaux de ce glucocorticoïde par les 11β-hydroxystéroïde déshydrogénases (11β-HSD) est donc essentielle pour éviter une stimulation inappropriée des MR. Nous suggérons que, durant la grossesse, ces enzymes sont impliquées dans la protection de la mère et du foetus contre les niveaux élevés d’aldostérone et de cortisol. Notre hypothèse de travail est que les mécanismes d’adaptation qui prennent place au cours de la grossesse nécessitent des changements d’expression (ARNm et protéine) et d’activité des 11β-HSD spécifiques selon le tissu. Des rates Sprague-Dawley ont été sacrifiées aux jours 14, 17, 19 et 22 de gestation (terme = jour 23) et leurs organes ont été collectés. Dans le rein, les niveaux protéiques des 11β-HSD sont diminués en fin de gestation. Dans le placenta, on observe une importante chute de l’expression génique et protéique de la 11β-HSD1 au jour 17 tandis que la 11β-HSD2 y est augmentée. L’expression et l’activité de la 11β-HSD2 sont par la suite diminuées jusqu’à terme. Aucune différence significative n’est retrouvée dans le ventricule gauche cardiaque. En conclusion, nos résultats démontrent que la gestation est accompagnée d’importants changements dans le placenta, possiblement pour assurer un développement foetal adéquat, tandis que le rein et le coeur sont peu ou pas affectés. Des études plus approfondies sur l’expression des MR dans ces tissus nous aideront à mieux comprendre l’implication des 11β-HSD au fil de la gestation. / The activation of the renin-angiotensin-aldosterone system can lead to hypertension and cardiac fibrosis. However, despite a substantial elevation of aldosterone during pregnancy, those adverse effects are not observed. Aldosterone acts via the mineralocorticoid receptors (MR) which can also bind cortisol with a similar affinity. Regulation of the local levels of this glucocorticoid by the 11β-hydroxysteroid dehydrogenases (11β-HSD) is thus crucial to avoid overstimulation of MRs. We believe that these enzymes are involved in the maternal and fetal protections against the high levels of aldosterone and cortisol observed during pregnancy. We propose that the adaptative mechanisms occurring during normal pregnancy involve tissue-specific changes in the expression (mRNA and protein) and activity of both 11β-HSDs. Pregnant Sprague-Dawley rats were sacrified on day 14, 17, 19 or 22 of gestation (term = day 23) and their organs were collected. In the kidney, our results have shown that 11β-HSDs protein levels decrease in late gestation. In the placenta, a dramatic decrease of 11β-HSD1 mRNA and protein expressions is observed on day 17 while 11β-HSD2 levels are increased. Expression and activity of the 11β-HSD2 are then decreased up to day 22. No significant differences were detected in the left cardiac ventricle. In conclusion, our results demonstrate that gestation is associated with important modifications in the placenta, possibly to ensure a normal fetal growth, while expression in the kidney and the heart is barely changed. More studies on MR expression in those tissues will be required to better characterise the function of the 11β-HSDs throughout pregnancy.

Les améliorations dans les protocoles de traitement pour la majorité des cancers pédiatriques ont augmenté de façon marquée les taux de survie. Cependant, des risques élevés de multiples problèmes de santé chez les survivants sont bien documentés. En ce qui concerne spécifiquement les problèmes neuropsychologiques, les principaux facteurs de risque individuels connus à ce jour (l’âge au diagnostic, le genre du patient, l’exposition aux radiations) demeurent insuffisants pour cibler efficacement et prévenir les séquelles à long terme. Les objectifs généraux de cette thèse étaient : 1) la caractérisation des trajectoires individuelles de problèmes de comportement chez une population de patients pédiatriques atteints de leucémie lymphoblastique aiguë; 2) l’identification des principaux déterminants génétiques, médicaux et psychosociaux associés aux problèmes de comportements. Les hypothèses étaient : 1) Il existe une association entre les trajectoires individuelles de problèmes de comportement et a - des facteurs psychosociaux liés au fonctionnement familial, b - des polymorphismes dans les gènes modérateurs des effets thérapeutiques du méthotrexate et des glucocorticoïdes, c - des variables liées aux traitements oncologiques. 2) L'utilisation de modèles statistiques multi-niveaux peut permettre d’effectuer cette caractérisation des trajectoires individuelles et l’identification des facteurs de risque associés. 138 patients pédiatriques (0-18 ans) ayant reçu un diagnostic de leucémie lymphoblastique aiguë entre 1993 et 1999 au CHU Ste-Justine ont participé à une étude longitudinale d’une durée de 4 ans. Un instrument validé et standardisés, le Child Behavior Checklist, a été utilisé pour obtenir un indice de problèmes de comportement, tel que rapporté par la mère, au moment du diagnostic, puis 1, 2, 3 et 4 ans post-diagnostic. Des données génétiques, psychosociales et médicales ont aussi été collectées au cours de cette même étude longitudinale, puis ont été exploitées dans les modélisations statistiques effectuées. Les résultats obtenus suggèrent que les problèmes de comportement de type internalisés et externalisés possèdent des trajectoires et des facteurs de risque distincts. Les problèmes internalisés sont des manifestations de troubles affectifs chez le patient, tels que des symptômes dépressifs ou anxieux, par exemple. Ceux-ci sont très prévalents tôt après le diagnostic et se normalisent par la suite, indiquant des difficultés significatives, mais temporaires. Des facteurs médicaux exacerbant l'expérience de stress, soit le risque de rechute associé au diagnostic et les complications médicales affectant la durée de l'hospitalisation, ralentissent cette normalisation. Les problèmes externalisés se manifestent dans le contact avec autrui; des démonstrations d’agression ou de violence font partie des symptômes. Les problèmes externalisés sont plus stables dans le temps relativement aux problèmes internalisés. Des variables pharmacologiques et génétiques contribuent aux différences individuelles : l'administration d’un glucocorticoïde plus puissant du point de vue des effets pharmacologiques et toxicologiques, ainsi que l’homozygotie pour l’haplotype -786C844T du gène NOS3 sont liés à la modulation des scores de problèmes externalisés au fil du temps. Finalement, le niveau de stress familial perçu au diagnostic est positivement corrélé avec le niveau initial de problèmes externalisés chez le patient, tandis que peu après la fin de la période d’induction, le niveau de stress familial est en lien avec le niveau initial de problèmes internalisés. Ces résultats supportent l'idée qu'une approche holistique est essentielle pour espérer mettre en place des interventions préventives efficaces dans cette population. À long terme, ces connaissances pourraient contribuer significativement à l'amélioration de la qualité de vie des patients. Ces travaux enrichissent les connaissances actuelles en soulignant les bénéfices des suivis longitudinaux et multidisciplinaires pour comprendre la dynamique de changement opérant chez les patients. Le décloisonnement des savoirs semble devenir incontournable pour aspirer dépasser le cadre descriptif et atteindre un certain niveau de compréhension des phénomènes observés. Malgré des défis méthodologiques et logistiques évidents, ce type d’approche est non seulement souhaitable pour étudier des processus dynamiques, mais les travaux présentés dans cette thèse indiquent que cela est possible avec les moyens analytiques actuels. / Recent improvements in pediatric cancers treatment have led to marked increases in patient survival rate. However, it has been well documented that pediatric cancer survivors are at elevated risk for various other health problems. With respect specifically to neuropsychological side effects, known predictors (mainly: age at diagnosis, patient gender, exposure to radiation therapy) remain insufficient so far to target, and prevent efficiently, long term sequelae in this population. General objectives related to this thesis were: 1) characterization of individual trajectories of behavioral problems in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia; 2) the identification of genetic, medical and psychosocial determinants of behavioral problems in this population. This research program was based on the following hypotheses: 1) there is an association between the trajectories of individual behavioral problems and a – familial well-being-related psychosocial factors, b – gene polymorphisms involved in the therapeutic responses to methotrexate and glucocorticoids, c – anti-cancer treatments-related variables. 2) Multilevel statistical modeling can be used to characterize patient groups according to their individual behavioral problem trajectories, and can also identify predictive factors. 138 pediatric patients (0-18 years old) who received an acute lymphoblastic leukemia diagnosis between 1993 and 1999 at CHU Ste-Justine participated in this 4 years-long longitudinal study. A standardized and validated instrument, the Child Behavior Checklist, was used to measure behavior problems, as reported by the mother, at diagnosis, and then 1, 2, 3 and 4 years post-diagnosis. Genetic, psychosocial and medical data were also collected during this longitudinal study; these data were exploited in the context of the statistical modeling performed. Results obtained suggest that internalized and externalized behavioral problems have distinct trajectories and have different predictive factors. Internalized problems are affective issues presented by the patient, such as depressive or anxious symptoms. They are highly prevalent post-diagnosis and normalize over the following years, suggestive of temporary yet significant problems. Stress-enhancing medical variables such as a higher relapse risk at diagnosis and medical complications requiring a longer hospitalization slow down the normalization process. Externalized problems need interpersonal contact to occur; violence or aggressiveness manifestations are some examples. Compared to internalized problems, externalized problems are much more stable across time. However, pharmacological and genetic variables do contribute to individual differences in trajectories. In particular, administration of a more potent glucocorticoid (from pharmacological and toxicological perspectives) and being homozygous for NOS3 gene -786C844T haplotype are linked to modulation of externalized problems in time. Finally, the level of perceived family stress at time of diagnosis is positively correlated with initial externalized problems, while shortly after the induction period, the level of familial stress is linked with the initial internalized problems. Together, these results support the idea that a holistic care strategy is essential to develop efficient, preventive interventions in this population, due to the multifactorial nature of these behavioral problems. The knowledge generated in the present studies could contribute to better quality of life for these patients. This thesis also brings a more holistic contribution to our current knowledge of behavioral problems in this population, by highlighting the need for individual, multidisciplinary follow-ups, with particular emphasis on repeated measurements and appropriate statistical analyses. More than ever, knowledge de-compartmentalization appears essential in reaching a certain comprehension level of observed phenomena, rather than adhering to descriptive settings. It indicates that, despite obvious methodological and logistic challenges, this type of research is not only desirable in studying dynamic processes, but is certainly achievable with current analytical tools.

Les neutrophiles sont généralement considérés résistants aux glucocorticoïdes. Cependant, peu d’études comparant l’effet de ces drogues sur les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins (monocytes, lymphocytes et éosinophiles) ont été rapportées. Dans notre étude, nous avons évalué la réponse aux glucocorticoïdes de ces deux populations cellulaires chez le cheval et l’homme. Les cellules, préalablement isolées du sang de 6 chevaux et 4 sujets humains sains, ont été incubées pendant 5 h en présence de lipopolysaccharide (LPS; 100 ng/mL) seul ou combiné avec de l’hydrocortisone, de la prednisolone ou de la dexaméthasone (10-8M et 10-6M). L’expression d’ARNm pour l’IL-1β, le TNF-α, l’IL-8, la glutamine synthétase et le récepteur α des glucocorticoïdes (GR-α) a été quantifiée par qPCR. Les neutrophiles équins ont également été incubés pendant 20 h en présence de ces 3 glucocorticoïdes et la survie cellulaire a été évaluée par cytométrie de flux et microscopie optique. Nous avons démontré que les glucocorticoïdes inhibaient l’expression des gènes pro-inflammatoires induite par le LPS pour les deux populations cellulaires chez les deux espèces étudiées. L’expression de la glutamine synthétase était également significativement augmentée par les glucocorticoïdes chez les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins équins. De manière générale, l’intensité de la réponse aux glucocorticoïdes s’est avérée similaire dans les 2 populations leucocytaires et chez les deux espèces. Les glucocorticoïdes augmentaient également la survie des neutrophiles équins, phénomène également rapporté dans d’autres espèces. Ainsi, les glucococorticoïdes exercent des effets d’intensité comparable sur les neutrophiles et les autres leucocytes sanguins. Nous spéculons que la faible réponse à la corticothérapie observée lors de maladies inflammatoires chroniques neutrophiliques comme l’asthme sévère ou la Maladie Pulmonaire Obstructive Chronique (MPOC) ne s’explique pas par une corticorésistance intrinsèque des neutrophiles. / Neutrophils are generally considered resistant to glucocorticoids compared to other inflammatory cells. However, there are few studies comparing the effects of glucocorticoids in neutrophils and those of other blood leukocytes (monocytes, lymphocytes and eosinophils). In our study, we assessed glucocorticoid-responsiveness in equine and human peripheral blood neutrophils and in neutrophil-depleted leukocytes. Cells were isolated from 6 healthy horses and 4 human healthy subjects. They were incubated for 5 h with or without lipopolysaccharide (LPS; 100 ng/mL) alone or combined with hydrocortisone, prednisolone or dexamethasone (10-8M and 10-6M). IL-1β, TNF-α, IL-8, glutamine synthetase and Glucocorticoid Receptor α (GR-α) mRNA expression was quantified by qPCR. Equine neutrophils were also incubated for 20 h with or without the three glucocorticoids and cell survival was assessed by flow cytometry and light microscopy. We found that glucocorticoids down-regulated LPS-induced pro-inflammatory mRNA expression in both cell populations and species. These drugs also significantly increased glutamine synthetase gene expression in both equine cell populations. The magnitude of glucocorticoid response was generally similar in both cell populations and species. As reported in other species, glucocorticoids significantly increase the survival in equine neutrophils. Based on these results, it appears that glucocorticoids exert effects of similar magnitude on neutrophils and on other blood leukocytes. We speculate that the poor response to glucocorticoids observed in some chronic neutrophilic human diseases such as severe asthma or Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is not explained by an inherent attenuated response of neutrophils to these drugs.