Desde os anos 50 o mercúrio tem chamado a atenção de muitos pesquisadores. No Brasil, a preocupação inicial se restringia à exposição humana pelo seu uso na mineração do ouro. Entretanto, nos últimos anos a atenção de muitos pesquisadores se voltou para outras fontes de exposição, incluindo fontes naturais. Na região Amazônica, os solos são naturalmente ricos em mercúrio. Devido a constante degradação da floresta, o solo se torna mais exposto à ação das chuvas que facilitam a passagem do mercúrio aos rios. Na água o mercúrio sofre um processo de metilação, se transformando em metilmercúrio (MeHg) que se acumula principalmente nos peixes da região. As populações ribeirinhas, que têm sua alimentação baseada no consumo de peixes, são as principais vítimas da exposição a este metal. Muito tem se estudado a respeito dos efeitos tóxicos do metilmercúrio, reconhecido como a forma do mercúrio mais perigosa à saúde humana, devido à alta solubilidade para atravessar barreiras biológicas, capacidade de bioacumulação e elevada meia-vida de eliminação dos tecidos. Dentre os efeitos tóxicos mais documentados do MeHg, encontram-se aqueles relacionados ao sistema nervoso. Entretanto, o sistema cardiovascular tem tomado destaque como um outro alvo a toxicidade do metal. Apesar do número considerável de estudos nesta área, ainda não há um consenso quanto aos mecanismos cardiotóxicos do mercúrio e muitos resultados em estudos clínicos são muito conflitantes. Alguns estudos em ratos sugerem uma relação entre a diminuição de disponibilidade do óxido nítrico (NO), com aumento na exposição ao metilmercúrio. O NO é um componente de extrema importância na fisiologia cardiovascular, porque mantêm o tônus vascular e inibe a agregação plaquetária. Por outro lado, uma dieta rica em peixes e castanhas, comum na região Amazônica, fornece ao organismo quantidades consideráveis de selênio (Se), um nutriente conhecido por propriedades antioxidantes bem como antagonista de efeitos tóxicos de alguns metais, principalmente o mercúrio. Isso sugere que os efeitos danosos do MeHg podem ser minimizados pela presença de selênio na dieta. Neste sentido, o presente estudo avaliou em uma população ribeirinha (n=265), do Rio Tapajós, no Estado do Pará a relação entre as concentrações de mercúrio e selênio em sangue, plasma e cabelo e os níveis de óxido nítrico no plasma. / Since the 1950s, the mercury has attracted attention of many researchers. In Brazil, the initial concern was restricted to human exposure of its use in gold mining. However in the latest years, many researchers have concerned to others exposure sources, including natural sources. In Amazon region, the soils are naturally rich in mercury. Soils become more exposed to rain actions, which provide the passage of mercury to the rivers due to forest degradation. In the water, mercury suffers a methylation process changing to methyl mercury (MeHg), which stores up mainly in the fish of that area. The riverside population, who has a diet based on fish, is the main victims of the exhibition to this metal. The toxic effects of methyl mercury have been studied and this metal is recognized as the most dangerous type of mercury to human health due to the high solubility to cross biological barriers, the capacity of bioaccumulation and the high half-life of elimination from tissues. Among the most studied toxic effects of MeHg, there are those related to the nervous system. However the cardiovascular system has been a highlight as another metal toxicity target. In spite of the large number of studies, there is not an agreement about the cardio toxic mechanisms of mercury and many results in clinical studies are very controversial. Some studies in mice suggest a relationship between the reduction of nitric oxide (NO) and the increase of methyl mercury exposure. Nitric oxide is a very important component in cardiovascular physiology because it maintains the vascular tone and inhibits the platelets aggregation. On the other hand, a diet based on fish and nuts, which are common in Amazon region, provides a large quantity of selenium (Se) to the organism. This nutrient is known by its antioxidant qualities and it is also known as an antagonist of some metal, especially mercury, toxic effects. These facts suggest that the harmful effects of MeHg may be reduced due to the presence of selenium in diet. Therefore, the present study has estimated the relationship among mercury and selenium concentrations in blood, plasma and hair and the nitric oxide levels in plasma, in a riverside population (n=265) of Tapajós River in Pará

O óxido nítrico (NO) é um dos mais importantes radicais livres da fisiologia humana. Desde a sua descoberta, inúmeras pesquisas são realizadas com o objetivo de encontrar métodos alternativos para detecção e quantificação deste radical in vitro, in vivo e ex vivo.Este trabalho consistiu no desenvolvimento e aperfeiçoamento de um sensor de NO construído a partir de uma matriz sólida de látex. O sensor proposto baseia-se no aprisionamento do complexo ferro(II)-dietilditiocarbamato Fe+2(DETC)2, dentro da matriz sólida. Neste caso, o NO é armadilhado no FeDETC, o que permite a sua detecção. O látex foi usado como matriz sólida por ser promissor em aplicações biomédicas, pois apresenta excelentes propriedades de bio-compatibilidade e de estímulo natural a angiogênese. Para a detecção do NO, bem como para a caracterização do sensor, foi utilizada a técnica de ressonância paramagnética eletrônica (RPE), devida a sua seletividade e sensibilidade. As análises dos processos de otimização do sensor sólido envolveram as concentrações de FeCl3.6H2O e DETC, temperatura do látex, proporção de FeDETC na matriz de látex, homogeneidade da membrana, sensibilidade e reprodutibilidade do sinal de RPE. O sensor apresentou uma alta estabilidade quando observado por RPE. A detecção do NO pôde ser obtido mesmo depois de 40 dias de exposição ambiente. Ele pode ser reutilizado e é capaz de medir o NO em concentrações de até 0,1mM. Estes resultados faz do látex-FeDETC um sensor promissor de NO onde a detecção com resolução espacial pode ser atingida. / Nitric oxide (NO) is one of the most important free radicals of the human physiology. Since its discovery, many efforts have been preformed in order to find alternative methods of detection and quantification for this radical in vitro, in vivo and ex vivo. In this work a NO sensor is made with a solid latex matrix was developed and improved. The proposed sensor is based on encapsulating the complex iron(II)-diethyldithiocarbamic Fe+2(DETC)2 in a solid matrix. In this case, the NO radical is trapped in FeDETC, which allows its detection. The latex was used as solid matrix due to excellent biocompatible, natural angiogenesis properties and it is a promising material to be applied in biological systems. The electron paramagnetic resonance (EPR), a selective and sensible technique, was used for the NO detection and sensor characterization. The fabrication and optimization processes was analyzed by FeCl36H2O and DETC concentrations, latex temperature, FeDETC/latex ratio, membrane homogeneity, sensitivity and reproducibility of the RPE signal. The sensor presents high stability when observed by EPR. The NO detection can be observed even after the sensor is exposed to ambient atmosphere for 40 days. It can be reused and is able to measure NO concentration of 0,1mM. These results make the latex-FeDETC a promising NO sensor.

Sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica frente a um estímulo infeccioso. Na fase inicial da doença ocorre aumento da secreção de vasopressina (AVP) e na fase tardia observamos uma redução, apesar dos elevados níveis de mediadores inflamatórios e agravamento da hipotensão que são estímulos para a secreção do hormônio. O óxido nítrico (NO), produzido pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), parece modular a secreção de AVP dependendo do contexto fisiopatológico. Durante sepse experimental nosso grupo demonstrou que as concentrações plasmáticas de nitrato, que servem como índice da produção de NO, se elevam progressivamente durante a evolução da doença, mas não há evidências de que isto ocorra também a nível central. Nosso objetivo foi avaliar temporalmente a concentração de nitrato no líquido cefalorraquidiano (LCR) e a atividade enzimática das NOS no hipotálamo de ratos submetidos à sepse por ligadura e perfuração cecal (CLP). Os procedimentos, aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Campus de Ribeirão Preto (CEUA-USP, protocolo nº 10.1.294.53.7), foram realizados com ratos Wistar pesando 250 ± 30 gramas, os quais foram divididos em dois grupos: CLP e operação fictícia (OF). Após 0, 2, 6 e 24 horas das cirurgias, foi feita a coleta do LCR para a determinação da concentração de nitrato pelo método de quimiluminescência NO/ozônio. Imediatamente após os animais foram decapitados para coleta de sangue utilizado para determinação de hematócrito, sódio sérico, proteína, interleucina (IL)-1?, nitrato e AVP plasmáticos. Também foram removidas as neurohipófises para análise do conteúdo de AVP e o hipotálamo para análise da atividade da NOS pelo método da Citrulina. Nos animais sépticos, as concentrações plasmáticas de AVP seguiram o padrão esperado, com aumento em 2h e 6h, retornando a níveis basais em 24h. Os estoques neurohipofisários de AVP reduziram em 2h e 6h retornando a níveis basais em 24h. O sódio sérico e as proteínas plasmáticas diminuíram 2h, 6h e 24h após CLP, e os hematócritos aumentaram nos mesmos períodos. As concentrações plasmáticas de IL-1? e nitrato aumentaram 6h e mantiveram-se elevadas 24h após CLP. Entretanto, no LCR o nitrato aumentou em 6h, mas retornou a níveis basais em 24h. A atividade hipotalâmica das NOS totais e constitutivas eram de 50 a 100 vezes maiores que as das NOS induzidas e aumentaram 6h e 24h após a CLP. Os resultados deste estudo mostram que as atividades das NOS observadas no hipotálamo ex vivo dos ratos sépticos indicam a presença de formas viáveis das enzimas, sendo a isoforma constitutiva a mais relevante para a produção de NO nesta região cerebral. Além disso, as alterações temporais das concentrações de nitrato no LCR diferem da de nitrato plasmático, revelando um perfil diferenciado da produção de NO central em relação à periférica, e que este pode estar relacionado à secreção bifásica de AVP na sepse / Sepsis is defined as a systemic inflammatory response to an infectious stimulus. In the initial phase of the disease the secretion of vasopressin (AVP) is increased and late is observed a reduction, although high levels of inflammatory mediators and worsening of the hypotension, which are stimuli for the hormone secretion. Nitric oxide (NO) produced by the enzyme nitric oxide synthase (NOS), appears to modulate the secretion of AVP depending on the pathophysiological context. During experimental sepsis our group demonstrated that the plasma nitrate concentrations, which serve as an index of NO production, increase gradually during the course of the disease. However, there is no evidence that this also occurs at the central level. Our aim was to evaluate the temporal nitrate concentration in the cerebrospinal fluid (CSF) and the enzymatic activity of NOS in the hypothalamus of rats submitted to sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). The procedures, approved by the Ethics Committee on Animal Use of the Campus of Ribeirão Preto (CEUA - USP, Protocol nº10.1.294.53.7) were performed with Wistar rats weighing 250 ± 30 grams, which were divided into two groups: CLP and Sham operation. After 0, 2, 6 and 24 hours of surgery, CSF was collected for determining the nitrate concentration by the chemiluminescence NO/ozone method. Immediately after, the animals were decapitated, blood was collected and used for hematocrit, serum sodium, protein, interleukin (IL)-1?, nitrate and plasma AVP determination. The neurohypophysis was removed for AVP content determinations and hypothalamus for NOS activity analysis by the method of citrulline. In septic animals, plasma concentrations of AVP showed the expected pattern, an increase at 2h and 6h and returning to basal levels at 24h. The AVP neurohypophyseal stocks decreased at 2h and 6h returning to basal levels at 24h. The sodium serum and plasma proteins decreased 2h, 6h and 24h after CLP, and the hematocrit increased at the same periods. The plasma concentration of IL-1? and nitrate increased 6h and remained elevated 24h after CLP. However, in the cerebrospinal, nitrate increased at 6h but returned to basal level in 24h. The total and constitutive NOS activities were fifty to one hundred times higher than inducible NOS and were increased 6h and 24h after CLP. These results suggest that the activity of NOS observed in the hypothalamus ex vivo of rats septic indicates the presence of viable forms of enzymes, and that the constitutive isoform is the most relevant for the NO production in this brain region. Moreover the temporal alterations of the nitrate concentrations in the CSF differ from the plasma nitrate, showing a different profile of the central and peripheral NO production, which may be related to biphasic AVP secretion in the sepsis.

O óxido nítrico (NO) é um versátil agente biológico, atuando em diversas partes do organismo, tais como cérebro, artérias, sistema imunológico, fígado e pulmões. Alterações nos níveis basais de NO são relacionadas a causas de diversas doenças como hipertenção, câncer, doença de Raymond´s e agregação plaquetária. Visando suprir tal deficiência, mostrou-se de grande valia a obtenção de fármacos capazes de liberar quantidades significativas de NO e de maneira controlada. Uma das possibilidades é o uso de compostos de coordenação, com centro metálico rutênio coordenado ao ligante nitrosil, os quais possuem como característica liberação de NO por estímulo externo. Neste trabalho foram estudados as propriedades químicas, fotoquímicas, farmacológicas e tumoricidas do complexo trans-[RuC(MAC)NO]2+, onde MAC é 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (cyclam) ou 1,4,8,12-tetraazaciclopentadecano ([15]aneN4), na presença do fotossensibilizador [Ru(NH3)5pz]2+. Os estudos fotoquímicos mostraram que o fotossensibilizador utilizado, [Ru(NH3)5pz]2+, possui tempo de vida no estado excitado de 113 ps, e apresenta processos de transferências eletrônicas e de energia fotoinduzida com o oxigênio molecular, gerando espécies reativas de oxigênio (EROS) como oxigênio singlete e ânion superóxido. Na presença do complexo macrocíclico trans-[RuC(MAC)NO]2+ a irradiação luminosa de [Ru(NH3)5pz]2+ na região do visível proporciona trasferência eletrônica fotoinduzida entre o fotosenssibilizador e o complexo nitrosilo com concomitante formação de NO. O rendimento quântico de NO (NO) é dependente do meio e é de cerca de 10-4 Einstein.mol.cm-1 em meio aquoso sob argônio e 10-2 Einstein.mol.cm-1 em meio oxigenado. Os estudos farmacológicos mostraram que a mistura proposta, em tampão fosfato pH 7,4, promoveu 75% de dilatação em musculatura de aorta pré-contraída com KC enquanto que, quando incorporados em sistemas carreadores de fármacos como emulsão óleo-em-água, HEG gel e membrana sol-gel, promoveram 40%, 35% e 35% de dilatação, respectivamente. A via vasodilatadora foi detectada como sendo pela ativação da GMPc (guanosina monofosfato cíclica), através da quantificação da concentração de cálcio citosólico. Os estudos das atividades anti-tumorais com os complexos doadores de NO foram realizados com linhagens celulares do tipo B16F10, Melan A, HL-60 WMs e Jurkat. Estes experimentos mostraram redução da viabilidade celular dos melanomas entre 50% e 75%, não apresentou ação em células normais (MelanA), mostrando-se seletivos ás células neoplasicas; e 95% de redução da viabilidade celular das células leucêmica (HL-60). Os resultados obtidos e descritos neste trabalho permitem vislumbrar que o uso de espécies doadoras de NO e oxigênio singlete possam ser utilizados no futuro em terapia clínica. / Nitric oxide (NO) is a multipurpose biological agent that shows important role in brain, arteries, immunological system, liver and lungs. The NO basal level alterations have correlation with several diseases as hypertension, cancer, Raymonds disease and platelet aggregation. Aiming supply this deficient NO level, it was necessary propose new compounds that can release NO at controlled manner. One of the possibilities is utilize nitrosyl ruthenium complexes that have ability to release NO under external stimulus. In this work we have studied, the chemical, photochemical, pharmacological and anti-tumoral properties of the trans-[RuC(MAC)NO]2+ complex, were MAC is 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane (cyclam) or 1,4,8,12-tetraazacyclopentadecane ([15]aneN4), in the presence of the sensitizer [Ru(NH3)5pz]2+. The photochemical studies of [Ru(NH3)5pz]2+ complex showed excited state lifetime of 113 ps and presented photoinduced electron and energy transfer with oxygen resulting in reactive oxygen species (ROS) generation as singlet oxygen and superoxide anion. In the presence of trans-[RuC(MAC)NO]2+ complex, the visible light irradiation of [Ru(NH3)5pz]2+ causes photoinduced electron transfer between the photosensitizer and the nitrosyl ruthenium complex resulting NO generation. The quantum yield (NO) is milieu dependent and showed 10-4 Einstein.mol.cm-1 in inert atmosphere and 10-2 Einstein.mol.cm-1 in aerated aqueous solution. The pharmacological studies showed that the proposed mixture in phosphate buffer, under visible irradiation, induce 75% of relaxation in aorta pre-contracted with KC while this system incorporated into drug delivery system as water-in-oil emulsion, HEG gel and sol-gel membrane, the nitric oxide generated induced 40%, 35% and 35% of relaxation, respectively. The quantification of cytosolic calcium concentration, using confocal image, showed that vasodilatation pathway observed was via cGMP (cyclic guanosine monophosphate) activation. The anti-tumoral studies using NO donors were carried out for B16F10, Melan A, HL-60, WMs and Jurkat cells. Those experiments showed decrease from 50% to 75% of cell viability of tumor cells and no toxicity in melanoma cells and 95% of reduction of leukemic cells (HL-60). The obtained results described in this work permit to glimpse that the use of NO donor species and singlet oxygen maybe is a useful tool in the future in clinical therapy.

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), mais de um bilhão de pessoas estão infectadas com uma ou mais doenças tropicais endêmicas encontradas especialmente entre as populações pobres da África, Ásia e América Latina. Nos últimos 25 anos, apenas 1% de todos os medicamentos desenvolvidos no mundo foram destinados ao tratamento de doenças tropicais, como a doença de Chagas. A doença de Chagas é causada por um protozoário intracelular, o Trypanosoma cruzi, e atualmente apenas dois compostos tem sido empregados para tratamento etiológico da doença de Chagas: nifurtimox e benznidazol. Entretanto, ambos os compostos apresentam considerável toxicidade sistêmica. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver complexos híbridos de rutênio, com potencial atividade tripanocida, que possam atuar com maior eficácia em sítios biológicos específicos do Trypanosoma cruzi e com reduzida toxicidade sistêmica. Para tal efeito, moléculas com conhecida atividade microbicida como derivados aminoglicosídeos, óxido nítrico e benznidazol foram coordenados a complexos de rutênio originando as espécies Ru(desoxiestreptamina), Ru(neamina), cis-[Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 e cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6. Os complexos foram caracterizados por espectroscopia de absorção no UV-vis e FTIR, espectrometria de massa, análise elementar, voltametria cíclica e voltametria de pulso diferencial. Nossos estudos sugerem que os complexos Ru(desoxiestreptamina), Ru(neamina), cis-[Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 e cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 apresentam propriedades químicas que suportam o sucesso da coordenação dos ligantes ao íon metálico rutênio(II) ou (III). Dentre todos os compostos estudados, cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6, apresentou maior potência tripanocida desprovida de citotoxicidade, a julgar pelos estudos in vitro. IC50 foi ao redor de 0,24 ?mol.L-1, o que é 47 vezes menor do que a droga comumente usada em tratamento de Doença de Chagas. Isto determinou avaliação in vivo, no que foi observado aumento da sobrevida dos animais infectados com tripomastigotas, para 60 dias. Os estudos desenvolvidos com complexos de rutênio no presente trabalho reafirmam o sucesso na obtenção de tais complexos inicialmente propostos, implementando importantes informações e perspectivas no que diz respeito a complexos nitrosilos de rutênio e seus potenciais terapêuticos na doença de Chagas. / Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 and cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 complexes. The compounds were characterized by UV-vis absorption spectroscopy, FTIR, mass spectrometry, elemental analysis, and cyclic voltammetry and differential pulse voltammogram. The chemical characterization presented in this work gave evidencie that support the coordination of biological ligand in ruthenium ion such as in Ru(desoxiestreptamina), Ru(neamina), cis-[Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 and cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 complexes. Subsequently, in vitro and in vivo studies have been conducted evaluating the cytotoxicity and trypanocidal activity of the ligands and ruthenium complexes. In vitro analysis suggested us that ruthenium complexes are greatly effective against T. cruzi. Among all complexes synthesized cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 showed higher in vitro trypanocidal activity, which has determined the in vivo assays with this compound. IC50 was around 0,24 ?mol.L-1, which is 47 times less than usual drugs used in Chagas diseases treatment. This was performed using animals infected with T. cruzi in trypomastigote form, animal survivals until 60 days. The studies developed for ruthenium complexes reaffirm the success in obtaining of the complexes originally proposed, implementing important information and perspectives regarding the nitrosyl ruthenium complex and its therapeutic potential in Chagas disease.

A glândula pineal é um órgão transdutor da informação fótica ambiental para o meio interno do organismo, provendo melatonina para a circulação sistêmica, a qual sinaliza o período de escuro e sincroniza os ritmos endógenos de acordo com as variações ambientais (Reiter, 1993). Várias evidências apontam para uma comunicação bidirecional entre a pineal e o sistema imune. Foi identificado na glândula pineal de ratos o fator de transcrição NFkB, uma via de trasncrição preferencial para citocinas e glicocorticóides e que modula a síntese de melatonina. TNFα inibe transientemente enquanto corticosterona potencia a transcrição do gene da Aa-nat, enzima chave na síntese de melatonina (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). LPS é um constituinte da membrana de bactérias gram-negativas e potente indutor de inflamação sistêmica e local. A sinalização de LPS é mediada por receptores toll-like 4 (TLR4) que leva à indução da enzima sintase de óxido nítrico induzivel (iNOS) e subsequente formação de óxido nítrico (NO). O objetivo deste trabalho foi demonstrar a expressão de TLR4 e a resposta funcional da via de transdução de LPS. Foram usados ratos Wistar fêmeas (1-2 meses). O RNAm total foi extraído de pineais controle e usados em RT-PCR com primers específcos contra os transcritos tlr-4, Cd14 e o controle interno Gapdh. Para a imunohistoquímica, secções de pineal de animais perfundidos com solução fixadora seguida de fixação com PAF 4% foram usadas com o anticorpo contra TLR4, sendo o controle negativo obtido na ausência de anticorpo. Os pinealocitos foram obtidos por tripsinização seguida de dispersão mecânica. O acúmulo de NFkB em extratos nucleares de pineais de animais tratados in vivo com LPS (1 mg/kg, iv, 2h) foi analisado por EMSA. A produção de NO foi medida por microscopia confocal em células carregadas com o cromóforo fluorescente DAR-4M-AM (5μM, 30min). RT-PCR revelou a presence constitutiva do RNAm de tlr-4 e Cd14 em pineais de rato. O estudo imunohistoquímico indicou uma marcação positiva para TLR4 em localização citoplasmática e nuclear, sendo abolida qualquer marcação na ausência do anticorpo. Um aumento na translocação nuclear de NFB foi observada nos animais tratados com LPS. LPS também levou a uma resposta funcional com aumento na reatividade da iNOS e aumento na produção de NO de maneira dependente de tempo e da concentração de LPS (0,1 to 10 μg/mL). O máximo aumento da produção de NO foi observado com LPS 1 μg/mL por 2 h. Este efeito foi inibido com o pré-tratamento com L-NAME (0.1mM, 30min) e 1400W (1μM, 30 min). Estes resultados demonstram que a glândula pineal de rato está instrumentada a responder ao desafio com LPS através da indução da via NFkB mediada por TLR4. Além disso, funcionalmente esta estimulação induz um significante aumento da imunoreatividade à iNOS e produção de NO. Estes dados corroboram com a hipótese do eixo imune-pineal com supressão da produção de melatonina no início de uma resposta de defesa. / Accumulating evidences put the pineal gland and the immune system reciprocally linked by bidirectional communication. Rat pineal gland constitutively activated NFkB, which plays a role on melatonin synthesis, is a preferential transduction pathway for cytokines and glucocorticoids (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). TNFα transiently inhibits, while corticosterone potentiates, noradrenaline-induced Aa-nat gene transcription, a key enzyme in melatonin synthesis. Lipopolysaccharides (LPS) are the major components of the outer membrane of Gram-negative bacteria, which makes them prime targets for recognition by the immune system. Toll-like receptor 4 (TLR4) conveys LPS signaling which induces expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and subsequent nitric oxide (NO) formation. An attempt has been made to demonstrate the expression of TLR4 in the rat pineal glands as well as the characterization of functional response and the transduction pathway following LPS challenge. Female Wistar rats (1-2 months) were used. Total RNA was extracted from control pineals and used in real time RT-PCR with specific primers against tlr-4 and Cd14 transcritps and the housekeeping gene Gapdh (internal control). For immunohistochemistry, the pineals cryosections (8μm) from perfused animals (Lanas fixative, 4% PAF, 15min) followed by fixation (4% PAF, 30min) were used with an antibody against rat TLR4, being the negative control performed in the absence of primary antibody. Pinealocytes were obtained by trypsinization followed by mechanical dispersion. The amount of NFB present in nuclear extracts of pinealocytes challenged with LPS (1μg/ml, 15min) was assayed by EMSA. NO production was measured by confocal microscopy in cells loaded with the fluorescent dye DAR-4M-AM (5μM, 30min). RT-PCR revealed specific constitutive tlr-4 and Cd14 mRNA levels in rat pineals. Immunohistochemistry (n=4) indicated TLR4-positive and -negative immunostaining in the nuclear and cytoplasmic compartments of the cells. All TLR4-positive immunostaining were significantly decreased when experiments were performed in the absence of the primary antibody. An increase in the nuclear translocation of NFKB was observed in LPS challenged cells. LPS (0.1 to 10 μg/mL) also lead to a functional response, as it increased the immunoreactivity of iNOS and a time- and concentration-dependent manner the level of NO in cultured pinealocytes. The maximal NO content induced by LPS 1.0 μg/mL was observed 2h after stimulation. Baseline levels were restored after 4-6h of LPS. The LPS stimulatory effect was fully abolished by the pre-treatments with L-NAME (0.1mM, 30min) and 1400W (1μM). Therefore, our data show that pinealocytes are instrumented for answering to LPS challenge through TLR4-induced NFkB pathway. In addition we observed that this stimulation induces a significant increase in iNOS immunoreactivity and NO production. These data corroborates to the hypothesis that pineal melatonin production is suppressed at the beginning of a defense response.

O núcleo supraóptico (SON), uma das várias áreas hipotalâmicas envolvidas no equilíbrio hidroeletrolítico corporal, é de suma importância na complexa rede de sistemas fisiológicos que atuam na manutenção da homeostase. Este núcleo é constituído por um grupamento de neurônios magnocelulares (MNCs) responsáveis pela síntese e liberação de vasopressina e ocitocina, neuropeptídios cujos principais efeitos se fazem sobre a excreção de água e sal pelos rins. Alterações da osmolalidade plasmática implicam em mudanças funcionais intrínsecas (propriedades de membrana) e extrínsecas (sinápticas) na excitabilidade desses neurônios, com consequências para a liberação desses neuropeptídios. Além da osmolalidade, outros fatores são capazes de modular a excitabilidade dos MNCs, dentre elas o óxido nítrico (NO). Vários estudos têm mostrado que o NO desempenha um papel neuromodulador importante nesses neurônios, resultando na inibição da excitabilidade dos MNCs durante condições isotônicas e hipertônicas. Além disso, estas respostas são independentes das conexões sinápticas e envolvem a modulação de canais para cátions ativados por hiperpolarização e nucleotídeo cíclico (HCN). Entretanto, ainda é desconhecido à origem deste mensageiro neural, o envolvimento de outros tipos celulares nesta resposta, os mecanismos de sinalização utilizados pelo NO na modulação dos canais HCN, se esta modulação também ocorre em situações de aumentos de osmolaridade plasmática, e se há diferenças na modulação nitrérgica entre os fenótipos celulares. Assim, dada a importância deste núcleo para a manutenção do meio interno, elucidar os mecanismos pelo qual o NO modula os neurônios magnocelulares do SON torna-se essencial para o entendimento do controle da sua excitabilidade elétrica. Desta forma, considerando que: 1) os neurônios magnocelulares expressam a enzima para a síntese do NO em condições isotônicas e hipertônicas; 2) que os efeitos do NO parecem envolver, principalmente, a guanilato ciclase solúvel com consequente produção de cGMP; e 3) que os canais HCN são modulados por este segundo mensageiro, nós hipotetizamos que os MNCs são capazes de produzir NO independente de outros tipos celulares e do fenótipo celular, e que a modulação nitrérgica dos canais HCN envolve a produção de cGMP. Frente a isso, este projeto teve como objetivo: 1) investigar o envolvimento das células gliais na modulação nitrérgica observada nos MNCs; 2) desvendar a origem do NO; 3) estudar as vias de sinalização da modulação nitrérgica sobre os canais HCN 4) avaliar se os efeitos do NO nos canais HCN também ocorre durante estímulo hiperosmótico agudo, e 5) se há diferença na modulação do NO em relação ao fenótipo celular. Para tanto, utilizamos a eletrofisiologia celular, essencialmente a técnica de patch clamp em fatias do SON e neurônios isolados. Experimentos de fluorescência foram realizados para a detecção da atividade intracelular do NO com o intuito de elucidar a origem deste mensageiro neural. Além disso, técnicas de biologia celular e molecular também foram utilizadas para caracterizar o fenótipo da célula que se está registrando, uma vez que 3 tipos já foram descritos neste núcleo e podem responder de maneira diferente ao mesmo estímulo. Até o presente nossos resultados mostraram que: 1) A modulação nitrérgica nos MNCs não envolve células gliais, 2) O NO é produzido pelos neurônios magnocelulares durante estímulo hipertônico, e este processo é dependente das alterações da osmolalidade, mas não da atividade elétrica dos neurônios frente ao estímulo; 3) Esta modulação ocorre por um mecanismo dependente de S-nitrosilação e independentemente da formação de cGMP; 4) a modulação nitrérgica nos canais HCN não difere entre os diferentes tipos de fenótipos encontrados e também ocorre durante aumentos da osmolaridade plasmática. Frente a estes resultados podemos concluir que a excitabilidade dos neurônios magnocelulares do SON é essencialmente determinada por um efeito do NO sobre os canais HNC por um mecanismo dependente de S-nitrosilação. Desta forma, o NO apresenta-se como mais uma molécula nesse complexo mecanismo de manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico do organismo. / The hypothalamic supraoptic nucleus (SON) plays an importante role in the complex systems network that operates to maintain the hydroelectrolytic balance of the body. The nucleus is formed by a cluster of neurons (magnocellular neurosecretory cells - MNCs) responsible for the synthesis and secretion of vasopressin and oxytocin, whose main effects are on the excretion of water and salt by the kidneys. Changes in plasma osmolality lead to intrinsic (membrane properties) and extrinsic (synaptic inputs) functional changes in these neurons, with consequences for neuropeptides release. Furthermore, besides osmolality, studies have shown that the electrical excitability of MNCs can be modulated by several factors, including nitric oxide (NO). Previous studies of our group, demonstrated that NO inhibits the excitability of MNCs during isotonic and hypertonic conditions and that this responses are independent of synaptic connections and involve the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels (HCN). However, some points remained unclear, such as: What is the origin of NO? Are there other cell types involved in this response? What signaling pathway does NO use to modulate HCN channels? Does NO modulate HCN channels during changes in the plasma osmolality? Are there differences in the nitrergic modulation according to cellular phenotypes? Considering that: 1) MNCs express the enzyme for nitric oxide synthesis, in isotonic and hypertonic conditions; 2) the NO effects involve, mainly, activation of guanylate cyclase with consequent increase in the cGMP production, and that 3) HCN channels are modulated by this second messenger, we hypothesize that MNCs are able to produce NO independently of other cells and cellular phenotypes, and that nitrergic modulation of HCN channels involves the guanylate cyclase activation. To answer those questions and to test our hypothesis, we used cellular electrophysiology, essentially Whole cell patch clamp using slices of the SON and isolated neurons. Fluorescence experiments were also used to detect the intracellular activity of NO in order to clarify the origin of this neuronal messenger. In addition, cellular and molecular biology approaches were also used to characterize the phenotype of recorded cells, since 3 distinct cellular types have been described in this nucleus. Our results demonstrate that: 1) NO is produced by MNCs during hypertonic stimulation, and this process is dependent on changes in osmolality, but not on the electrical activity of MNCs in response to the stimulus; 2) NO modulates the electric excitability of the neurons by acting on HCN channels and it does not differ among cellular phenotypes; and 3) the effect of NO occurs by a mechanism dependent of S-nitrosylation and independently of cGMP production. Considering these results we may conclude that electrical excitability of magnocellular neurons of the supraoptic nucleus is essentially determined by an effect of NO on Ih currents by a mechanism dependent of S-nitrosylation. Acting on HCN channels, NO is another player in the complex set of mechanisms controlling the hydroelectrolytic balance.

O núcleo supraóptico (SON), uma das várias áreas hipotalâmicas envolvidas no equilíbrio hidroeletrolítico corporal, é de suma importância na complexa rede de sistemas fisiológicos que atuam na manutenção da homeostase. Este núcleo é constituído por um grupamento de neurônios magnocelulares (MNCs) responsáveis pela síntese e liberação de vasopressina e ocitocina, neuropeptídios cujos principais efeitos se fazem sobre a excreção de água e sal pelos rins. Alterações da osmolalidade plasmática implicam em mudanças funcionais intrínsecas (propriedades de membrana) e extrínsecas (sinápticas) na excitabilidade desses neurônios, com consequências para a liberação desses neuropeptídios. Além da osmolalidade, outros fatores são capazes de modular a excitabilidade dos MNCs, dentre elas o óxido nítrico (NO). Vários estudos têm mostrado que o NO desempenha um papel neuromodulador importante nesses neurônios, resultando na inibição da excitabilidade dos MNCs durante condições isotônicas e hipertônicas. Além disso, estas respostas são independentes das conexões sinápticas e envolvem a modulação de canais para cátions ativados por hiperpolarização e nucleotídeo cíclico (HCN). Entretanto, ainda é desconhecido à origem deste mensageiro neural, o envolvimento de outros tipos celulares nesta resposta, os mecanismos de sinalização utilizados pelo NO na modulação dos canais HCN, se esta modulação também ocorre em situações de aumentos de osmolaridade plasmática, e se há diferenças na modulação nitrérgica entre os fenótipos celulares. Assim, dada a importância deste núcleo para a manutenção do meio interno, elucidar os mecanismos pelo qual o NO modula os neurônios magnocelulares do SON torna-se essencial para o entendimento do controle da sua excitabilidade elétrica. Desta forma, considerando que: 1) os neurônios magnocelulares expressam a enzima para a síntese do NO em condições isotônicas e hipertônicas; 2) que os efeitos do NO parecem envolver, principalmente, a guanilato ciclase solúvel com consequente produção de cGMP; e 3) que os canais HCN são modulados por este segundo mensageiro, nós hipotetizamos que os MNCs são capazes de produzir NO independente de outros tipos celulares e do fenótipo celular, e que a modulação nitrérgica dos canais HCN envolve a produção de cGMP. Frente a isso, este projeto teve como objetivo: 1) investigar o envolvimento das células gliais na modulação nitrérgica observada nos MNCs; 2) desvendar a origem do NO; 3) estudar as vias de sinalização da modulação nitrérgica sobre os canais HCN 4) avaliar se os efeitos do NO nos canais HCN também ocorre durante estímulo hiperosmótico agudo, e 5) se há diferença na modulação do NO em relação ao fenótipo celular. Para tanto, utilizamos a eletrofisiologia celular, essencialmente a técnica de patch clamp em fatias do SON e neurônios isolados. Experimentos de fluorescência foram realizados para a detecção da atividade intracelular do NO com o intuito de elucidar a origem deste mensageiro neural. Além disso, técnicas de biologia celular e molecular também foram utilizadas para caracterizar o fenótipo da célula que se está registrando, uma vez que 3 tipos já foram descritos neste núcleo e podem responder de maneira diferente ao mesmo estímulo. Até o presente nossos resultados mostraram que: 1) A modulação nitrérgica nos MNCs não envolve células gliais, 2) O NO é produzido pelos neurônios magnocelulares durante estímulo hipertônico, e este processo é dependente das alterações da osmolalidade, mas não da atividade elétrica dos neurônios frente ao estímulo; 3) Esta modulação ocorre por um mecanismo dependente de S-nitrosilação e independentemente da formação de cGMP; 4) a modulação nitrérgica nos canais HCN não difere entre os diferentes tipos de fenótipos encontrados e também ocorre durante aumentos da osmolaridade plasmática. Frente a estes resultados podemos concluir que a excitabilidade dos neurônios magnocelulares do SON é essencialmente determinada por um efeito do NO sobre os canais HNC por um mecanismo dependente de S-nitrosilação. Desta forma, o NO apresenta-se como mais uma molécula nesse complexo mecanismo de manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico do organismo. / The hypothalamic supraoptic nucleus (SON) plays an importante role in the complex systems network that operates to maintain the hydroelectrolytic balance of the body. The nucleus is formed by a cluster of neurons (magnocellular neurosecretory cells - MNCs) responsible for the synthesis and secretion of vasopressin and oxytocin, whose main effects are on the excretion of water and salt by the kidneys. Changes in plasma osmolality lead to intrinsic (membrane properties) and extrinsic (synaptic inputs) functional changes in these neurons, with consequences for neuropeptides release. Furthermore, besides osmolality, studies have shown that the electrical excitability of MNCs can be modulated by several factors, including nitric oxide (NO). Previous studies of our group, demonstrated that NO inhibits the excitability of MNCs during isotonic and hypertonic conditions and that this responses are independent of synaptic connections and involve the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels (HCN). However, some points remained unclear, such as: What is the origin of NO? Are there other cell types involved in this response? What signaling pathway does NO use to modulate HCN channels? Does NO modulate HCN channels during changes in the plasma osmolality? Are there differences in the nitrergic modulation according to cellular phenotypes? Considering that: 1) MNCs express the enzyme for nitric oxide synthesis, in isotonic and hypertonic conditions; 2) the NO effects involve, mainly, activation of guanylate cyclase with consequent increase in the cGMP production, and that 3) HCN channels are modulated by this second messenger, we hypothesize that MNCs are able to produce NO independently of other cells and cellular phenotypes, and that nitrergic modulation of HCN channels involves the guanylate cyclase activation. To answer those questions and to test our hypothesis, we used cellular electrophysiology, essentially Whole cell patch clamp using slices of the SON and isolated neurons. Fluorescence experiments were also used to detect the intracellular activity of NO in order to clarify the origin of this neuronal messenger. In addition, cellular and molecular biology approaches were also used to characterize the phenotype of recorded cells, since 3 distinct cellular types have been described in this nucleus. Our results demonstrate that: 1) NO is produced by MNCs during hypertonic stimulation, and this process is dependent on changes in osmolality, but not on the electrical activity of MNCs in response to the stimulus; 2) NO modulates the electric excitability of the neurons by acting on HCN channels and it does not differ among cellular phenotypes; and 3) the effect of NO occurs by a mechanism dependent of S-nitrosylation and independently of cGMP production. Considering these results we may conclude that electrical excitability of magnocellular neurons of the supraoptic nucleus is essentially determined by an effect of NO on Ih currents by a mechanism dependent of S-nitrosylation. Acting on HCN channels, NO is another player in the complex set of mechanisms controlling the hydroelectrolytic balance.

A manutenção da osmolalidade e do volume dos líquidos extra- (LEC) e intracelular (LIC) são fatores de extrema importância à conservação da vida. Na desidratação (por ingestão insuficiente ou perda excessiva de água), sistemas de controle autonômicos e endócrinos são acionados frente à ativação de barorreceptores (periféricos) e osmorreceptores (centrais e periféricos), visando estimular a sede e inibir o apetite ao sódio, além de reduzir a diurese, promover a natriurese e contrair a musculatura lisa dos vasos. Especificamente para o sistema de controle endócrino é evidente que tais respostas se dão pela secreção dos hormônios neuroipofisários vasopressina (AVP) e ocitocina (OT), e pelo aumento da concentração sanguínea de angiotensina II (ANGII). As secreções de AVP e OT são controladas por sistemas subjacentes, representados por neurotransmissores e também por moduladores gasosos, como óxido nítrico (NO) e monóxido de carbono (CO) (Calapai e cols., 1992; Ventura e cols., 2002 e 2008; Gomes e cols., 2004 e 2010; Reis e cols., 2010). Apesar da existência de modelos que investigassem a modulação do H2S sobre respostas hipocampais, modulação da frequência cardíaca e pressão arterial, e temperatura corporal (Abe e Kimura, 1996; Dawe e cols., 2008; Liu e cols., 2011; Ren e cols., 2011; Kwiatkoski e cols., 2012), nenhuma abordagem sobre a interação do H2S com a secreção de AVP e OT havia sido realizada. No presente estudo, portanto, objetivou-se avaliar, após a privação hídrica de 24 horas (estímulo potente à sede e secreção de AVP e OT), os efeitos do H2S sobre a resposta hipotalâmica. Para tanto, sulfeto de sódio (Na2S 65 mM, doador inorgânico), aminooxiacetato (AOA 50 ?M, inibidor da enzima cistationina ?-sintase) ou veículo (NaCl 0,9%) foram administrados intracerebroventricularmente (icv) em ratos adultos privados de água ou hidratados. Observou-se inicialmente que, em animais apenas submetidos à desidratação (vs. hidratados), houve um aumento da atividade das enzimas hipotalâmicas 8 geradoras de H2S; e, além disso, a administração aguda de Na2S a estes animais potencializou a secreção de AVP, OT e CORT (corticosterona), sem alterar a concentração plasmática de ANGII, ANP e prolactina (hormônios medidos após 5 min. da administração icv da droga ou veículo). O H2S exógeno foi também capaz de reduzir o conteúdo de NO hipotalâmico (medido indiretamente pelo metabólito nitrato/nitrito após 5 min.). O grande aumento na secreção plasmática de AVP e OT provavelmente foi o responsável pela maior concentração plasmática de CORT, uma vez que estes hormônios são secretagogos do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) adenoipofisário. Enquanto o aumento de OT pode ter sido o responsável pela redução da ingestão de água entre os animais privados. Inversamente, a administração de AOA (vs. veículo) aumentou a ingestão de água entre os animais desidratados. Desta forma, estes resultados sugerem que o gás H2S pode ser um importante agente modulador da resposta de sede e secreção neuroipofisária durante a privação hídrica; atuando ou diretamente sobre canais e receptores neuronais ou indiretamente através dos sistemas do NO e CO. / Osmolality and volume maintenance of extra- (ECF) and intracellular fluids (ICF) are factors of extreme importance to life preservation. During dehydration (from insufficient intake or excessive loss of water), autonomic and endocrine control systems are triggered mainly by (peripheral) baroreceptors and (central and peripheral) osmoreceptors to stimulate water intake and inhibit sodium appetite, in addition to restraining diuresis, promoting natriuresis and contracting smooth muscle of vessels. Specifically for endocrine control system, it is evident that such responses take place by neurohypophysis secretion of vasopressin (AVP) and oxytocin (OT), and by increase of plasma angiotensin II (ANGII) levels. Both AVP and OT secretion are controlled by underlying systems, which are represented by neurotransmitters and also by gaseous modulators like nitric oxide (NO) and carbon monoxide (CO) (Calapai et al., 1992; Ventura et al., 2002 and 2008; Gomes et al., 2004 and 2010; Reis et al., 2010). Despite the existence of models which investigated H2S modulation on hippocampus responses, heart frequency and blood pressure, and body temperature (Abe and Kimura, 1996; Dawe et al, 2008; Liu et al, 2011; Ren et al, 2011; Kwiatkoski et al, 2012), no approach of H2S interaction with AVP and OT secretion had been conducted. In this study, we thus aimed to evaluate the effects of H2S on hypothalamus response after a 24-hour water deprivation (a powerful stimulus for thirst and AVP/OT secretion). To that, 65 mM sodium sulfide (Na2S, inorganic donor), 50 ?M aminooxyacetate (AOA, cystathionine ?-synthase inhibitor) or vehicle (NaCl 0,9%) were administered intracerebroventricularly (icv) to water-deprived or euhydrated adult rats. It has been initially observed that hypothalamus H2S-generating enzymes activity of dehydrated-only animals was increased (vs. euhydrated); and, further, acute Na2S administration to dehydrated animals potentiated AVP, OT and CORT 10 (corticosterone) secretion without modifying ANGII, ANP and prolactin plasma levels (measured after 5 min. of drug or vehicle icv administration). Exogenous H2S could reduce hypothalamus NO content as well (indirectly measured by metabolite nitrate/nitrite after 5 min.). The great increase of AVP and OT secretion was probably responsible for higher levels of corticosterone, since these hormones are secretagogues of anterior pituitary adrenocorticotropic hormone (ACTH). While OT rise might have been the responsible for reduced water intake among deprived animals. On the other hand, AOA central injection (vs. vehicle) augmented water intake among water-deprived rats. These results therefore suggest that the gas H2S may be an important modulating agent of thirst and posterior pituitary secretion response during water deprivation; acting either directly on neuron channels and receptors or indirectly by NO and CO systems.

Adenosina e óxido nítrico, importantes neuromoduladores endógenos, atuam modulando finamente o controle neural cardiovascular no núcleo de trato solitário (NTS). Embora se tenha conhecimento sobre a relação entre adenosina e NO periférica e centralmente, em particular, no bulbo, os mecanismos pelos quais a adenosina interfere na dinâmica da neurotransmissão nitrérgica, ainda não são totalmente conhecidos. Logo, alterações na interação entre esses sistemas podem ser especialmente relevantes para indivíduos predispostos à hipertensão. Dessa forma, os objetivos do presente estudo foram estudar a interação entre o sistema adenosinérgico e nitrérgico em culturas de células da porção dorsomedial do bulbo de ratos normotenso Wistar Kyoto (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR). Para tal, utilizou-se técnicas para quantificação dos níveis de nitrito, PCR em tempo real e RNA de interferência. Foi observada uma redução e um aumento concentração-dependente nos níveis de nitrito e do mRNA da nNOS induzido pelos agonistas dos receptores A1(A1R) e A2A(A>sub>2AR), CPA e CGS21680, respectivamente. Os efeitos nos níveis de nitrito foram atenuados pela administração dos antagonistas seletivos dos A1R e A2AR, CPT e ZM241385. Knockdown dos A1R e A2AR mostraram que a redução da expressão desses receptores aumentaram e diminuíram os níveis de expressão da nNOS, respectivamente. Pré-tratamento com o inibidor não seletivo da nNOS, L-NAME, aboliu os níveis aumentados de nitrito desencadeados pelo CGS21680 em células de WKY e SHR. Por fim, é mostrado que a via cAMP-PKA está envolvida na sinalização que deflaga tantos os níveis reduzidos de nitrito, via A1R, quantos os níveis aumentados de nitrito, via A2AR, em culturas de WKY e SHR. Em síntese, nossos resultados destacam a influência da adenosina sobre a síntese de NO em culturas de células da porção dorsomedial do bulbo de ratos WKY e SHR. Pelo menos em parte, o perfil modulatório é diferenciado em ratos SHR / Adenosine and nitric oxide, important endogenous neuromodulators, act on the fine tuning regulation of neural cardiovascular control in the nucleus tractus solitarius (NTS). Although the relationship between adenosine and NO peripheral and centrally, is well established, in particular, in the oblongata medulla, the mechanisms by which adenosine interferes in the dynamics of nitrergic neurotransmission, is not completely understood. Thus, changes in the interaction between these systems may be especially relevant for individuals predisposed to hypertension. The aim of this study was to evaluate the interaction between the adenosinergic and nitrergic systems in cell culture from the dorsomedial medulla oblongata of Wistar Kyoto (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR). This purpose was performed the quantification of nitrite level, RT-PCR analysis and RNA interference. We observed a concentration-dependent decrease and increase of nitrite and nNOS mRNA levels in cultured cells of WKY and SHR rats induced by agonists of adenosine A1 (A1R) and A2A receptor (A2AR), CPA and CGS21680, respectively. These effects in nitrite level were attenuated by the administration of the A1R and A2AR selective antagonist, CPT and ZM241385. Furthermore, knockdown of A1R and A2AR showed an increase and decrease of nNOS mRNA levels, respectively. The pretreatment with nonselective inhibitor of NOS, L-NAME, abolished nitrite-increased levels triggered by CGS 21680 in WKY and SHR cells. Finally, it is shown that the cAMP-PKA pathway is involved in A1R and A2AR -mediated decrease and increase in nitrite levels in SHR and WKY cells. In summary, our results highlight the influence of adenosine on nitric oxide levels in cultured cells from dorsal medulla oblongata of WKY and SHR rats. In part, the modulatory profile is different in the SHR strain