A doença de Chagas representa um grave problema de saúde pública, afetando principalmente a população de baixa renda, o que a torna negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente, existe apenas um fármaco disponível para o tratamento, o benzonidazol, porém este apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. O ácido ursólico, um triterpeno de origem natural, possui atividade tripanocida, porém, sua solubilidade aquosa baixa limita sua biodisponibilidade. Para o aumento da biodisponibilidade tem destaque o uso das dispersões sólidas, onde fármacos lipofílicos são dispersos molecularmente ou no estado amorfo em carreadores hidrofílicos, acarretando um aumento do perfil de dissolução. Neste trabalho, dispersões sólidas e misturas físicas contendo ácido ursólico foram preparadas com os carreadores polietilenoglicol 6000, Gelucire 50/13 e dióxido de silício coloidal, Poloxamer 407 e caprato de sódio, empregando as técnicas de fusão e evaporação do solvente. Os sistemas foram caracterizados através das técnicas de microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia do infravermelho com transformada de Fourier, calorimetria exploratória diferencial, microscopia em hot stage e difratometria de raios-X. Em outra etapa, os produtos foram avaliados quanto à solubilidade aquosa, perfil de dissolução in vitro, citotoxicidade em linhagem celular LLC-MK2, e atividade tripanocida em modelo animal. Em conjunto, os resultados mostraram que o fármaco não teve suas propriedades afetadas pela manipulação em misturas físicas, mantendo sua estrutura cristalina. Por outro lado, os experimentos de difratometria de raios-X e as observações microscópicas em hot stage revelaram a alteração do ácido ursólico para o estado amorfo, principalmente para os sistemas preparados pelo método do solvente, enquanto que algumas formulações manipuladas pelo método da fusão exibiram alterações polimórficas. Além disso, evidenciaram-se interações intermoleculares do tipo ligações de hidrogênio para as dispersões sólidas preparadas pelo método do solvente. As alterações do fármaco observadas para as dispersões sólidas preparadas pelo método do solvente aumentaram sua solubilidade e melhoraram seu perfil de dissolução comparado às dispersões sólidas pelo método da fusão e misturas físicas, sendo este aumento maior para os sistemas compostos por Poloxamer 407 + caprato de sódio, seguido por Poloxamer 407, Gelucire 50/13 + dióxido de silício coloidal e PEG 6000, o que pode ser atribuído ao poder tensoativo dos três primeiros carreadores. As formulações mostram-se seguras até a concentração de 128 ?M do fármaco, através da avaliação da citotoxicidade. Por último, o ursólico teve um aumento significativo da atividade tripanocida para a formulação composta pelo tensoativo Poloxamer 407 junto com o promotor de absorção oral caprato de sódio, manipulada pelo método do solvente, sugerindo o aumento da biodisponibilidade do fármaco. / Chagas disease represents a severe problem in public health, affecting mainly the low-income population, making it neglected by the pharmaceutical industry. Currently, there is only one drug available for treatment, benznidazol, however, it presents limited efficacy and is associated with several side effects. Ursolic acid, a naturally occurring triterpene, presents trypanocidal activity, but its low water solubility limits the bioavailability. To increase the biovailability, solid dispersions, where lipophilic drugs are molecularly or in the amorphous state dispersed in hydrophilic carriers, can play an important role, resulting in enhanced dissolution profile of the drug. In this work, solid dispersions and physical mixtures containing ursolic acid were prepared with Polyethyleneglycol 6000, Gelucire 50/13 and silicon dioxide, Poloxamer 407 and sodium caprate as carriers, employing the fusion and solvent evaporation techniques. The products were characterized through scanning electron microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, differential scanning calorimetry, hot stage microscopy and X-ray diffractometry. In another step, the formulations were evaluated regarding the aqueous solubility, in vitro dissolution profile, citotoxicity using LLC-MK2 cell line, and trypanocidal activity in animal model. Together, results showed that the drug did not suffer any change in its properties when in physical mixture. On the other hand, X-ray diffractometry and hot stage microscopy revealed a transition from the crystalline to the amorphous state for ursolic acid, especially for the products prepared by the solvent method. In the fusion method, some formulations exhibited a polymorphic change. Moreover, we identified intermolecular interactions between drug and carrier by hydrogen bonding in the products prepared by the solvent method. These changes observed for solid dispersions prepared by the solvent method resulted in increased water solubility and dissolution profile and these effects were higher for the products prepared with Poloxamer 407 + sodium caprate, followed by Polomer 407 alone, Gelucire 50/13 + silicon dioxide and PEG 6000, which can be attributed to the surfactant property of the three first carriers. The formulations were safe up to 128 ?M of the drug, showed by the citotoxicity evaluation. Very importantly, we highlight that ursolic acid had a significant increase in the trypanocidal activity for the product prepared with the surfactant Poloxamer 407 and the penetration enhancer sodium caprate, prepared by the solvent method, suggesting that in this composition ursolic acid was more bioavailable.

A doença de Chagas causada pelo Trypanosoma cruzi representa um grave problema de saúde pública na América Latina e cada vez mais em todo o mundo, afetando principalmente regiões de baixo poder aquisitivo, e por isso negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente apenas um fármaco está disponível, o benzonidazol, o qual apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. Estudos recentes demonstraram atividade tripanocida do ácido ursólico, entretanto sua utilização é limitada pela alta hidrofobicidade, sendo o uso dos nanocarreadores lipossomais reconhecido como uma estratégia promissora para solucionar tal limitação, além de serem sistemas altamente versáteis e biocompatíveis. Neste trabalho, foram desenvolvidos lipossomas de fosfatidilcolina e colesterol contendo ácido ursólico pela técnica da evaporação do solvente e hidratação do filme lipídico seguida de sonicação, permitindo a obtenção de vesículas unilamelares e com baixa polidispersividade. A partir da avaliação preliminar da estabilidade das dispersões, a adição do colesterol na razão molar 10:1 fosfatidilcolina:colesterol foi essencial para a manutenção do conteúdo encapsulado quando a formulação foi estocada em temperatura ambiente e melhor retenção do conteúdo a 4°C (90%). Após a liofilização o emprego de sucrose na razão molar 1:10 lipídeo:açúcar, a formulação manteve o tamanho e distribuição de tamanho e impediu a agregação das vesículas. A formulação obtida foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão, apresentando diâmetro entre 100 e 120 nm, também observado pelo espalhamento dinâmico da luz. As análises por espectroscopia no infravermelho e calorimetria exploratória diferencial demonstraram uma forte interação do fármaco com a membrana fosfolipídica por interações de hidrogênio, assim como uma menor mobilidade das cadeias lipídicas e formação de uma matriz vítrea a qual foi responsável pela efetiva crioproteção das vesículas. Estudo in vitro do perfil de liberação do fármaco a partir dos lipossomas pela técnica da diálise resultou em alta retenção do conteúdo encapsulado e uma liberação sustentada deste. A partir de ensaio biológico in vitro empregando azul de trypan, a formulação liofilizada contendo ácido ursólico se mostrou segura até a concentração em que seria necessária para carrear 32 ?M do fármaco, considerando a linhagem de mamíferos LLC-MK2. Em relação à atividade tripanocida em linhagem da cepa CL da forma epimastigota empregando MTT, o lipossoma contendo o fármaco foi capaz de causar morte celular do parasita em 100%, considerando-se um possível efeito sinérgico do ácido ursólico e o colesterol, cuja seletividade à membrana do parasita tem sido recentemente demonstrada. Contudo apenas a formulação contendo o ácido ursólico apresentou índice de seletividade aceitável, o que está relacionado com o efeito citoprotetor do ácido ursólico. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi is a serious public health problem in Latin America and is an increasing disease around the world, mainly affecting regions with low purchasing power, and therefore Chagas disease is considered neglected by the pharmaceutical industry. Today, only one product is available, benznidazole, which has limited efficacy and is associated with several side effects. Recent studies have shown trypanocidal activity of ursolic acid, however its use is limited by the high hydrophobicity. The use of liposomal nanocarriers is recognized as a promising strategy to address this limitation and they are highly versatile and biocompatible systems. In this study, ursolic acid loaded phosphatidylcholine and cholesterol liposomes were developed using the solvent evaporation and lipid film hydration technique followed by sonication, allowing unilamellar vesicles formation with low polydispersity. From the preliminary assessment of the dispersion stability, the addition of cholesterol allowed the encapsulation efficiency maintenance when the formulation was stored at room temperature and better drug retention at 4°C (90%). After lyophilization employing sucrose 1:10 lipid:sugar molar ratio, the formulation manteined the size and size distribution and vesicle aggregation was prevented. The formulation obtained was characterized by transmission electron microscopy, with diameter between 100 and 120 nm, also observed by dynamic light scattering. The analysis by infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry showed a strong hydrogen interaction between ursolic acid and the phospholipid membrane, as well as a lower mobility of the lipid chains and glassy matrix formation which was responsible for the effective cryoprotection. In vitro drug release profile from liposomes by dialysis technique resulted in high retention of the encapsulated content and a sustained release. From in vitro biological assay using trypan blue, the ursolic acid loaded lyophilized liposomes proved to be safe up to a concentration that would be required to carry 32 ?M of the drug, considering the LLC-MK2 mammalians cell line. Regarding the trypanocidal activity of epimastigotes CL strain by MTT technique, the ursolic acid loaded liposomes showed greater efficacy than blank liposome able to causing 100% of parasite cell death, considering a possible synergism effect of ursolic acid and cholesterol, whose selectivity to the parasite membrane has been recently demonstrated. However, only the formulation containing ursolic acid showed acceptable selectivity index, which is related to the ursolic acid cytoprotective effect.

Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

A bexiga urinária é exposta constantemente a substâncias potencialmente prejudiciais presentes na urina, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias. Dentre estas patologias está a cistite hemorrágica que é uma condição inflamatória grave da bexiga associada ao uso de fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida. É descrito que a exposição em longo prazo à ciclofosfamida aumenta o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga, o qual é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato urinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. Alterações na sinalização purinérgica têm sido evidenciadas em diferentes patologias associadas à bexiga urinária. De fato, o sistema purinérgico tem emergido como um potencial alvo a ser estudado. Portanto, nesta tese buscou-se avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica em um modelo in vivo de cistite hemorrágica e em um modelo in vitro de câncer de bexiga. No intuito de identificar estratégias preventivas e tratamentos eficazes para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à cistite hemorrágica, a espécie Uncaria tomentosa foi investigada, devido a sua ampla utilização em casos de inflamação crônica e doenças do trato urinário. A partir dos estudos conduzidos in vivo, demonstramos que o tratamento sistêmico com a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico de U. tomentosa foi capaz de prevenir os eventos nociceptivos e inflamatórios associados à cistite hemorrágica. A diminuição da expressão dos receptores P2X7, provavelmente pela inibição da migração dos neutrófilos ao local da inflamação foi observada, evidenciando propriedades anti-inflamatórias promissoras para esta fração podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento desta patologia. Para o câncer de bexiga músculo invasivo, a cistectomia radical é considerada o tratamento padrão, porém está associada à morbidade significativa. Na tentativa de proporcionar uma melhor qualidade de vida aos pacientes, o interesse por abordagens terapêuticas que visam à preservação da bexiga urinária tem aumentado. Neste sentido, a radioterapia tem recebido destaque por ser uma modalidade de tratamento já utilizada. Desta forma, investigamos os efeitos da radioterapia sobre a sinalização purinérgica em linhagem celular de câncer de bexiga humano T24. Dentre os receptores expressos pelas células T24, o receptor P2X6 apresentou aumento expressivo após a radioterapia. A partir da análise de pacientes com câncer de bexiga (Kaplan-Meier), evidenciamos a relação existente entre a alta expressão deste receptor e o aumento da taxa de sobrevivência. Na sequência, o provável envolvimento da família das ectonucleotidases nos efeitos da radioterapia na linhagem celular T24 também foi avaliado. Observamos que a sinalização purinérgica, principalmente via hidrólise do ATP à adenosina pela ação combinada de ectoenzimas demonstrou papel importante no tratamento radioterápico in vitro. A indução transitória da expressão da enzima ecto- 5’NT/CD73 pela radioterapia também foi observada, sendo a adenosina gerada a responsável por contribuir na morte celular. O papel crucial da ecto-5’NT/CD73 na radiossensibilização das células foi confirmado pela inibição farmacológica e pelo uso do nocaute da enzima. Em conjunto, os resultados in vitro demonstraram que a vantagem da radioterapia parece ser alcançada naqueles pacientes que expressam o receptor P2X6 e a enzima ecto-5’NT/CD73 na área tumoral, podendo no futuro, ambos serem considerados possíveis marcadores para prever a eficácia da resposta à radioterapia para o tratamento do câncer de bexiga. Por fim, a realização do ensaio radiométrico frente à ecto-5’NT/CD73 evidenciou o potente efeito inibitório do ácido ursólico sobre esta enzima, cujo potencial também foi confirmado frente à linhagem celular T24. / The urinary bladder is constantly exposed to potentially harmful substances in the urine, whose chronic exposure can lead to various diseases. Among these pathologies the hemorrhagic cystitis is a severe inflammatory condition of the bladder associated with the use of chemotherapeutic drugs, such as cyclophosphamide. It has been reported that long-term exposure to cyclophosphamide increases the risk of developing bladder cancer, which is characterized as being the second most common cancer of the urinary tract and the seventh most common cancer among men in the world. Alterations in the purinergic signaling have been shown in diseases associated with urinary bladder. In fact, the purinergic signaling has emerged as a potential target to be studied. Therefore, this thesis sought to evaluate the involvement of purinergic signaling in an in vivo model of hemorrhagic cystitis and in an in vitro model of bladder cancer. In order to identify preventive strategies and effective treatments to reduce morbidity and mortality associated with hemorrhagic cystitis, the Uncaria tomentosa species was investigated due to its wide use in cases of chronic inflammation and urinary tract diseases. From studies conducted in vivo, we demonstrated that systemic treatment with the quinovic acid glycosides purified fraction from U. tomentosa was able to prevent nociceptive and inflammatory events associated with hemorrhagic cystitis. The decreased expression of the P2X7 receptor was observed, most likely by the reduction of neutrophils migration to the site of inflammation. Therefore, this investigation has shown promising antiinflammatory properties for this fraction, which may in the future become a potential therapeutic agent for the treatment of this pathology. For bladder muscle invasive cancer, although radical cystectomy has been considered the standard treatment is still associated with significant morbidity. In an attempt to provide a better quality of life for patients, interest in therapeutic approaches aimed the preservation of the urinary bladder have increased. In this regard, the radiotherapy has been highlighted by being a treatment modality already used. Thus, we investigated the effects of radiation on the purinergic signaling in T24 human bladder cancer cell line. Among the receptors expressed by T24 cells, the P2X6 receptor showed significant increase after radiotherapy. From the analysis of patients with bladder cancer (Kaplan-Meier), we noticed the relationship between high expression of this receptor and increased survival rate. Following, the involvement of ectonucleotidases after irradiation exposure in T24 cell line was also evaluated. The purinergic signaling, mainly through hydrolysis of ATP to adenosine by the combined action of ectoenzymes, demonstrated important role in radiotherapy in vitro. The transient induction of ecto-5’NT/CD73 expression by radiotherapy was also observed, being the adenosine generated a possible responsible in T24 cell death. The crucial role of ecto-5’NT/CD73 in the radiosensitization of the cells was confirmed by pharmacological inhibition and the use of the enzyme knockout. Taken together, the in vitro results demonstrate that the benefit of radiation therapy appears to be achieved in those patients that express the P2X6 receptor and the enzyme ecto-5’NT/CD73 in the tumor area, and in the future both may be considered potential markers for predicting the effectiveness response to radiotherapy for the treatment of bladder cancer. Finally, the radiometric ecto-5’NT/CD73 assay showed the potent inhibitory effect of ursolic acid on this enzyme, whose potential was also confirmed through the T24 cell line.

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes referentes ao número de pessoas contaminadas e daquelas que ainda permanecem expostas ao risco de infecção. As doenças tropicais desafiam as pesquisas científicas, pois os medicamentos existentes apresentam sérios efeitos colaterais. As tripanossomíases são doenças de grande importância no Brasil, como é o caso da doença de Chagas. Estudos realizados em diversos países têm relatado que muitas espécies vegetais possuem atividade contra o agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi. Ácido ursólico e seu isômero, ácido oleanólico, pertencem à classe de compostos triterpenóides e são amplamente distribuídos no reino vegetal e têm sido frequentemente isolados como mistura isomérica. Nesse sentido, a proposta para o presente estudo foi avaliar a atividade tripanocida, sobre a cepa Y e Bolívia de T. cruzi, dos triterpenos ácido ursólico e ácido oleanólico, sintetizar e avaliar a atividade tripanocida do sal derivado de ácido ursólico. As substâncias foram administradas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg por via intraperitoneal e oral, após a avaliação da dose letal média (DL50). As três substâncias empregadas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg, administradas por via intraperitoneal não foram capazes de reduzir a parasitemia dos animais experimentalmente infectados com as cepas Y e Bolívia de T. cruzi. Entretanto, as três substâncias exibiram atividade tripanocida significativa, na concentração de 50 mg/kg, administradas por via oral, em animais infectados com a cepa Y de T. cruzi. Para a cepa Bolívia de T. cruzi, as substâncias administradas por via oral exibiram atividade biológica na concentração de 20 mg/kg, sendo significativa apenas para o triterpeno ácido ursólico. A análise histológica realizada não demonstrou uma correlação significativa entre os níveis parasitêmicos e o parasitismo tecidual, para todos os grupos avaliados. A avaliação do perfil hepatobiliar e renal das substâncias foi realizada a fim de se verificar possíveis efeitos tóxicos das mesmas. Entretanto, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados e o grupo controle, indicando que o aumento dos níveis parasitêmicos não está associado ao efeito das substâncias no tecido. Através da avaliação do efeito dos triterpenos sobre a resposta imune, verificamos uma diminuição dos níveis plasmáticos de IFN- e um aumento das concentrações de IL-10. Dessa maneira, nós sugerimos que o tratamento com essas substâncias pode direcionar a resposta imune para o padrão Th2 e, em conseqüência desse efeito imunossupressor, uma maior quantidade de formas tripomastigotas poderia ser observada na circulação do hospedeiro. / Chagas disease is a public health problem with worrisome data on the number of infected people, not to mention the population that still remains at risk of infection. Tropical diseases defy scientific research since the existing drugs have serious side effects. Trypanosomiases, such as Chagas disease, are of great importance in Brazil. Studies in several countries have reported that many plant species display activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Ursolic acid and its isomer, oleanolic acid, belong to a class of triterpenoid compounds that is widely distributed in the plant kingdom and has frequently been isolated as an isomeric mixture. In the present study, the trypanocidal activity of the triterpenoids ursolic acid and oleanolic acid was evaluated against the Y and Bolivia strains of T. cruzi. In addition, the potassium salt derivative of ursolic acid was synthesized and also tested. The triterpenoids were administered intraperitoneally and orally at concentrations of 20 and 50 mg / kg, after evaluation of the median lethal dose (LD50). At the concentrations of 20 and 50 mg / kg, the intraperitoneal administration of each of the substances was not able to reduce parasitemia of the animals infected with the Y and Bolivia strains of T. cruzi. However, ursolic and oleanolic acid, as well as the potassium salt derivative of ursolic acid exhibited significant trypanocidal activity at a concentration of 50 mg / kg when they were orally administered to animals infected with the Y strain of T. cruzi. On the other hand, oral administration of the tested compounds at a concentration of 20 mg / kg evidenced biological activity, which was significant for ursolic acid only. For the most of studied groups, histological analysis did not demonstrate a significant correlation between the levels of parasitemia and tissue parasitism. Determination and evaluation of biochemical parameters in the serum of experimental animals was performed, to assess the hepatic, biliary, and renal toxic effects of the substances. There were no statistically significant differences between the treated groups and the control group, indicating that the increase in parasitemia is not associated with the effects of the substances in the tissue. We suggest the hypothesis of an immunosuppressive effect, since there was a decreased plasma levels of IFN- after treatment with the triterpenes. Moreover, the treated groups also exhibited increased levels of IL-10. Therefore, we suggest that treatment with the substances could be directing the immune response toward the Th2 type and, as a consequence of this immunosuppressive effect, a greater amount of trypomastigotes could be observed in the circulation of the host.

A bexiga urinária é exposta constantemente a substâncias potencialmente prejudiciais presentes na urina, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias. Dentre estas patologias está a cistite hemorrágica que é uma condição inflamatória grave da bexiga associada ao uso de fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida. É descrito que a exposição em longo prazo à ciclofosfamida aumenta o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga, o qual é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato urinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. Alterações na sinalização purinérgica têm sido evidenciadas em diferentes patologias associadas à bexiga urinária. De fato, o sistema purinérgico tem emergido como um potencial alvo a ser estudado. Portanto, nesta tese buscou-se avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica em um modelo in vivo de cistite hemorrágica e em um modelo in vitro de câncer de bexiga. No intuito de identificar estratégias preventivas e tratamentos eficazes para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à cistite hemorrágica, a espécie Uncaria tomentosa foi investigada, devido a sua ampla utilização em casos de inflamação crônica e doenças do trato urinário. A partir dos estudos conduzidos in vivo, demonstramos que o tratamento sistêmico com a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico de U. tomentosa foi capaz de prevenir os eventos nociceptivos e inflamatórios associados à cistite hemorrágica. A diminuição da expressão dos receptores P2X7, provavelmente pela inibição da migração dos neutrófilos ao local da inflamação foi observada, evidenciando propriedades anti-inflamatórias promissoras para esta fração podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento desta patologia. Para o câncer de bexiga músculo invasivo, a cistectomia radical é considerada o tratamento padrão, porém está associada à morbidade significativa. Na tentativa de proporcionar uma melhor qualidade de vida aos pacientes, o interesse por abordagens terapêuticas que visam à preservação da bexiga urinária tem aumentado. Neste sentido, a radioterapia tem recebido destaque por ser uma modalidade de tratamento já utilizada. Desta forma, investigamos os efeitos da radioterapia sobre a sinalização purinérgica em linhagem celular de câncer de bexiga humano T24. Dentre os receptores expressos pelas células T24, o receptor P2X6 apresentou aumento expressivo após a radioterapia. A partir da análise de pacientes com câncer de bexiga (Kaplan-Meier), evidenciamos a relação existente entre a alta expressão deste receptor e o aumento da taxa de sobrevivência. Na sequência, o provável envolvimento da família das ectonucleotidases nos efeitos da radioterapia na linhagem celular T24 também foi avaliado. Observamos que a sinalização purinérgica, principalmente via hidrólise do ATP à adenosina pela ação combinada de ectoenzimas demonstrou papel importante no tratamento radioterápico in vitro. A indução transitória da expressão da enzima ecto- 5’NT/CD73 pela radioterapia também foi observada, sendo a adenosina gerada a responsável por contribuir na morte celular. O papel crucial da ecto-5’NT/CD73 na radiossensibilização das células foi confirmado pela inibição farmacológica e pelo uso do nocaute da enzima. Em conjunto, os resultados in vitro demonstraram que a vantagem da radioterapia parece ser alcançada naqueles pacientes que expressam o receptor P2X6 e a enzima ecto-5’NT/CD73 na área tumoral, podendo no futuro, ambos serem considerados possíveis marcadores para prever a eficácia da resposta à radioterapia para o tratamento do câncer de bexiga. Por fim, a realização do ensaio radiométrico frente à ecto-5’NT/CD73 evidenciou o potente efeito inibitório do ácido ursólico sobre esta enzima, cujo potencial também foi confirmado frente à linhagem celular T24. / The urinary bladder is constantly exposed to potentially harmful substances in the urine, whose chronic exposure can lead to various diseases. Among these pathologies the hemorrhagic cystitis is a severe inflammatory condition of the bladder associated with the use of chemotherapeutic drugs, such as cyclophosphamide. It has been reported that long-term exposure to cyclophosphamide increases the risk of developing bladder cancer, which is characterized as being the second most common cancer of the urinary tract and the seventh most common cancer among men in the world. Alterations in the purinergic signaling have been shown in diseases associated with urinary bladder. In fact, the purinergic signaling has emerged as a potential target to be studied. Therefore, this thesis sought to evaluate the involvement of purinergic signaling in an in vivo model of hemorrhagic cystitis and in an in vitro model of bladder cancer. In order to identify preventive strategies and effective treatments to reduce morbidity and mortality associated with hemorrhagic cystitis, the Uncaria tomentosa species was investigated due to its wide use in cases of chronic inflammation and urinary tract diseases. From studies conducted in vivo, we demonstrated that systemic treatment with the quinovic acid glycosides purified fraction from U. tomentosa was able to prevent nociceptive and inflammatory events associated with hemorrhagic cystitis. The decreased expression of the P2X7 receptor was observed, most likely by the reduction of neutrophils migration to the site of inflammation. Therefore, this investigation has shown promising antiinflammatory properties for this fraction, which may in the future become a potential therapeutic agent for the treatment of this pathology. For bladder muscle invasive cancer, although radical cystectomy has been considered the standard treatment is still associated with significant morbidity. In an attempt to provide a better quality of life for patients, interest in therapeutic approaches aimed the preservation of the urinary bladder have increased. In this regard, the radiotherapy has been highlighted by being a treatment modality already used. Thus, we investigated the effects of radiation on the purinergic signaling in T24 human bladder cancer cell line. Among the receptors expressed by T24 cells, the P2X6 receptor showed significant increase after radiotherapy. From the analysis of patients with bladder cancer (Kaplan-Meier), we noticed the relationship between high expression of this receptor and increased survival rate. Following, the involvement of ectonucleotidases after irradiation exposure in T24 cell line was also evaluated. The purinergic signaling, mainly through hydrolysis of ATP to adenosine by the combined action of ectoenzymes, demonstrated important role in radiotherapy in vitro. The transient induction of ecto-5’NT/CD73 expression by radiotherapy was also observed, being the adenosine generated a possible responsible in T24 cell death. The crucial role of ecto-5’NT/CD73 in the radiosensitization of the cells was confirmed by pharmacological inhibition and the use of the enzyme knockout. Taken together, the in vitro results demonstrate that the benefit of radiation therapy appears to be achieved in those patients that express the P2X6 receptor and the enzyme ecto-5’NT/CD73 in the tumor area, and in the future both may be considered potential markers for predicting the effectiveness response to radiotherapy for the treatment of bladder cancer. Finally, the radiometric ecto-5’NT/CD73 assay showed the potent inhibitory effect of ursolic acid on this enzyme, whose potential was also confirmed through the T24 cell line.

Orientador: Marcos Antonio Corrêa / Resumo: O aumento da preocupação com a estética e saúde corporal vem elevando a demanda por produtos cosméticos contendo ativos que previnam o envelhecimento e outras alterações cutâneas. O ácido ursólico (AU), ativo natural extraído de plantas como o alecrim e o manjericão, tem se demonstrado interessante para incorporação em cosméticos por possuir potencial antioxidante, despigmentante, propriedade antimicrobiana, entre outras. Este trabalho teve como objetivo avaliar a possibilidade da utilização do AU como um ativo cosmético multifuncional através da avaliação da eficácia e citotoxicidade in vitro do AU, bem como o preparo e avaliação de uma emulsão contendo o ativo. O potencial antioxidante do AU foi avaliado por meio de métodos de inibição de radicais como o 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH•) e o 2,2 -azino bis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid (ABTS•+), tendo demonstrado atividade antioxidante, com IC50 de 235,61 µg/mL para técnica com DPPH• e 107,17 µg/mL para técnica com ABTS•+. A atividade despigmentante foi verificada através da inibição da enzima tirosinase, utilizando 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) como substrato, e apresentando como resultado um IC50 de 338,00 µg/mL. Para a avaliação da atividade antimicrobiana diversas cepas foram testadas a partir da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de diluição em microplacas, e da concentração bactericida mínima (CBM) pela replicação em placa de Petri, seguindo suplemento M100-S16 do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

A bexiga urinária é exposta constantemente a substâncias potencialmente prejudiciais presentes na urina, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias. Dentre estas patologias está a cistite hemorrágica que é uma condição inflamatória grave da bexiga associada ao uso de fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida. É descrito que a exposição em longo prazo à ciclofosfamida aumenta o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga, o qual é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato urinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. Alterações na sinalização purinérgica têm sido evidenciadas em diferentes patologias associadas à bexiga urinária. De fato, o sistema purinérgico tem emergido como um potencial alvo a ser estudado. Portanto, nesta tese buscou-se avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica em um modelo in vivo de cistite hemorrágica e em um modelo in vitro de câncer de bexiga. No intuito de identificar estratégias preventivas e tratamentos eficazes para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à cistite hemorrágica, a espécie Uncaria tomentosa foi investigada, devido a sua ampla utilização em casos de inflamação crônica e doenças do trato urinário. A partir dos estudos conduzidos in vivo, demonstramos que o tratamento sistêmico com a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico de U. tomentosa foi capaz de prevenir os eventos nociceptivos e inflamatórios associados à cistite hemorrágica. A diminuição da expressão dos receptores P2X7, provavelmente pela inibição da migração dos neutrófilos ao local da inflamação foi observada, evidenciando propriedades anti-inflamatórias promissoras para esta fração podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento desta patologia. Para o câncer de bexiga músculo invasivo, a cistectomia radical é considerada o tratamento padrão, porém está associada à morbidade significativa. Na tentativa de proporcionar uma melhor qualidade de vida aos pacientes, o interesse por abordagens terapêuticas que visam à preservação da bexiga urinária tem aumentado. Neste sentido, a radioterapia tem recebido destaque por ser uma modalidade de tratamento já utilizada. Desta forma, investigamos os efeitos da radioterapia sobre a sinalização purinérgica em linhagem celular de câncer de bexiga humano T24. Dentre os receptores expressos pelas células T24, o receptor P2X6 apresentou aumento expressivo após a radioterapia. A partir da análise de pacientes com câncer de bexiga (Kaplan-Meier), evidenciamos a relação existente entre a alta expressão deste receptor e o aumento da taxa de sobrevivência. Na sequência, o provável envolvimento da família das ectonucleotidases nos efeitos da radioterapia na linhagem celular T24 também foi avaliado. Observamos que a sinalização purinérgica, principalmente via hidrólise do ATP à adenosina pela ação combinada de ectoenzimas demonstrou papel importante no tratamento radioterápico in vitro. A indução transitória da expressão da enzima ecto- 5’NT/CD73 pela radioterapia também foi observada, sendo a adenosina gerada a responsável por contribuir na morte celular. O papel crucial da ecto-5’NT/CD73 na radiossensibilização das células foi confirmado pela inibição farmacológica e pelo uso do nocaute da enzima. Em conjunto, os resultados in vitro demonstraram que a vantagem da radioterapia parece ser alcançada naqueles pacientes que expressam o receptor P2X6 e a enzima ecto-5’NT/CD73 na área tumoral, podendo no futuro, ambos serem considerados possíveis marcadores para prever a eficácia da resposta à radioterapia para o tratamento do câncer de bexiga. Por fim, a realização do ensaio radiométrico frente à ecto-5’NT/CD73 evidenciou o potente efeito inibitório do ácido ursólico sobre esta enzima, cujo potencial também foi confirmado frente à linhagem celular T24. / The urinary bladder is constantly exposed to potentially harmful substances in the urine, whose chronic exposure can lead to various diseases. Among these pathologies the hemorrhagic cystitis is a severe inflammatory condition of the bladder associated with the use of chemotherapeutic drugs, such as cyclophosphamide. It has been reported that long-term exposure to cyclophosphamide increases the risk of developing bladder cancer, which is characterized as being the second most common cancer of the urinary tract and the seventh most common cancer among men in the world. Alterations in the purinergic signaling have been shown in diseases associated with urinary bladder. In fact, the purinergic signaling has emerged as a potential target to be studied. Therefore, this thesis sought to evaluate the involvement of purinergic signaling in an in vivo model of hemorrhagic cystitis and in an in vitro model of bladder cancer. In order to identify preventive strategies and effective treatments to reduce morbidity and mortality associated with hemorrhagic cystitis, the Uncaria tomentosa species was investigated due to its wide use in cases of chronic inflammation and urinary tract diseases. From studies conducted in vivo, we demonstrated that systemic treatment with the quinovic acid glycosides purified fraction from U. tomentosa was able to prevent nociceptive and inflammatory events associated with hemorrhagic cystitis. The decreased expression of the P2X7 receptor was observed, most likely by the reduction of neutrophils migration to the site of inflammation. Therefore, this investigation has shown promising antiinflammatory properties for this fraction, which may in the future become a potential therapeutic agent for the treatment of this pathology. For bladder muscle invasive cancer, although radical cystectomy has been considered the standard treatment is still associated with significant morbidity. In an attempt to provide a better quality of life for patients, interest in therapeutic approaches aimed the preservation of the urinary bladder have increased. In this regard, the radiotherapy has been highlighted by being a treatment modality already used. Thus, we investigated the effects of radiation on the purinergic signaling in T24 human bladder cancer cell line. Among the receptors expressed by T24 cells, the P2X6 receptor showed significant increase after radiotherapy. From the analysis of patients with bladder cancer (Kaplan-Meier), we noticed the relationship between high expression of this receptor and increased survival rate. Following, the involvement of ectonucleotidases after irradiation exposure in T24 cell line was also evaluated. The purinergic signaling, mainly through hydrolysis of ATP to adenosine by the combined action of ectoenzymes, demonstrated important role in radiotherapy in vitro. The transient induction of ecto-5’NT/CD73 expression by radiotherapy was also observed, being the adenosine generated a possible responsible in T24 cell death. The crucial role of ecto-5’NT/CD73 in the radiosensitization of the cells was confirmed by pharmacological inhibition and the use of the enzyme knockout. Taken together, the in vitro results demonstrate that the benefit of radiation therapy appears to be achieved in those patients that express the P2X6 receptor and the enzyme ecto-5’NT/CD73 in the tumor area, and in the future both may be considered potential markers for predicting the effectiveness response to radiotherapy for the treatment of bladder cancer. Finally, the radiometric ecto-5’NT/CD73 assay showed the potent inhibitory effect of ursolic acid on this enzyme, whose potential was also confirmed through the T24 cell line.

Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.