A fisiopatologia da pré-eclâmpsia não está completamente elucidada. No entanto, o aumento do estresse oxidativo e o comprometimento da atividade da sintase induzida do óxido nítrico (iNOS) têm sido envolvido nesse estado crítico. O aumento do estresse oxidativo com o aumento das espécies altamente reativas, incluindo o superóxido, pode formar o peroxinitrito. Verificamos o papel da sintase induzida do óxido nítrico e do estresse oxidativo no modelo experimental de pré-eclâmpsia caracterizado pela redução de pressão de perfusão uterina (RUPP). Este foi induzido em ratas wistar. Ratas grávidas do grupo RUPP tiveram a aorta clipada no 14° dia de gestação. Após uma incisão na linha média, um clipe de prata (0.203 mm) foi colocado em torno da aorta acima da bifurcação ilíaca; clipes de prata (0.100 mm) também foram colocados em ambos os ramos das artérias ovarianas direita e esquerda, que abastecem o útero. Ratas Sham operados (ratas grávidas controles) e RUPP foram tratadas com veículo ou subcutaneamente com 1 mg / kg de N-[3 - (aminometil)-benzil] acetamidina (1400W, inibidor da iNOS), durante 5 dias. Após o tratamento, a pressão arterial média foi verificada. Para determinarmos o estresse oxidativo foram avaliadas as concentrações plasmáticas de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), níveis do 8-isoprostano plasmático, atividade vascular da NADPH oxidase e produção de superóxido com dihidroetídeo. Além disso, utilizamos a técnica de imunohistoquímica para avaliar os níveis de nitrotirosina. A expressão vascular da iNOS foi verificada por western imunoblotting e concentrações de nitrito plasmático por quimiluminescência. Observamos um aumento da pressão arterial média em RUPP comparado com ratas grávidas controles e o tratamento com 1400W exerceu efeitos anti-hipertensivos. O tratamento com 1400W reduziu os níveis de 8-isoprostano, atividade vascular da NADPH oxidase e concentrações de EROs, expressão da iNOS e formação de peroxinitrito em RUPP 1400W em comparação com ratos não tratados RUPP. Nossos resultados sugerem que o 1400W atenua a hipertensão no modelo RUPP principalmente pela inibição da iNOS e formação de peroxinitrito. / The pathophysiology of preeclampsia (PE) is not entirely known. However, increased oxidative stress possibly leading to impaired nitric oxide (NO) activity has been implicated in this critical condition. The increased NO production associated with highly reactive oxygen species (ROS), including superoxide may generate peroxynitrite. We examined the role of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and oxidative stress in the reduction uterine perfusion pressure (RUPP) in preeclampsia experimental model. RUPP was induced in wistar rats. Pregnant rats in the RUPP group had their aortic artery clipped at day 14 of gestation. After a midline incision, a silver clip (0.203 mm) was placed around the aorta above the iliac bifurcation; silver clips (0.100 mm) were also placed on branches of both the right and left ovarian arteries that supply the uterus. Sham-operated (pregnant control rats) and RUPP rats were treated with subcutaneous vehicle or 1 mg/kg of iNOS inhibitor (1400W) for 5 days. After the treatment the mean arterial pressure (MAP) was monitored. To evaluated oxidative stress we measured thiobarbituric acid-reactive species (TBARS) and 8-isoprostane levels in plasma, aortic NADPH oxidase activity, and production of superoxide with dihydroethidine. Futhermore, the immunohistochemical analysis assessed nitrotyrosine levels. The vascular iNOS expression was determinated by western imunoblotting and nitrite concentrations in plasma were measured by chemiluminescence. We found increased MAP in RUPP compared with pregnant control rats and 1400W treatment exerted antihypertensive effects. Treatment with 1400W decreased RUPP-induced higher systemic 8-isoprostane levels and vascular NADPH oxidase activity and attenuated ROS concentrations, iNOS expression and peroxynitrite formation in RUPP 1400W rats compared with untreated RUPP rats. Our results suggest that treatment with 1400W attenuates the development of hypertension in RUPP mainly due to inhibition of iNOS and decreased peroxynitrite formation.

INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral (LV), pertence ao grupo de endemias consideradas prioritárias no mundo. É uma doença grave e com poucas opções de tratamento e, mesmo quando adequadamente tratada, possui um nível de letalidade de 5 a 7%. Apesar da expansão da doença, o tratamento para leishmaniose visceral não obteve avanços. O tratamento da leishmaniose possui apenas dois grupos de medicamentos utilizados: os antimonoiais e os não-antimoniais. Os compostos nitroheterocíclicos foram utilizados pois acredita-se que a eficácia desta classe de compostos está na habilidade desses compostos inibirem a tripanotiona redutase. Os compostos foram obtidos por via sintética e refinados pelo método QSAR por remodelagem molecular. Foram obtidos séries de compostos nitroheterocíclicos, onde a série BSF (derivados 5-nitro-2-furfurilideno - azometínicos) foi utilizada para avaliar a bioatividade in vitro destes compostos frente à Leishmania. Para avaliação da atividade anti-Leishmania foram usadas formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum. Os métodos utilizados para determinar a atividade anti-Leishmania dos compostos da série BSF foram os métodos colorimétrico 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il] 2,5 brometo de difeniltetrazólio (MTT), apoptose por Anexina V e reação de Griess (dosagem de NO). Ao comparar os resultados com os respectivos controles positivos e com a Anfotericina B, foi observado que a atividade anti-Leishmania em formas promastigotas de L. L. infantum dos compostos foi menos significativa quando comparado com anfotericina B. Porém, ao comparar os resultados de macrófagos infectados e citotoxicidade com a anfotericina B, os compostos mostraram resultados expressivos, ao apresentarem baixa taxa de citotoxicidade e significativa diminuição da proliferação intracelular. A expressiva produção de nitrito pelos macrófagos infectados tratados com os compostos da série BSF sugere-se que estes compostos possuam uma ação indireta de potencialização de produção de NO nas células hospedeiras. Os resultados in vitro utilizando derivados nitroheterocíclicos mostraram atividade destes sobre formas promastigotas e amastigotas intracelulares, e são compostos em potencial para avaliação de efeito in vivo contra leishmaniose visceral / INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis (VL) belongs to the group of endemics prioritized worldwide. It is a serious disease with few treatment options, and even when adequately treated, it has a lethality level of 5 to 7%. Despite the expansion of the disease, treatment for visceral leishmaniasis has not made progress. Treatment of leishmaniasis has used only two groups of drugs: antimonial and non-antimonial. Nitro-heterocyclic compounds were used in this study because it is believed that the effectiveness of this class of compounds is the ability to inhibit trypanothione reductase. The compounds were obtained synthetically and refined by QSAR method molecular remodeling. Nitro-heterocyclic series of compounds were obtained, where the BSF series (derived from 5-nitro-2-furfurylidene - azometínicos) was used to evaluate the in vitro bioactivity of these compounds against the Leishmania. To evaluate the anti-Leishmania activity, promastigotes of Leishmania (Leishmania) infantum were used. The methods used to determine the anti-Leishmania activity of the BSF series compounds were colorimetric methods 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), apoptosis by Annexin V, and Griess reaction (IN dosage). By comparing the results with the respective positive controls and with amphotericin B, it was observed that the anti-Leishmania activity of L. L. infantum promastigotes of the compounds was less significant when compared with amphotericin B. However, comparing the results of infected macrophages and cytotoxicity with amphotericin B, compounds showed significant results, presenting low cytotoxicity rate and significant decrease in intracellular proliferation. The significant nitrite production by infected macrophages treated with the BSF series compounds suggested that these compounds have an indirect potentiation action in the NO production in the host cells. In vitro results using nitro-heterocyclic derivatives showed their activity on these promastigotes and intracellular amastigotes, and presented them as potential compounds for in vivo effect evaluation against visceral leishmaniasis

Esta tese avaliou a função em artérias de resistência do músculo esquelético (ARME) e em coronárias septais (CS) de ratos com disfunção ventricular esquerda leve (LDV) e severa (SDV) pós-infarto do miocárdio (IM). As ARME e as CS foram montadas em miógrafo de arame. O relaxamento dependente do endotélio, mediado pela acetilcolina (ACh), foi reduzido nas ARME dos SDV e preservado nos LDV. A resposta à ACh foi reduzida na CS dos SDV e aumentada nos LDV. O relaxamento mediado pelo doador de óxido nítrico (NO) foi preservado em todas as artérias. Utilizando-se a sonda DAF-2 em cortes de CS, antes e após estimulação com ACh, detectou-se menor produção de NO nos SDV e maior produção de NO nos LDV. Na CS observou-se aumento das espécies reativas de oxigênio nos SDV e redução destas nos LDV. Detectou-se maior expressão protéica da sintase de NO endotelial e neuronal e das isoformas da superóxido dismutase na CS dos LDV em relação ao SHAM. Conclui-se que a função nas ARME e nas CS é modulada diferentemente na dependência do estado da função cardíaca pós-IM. / This study assessed the reactivity in skeletal muscle resistance arteries (SMRA) and in septal coronary arteries (SC) from rats with slight (sliLVD) and severe (sevLVD) left ventricular dysfunction after myocardial infarction (MI). SMRA and the SC were mounted on a wire myograph. The endothelium-dependent relaxation by acetylcholine (ACh) was reduced in SMRA from sevLVD; but it was preserved in sliLVD. The ACh-relaxation was reduced in SC from sevLVD; while it was increased in sliLVD. The nitric oxide (NO) donor relaxation was unchanged in all arteries. Using DAF-2 probe in SC, before and after ACh stimulation, it was observed NO production decreased in SC from sevLVD, while it was increased in sliLVD. Reactive oxygen species was increased in SC from sevLVD and it was reduced in sliLVD. Neuronal and endothelial NO synthase and superoxide dismutase isoforms protein expression were greater in SC from sliLVD as compared to SHAM. In conclusion, SMRA and SC function is differentially modulated on the dependency of the cardiac function after MI.

Resultados preliminares do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a inibição da síntese de NO por período de tempo prolongado reduz o recrutamento de leucócitos para focos inflamatórios, dependente, pelo menos em parte, da inibição da interação leucócito-endotélio e da expressão de L-selectina. 0 presente trabalho visou complementar os estudos sobre os mecanismos envolvidos nesta ação antiinflamatória. Para tanto, ratos Wistar machos (180 a 220g) receberam L-NAME (20mg/Kg; v.o.; 14 dias) ou água pela mesma via e período de tempo. Foi avaliada a atividade das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) no tecido cerebral por radioimunoensaio; o recrutamento leucocitário para cavidade peritoneal induzido pelo LPS (5mg/kg, 4 horas); as expressões de moléculas de adesão em leucócitos do sangue circulante, no músculo cremaster e nos sinusóides hepáticos por ensaios de citometria de fluxo ou imunohistoquímica; as expressões gênicas de moleculas de adesão, quantificadas por PCR e a secreção/produção de mediadores inflamatórios em leucócitos por ensaios imunoenzimáticos, reacao de Griess ou quimiluminescência. Os resultados obtidos mostraram que: 1) o tratamento com L-NAME reduziu em torno de 90% a atividade das NOS dependentes de Ca+2 em condições basais ou após estimulação in vivo com LPS; 2) as concentrações de NO no plasma e no peritônio inflamado estavam reduzidos em animais tratados com L-NAME (30% vs. controles); 3) a migração de leucócitos polimorfonucleares (PMN) para o peritônio inflamado estava reduzida em animais tratados com L-NAME (40% vs. controles); 4) as expressões de L-selectina e PECAM-1 em leucócitos circulantes; de PECAM-1 no endotélio do músculo cremaster e de VAP-1 no endotélio dos sinusóides hepáticos e músculo cremaster de animais tratados com L-NAME estavam reduzidas; 5) a redução na expressão de L-selectina foi dependente de inibição de sua síntese; 6) a concentração de IL-10 estava major no soro de animais tratados com L-NAME em relação aos controles; 7) a maior concentração de IL-10 circulante pode refletir a produção desta citocina por leucócitos na circulação, uma vez que a concentração de IL-10 também estava maior no sobrenadante de leucócitos circulantes de animais tratados com L-NAME; 8) concentrações reduzidas de IL-1β e LTB4 foram detectadas nos sobrenadantes de neutrófilos obtidos de animais tratados com L-NAME; 9) macrófagos obtidos de animais tratados com L-NAME produziram maiores concentrações de IL-1β, TNF-α e IL-6, e menores concentrações de IL-10 na ausência de estimulação; na vigência estimulação in vitro com LPS os macrófagos de animais tratados com L-NAME produziram menores concentrações de NO. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho mostram que o tratamento com L-NAME por período prolongado de tempo inibe a atividade das NOS dependentes de Ca+2 e nesta condição reduz as concentrações de NO circulante e no foco da inflamação, além de inibir a migração de leucócitos para o foco inflamatório, confirmando propriedades pro-inflamatórias do NO. Os mecanismos envolvidos na inibição da migração celular parecem compreender a modulação da expressão e/ou síntese das moléculas de adesão constitutivas expressas em leucócitos e no endotélio, além da modulação da secreção de mediadores pró ou antiinflamatórios em leucócitos circulantes e neutrófilos. Por outro lado, os efeitos do tratamento com L-NAME sobre a secreção de mediadores químicos por macrófagos induzem a secreção destes e corroboram a dualidade dos efeitos do NO no processo de recrutamento celular. / Our previous results have demonstrated that in vivo chronic inhibition of nitric oxide synthesis reduces leukocyte recruitment into inflammatory focus, dependent, at least in part, on impaired leukocyte-endothelial interactions and expression of L-selectin. This study aimed to clarify the mechanisms involved in the reduced leukocyte migration observed in L-NAME-treated rats. For this purpose, male Wistar rats (180-220g) were treated with L-NAME (20 mg/kg, oral route, 14 days, dissolved in drinking water); controls animals received water by the same route and period of time. The effectiveness of L-NAME treatment was investigated by examining the activity of nitric oxide synthases (NOS) in the brain tissue using radioimmunoassay. In addition, effects of L-NAME treatment were evaluated in LPS-induced leukocyte recruitment into peritoneal cavity (5mg/kg, 4 hours); expression of adhesion molecules was determined in circulating leukocytes, cremaster muscle and liver sinusoids by flow cytometry and immunohistochemistry assay; gene expressions of adhesion molecules were quantified by PCR and leukocyte secretion of inflammatory mediators was measured by immunoenzimatics assays, Griess reaction or chemiluminescence. Our results show that: 1) L-NAME treatment reduced, around 90%, Ca+2 - dependent NOS activity in the presence or not of in vivo inflammation; 2) concentrations of NO in the plasma and into inflamed peritoneum were reduced in L-NAME-treated animals (30% vs. control animals); 3) migration of PMN leukocytes into inflammed peritoneum was impaired in L-NAME-treated rats (40% vs. control animals); 4) expressions of L-selectin and PECAM-1 in circulating leukocytes, PECAM-1 in endothelium from cremaster muscle and VAP-1 in endothelium from liver sinusoids and cremaster muscle were reduced in L-NAME-treated rats; 5) decrease in L-selectin expression was dependent on inhibition of its synthesis; 6) concentrations of IL-10 was higher in serum from L-NAME-treated rats in comparison to control rats; 7) these higher concentrations of circulating IL-10 can reflect the production of this cytokine by leukocytes from circulation, as IL-10 levels was greater in the supernatant of circulating leukocytes obtained from L-NAME-treated animals; 8) L-NAME treatment disturbed neutrophils ability to secrete IL-1β e LTB4, since these concentrations were lower in the supernatants of neutrophils from L-NAME-treated animals; 9) in absence of stimulation, macrophages obtained from L-NAME-treated rats produced higher concentrations of IL-1β, TNF-α e IL-6, and lower concentrations of IL-10, whereas in presence of in vitro LPS these cells produced lower concentrations of NO. Taken together, our results show that L-NAME treatment administrated for a prolonged period of time inhibits Ca+2 -dependent NOS activity, and in this condition, reduces concentrations of NO in plasma and into inflammatory focus and decreases leukocyte migration to the inflammatory focus thus confirming pro-inflammatory properties of NO. The mechanisms involved in impaired cellular migration seem to involve the modulation of expression and/or synthesis of constitutive adhesion molecules in leukocytes and endothelium, and to interfere in the secretion of pro or anti inflammatory mediators. On the other hand, actions of NO in secreation of chemical mediators by macrophages induces the production of inflammatory mediators and support the duality of NO in the cellular recruitment process.

O estabelecimento de uma resposta TH1 com a produção de IL-12, IFN-gama e de óxido nítrico é crucial no controle do Trypanosoma cruzi, o qual pode colonizar o SNC de crianças e pacientes imunossuprimidos. A inflamação exacerbada em decorrência da persistência de um estímulo antigênico gera o acúmulo de substâncias potencialmente citotóxicas, como mediadores pró-inflamatórios e radicais livres. A partir da infecção de camundongos imunodeficientes (IL-12p40KO) com T. cruzi Sylvio X10/4, avaliamos os danos causados à medula espinal com enfoque na inflamação e neurodegeneração. Além da desmielinização, alta reatividade glial e morte de neurônios no ponto mais tardio da doença, constatamos uma baixa produção de mediadores inflamatórios nas primeiras semanas após a infecção, acompanhada pela proliferação ascendente do parasita no tecido nervoso. Acreditamos que um atraso na produção de IFN-gama seja responsável pela ativação tardia ou ineficiente dos fagócitos da medula espinal, favorecendo a disseminação descontrolada do protozoário e subsequentes danos teciduais. / The establishment of a TH1 response with IL-12, IFN-gamma and nitric oxide production is crucial for controlling the proliferation of Trypanosoma cruzi, which may colonize the CNS of children and immunosuppressed hosts. The exacerbated inflammation due to the persistence of an antigenic stimulus results on the accumulation of potentially cytotoxic substances, such as pro-inflammatory mediators and free radicals. By the infection of immunodeficient mice (IL-12p40KO) with T. cruzi Sylvio X10/4 parasites we evaluated the spinal cord damages, focusing on the inflammation and neurodegeneration. Besides demyelization, high glial reactivity and neuron death at the latest stage of the disease, we noticed low production of inflammatory mediators during the first weeks of the infection, accompanied by an ascendant parasite proliferation in the nervous tissue. We believe that a delay on IFN-gamma production is responsible for the late or inefficient phagocyte activation in the spinal cord, contributing to the uncontrolled protozoan proliferation and subsequent tissue injury.

O óxido nítrico (NO) é um versátil agente biológico, atuando em diversas partes do organismo, tais como cérebro, artérias, sistema imunológico, fígado e pulmões. Sua natureza radicalar lhe confere grande reatividade e versatilidade, tornando o entendimento de sua bioquímica um desafio. A molécula de NO tende a reagir rapidamente com alguns metais de transição, formando compostos estáveis denominados complexos nitrosilos, os quais podem ser utilizados como fonte geradora de óxido nítrico. A liberação de NO a partir de complexos nitrosilos pode ocorrer por redução química, eletroquímica e fotoquímica. No presente trabalho foi estudada a obtenção, caracterização e permeação cutânea de um complexo nitrosilo de rutênio, o trans-[RuC(cyclam)(NO)]C2 (cyclam-NO), que associado ao fotossensibilizador protoporfirina IX, possui a peculiaridade de absorver na região do visível, podendo então ser aplicados na terapia fotodinâmica (TFD) para tratamento de câncer de pele. A mistura dos compostos foi incorporada em nanodispersões de cristais líquidos, de fase cúbica (DFC) e de fase hexagonal (DFH), e sua penetração/permeação in vitro em pele de modelo animal foi avaliada, assim como o comportamento fotoquímico do sistema, no que se refere à liberação de NO, visando uma futura aplicação em TFD. A atividade citotóxica dos compostos isolados e em mistura foi avaliada frente às linhagens B16F10 e Melan-A, na ausência e presença de luz, mostrando maior atividade da mistura dos compostos quando irradiados em 630 nm. Foram construídos diagramas de fase binário e ternário e, a partir destes, foram escolhidas as formulações a serem estudadas. Estas formulações foram caracterizadas por microscopia de luz polarizada e difração de raios-X e foram avaliados o tamanho médio de partícula e o índice de polidispersividade das nanodispersões obtidas e sua estabilidade por turbidimetria. Também foi analisada a liberação de oxigênio singlete e de NO a partir dos compostos em solução e destes incorporados nas formulações. Foi desenvolvido e validado um método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência para a quantificação simultânea dos compostos nos experimentos. A liberação dos compostos a partir das formulações usando membrana de acetato de celulose também foi avaliada, sendo possível detectar apenas o cyclam-NO. O estudo da eficiência de encapsulação mostrou que cerca de 70% da quantidade adicionada dos compostos foi incorporado na DFC e cerca de 80% na DFH. Os experimentos in vitro de permeação e retenção dos compostos em pele de orelha de porco mostraram aumento significativo da concentração dos compostos, comparado a controles contendo os mesmos em PEG. A DFH promoveu um aumento na concentração de PpIX no estrato córneo (EC) de 2,6 vezes e na epiderme+derme se EC ([E+D]) de 3,4 vezes, e para o cyclam-NO de 2,7 vezes no EC e 2,4 vezes na [E+D]. Já a DFC aumentou em 1,6 vezes a quantidade de PpIX no EC e 1,9 vezes na [E+D] e em 4,6 vezes a quantidade de cyclam-NO no EC e em 2,0 vezes na [E+D]. Os resultados obtidos permitem sugerir que estes sistemas são adequados para utilização como potenciais carreadores para a associação cyclam-NO e PpIX na TFD do câncer de pele e que esta associação apresentou efeito sinérgico, sendo mais eficiente que a utilização de apenas um dos compostos. / Nitric oxide (NO) is a versatile biological agent, acting in several parts of the body such as brain, arteries, immune system, liver and lungs. Its radical nature gives great versatility and reactivity, making the understanding of its biochemical a challenge. The NO molecule tends to react quickly with some transition metals, forming stable compounds called nitrosyl complexes, which can be used as a source of nitric oxide. NO release from nitrosyl complexes can occur by chemical, electrochemical or photochemical reduction. In this work, the acquisition, characterization and permeation of a nitrosyl ruthenium complex, trans-[RuC(cyclam)(NO)]C2 (cyclam-NO), which associated with the photosensitizer protoporphyrin IX, has the peculiarity of absorbing in the visible region, and could then be applied in photodynamic therapy (PDT) for treatment of skin cancer, were studied. The mixture of compounds was incorporated into liquid crystal nanodispersions, cubic (DFC) and hexagonal (DFH) phases, and its penetration/permeation in vitro in an animal model skin was evaluated, as well as the photochemical behavior of the system, with regard to NO release, seeking a future application in PDT. The cytotoxic activity of the compounds alone and in combination was evaluated against the B16F10 and Melan-A cell lines, in the absence and in the presence of light. Binary and ternary phase diagrams were constructed, and from these, the formulations to be studied were chosen. These formulations were characterized by polarized light microscopy and X-ray diffraction and were evaluated for particle size and polydispersity index of nanodispersions obtained and their stability by turbidimetry. Also, the release of singlet oxygen and NO from the compounds in solution and incorporated in the formulations was discussed. An analytical method using high efficiency liquid chromatography was developed and validated for simultaneous quantification of compounds in the experiments. The release of compounds from formulations using cellulose acetate membrane was evaluated, and only the cyclam-NO could be detect. The study of the encapsulation efficiency showed that about 70% of the added amount of the compounds was incorporated in the DFC and approximately 80% in DFH. In vitro permeation and retention experiments of the compounds in pig ear skin were performed, showing a significant increase in the concentration of the compounds in the skin layers, compared to controls containing compounds in polyethylene glycol. The DFH promoted an increase in the concentration of PpIX in the stratum corneum (EC) of 2.6 times and in the epidermis + dermis without EC ([E + D]) of 3.4 times, and the cyclam-NO by 2.7 times for EC and 2.4 times in the [E + D]. DFC already increased by 1.6 times the amount of PpIX in EC and 1.9 times at the [E+D] and 4.6 times the amount of cyclam-NO in EC and 2.0 times in the [E + D]. The results may suggest that these systems are suitable for use as potential carriers for the association of cyclam-NO and PpIX for use in skin cancer PDT and that this association showed a synergistic effect, being more efficient than the use of only one of the compounds.

IGF-I induz proliferação e diferenciação celular. Neste estudo visamos sua participação na imunidade específica na leishmaniose. Estudamos efeito de citocinas Th1 (IFN-g) e Th2 (IL- 4 mais IL-13) na modulação da produção de IGF-I e seu reflexo no parasitismo de macrófago (MØ) de camundongos BALB/c e C57BL/6, infectados por amastigotas e promastigotas de Leishmania (L.) major. Iniciamos avaliando os efeitos de IGF-I no modelo, onde no desenvolvimento da lesão IGF-I induziu aumento maior de lesão em camundongos BALB/c. Nos camundongos C57BL/6 o efeito foi marcante com evolução progressiva da lesão enquanto que sem o fator, a lesão se controlava. Como a produção de IGF-I por MØ é modulada por citocinas, onde IFN-g diminui e IL-4 e IL-13 aumentam a sua expressão, fomos estudar seus efeitos no modelo proposto onde MØ foram infectados com amastigotas ou promastigotas de L.(L.) major (parasitos/célula = 2:1) e incubados com IFN-g (200U/mL) ou IL-4 (2ng/mL) mais IL-13 (5ng/mL). IFN-g induziu aumento significante na produção de NO nos dois modelos estudados. O efeito de citocinas Th1 e Th2 sobre o parasitismo em MØ foi distinto em BALB/c e C57BL/6. Quando infectados por amastigotas, o parasitismo aumentou sob estímulo com IL-4 mais IL-13 e diminuiu com IFN-g como era esperado. No entanto, quando infectado por promastigota, o parasitismo aumentou com IL-4 mais IL-13 somente em células BALB/c. Por outro lado, o parasitismo diminuiu com IFN- g somente em células C57BL/6. Mesmo na ausência do estímulo por citocinas, observou-se aumento na expressão de RNA de IGF-I nos MØ de animais BALB/c infectados por formas amastigotas ou promastigotas e de C57BL/6 infectados por promastigotas. Um resultado destoante foi à diminuição da expressão de IGF-I em MØ de C57BL/6 infectados por amastigotas. Em células BALB/c, essa expressão aumentada de IGF-I ocorrida em função da infecção, somente se alterou com IL-4 mais IL-13 quando infectadas por amastigotas. Em células C57BL/6, a expressão aumentada de IGF-I com a infecção por prormastigota, sofreu diminuição sob estímulo com IFN-g, não se alterando com citocinas Th2. A expressão diminuída de IGF-I com a infecção por amastigotas diminuiu ainda mais com IFN-g e aumentou com citocinas TH2. Os dados sugerem a possibilidade de modulação do efeito de citocinas pela expressão diferenciada de IGF-I em macrófagos infectados por L. (L.) major / Insulin-like growth factor (IGF)-I induces cell proliferation and differentiation. In this study, we focused on its participation on specific immunity. We studied the effect of Th1 (IFN-g) and Th2 (IL-4 plus IL-13) cytokines on the modulation of the production of IGF-I and its influence on BALB/c and C57BL/6 macrophage (MØ) parasitism using Leishmania (L.) major amastigote and promastigote. IGF-I expression was increased in infected macrophages. Initially, we substantiated the effect of IGF-I on in vitro growth of Leishmania (L.) major promastigote, on cutaneous lesion development in vivo and diminished production of nitric oxide in MØ. On development of the lesion, IGF-I induced greater increase of the lesion in BALB/c mice. In C5BL/6 mice, its effect was more pronounced with progression of the lesion whilst without the factor it was controlled. Since IGF-I production by MØ is modulated by cytokines where IFN-g decreases and IL-4 plus IL-13 increase its expression, we studied their effects in BALB/c and C57BL/6 MØ. Macrophages were infected with L.(L.) major amastigotes or promastigotes (parasites/cell = 2:1) and incubated with IFN-g (200U/mL) or IL-4 (2ng/mL) plus IL-13 (5ng/mL). IFN-g induced a significant increase of NO production by MØ from both models. The effect of Th1 and Th2 cytokines on parasitism was distinct when MØ infected with amastigotes, the parasitism increased upon IL-4 plus IL-13 stimuli and diminished with IFN-g as expected. However, when infected with promastigotes, the parasitism increased with IL-4 plus IL-13 only in BALB/c cells. Conversely, the parasitism diminished with IFN-g only in C57BL/6. Even in the absence of cytokine stimuli, an increase of the expression of IGF-I mRNA was observed in L (L.) major amastigote- and promastigote- infected BALB/c MØ and in promastigoteinfected C57BL/6 MØ. A dissonant result was a diminished IGF-I expression in amastigoteinfected C57BL/6 MØ. In BALB/c this increased IGF-I expression with infection only altered with IL-4 plus IL-13 in amastigote-infected cells. In C57BL/6 cells, the increased IGF-I expression upon prormastigote infection diminished under IFN-g stimulus that was not altered with Th2 cytokines. A decreased IGF-I expression with amastigote-infection diminished even more with IFN-g and increased with Th2 cytokines. These data suggest a possibility of modulation of the effect of cytokines on distinct expression of IGF-I in L. (L.) major-infected MØ

Neste trabalho foram investigados os mecanismos e o perfil cinético de processos nitrosativos do ponto de vista da nitrosação do indicador 4,5-diamino fluoresceina (DAF2) em células do tipo RAW 264.7. Também foi investigado o papel que ferro lábil (LIP) exerce em tais processos. O estudo cinético mostrou que a nitrosação do DAF2 é dependente de superóxido intracelular e se processa por dois mecanismos distintos denominados nitrosilação oxidativa e nitrosação. Observou-se que o perfil cinético da nitrosaçao do DAF2 sofre uma transição passando de dependente para independente com relação à concentração de NO, quando a concentração de NO se aproxima de 100-110nM. Este perfil está relacionado com a dinâmica de recombinação entre NO e O2¯ que dispara todo o processo de nitrosação do DAF2. No trabalho fica claro que processos nitrosativos que ocorrem pelos mesmos mecanismos podem apresentar perfis cinéticos completamente diferentes dependendo da localização onde ocorre a recombinação entre NO e O2¯. O ponto mais interessante foi a constatação de que quelantes permeáveis à membranas biológicas estimulam a nitrosação do DAF2 intracelular. Este efeito é decorrente da remoção de LIP intracelular que, surpreendementemente, apresenta papel antinitrosativo nas condições experimentais estudadas. O papel incomum antinitrosativo apresentado por LIP é analizado do ponto de vista da reação entre LIP e ONOO¯ que tem como produto nitrito, uma espécie não nitrosante. Estes resultados podem alterar a forma como LIP é visto em processos oxidativos e nitrosativos. / In this work, we investigated the mechanisms and kinetic profiles of nitrosative processes using fluorescent indicator 4,5-diaminofluorescein (DAF2) in RAW 264.7 cells. The labile iron pool (LIP) influence in nitrosative processes was also evaluated. Intracellular DAF2 nitrosation is superoxide dependent and proceeds by two distinct mechanisms: Oxidative nitrosylation and nitrosation. The former mechanism is the most relevant under all experimental conditions tested. Interestingly, the DAF2 nitrosation rate increases linearly with NO concentration of up 100-110 nM but thereafter undergoes a sharp transition and becomes insensitive to NO. This peculiar kinetic behavior has never been reported and it is linked with NO and superoxide recombination dynamics. When NO reaches a concentration capable to outcompete superoxide dismutase for superoxide, the rate of DAF2 nitrosation becomes insensitive to NO. The most striking finding is the LIP´s influence in nitrosative processes. LIP removal by cell membrane permeable metal chelantors increases DAF2 nitrosation rate significantly, suggesting tha LIP can act as an anti-nitrosant species. This increase is probably related with LIP´s direct reaction with peroxynitrite, wich produces non-nitrosant species like nitrite. This controversial LIP´s anti-nitrosative role in cellular systems is rather interesting since it can change the way we understand it´s role in nitrosative and oxidative processes.

Atualmente, a população mundial está passando por um processo de transição demográfica, relacionado com o aumento considerável do número de idosos em relação aos jovens. O rápido crescimento da população idosa constitui uma das maiores preocupações da sociedade moderna, o que demanda um aumento no estudo da saúde e da melhoria da qualidade de vida dos idosos, incluindo um maior esclarecimento dos aspectos patofisiológicos relacionados com as doenças microbianas. Uma das infecções que afetam os idosos, principalmente os imunocomprometidos, é a candidose, a qual pode ser causada por diferentes espécies de Candida, em especial Candida albicans (C. albicans). Os monócitos e macrófagos exercem funções essenciais no combate a microrganismos através do processo fagocítico que abrange a produção de espécies reativas do nitrogênio e oxigênio que culminam no controle e/ou morte do patógeno. Uma vez esses fatores comprometidos, o combate aos agentes agressores é dificultado e ou ineficaz fazendo com que estas disfunções ocasionem problemas clínicos. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar in vitro a capacidade fagocítica, a geração de óxido nítrico (NO) e peróxido de hidrogênio (H2O2) intracelular, e a habilidade de controlar o crescimento extracelular do fungo C. albicans por monócitos e macrófagos humanos de idosos e jovens. Para isso, foram obtidos monócitos do sangue periférico de indivíduos idosos e jovens os quais permaneceram em cultura por 7 dias e se diferenciaram em macrófagos. Ambos os fagócitos foram desafiadas com diferentes proporções de C. albicans viáveis (5 células:1 fungo, 1:1 e 1:5) por 30min, 2h e 5h. Após os desafios, os dados foram analisados por meio de ensaio fluorescente de fagocitose e crescimento fúngico extracelular, e pelos kits DAF-FM diacetato (NO) e Cell Rox Deep (H2O2). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (SD) dos valores ou porcentagens obtidos e a análise estatística foi realizada por meio do teste estatístico ANOVA fatorial seguido do teste de Fischer, considerando p<0,05. Nossos resultados revelaram que a idade não afeta a internalização de C. albicans por monócitos e macrófagos oriundos de idosos, no entanto, esses indivíduos levaram mais tempo para ativar a produção de NO e H2O2 que os jovens. Após 5h de estímulo fúngico, as células dos idosos se igualaram ou superaram a resposta imunológica apresentada pelos jovens, demonstrando maior habilidade em controlar o crescimento fúngico extracelular. Baseados nestes resultados, concluímos que, em comparação aos jovens, os monócitos e macrófagos de idosos têm sua habilidade de internalizar o fungo C. albicans preservada; no entanto, os seus sinais de ativação para a produção de substâncias microbicidas, como NO e H2O2, estão prejudicados, o que pode propiciar a instalação local do fungo e/ou disseminação sistêmica nesta população. Além disso, ao longo do tempo, estas células oriundas de idosos conseguiram produzir NO e H2O2 como ou mais que os jovens, sugerindo um estado de pré-ativação celular em função de níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias inerentes do estado crônico inflamm-aging, o qual os idosos podem estar vivenciando. / Currently, the world population is undergoing a process of demographic transition, associated with a considerable increase in the number of elderly compared with young subjects. The rapid growth of the elderly population is a major concern of the modern society, which requires an increase in the study of health and improved quality of life for the aged. This includes a greater clarification of the pathophysiological aspects of microbial diseases. One of the infections affecting the elderly, particularly those immunocompromised, is the candidosis that can be caused by various Candida species, especially Candida albicans (C. albicans). Monocytes and macrophages exert essential functions in combating microorganisms by phagocytic process. During this process occur the production of reactive nitrogen species and reactive oxygen species that culminate in the control and/or death of the pathogen. Once these factors are affected, the fight against aggressors is difficult and/or ineffective, and these disorders can cause clinical problems. Thus, the aim of this in vitro study was to investigate occurrence of phagocytosis, the intracellular generation of nitric oxide (NO) and hydrogen peroxide (H2O2), and the ability of human monocytes and macrophages from young and old in controlling the extracellular growth of the fungus C. albicans. Therefore, peripheral blood monocytes from elderly and young subjects were obtained and remained in culture for 7 days until they differentiate into macrophages. Both mononuclear cells were challenged with different proportions of viable C. albicans (5 cells:1 fungus, 1:1 and 1:5) for 30min, 2h and 5h. After the challenges, it was possible to evaluate the ability of fungal internalization and the controlling of extracellular fungal growth by a fluorescent assay, and measure the intracellular production of nitric oxide (NO) by DAF-FM Diacetate and hydrogen peroxide (H2O2) by Rox Deep Cell Kit. The results were expressed as mean ± standard deviation (SD) values or percentages obtained and the statistical analysis was performed using factorial ANOVA followed by Fisher test, with p <0.05. Our results showed that age does not affect the internalization of C. albicans by monocytes and macrophages derived from older subjects, however, these individuals took more time to activate the production of NO and H2O2 than that young. After 5h of fungal stimulation, the cells of the elderly equaled or exceeded the immune response presented by young people, demonstrating greater ability to control the extracellular fungal growth. Thus, we conclude that, compared with young, monocytes and macrophages from elderly have their ability to internalize the fungus C. albicans preserved; however, their activation signals for the production of microbicidal substances, such as NO and H2O2 are impaired, which may facilitate the local installation of the fungus and/or systemic dissemination in this population. Furthermore, over time, these cells derived from elderly were able to produce NO and H2O2 as or more than the young, suggesting a state of cellular pre-activation. Probably due to high levels of proinflammatory cytokines involved in the chronic state which older people may be experiencing, known as inflamm-aging.

Peroxinitrito (ONOO- + ONOOR), o produto da reação controlada por difusão do óxido nítrico com o ânion radical superóxido, tem recebido muita atenção como possível mediador dos efeitos deletérios associados a uma superprodução de óxido nítrico. O peroxinitrito é um potente oxidante que é capaz de oxidar e nitrar várias biomoléculas cujos mecanismos contribuímos para esclarecer. Particularmente relevante foi demonstrar inequívocamente, por EPR de fluxo, que a rápida reação entre peroxinitrito e o biologicamente abundante dióxido de carbono, produz dióxido de nitrogênio e ânion radical carbonato em rendimentos de aproximadamente 35%. Sugerimos então, que o peroxinitrito deveria atuar na maioria dos ambientes biológicos através de seus radicais derivados que produziriam radicais de biomoléculas. Consubstanciamos essa sugestão pelo estudo da oxidação dos biotióis cisteína, glutationa e BSA-cys34 por peroxinitrito e peroxinitrito/dióxido de carbono. Também, demonstramos que a reação entre o nitróxido tempol e os radicais derivados do peroxinitrito é uma etapa relevante para que o tempol redirecione a reatividade do peroxinitrito de nitração para nitrosação de biomoléculas. Finalmente, demonstramos que existem outras potenciais fontes biológicas de dióxido de nitrogênio e anion radical carbonato como a atividade peroxidásica da enzima superóxido dismutase e a enzima xantina oxidase. / Peroxynitrite (ONOO- + ONOOR), which is formed by the diffusion-controlled reaction between nitric oxide and superoxide anion, has been receiving increasing attention as a mediator of the deleterious effects associated with an overproduction of nitric oxide. Peroxynitrite is a strong oxidant that is able to oxidize and nitrate a variety of biotargets by mechanisms that this work has contributed to establish. Particularly relevant, was the unequivocal demonstration by rapid flow EPR that the rapid reaction between peroxynitrite and the biologically ubiquitous carbon dioxide produces nitrogen dioxide and carbonate radical anion in yields of around 35%. This led us to suggest that in most biological environments peroxynitrite would act through its derived radicals that would oxidize biomolecules to radicals. This hypothesis was clearly supported by our studies of biothioI (cysteine, glutathioneand BSA-cys34) oxidation by peroxynitrite and peroxynitrite/carbon dioxide. In addition, we demonstrated that the reaction between the nitroxide tempol and peroxynitrite-derived radicals is an important step of the mechanism by which tempol diverts peroxynitrite reactivity from nitration to nitrosation of biomolecules. Finally, we demonstrated that there are other potential sources of nitrogen dioxide and carbonate radical anion such as the peroxidase activity of the enzyme Cu,Zn-superoxide dismutase and the enzyme xanthine oxidase turnover.