Le cœur des vertébrés est un organe modulaire qui requiert le " patterning " complexe des champs morphogénétiques cardiogènes et la convergence coordonnée des diverses sous-populations de progéniteurs cardiogéniques. Au moins 7 facteurs de transcription de la famille T-box coopèrent au sein de ces nombreuses sous-populations de progéniteurs cardiogéniques afin de réguler la morphogenèse et l’agencement de multiples structures le long de l’ébauche cardiaque, ce qui explique que les mutations humaines de ces gènes engendrent diverses malformations congénitales cardiaques (MCCs). L’un de ces gènes T-box, Tbx5, dont l’haploinsuffisance génère le syndrome de Holt-Oram (SHO), intervient dans une grande variété de réseaux de régulation géniques (RRGs) qui orchestrent la morphogenèse des oreillettes, du ventricule gauche, de la valve mitrale, des septums inter-auriculaire et inter-ventriculaire, ainsi que du système de conduction cardiaque. La diversité des RRGs impliqués dans la formation de ces structures cardiaques suggère que Tbx5 détient une profusion de fonctions qui ne seront identifiables qu’en répertoriant ses activités moléculaires dans chaque lignée cardiaque examinée isolément. Afin d’aborder cette problématique, une ablation génétique de Tbx5 dans l’endocarde a été réalisée. Cette expérience a démontré le rôle crucial de Tbx5 dans la survie des cellules endocardiques bordant le septum primum et des cardiomyocytes au sein de cette structure embryonnaire qui contribuera à la morphogenèse du septum inter-auriculaire. En outre, cette étude a révélé l’existence d’une communication croisée entre la sous-population de cellules endocardiques Tbx5+ et le myocarde au niveau du septum primum, afin d’assurer la survie des cardiomyocytes, et ultimement de garantir la maturation du septum inter-auriculaire. Nos résultats confirment aussi l’importance de l’interdépendance génétique (Tbx5 et Gata4 ainsi que Tbx5 et Nos3) entre différents loci dans la morphogenèse de la cloison inter-auriculaire, et particulièrement de l’influence que peut avoir l’environnement sur la pénétrance et l’expressivité des communications inter-auriculaires (CIAs) dans le SHO. En outre, puisque les fonctions d’un gène dépendent ordinairement des différents isoformes qu’il peut générer, une deuxième étude a focalisé davantage sur l’aspect transcriptionnel de Tbx5. Cette approche a mené à la découverte de 6 transcrits alternatifs exhibant des fonctions à la fois communes et divergentes. La caractérisation de 2 de ces isoformes a révélé le rôle de l’isoforme long (Tbx5_v1) dans la régulation de la croissance des cardiomyocytes durant la cardiogénèse, tandis que l’isoforme court (Tbx5_v2), préférentiellement exprimé dans le cœur mature, réprime la croissance cellulaire. Il est donc entièrement concevable que les mutations de TBX5 entraînant une troncation de la région C-terminale accroissent la concentration d’une protéine mutée qui, à l’instar de Tbx5_v2, interfère avec la croissance de certaines structures cardiaques. En revanche, la divergence de fonctions de ces isoformes, caractérisée par les disparités de localisation subcellulaire et de d’interaction avec d’autres cofacteurs cardiaques, suggère que les mutations affectant davantage un isoforme favoriseraient l’émergence d’un type particulier de MCC. Finalement, un dernier objectif était d’identifier le ou les mécanisme(s) moléculaire(s) par le(s)quel(s) Tbx5 régule son principal gène cible, Nppa, et d’en extraire les indices qui éclairciraient sa fonction transcriptionnelle. Cet objectif nécessitait dans un premier lieu d’identifier les différents modules cis-régulateurs (MCRs) coordonnant la régulation transcriptionnelle de Nppa et Nppb, deux gènes natriurétiques dont l’organisation en tandem et le profil d’expression durant la cardiogénèse sont conservés dans la majorité des vertébrés. L’approche d’empreinte phylogénétique employée pour scanner le locus Nppb/Nppa a permis d’identifier trois MCRs conservés entre diverses espèces de mammifères, dont un (US3) est spécifique aux euthériens. Cette étude a corroboré que la régulation de l’expression du tandem génique Nppb/Nppa requérait l’activité transcriptionnelle d’enhancers en complément aux promoteurs de Nppa et Nppb. La concordance quasiment parfaite entre les profils d’expression de Tbx5 et de ces deux gènes natriurétiques chez les mammifères, suggère que le gradient d’expression ventriculaire de Tbx5 est interprété par le recrutement de ce facteur au niveau des différents enhancers identifiés. En somme, les études présentées dans cette thèse ont permis de clarifier la profusion de fonctions cardiaques que possède Tbx5. Certaines de ces fonctions émanent de l’épissage alternatif de Tbx5, qui favorise la synthèse d’isoformes dotés de propriétés spécifiques. Les diverses interactions combinatoires entre ces isoformes et d’autres facteurs cardiaques au sein des diverses sous-populations de progéniteurs cardiogènes contribuent à l’émergence de RRGs cardiaques divergents. / The vertebrate heart is a modular organ, which requires the complex patterning of the morphogenetic heart fields and the coordinated convergence of the diverse subpopulations of cardiogenic progenitors. At least 7 transcription factors of the T-box family cooperate within these numerous subpopulations of cardiogenic progenitors to regulate the morphogenesis and the layout of multiple structures along the primordial heart tube, which explains that the human mutations of these genes induce various congenital heart defects (CHDs). One of these T-box genes, Tbx5, whose haploinsufficiency generates the Holt-Oram syndrome (HOS), intervenes in a wide variety of gene regulatory networks (GRNs) that orchestrate the morphogenesis of the atria, the left ventricle, the mitral valve, the inter-atrial and inter-ventricular septa, as well as the cardiac conduction system. The diversity of GRNs involved in the formation of these cardiac structures suggests that Tbx5 holds a profusion of functions which will be identifiable only by indexing its molecular activities in each separately examined cardiac lineage. To address this problem, a conditional knockout of Tbx5 in the endocardium was generated. This experiment demonstrated a crucial role of Tbx5 in the survival of the endocardial cells lining the septum primum and the cardiomyocytes within this embryonic structure, which will contribute to the morphogenesis of the inter-atrial septum. Moreover, this study revealed a crosstalk between the Tbx5-positive endocardial cells subpopulation and the myocardium at the level of the septum primum to ensure the survival of cardiomyocytes, and ultimately to guarantee the maturation of the inter-atrial septum. Our results also confirmed the importance of genetic interdependence (Tbx5 and Gata4 as well as Tbx5 and Nos3) between different loci in the morphogenesis of the inter-atrial septum, and particularly the influence that the environment can have on the penetrance and the expressivity of atrial septal defects (ASDs) in the HOS. Besides, since the functions of a gene usually depend on the different isoforms it can generate, a second study focused more on the transcriptional aspect of Tbx5. This approach led to the discovery of 6 alternative transcripts exhibiting both common and specific functions. The characterization of 2 of these isoforms revealed the role of the long isoform (Tbx5_v1) in the regulation of cardiomyocytes growth during cardiogenesis, whereas the short isoform (Tbx5_v2), preferentially expressed in the mature heart, represses cell growth. It is thus entirely conceivable that TBX5 mutations leading to a C-terminal truncation increase the concentration of a mutated protein, which, like Tbx5_v2, interferes with the growth of certain cardiac structures. On the other hand, the divergence of functions of these isoforms, characterized by the disparities of subcellular localization and interaction with other cardiac cofactors, suggests that mutations affecting more one isoform would favor the emergence of a particular type of CHD. Finally, a last objective was to identify one or several molecular mechanism(s) by which Tbx5 regulates its main target gene, Nppa, and to extract clues that might clarify its transcriptional function. This objective required in a first place to identify the various cis-regulatory modules (CRMs) coordinating the transcriptional regulation of Nppa and Nppb, two natriuretic genes whose tandem organization and expression pattern during cardiogenesis are preserved in most vertebrates. The phylogenetic footprint approach employed to scan the Nppb/Nppa locus allowed the identification of three CRMs evolutionary conserved between different mammals species, one of which (US3) is specific to eutherians. This study confirmed that the regulation of the tandem genes Nppb/Nppa required the transcriptional activity of enhancers in complement to Nppa and Nppb promoters. The almost perfect concordance between the expression profiles of Tbx5 and these two natriuretic genes in mammals, suggests that the ventricular expression gradient of Tbx5 is interpreted by the recruitment of this factor to the identified enhancers. Altogether, the studies presented in this thesis allowed clarifying the profusion of Tbx5 cardiac functions. Some of these functions emanate from the alternative splicing of Tbx5, which favors the synthesis of isoforms endowed with specific properties. The diverse combinatorial interactions between these isoforms and other cardiac factors within the various cardiogenic progenitor subpopulations contribute to the emergence of distinct cardiac RRGs.

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L‟épissage alternatif est un mécanisme de régulation de l‟expression des gènes ayant pris une importance croissante dans l‟étude du vivant. Si des méthodes existent pour déterminer les gènes qui y sont soumis, peu d‟outils sont disponibles pour suivre ces événements d‟épissage in vivo au cours du développement. Pourtant, la caractérisation des régulations sous-jacentes à ces évènements et la détermination des facteurs impliqués sont dépendantes de stratégies fiables pour les visualiser dans des conditions physiologiques.Nous avons développé un système adapté à l‟étude d‟événements d‟épissage basé sur un rapporteur fluorescent bicolore. Nous l‟avons appliqué à cinq gènes de l‟organisme modèle Caenorhabditis elegans et avons suivi leur épissage in vivo.Parmi les différents gènes suivis, deux d‟entre eux suivaient un modèle d‟épissage potentiellement stochastique, un autre une absence d‟épissage alternatif détectable. Les deux derniers gènes présentent un profil d‟épissage spécifique à certain types cellulaires mais ont un effet toxique sur l‟organisme lorsque nous les avons exprimés à partir de concatémères extrachromosomiques. Pour remédier à cela, nous avons choisi de mettre en place une méthode simplifiée d‟insertion en simple copie des rapporteurs utilisant le CRISPR-Cas.Nos résultats indiquent que le système rapporteur fonctionne avec succès. Cependant, il peut encore être amélioré pour se rapprocher des taux physiologiques de transcription grâce à une insertion en simple copie dans le génome de l‟organisme. Nous avons également révélé un événement sous le contrôle de régulations spatiales, temporelles et conditionnelles. De plus, nous avons créé une série de constructions capables de déterminer les éléments en cis impliqués dans la régulation du gène top-1. / Alternative splicing is a regulatory mechanism of gene expression which is increasingly studied in Life Science. Methods exist to study this mechanism but specific tools to follow each alternative splicing event in a spatio-temporal manner are lacking. Yet, the characterization of the regulation and the elements that determines them depends on valide strategies for visualising them in physiological conditions.We have developped a dual-fluorescent reporter-based system in order to follow alternative splicing event regulation in vivo. It has been applied to five different genes in the model organism Caenorhabditis elegans. Among the genes followed, two follow a potentially stochastic scheme, one show no visible sign of alternative splicing. The last display tissue specific splicing patterns but developed a toxic effect in the animal when expressed from a multicopy extrachromosomal array. To remediate this problem, we decided to develop a method that allows for simpler single copy insertion of fluorescent reporter using CRISPR-Cas.Our results indicates that the dual-fluorescent reporter works well. However, this system can be upgraded by getting close to physiological rates of transcription allowed by single-copy insertion in the genome of C.elegans. We also discovered an alternatiove splicing event which follows a spatial, temporal and conditionnal regulation. Moreover, we constructed a set of different reporter to unravel the regulation observed in the gene top-1.

Le cœur humain est un organe composé de différents types cellulaires tels que les cardiomyocytes, les fibroblastes, les muscles lisses et les cellules endothéliales. Ces cellules se diversifient grâce à des mécanismes moléculaires spécifiques en acquérant leurs propriétés fonctionnelles spécifiques. L’embryon de Drosophile est un modèle simple et adapté pour étudier la diversification des cellules cardiaques et leurs propriétés spécifiques. Le but du projet est d’améliorer notre connaissance sur les acteurs moléculaires qui contrôlent la diversification des cellules cardiaques. Pour atteindre cet objectif nous avons appliqué la méthode TRAP-rc ("rare cell Translation Ribosome Affinity Purification") suivie du séquençage ARN pour identifier les ARN messagers en cours de traduction spécifiques des cellules cardiaques Tin et Lb (Tin CBs et Lb CBs) à deux stades de développement corrélés avec la morphogenèse du cœur embryonnaire. Dans une première analyse focalisée sur l'analyse des données issues des TRAP-Seq sur cellules Tin nous avons mis en évidence que CAP et MSP-300 sont impliqués dans la migration des cardioblasts pendant la fermeture du cœur. En parallèle, nous avons également identifié deux autres gènes impliqués dans la morphogenèse, kon-tiki et dGrip qui semblent contrôler la cohésion des CBs au cours de la migration. En outre, nous avons trouvé qu'au stade 16, environ 60% des gènes enrichis sont communs entre les populations Tin et Lb. Parmi ces gènes, Src42, sqa et flr participent à la régulation du cytosquelette d'actine et nos analyses ont permis de démontrer qu'ils avaient également des fonctions dans la morphogenèse cardiaque. Nous avons également identifié des groupes de gènes plus spécifiques à chacune des populations ciblées. Une catégorie fonctionnelle fortement associée à la population Lb, comprend les gènes qui régulent l'épissage des ARN messagers et certains de ces gènes semblent être requis au cours de la morphogenèse cardiaque. Enfin, nous avons comparé nos données de TRAP-seq cardiaque avec des données de TRAP-Seq issues du muscle somatique (de l'équipe), et ainsi identifié près de 90 gènes qui présentent des isoformes protéiques spécifiques à chaque tissu notamment impliquées dans la formation de l'unité contractile sarcomérique. Ceci suggère que des mécanismes d'épissage spécifiques sont mis en place dans différents types cellulaires pour moduler les fonctions de certaines protéines musculaires. A travers ce projet, nous avons identifié de nouveaux acteurs généraux de la migration collective des cardioblastes au cours de la fermeture du cœur mais également de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans l’acquisition des propriétés spécifiques dessous populations cardiaques Tin et Lb et de tissus musculaires distincts. Nous espérons que les données générées permettront dans le futur de mieux comprendre les mécanismes de la cardiogenèse des vertébrés ainsi que l’étiologie de maladies cardiaques. / Cardiac cells diversification is required for the formation of a functional heart. Human heart is a multi-lineage organ that develops through progressive diversification of progenitors derived from different heart fields. This process is underlined by numerous changes in the expression of a repertory of genes that allow cells to acquire their own identity and functions. The Drosophila embryo is a relatively simple model to study the diversification of cardiac cells and their properties. The goal of this project is to identify the repertories of genes that control the formation of different types of cardiac cells. To reach this objective we applied Translation Ribosome Affinity Purification (TRAP) method followed by RNA sequencing in order to identify mRNA engaged in translation specific to two cardiac cell types (Tinman (Tin) and Labybird (Lb) expressing cells), at two different time windows. We obtained a list of enriched genes for the different types of cardiac cells and time points. In a first part, we focused our attention on the Tindatasets and found that two genes, CAP and Msp300, are involved in cardioblasts migration during the heart closure. Then we identified two other candidate genes kontiki and dGrip that seem to contribute to maintain cohesion between CBs during heartmorphogenesis. Moreover by comparing our spatial datasets, we found that for the same time point, around 60% of Tin CBs enriched genes are common with Lb CBs enriched population and within this group we identified evolutionary conserved genes such as Src42, flr and sqa known to be involved in the cytoskeleton organization and in the actinpolymerization and depolymerisation. Our premiminary analyses show that they seem to be required for correct cardiac morphogenesis. We also identified sets of genes more specific for each cardiac cell population. Indeed, Lb CBs datasets show that in early stage there is the enrichment of genes mostly involved in transcriptional regulation and RNA splicing and some of these genes (prp8 and prp38) are involved in cardiac development. In parallel, we compared our TRAP-Seq dataset in the cardiac system with the TRAP-seqon muscle cells, and identified close to 90 genes that present cardiac or muscular specific isoforms. It is known that the alternative splicing, by increasing proteins diversity, contributes to the acquisition of specific cell properties. Furthermore, some cardiomyopathies are associated to defects in the alternative splicing of genes encoding sarcomeric proteins that we found in our dataset such as Tropomyosin and Zasp52. With this project, we have identified new actors of collective cardioblast migration and a set of genes with potential role in the acquisition of individual properties of Tin and Lbcardiac cells or of specific type of muscle tissue. We hope that our data could provide new insights into the genetic control of vertebrate cardiogenesis and into etiology of cardiac diseases.

Les progrès des technologies de séquençage ont joué un rôle important dans le diagnostic moléculaire des maladies rares, telles que les myopathies et les dystrophies musculaires. Cependant, plusieurs patients atteints de maladies neuromusculaires restent sans diagnostic. Ceci est dû à la grande hétérogénéité clinique et génétique ainsi qu'au caractère hautement polymorphique des gènes associés à ces troubles. L'interprétation des données génétiques est un grand défi et les tests génétiques aboutissent souvent à l'identification de variants de signification inconnue (VUSs). Plusieurs de ces variants peuvent perturber l'épissage normal de l'ARN ou affecter l'expression des gènes. À cet égard, nous proposons une approche bio-informatique. Notre objectif est de mettre en place un pipeline identifiant et caractérisant des variants d'intérêt dans un contexte pathologique. Afin de déterminer si les variants ont un impact fonctionnel, notre pipeline se concentre sur l'épissage alternatif ainsi que sur l'intégration des données génomiques et transcriptomiques. Nous émettons l'hypothèse qu'une partie des patients sans diagnostic pour leur maladie neuromusculaire s'explique par des variants introniques jouant un rôle régulateur ou affectant l'épissage et l'abondance de l'ARNm. Cette approche multi-omique permet de déterminer si les variants ont un impact fonctionnel. Pour ce faire, nous avons réalisé un séquençage de l'ARN et de l'ADN à partir de biopsies musculaires de quatre patients. Les données ont été alignées et annotées avec différents scores de pathogénicité. Les événements d'épissage sont analysés par SpliceAI et rMATS. L'analyse des gènes différentiellement exprimés a été réalisée par l'outil LPEseq. Les CNVs et les expansions de répétitions ont été analysés avec CNVkit et ExpansionHunter. Plusieurs scripts maison filtrent et intègrent les données ARN et ADN. Pour l'instant, un total de huit variants pathogéniques sont proposés pour nos patients, mais des investigations supplémentaires sont nécessaires. Les variants recherchés sont rares et nécessitent donc un pipeline cohérent et efficace. Ce projet apportera un bénéfice significatif pour les patients en leur permettant d'obtenir un diagnostic et ainsi d'avoir accès à un meilleur suivi clinique. / Advances in sequencing technologies have played an important role in the molecular diagnosis of rare diseases, such as myopathies and muscular dystrophies. However, several patients with these neuromuscular diseases remain undiagnosed. This is due to the great clinical and genetic heterogeneity as well as the highly polymorphic nature of the genes associated with myopathies and muscular dystrophies. The interpretation of genetic data is a great challenge and genetic testing often results in the identification of variants of uncertain significances (VUSs). Many of these variants can disrupt normal RNA splicing or affect gene expression. In this regard, we propose a bioinformatics approach. Our aim is to put in place a pipeline identifying and characterizing variants of interest in a pathological context. To determine if the variants have a functional impact, our pipeline focuses on alternative splicing as well as the integration of genomic and transcriptomic data. We hypothesize that a portion of patients without a diagnosis for their neuromuscular disorder is explained by intronic variants having a regulatory role or affecting mRNA splicing and abundance. This multi-omics approach will make it possible to determine whether the variants have a functional impact. To do so, we performed RNA and DNA sequencing using muscle biopsies from four patients. Data was aligned and annotated with different pathogenicity scores. Splicing events are analyzed by SpliceAI and rMATS. The analysis of the differentially expressed genes was carried out by the LPEseq tool. CNVs and repeat expansion were analyzed with CNVkit and ExpansionHunter. Several in-house scripts filter and integrate RNA and DNA data. For now, a total of eight pathogenic variants are proposed for our patients, but further investigations are needed. The variants sought are rare and therefore require a coherent and efficient pipeline to facilitate their characterization. This project will have a significant benefit for patients by allowing them to obtain a diagnosis and thus have access to better clinical follow-up.

L’hypothyroïdie congénitale (HC), qui se traduit par une insuffisance d’hormone thyroïdienne (HT) à la naissance, est la maladie endocrinienne congénitale la plus fréquente avec une prévalence d’un cas sur 2,500 naissances vivantes. Non-traitée, cette insuffisance peut entrainer un retard de développement sévère, surtout au niveau cognitif. L’HC est le plus souvent due à un défaut lors du développement de la thyroïde (dysgénésie thyroïdienne (DT)) ou lors de la production des hormones thyroïdiennes (dyshormonogenèse (D)). La majorité des cas d’HC par dysgénésie thyroïdienne (HCDT) ont une ectopie, soit une glande mal positionnée. Contrairement aux dyshormonogenèses, qui s’expliquent fréquemment par des mutations dans les gènes responsables de la production des HT, selon un modèle autosomique récessif, les causes de l’HCDT demeurent largement inconnues. Certains arguments sont en faveur d’une prédisposition génétique (le risque relatif chez les parents de premier degré est de 40 fois supérieur à celui de la population générale) mais l’HCDT ne suit pas un modèle Mendélien: 98 % des cas sont sporadiques et 92 % des jumeaux monozygotiques sont discordants pour l’HCDT. De ce fait, nous avons suggéré une hypothèse de double-hit pour expliquer les HCDT, hypothèse combinant une prédisposition germinale (héritée ou de novo) à un évènement somatique (génétique ou épigénétique). Par le passé, nous avons étudié l’évènement somatique, mais nous n’avions pas encore étudié la prédisposition germinale. Le séquençage d’exome complet peut permettre d’identifier la cause génétique dans des formes familiales d’HC, mais aussi déterminer si les cas avec une HCDT isolée sont enrichis en variants délétères, tel qu’observé chez des patients avec une malformation cardiaque congénitale, patients qui partagent des caractéristiques similaires avec ceux atteints d’HCDT. De plus, cette technique pourrait permettre d’identifier de nouveaux gènes de prédisposition associés à l’HCDT. D’une part, nous avons séquencé l’exome d’un trio (parent-enfant) afin d’identifier la cause de l’HC dans une famille avec plusieurs enfants sévèrement atteints d’HC. D’autre part, nous avons comparé les données d’exome d’une cohorte de cas avec une HCDT isolée (HCDT non syndromique, HCDT-NS) à celles d’une cohorte contrôle, à l’aide d’une approche biaisée (gene-based burden) et non biaisée (gènes candidats). Finalement, nous avons développé le modèle de poisson-zèbre afin de pouvoir valider, in vivo, l’implication de potentiels gènes candidats, dans le développement thyroïdien. L’analyse de l’exome du trio a révélé un variant dans le gène TSHR qui co-ségrégait parfaitement avec le phénotype, et les études de minigène ont permis de montrer que ce variant intronique loin des sites d’épissage traditionnels introduisait un pseudo-exon dans la séquence du TSHR, créant ainsi un récepteur tronqué et inactif. L’analyse par comparaison de cohorte (cas-contrôle) a montré que les cas avec une HCDT-NS n’ont pas davantage de variants rares délétères comparé aux contrôles. De plus, après correction, le gene-based burden n’a pas identifié de gène candidat. Par contre, des variants rares pathogéniques ou probablement pathogéniques dans des gènes liés à l’hypothyroïdie congénitale ont été identifiés chez 42% des cas. Les études réalisées chez le poisson-zèbre sur un gène candidat, IKBKE, identifié par une analyse préliminaire de l’exome dans la cohorte de cas, confirme que les vaisseaux sanguins sont importants pour le bon positionnement de la glande thyroïde chez le poisson-zèbre, mais ne permet pas d’établir le rôle d’IKBKE dans la migration thyroïdienne. Nous avons d’abord montré que l’exome est une bonne technique pour identifier la cause de l’HC dans une famille avec plusieurs enfants atteints. Toutefois, une connaissance approfondie de la maladie et des isoformes du gène d’intérêt s’est avérée essentielle afin de bien analyser les données d’exome. Ensuite, nos résultats suggèrent que les cas avec une HCDT-NS n’ont pas davantage de variants délétères que les contrôles et que l’exome complet n’est pas suffisant pour identifier des gènes de prédisposition. Le séquençage du génome est peut-être nécessaire pour trouver une prédisposition génétique à l’HCDT-NS. Par contre, il est aussi possible que la génétique ne joue pas un rôle majeur dans les dysgénésies thyroïdiennes. Finalement, nous avons validé que le poisson-zèbre est un bon modèle pour étudier le développement de la thyroïde. / Congenital hypothyroidism (CH) is a disorder with a prevalence of one in 2,500 live births. CH can lead to severe intellectual disability if left untreated. It is most commonly caused by a defect during thyroid development (thyroid dysgenesis), which results in an ectopic gland in the majority of cases. A defect in thyroid hormone production (dyshormonogenesis) is the second most common cause of CH. In contrast to dyshormonogenesis, which generally has an identified cause and follows a Mendelian mode of inheritance, the cause of CHTD remains mostly unknown. CHTD is generally sporadic (98%) and has a high discordance rate (92%) between monozygotic twins. However, first-degree relatives are affected more often than by chance alone (40x) and there is an ethnic and female predominance. We thus hypothesized that CHTD is a disorder caused by two events, one germinal (a necessary but not sufficient predisposing factor) becoming pathogenic only if a second genetic or epigenetic event occurs at the somatic level. Whole exome sequencing (WES) can allow for identification of the genetic cause of CHTD in familial forms, but may also reveal if non-syndromic CHTD (NS-CHTD) cases are enriched in rare protein-altering variant, as seen in congenital heart malformations, a developmental defect that shares several characteristics with CHTD. Moreover, it might also identify new predisposing genes. First, we performed WES on a trio (parent-child) in a family with several siblings affected with severe CH. Second, we compared WES data of a NS-CHTD cohort with data from a control cohort, using a gene-based burden (unbiased) approach and a candidate gene (biased) approach to evaluate whether WES analysis allows to identify new predisposing genes in a well-characterized cohort. Finally, we developed the zebrafish model to test the roles of candidate genes, that will be identified by WES, in thyroid development. We first identified a variant in TSHR that segregated perfectly with the phenotype in the family with CHTD and a mini gene assay showed that this deep intronic variant induced a pseudo-exon, leading to a truncated protein missing the transmembrane domain, thus an inactive TSH receptor. Next, we found that NS-CHTD cases are not enriched in rare protein-altering variants and gene-base burden analysis did not identify novel candidate genes. However, WES data revealed pathogenic or likely pathogenic variants in CH-related genes in 42% of the NS-CHTD cases. Finally, zebrafish is a good model to study thyroid development and our results on IKBKE confirm the importance of vessels in thyroid positioning, but not its role in thyroid migration. First, we showed that WES analysis is a good tool to identify the causative variant in a family with several siblings affected by CH. However, the interpretation of the exome analysis required knowledge of the expression of the relevant isoforms and of the biology of the disease. Second, while a gene-based burden test, using WES data from a well-characterised NS-CHTD cohort, did not identified new predisposing genes, it identified pathogenic or likely pathogenic variants in 42% of the NS-CHTD cases. Whole genome sequencing might be required to identify the genetic causes in NS-CHTD. However, our result may indicate that genetics does not play a major role in thyroid dysgenesis. Finally, we have established that zebrafish is a good model to study thyroid development and may help, in the future, identify pathways implicated in this process.

Dans cette thèse, l’impact du polymorphisme rs3846662 sur l’épissage alternatif de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase (HMGCR) a été investigué in vivo, chez des patients atteints d’hypercholestérolémie familiale (HF) ou de maladie d’Alzheimer (MA). Le premier manuscrit adresse la problématique de la normalisation de la quantification relative des ARNm par PCR quantitative. Les découvertes présentées dans ce manuscrit nous ont permis de déterminer avec un haut niveau de confiance les gènes de référence à utiliser pour la quantification relative des niveaux d’ARNm de l’HMGCR dans des échantillons de sang (troisième manuscrit) et de tissus cérébraux post-mortem (quatrième manuscrit). Dans le deuxième manuscrit, nous démontrons grâce à l’emploi de trois cohortes de patients distinctes, soit la population canadienne française du Québec et les deux populations nord américaines « Alzheimer’s Disease Cooperative Study (ADCS) » et « Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) », que le génotype AA au locus rs3846662 confère à ces porteurs une protection considérable contre la MA. Les femmes porteuses de ce génotype voient leur risque de MA diminuer de près de 50% et l’âge d’apparition de leurs premiers symptômes retarder de 3.6 ans. Les porteurs de l’allèle à risque APOE4 voient pour leur part leurs niveaux de plaques séniles et dégénérescences neurofibrillaires diminuer significativement en présence du génotype AA. Enfin, les individus atteints de déficit cognitif léger et porteurs à la fois de l’allèle APOE4 et du génotype protecteur AA voient leur risque de convertir vers la MA chuter de 76 à 27%. Dans le troisième manuscrit, nous constatons que les individus atteints d’HF et porteurs du génotype AA ont, contrairement au modèle établi chez les gens normaux, des niveaux plus élevés de cholestérol total et de LDL-C avant traitement comparativement aux porteurs de l’allèle G. Le fait que cette association n’est observée que chez les non porteurs de l’APOE4 et que les femmes porteuses du génotype AA présentent à la fois une augmentation des niveaux d’ARNm totaux et une résistance aux traitements par statines, nous indique que ce génotype influencerait non seulement l’épissage alternatif, mais également la transcription de l’HMGCR. Comme une revue exhaustive de la littérature ne révèle aucune étude abondant dans ce sens, nos résultats suggèrent l’existence de joueurs encore inconnus qui viennent influencer la relation entre le génotype AA, l’épissage alternatif et les niveaux d’ARNm de l’HMGCR. Dans le quatrième manuscrit, l’absence d’associations entre le génotype AA et les niveaux d’ARNm Δ13 ou de protéines HMGCR nous suggère fortement que ce polymorphisme est non fonctionnel dans le SNC affecté par la MA. Une étude approfondie de la littérature nous a permis d’étayer cette hypothèse puisque les niveaux de HNRNPA1, la ribonucléoprotéine influencée par l’allèle au locus rs3846662, sont considérablement réduits dans la MA et le vieillissement. Il est donc proposé que les effets protecteurs contre la MA associés au génotype AA soient le résultat d’une action indirecte sur le processus physiopathologique. / In this thesis, the impact of rs3846662 polymorphism on the alternative splicing of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR) was investigated in vivo, in patients with familial hypercholesterolemia (FH) or Alzheimer disease (AD). The first manuscript addresses the issue of normalization in relative quantification of mRNA by quantitative PCR. The findings presented in this manuscript have allowed us to determine with a high level of certainty the appropriate reference genes to use for the relative quantification of HMGCR mRNA levels in blood samples (third manuscript) and postmortem brain tissues (fourth manuscript). In the second manuscript, we demonstrate through the use of three independent cohorts, namely the French Canadian population of Quebec and the two North American populations named "Alzheimer's Disease Cooperative Study (ADCS)" and "Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) ", that the AA genotype at locus rs3846662 confers significant protection against AD. Women carrying this genotype decrease their risk of AD by about 50%, and delay their age of onset of 3.6 years. For their part, individuals carrying both the APOE4 risk allele and the AA genotype have decreased levels of senile plaques and neurofibrillary tangles compared to individuals carrying both the APOE4 and HMGCR G alleles. Finally, individuals suffering from mild cognitive impairment and carrying both the APOE4 risk allele and the protective AA genotype see their risk of converting to AD drop from 76% to 27%. In the third manuscript, contrary to the model described in normal subjects, we discovered that individuals with FH carrying the AA genotype have higher levels of total cholesterol and LDL-C before treatment compared to the carriers of the G allele. This latter association is observed only in non-carriers of the APOE4 risk allele. Furthermore, women carrying the AA genotype have both an increase in total HMGCR mRNA levels and a decrease response to statin treatment. These results suggest the AA genotype has an impact not only on the alternative splicing, but also on the transcription of HMGCR. Since an exhaustive review of the literature has reveal no studies corroborating this hypothesis, our results suggest the existence of yet unknown players influencing the relationships between the AA genotype, alternative splicing and the mRNA levels of HMGCR. In the fourth manuscript, we uncovered no association between the AA genotype and Δ13 mRNA or HMGCR protein levels. This strongly suggests that the rs3846662 polymorphism is not functional in the CNS affected by AD. A thorough study of the literature enabled us to support this hypothesis since the levels of HNRNPA1, the ribonucleoprotein influenced by the allele status at rs3846662 locus, are significantly reduced in AD and aging. Accordingly, we propose that the protective effects of the AA genotype against AD may be mediated through indirect effects on the physiopathology of the disease.

La régulation de l’expression des gènes est fondamentale pour coordonner la synthèse, l’assemblage et la localisation des complexes macromoléculaires dans les cellules. Cette expression est régulée à divers niveaux. Elle commence dans le noyau où les facteurs de transcription se lient à des séquences spécifiques d’ADN et recrutent les ARN polymérases pour la synthèse des ARN. La régulation à ce niveau est dite transcriptionnelle. Les protéines de liaison à l’ARN s’associent avec l’ARN en cours de synthèse et opèrent divers modifications comme l’addition d’une coiffe en 5’, l’épissage, l’édition et la poly-adénylation en 3’. Les transcrits sont alors exportés vers le cytoplasme où ils vont être adressés et stockés dans des régions subcellulaires. Les ARNm s’assemblent avec des facteurs de traduction et les ribosomes pour initier la synthèse protéique de manière contrôlée. Enfin, les ARNm sont dégradés. Les régulations qui touchent chacune de ces étapes sont dites post-transcriptionnelles. Le développement récent d’outils d’analyse à l’échelle génomique ont permis une meilleure compréhension globale des programmes de régulation des gènes au niveau transcriptionnel. Cependant, l’architecture globale des systèmes qui régulent les étapes post-transcriptionnelles d’expression des gènes est encore peu connue. Un tel système de régulation post-transcriptionnelle doit être contrôlé par des centaines de protéines de liaison à l’ARN et de microARN (miARN) encodés dans les génomes eucaryotes. C’est pourquoi il est important de disposer d’outils et de plateformes adaptés à l’étude de cette régulation à l’échelle génomique. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés à deux programmes de la régulation post-transcriptionnelle chez Caenorhabditis elegans : l’épissage alternatif et la régulation par les miARN. Nous avons utilisés des vers rapporteurs de l’épissage alternatif exprimant la double fluorescence GFP et RFP afin d’étudier l’architecture de cette régulation et l’identification ou la validation des facteurs en trans et des éléments en cis par génétique classique en utilisant la mutagenèse aléatoire, l’automatisation du crible grâce au COPAS biosorter et le séquençage des génomes entiers. Nous avons également modifiés en profondeur le module ReFlx du cytomètre en flux adapté aux organismes de grande taille (COPAS Biosorter) afin d’éliminer les problèmes de contamination et diviser par sept le temps nécessaire au traitement dans le but de mener une étude de génétique inverse à haut débit par ARN interférence. Nous avons enfin générer des lignées fluorescentes bi-colores pour étudier la régulation dépendante de la région 3’ UTR grâce aux microARN. / The regulation of gene expression is fundamental to coordinate the synthesis, assembly and localization of macromolecular complexes in cells. This expression is regulated at various levels. It begins in the nucleus where transcription factors bind to specific DNA sequences and recruit RNA polymerases to synthesize RNA. Regulation at this level is called transcriptional. RNA binding proteins associate with RNA during synthesis and operate various modifications such as the addition of a 5' cap, splicing, editing and polyadenylation at the 3'. The transcripts are then exported to the cytoplasm where they will be sent to subcellular regions and stored. mRNA are then associated with translation factors and ribosomes to initiate protein synthesis in a controlled manner. Finally, mRNAs are degraded. Regulations that affect each of these steps are called post-transcriptional regulations. The recent tools developments for genomic scale analysis have allowed a better overall understanding of gene regulation programs at the transcriptional level. However, the overall architecture of systems that regulate post-transcriptional steps of gene expression is still misunderstood. Such a system of post-transcriptional regulation must be controlled by hundreds of RNA binding proteins and microRNA (miRNA) encoded in eukaryotic genomes. This is why it is important to have tools and platforms suited to the study of the post-transcriptional regulation on a genomic scale. During this thesis, we have focused our work on two post-transcriptional regulation programs in Caenorhabditis elegans : alternative splicing and miRNAs regulation. We used GFP and RFP double fluorescent alternative splicing reporter lines to study the architecture of this regulation and to identify trans factors and cis-elements by using forward genetics, random mutagenesis, automated screen through COPAS biosorter and whole genome sequencing. We also extensively modified the ReFlx module of the COPAS to fix carry over problems and divide by seven the time required for processing in order to conduct a High throughput reverse genetic study using RNA interference. We finally generate bi-color fluorescent lines to study 3 'UTR regulation mediated by microRNAs.

Le gène suppresseur de tumeurs TP53 exprime plusieurs isoformes, dont Δ40p53 (perte du domaine de transactivation) et Δ133p53 (perte du domaine de transactivation et d’une partie du domaine de liaison à l’ADN). Ces isoformes inhibent l’activité suppressive de p53 et seraient sur-exprimées dans les cancers (sein et mélanome). Dans les cancers faiblement associés à une mutation TP53, ces isoformes seraient de bons candidats pour inactiver p53. Il convient de comprendre les mécanismes transcriptionnels qui régulent leurs expressions. Δ133p53 est produite par un promoteur alternatif P3 localisé dans TP53. Nous avons montré que Δ133p53 est un gène cible de p53, qui transactive le promoteur P3 par fixation sur un élément de réponse présent dans l’exon 4. L’expression de Δ133p53 est corrélée à celle d’autres gènes cibles de p53 en réponse à un stress génotoxique. De plus, elle réprime la suppression de la prolifération induite par p53 en inhibant ses capacités de liaison à l’ADN. Δ40p53 est produite par épissage alternatif, dont la rétention de l’intron 2 favorise sa traduction et empêche celle de p53. Nous avons montré que des structures de type G-quadruplexes présentes dans l’intron 3 régulent l’exclusion de l’intron 2. Ces structures comprennent le polymorphisme TP53PIN3 (duplication de 16pb), qui change leur localisation et affecte l’expression des ARNm codant p53 et Δ40p53. De plus, nous avons montré que ce polymorphisme est associé à une accélération de la cancérogenèse dans le syndrome Li-Fraumeni, caractérisé par la présence d’une mutation germinale TP53 (effet modificateur: 19 ans de différence à l’âge moyen du premier diagnostique entre les deux variants). L’expression des isoformes de p53 dépend de mécanismes transcriptionnels différents, indiquant des rôles différents dans la modulation des fonctions suppressives de p53. En plus d’inactiver p53 dans les cancers, ces isoformes pourraient être à l’origine des effets modificateurs des polymorphismes de TP53 sur les mutants p53. / The TP53 tumour suppressor gene expresses several isoforms, of which Δ40p53 (lack of transactivation domain) and Δ133p53 (lack of both transactivation and part of DNA-binding domains). These isoforms inhibit p53 suppressive activity and have been shown to be over-expressed in cancers (breat and melanoma). In cancers associated with low TP53 mutation rate, these isoforms could be great candidates to inactivate p53. It seems important to understand the transcriptional mechanisms that regulate their expression. Δ133p53 is produced by an alternative P3 promoter within TP53. We showed that Δ133p53 is a p53 target gene. p53 transactivates the P3 promoter and interact with a response element within exon 4. Δ133p53 expression is correlated to other p53 target genes in response to genotoxic stress. In addition, Δ133p53 inhibits p53-dependent suppression of proliferation by inhibiting p53 DNA-binding activity. Δ40p53 is produced by alternative splicing: retention of intron 2 favours its translation while it avoid the one of p53. We showed that G-quadruplex structures are formed in intron 3 and regulate retention of intron 2. The TP53PIN3 polymorphism (16 bp duplication) is embedded within these structures and affects their locations leading to variation of mRNA expression of p53 and Δ40p53. In addition, we showed that this polymorphism is associated with acceleration of carcinogenesis in Li-Fraumeni syndrome, characterized by germline TP53 mutation (genetic modifier effect: difference of 19 years in mean age at first diagnosis of cancer between the two variants). The expression of p53 isoforms depends on different transcriptional mechanisms, suggesting different roles in the modulation of p53 suppressive functions. In addition to inactivate p53 in cancers, these isoforms could be the mediators of modifier effects observed for TP53 polymorphisms on mutant p53.

Les fichiers accompagnant le document sont en format Microsoft Excel 2010. / Les modèles classiques de signalisation cellulaire eucaryotes sont généralement organisés en voies linéaires et hiérarchiques, impliquant un ensemble de facteurs restreint. Ces facteurs forment un circuit isolé qui transmet une information externe vers sa destination, d’où une réponse cellulaire sera alors engendrée. Or, ces modèles sont justement le fruit d’approches expérimentales réductionnistes qui ne permettent pas d’intégrer aisément la contribution de facteurs multiples, ni de faire une évaluation quantitative de l’apport des composantes du système. Le développement de techniques d’investigation plus holistiques, telles la génomique fonctionnelle et la protéomique, permettent d’examiner de manière systématique et quantitative l’apport d’ensembles larges de facteurs et de les mettre en relation avec d’autres systèmes cellulaires. Il y aurait donc lieu de réévaluer le modèle de voie de signalisation linéaire au profit d’un modèle de réseau de signalisation multiparamétrique, comportant plusieurs branches d’entrée et sortie de signal interagissant avec d’autres systèmes cellulaires. Cet ouvrage porte sur la voie RAS/MAPK, l’un des principaux axes de signalisation associé à la prolifération et la différenciation cellulaires. Le sujet y est d’abord abordé sous l’angle d’une perspective historique, en mettant l’emphase sur les contributions des études de génétique classique chez les organismes modèles D. melanogaster et C. elegans. Il fait ensuite état du développement du criblage par ARNi pan-génomique dans ces deux modèles en le comparant aux approches de criblage génétique classique. Le corps de l’ouvrage décrit ensuite les résultats expérimentaux d’une campagne de criblage par ARNi visant à dresser une carte globale des régulateurs de la voie chez la drosophile. Trois groupes de régulateurs identifiés dans ce crible ont été caractérisés de manière plus détaillée. Dans un premier article, nous démontrons que les composantes du complexe EJC ont un impact sur l’épissage de mapk; une découverte doublement intéressante puisque l’EJC était jusqu’alors associé qu’à la régulation post-épissage des ARNm. Une seconde publication fait état de l’ensemble des résultats du crible ARNi, mettant l’emphase sur un ensemble de facteurs d’épissage qui modulent également mapk. Nous y montrons que l’impact de ces facteurs sur l’épissage alternatif est différent de celui de l’EJC, suggérant ainsi deux modes de régulation distincts. Finalement, dans un troisième manuscrit, nous nous attardons au rôle d’Usp47, une déubiquitinase qui, contrairement aux autres facteurs identifiés dans le crible, régule l’expression de MAPK de manière post-traductionnelle. Nous y détaillons une stratégie de criblage d’interaction génétique par ARNi visant à identifier des facteurs reliés fonctionnellement à Usp47. Ce second crible a permis l’identification de trois facteurs reliés au « N-end rule », un mécanisme de dégradation des protéines caractérisé par la reconnaissance des résidus N-terminaux de protéines ou peptides. Il existait jusqu’alors très peu de données quant à la régulation de l’expression des composantes de la voie MAPK, ce qui rend la description d’un large réseau de régulateurs agissant sur l’expression de MAPK d’autant plus insoupçonnée. L’absence d’un réseau équivalent rattaché aux autres composantes de la voie laisse supposer que MAPK serait un noeud servant de point d’entrée à ce type de régulation dans le système RAS/MAPK. De plus, nos travaux témoignent de la capacité de la génomique fonctionnelle à mettre en relation différents systèmes cellulaires de manière plus globale et à quantifier les liens établis entre eux. / The classical model of eukaryotic cellular signalling generally involves hierarchically organized linear pathways involving a restricted set of elements. These generally function together as an insulated circuit, transmitting information from the outside to the intracellular compartment involved in eliciting a response. These models, often the fruit of reductionist experimental approaches, do not allow for the integration of multiple inputs nor for a gradation of responses. The recent emergence of more holistic investigation techniques has brought about the re-evaluation of these classical models in favor of multiparametric signalling networks. This thesis focuses on the RAS/MAPK pathway, one of the cell’s main proliferation and differentiation signalling conduits, beginning with a historical perspective covering the contributions of model organism genetics to the current pathway model. This provides context for the description of a whole-genome RNAi screen experiment that we carried out to obtain a global view of regulators in Drosophila. Three groups of factors emerging from this screen were then examined in more detail. A first article shows that the exon junction complex (EJC) plays a role in mapk alternative splicing, an observation that is unexpected given that this complex was not previously known to act on splicing. A second paper details the genome wide screening campaign and focuses on a large set of splicing factors that also regulate mapk, albeit in a distinct manner than the EJC’s. Finally, a manuscript in a third segment examines Usp47 function and finds it to control MAPK levels post-translationally. An RNAi-based genetic interaction screen is then used to identify factors functionally related to Usp47 capable of counteracting its impact on MAPK levels. Three such factors identified through this technique are linked to the N-end rule protein degradation pathway. Regulation of core pathway component expression is a poorly described process, which makes the identification of a large set of factors regulating MAPK expression all the more unusual. Moreover, the absence of such regulation linked to other pathway components suggests that MAPK may act as a node incorporating inputs of this type into RAS/MAPK signaling dynamics.