Ces travaux de thèse d’imagerie moléculaire et translationnelle proposent, sur des modèles murins, deux approches innovantes pour les thérapies géniques. La plupart des cancers sont associés à des dérégulations de l’expression génique et certains gènes sont surexprimés. L’utilisation de microARN (miARN) permet d’envisager une réduction de l’expression d’un gène spécifique mais il est nécessaire de limiter cette inhibition au tissu pathologique. L’utilisation des promoteurs thermo-inductibles couplés à un dépôt local de chaleur autorise un contrôle spatial et temporel de l’expression génique in vivo. Notre projet a été de coupler le contrôle spatio-temporel et l’inhibition d’un gène cible. A cette fin, un miARN synthétique a été placé sous contrôle du promoteur thermo-inductible Hsp70B pour induire l’inhibition d’un gène d’imagerie (luciférase firefly) surexprimé dans une tumeur. L’étude a été menée in vitro sur des lignées cellulaires génétiquement modifiées puis in vivo sur un modèle de xénogreffes chez la souris grâce au suivi en imagerie optique de bioluminescence (BLI). Nos résultats montrent la faisabilité d’induire transitoirement l’inhibition génique au sein d’une tumeur. L’induction est modulable par la température. Cette stratégie peut être couplée à des méthodes couramment utilisées en clinique et ouvre des perspectives thérapeutiques intéressantes. Notre travail de thèse s’intéresse également à l’utilisation d’ARN comme molécule thérapeutique pour la thérapie génique. L’électroporation intra-dermique d’ARN codant pour la luciférase permet de suivre et de quantifier in vivo par BLI l’expression génique. Plusieurs types d’ARN ont été utilisés pour comparer les efficacités respectives des différentes voies traductionnelles. Notre travail démontre que les ARN permettent l’expression transitoire, sans risque d’insertion génomique, d’un gène in vivo. Nous montrons ainsi tout le potentiel de l’utilisation des ARN en thérapie génique. / The present thesis work in molecular and translational imaging establishes two innovative approaches for gene therapy in mouse models. Abnormal regulation of gene expression is the hallmark of cancer, and some of them are overexpressed. MicroRNA (miRNA) can be used as tools to reduce specific gene expression but requires inhibition to be limited to the pathological tissue. Thermo-inducibles promoters associated with local hyperthermia allow for spatial and temporal control of gene expression in vivo. The goal of the present study was to achieve gene inhibition with spatio-temporal control of miRNA expression to inhibit a target gene. In our strategy, a synthetic miRNA was placed under transcriptional control of the heat-inducible promoter Hsp70B to induce inhibition of the imaging reporter gene firefly luciferase overexpressed in a tumor. The study was conducted both in vitro using genetically modified cells lines and in vivo using a xenograft model in mice monitored by optical bioluminescence imaging (BLI). Our data show the feasibility of transient induction and heat-modulation of gene inhibition within a tumor. This strategy can be performed with currently clinically available methods and thus, offers interesting therapeutics prospects. Our work also includes a study on RNA as therapeutic vector for gene therapy. The intradermic electroporation of RNA encoding the imaging reporter gene firefly luciferase allows to monitor and quantify gene expression by BLI in vivo. Several types of RNA have been used to investigate efficiency of the different translational mechanisms. Our data clearly demonstrate that RNA allows for transient gene expression in vivo without any risk of insertion into the target cell’s genome. Altogether, our data highlight the potential use of RNA in gene therapy.

Dans cette thèse, nous proposons et étudions des systèmes d’exposition en vue d’explorer les effets biologiques sanitaire et thérapeutique des ondes électromagnétiques sur le vivant. Nous proposons une antenne micro-onde pour l’ablation thermique des tumeurs cancéreuses du foie à 2.45 GHz. Son originalité réside en ses dimensions miniatures et la possibilité de l’insérer dans le foie par voie endoscopique. Pour cette antenne, un débit d’absorption spécifique (DAS) supérieur à 50 W/kg/W inc a montré une zone exposée de 1-cm de diamètre. Nous proposons ensuite une cellule transverse électromagnétique (TEM) avec une ouverture fermée par un matériau transparent conducteur l’Indium tin oxyde (ITO). Cette cellule TEM peut être utilisée pour évaluer les effets sanitaires potentiels des signaux de télécommunications sans fils. Ce système permet l’observation microscopique en temps réel du milieu biologique exposé, à travers son ouverture fermée par l’ITO. L’influence de la présence de l’ouverture et de la couche d’ITO sur le DAS dans le milieu exposé a été évaluée. Les valeurs du DAS obtenues à 1.8 GHz dans le milieu exposé dans la cellule TEM avec l'ouverture fermée ou non par l’ITO étaient de 1.1 W/kg/W inc et 23.6 W/kg/W inc, respectivement. Une excellence homogénéité du DAS a été obtenue dans le milieu en présence de l’ITO. Enfin, nous proposons plusieurs dispositifs spécifiques pour l’exposition des cellules biologiques aux champs électriques pulsés nanosecondes de haute intensité (nsPEFs). Les effets biologiques des nsPEFs sont utilisés pour des applications dans le domaine médical et en biotechnologie. Nous proposons deux dispositifs à électrodes en contact direct avec le milieu biologique et trois dispositifs à électrodes isolées. Nous démontrons l’adaptation de ces dispositifs aux impulsions courtes de durée 3-ns et la capacité de ceux à électrodes en contact à fournir des champs intenses de l’ordre de quelques MV/m. Nous illustrons aussi l’importance des dispositifs isolés pour délivrer des impulsions ultracourtes. / In this thesis, we propose and study exposure systems to explore healthy and therapeutic biological effects of EM signals. We propose a microwave antenna for thermal ablation of liver tumors at 2.45 GHz. Its original feature consists in its reduced dimensions that permits the endoscopic insertion in the zone to be treated. For this antenna, a specific absorption rate (SAR) greater than 50 W/kg/W inc showed an exposed zone of 1-cm diameter. We propose a transverse electromagnetic cell (TEM) with an aperture sealed with a transparent conducting material Indium tin oxide (ITO).This TEM cell can be used to study the potential effects of wireless communication systems on biological cells. This delivery device allows real-time observation of biological cells during exposure across the aperture sealed with ITO. The effect of the aperture and the ITO layer presence on the SAR in the exposed sample was evaluated. The SAR values obtained at 1.8 GHz in the sample exposed in the TEM cell with the sealed or non-sealed aperture of 20-mm diameter were 1.1 W/kg/W inc and 23.6 W/kg/W inc, respectively. An excellent homogeneity of SAR was achieved in the medium in the presenceof ITO. Finally, we propose several devices for the exposure of biological medium to nanosecond pulsed electric field with high intensity (nsPEFs). The biological effect of nsPEFs are used in biotechnology and medicine. We propose two devices with electrodes in direct contact with the biological medium and three devices with isolated electrodes. We demonstrate their adaptation for 3-ns duration pulses and the suitability of those with electrodes in contactwith the biological medium to provide high intensities fields in the order of several MV/m. We demonstrate the importance of the isolated devices for delivering ultrashort pulses.

La compréhension des mécanismes immunologiques précoces mis en place suite à l’administration de vaccins est encore de nos jours largement méconnue. Pourtant de plus en plus d’études démontrent l’importance de ces mécanismes très précoces faisant intervenir les acteurs de l’immunité innée dans la génération d’une réponse spécifique efficace après vaccination. La peau est un organe intéressant pour l'administration de vaccins du fait de sa richesse en cellules présentatrices d'antigènes (APC), qui sont des cellules essentielles dans la mise en place de la réponse immunitaire. L'administration par voie intradermique du vaccin ADN de type auxoGTU induit des réponses immunitaires fortes et persistantes, en particulier en association avec une électroporation (EP) locale chez le macaque cynomolgus. Le but de ce travail de thèse fut de caractériser les réponses immunitaires locales précocement mises en place suite à l’administration par voie intradermique du vaccin ADN auxo-GTU en association avec une EP. Dans un premier temps, nous avons décrit les populations de cellules immunitaires présentes dans la peau normale chez le macaque cynomolgus.L'épiderme contient des cellules de Langerhans (LC) qui sont : CD1a+ CD1c- et des lymphocytes T caractérisés par l’expression du CD3. Le derme contient des cellules CD1a+CD1c-, qui présentent des similitudes avec les LC et correspondent donc probablement à des LC en migration à travers le derme. Il contient également des cellules dendritiques dermales (DDC) CD1a+CD1c+, des macrophages résidants CD163highCD11b+ et les lymphocytes T CD3+. Chez certains animaux, nous avons mis en évidence la présence de granulocytes CD66+ dans le derme sain. Les populations de cellules immunitaires identifiées chez le macaque sont similaires à celles identifiées chez l’homme malgré de légères différences phénotypiques. Cette caractérisation nous a ensuite permis d'étudier l’impact de la vaccination sur les populations immunitaires de la peau.Nous avons démontré que la vaccination induit le recrutement de granulocytes et de monocytes/macrophages inflammatoires dans l'épiderme et dans le derme, ainsi qu’un recrutement plus tardif de cellules dendritiques inflammatoires épithéliales (IDEC) dans l'épiderme. Dans l'épiderme, 24h après immunisation, nous avons observé une augmentation transitoire des LC accompagnée d’une surexpression de HLA-DR, de CD86 et de CD83, ce qui démontre leur maturation. Entre 24h et 72h, le nombre de LC diminue, ce qui suggère que les LC matures quittent l’épiderme pour migrer vers les nœuds lymphatiques. Ces événements cellulaires sont majoritairement dus à l’EP, indépendamment de la présence du vaccin à ADN. L’analyse du microenvironnement mis en place dans la peau suite à la vaccination révèle une libération de facteurs solubles pro-inflammatoires, comme MCP-1, IL-18 , IL-15, IL-8 et de facteurs solubles anti- inflammatoires comme IL-1RA et sCD40L dès 24h, dont certains sont considérablement augmentés par la présence de l’ADN vaccinal. Nos résultats suggèrent que l’EP, indépendamment de la présence de l'ADN, est suffisante pour induire la mobilisation des cellules et la maturation des DC au niveau du site de vaccination, ce qui montre un important rôle adjuvant de l’EP. Cependant, il semble que l'ADN soit nécessaire pour générer un microenvironnement favorable à l'activation optimale des APC. Ce travail fournit des éléments importants sur les mécanismes de l'inflammation locale et ouvre de nouvelles possibilités pour les stratégies vaccinales. / Mechanisms involved in early vaccine response are poorly understood. However, more and more studies show the importance of innate immunity in the very early times following vaccine administration in the generation of an optimal specific immune response. Skin is an interesting target for vaccine delivery because of its richness in antigen presenting cells (APC) which are essential cells in immune responses. The intradermal delivery of auxoGTU DNA vaccine was shown to induce strong and persistent immune responses, especially in association with electroporation in cynomolgus macaque. The aim of this work was to characterize the early local immune responses followed intradermal auxoGTU DNA vaccination in association with EP in cynomolgus macaque. In a first step, we have described immune cell populations present in the normal skin in the cynomolgus macaques. The epidermis contains CD1a+CD1c- Langerhans cells (LCs), and CD3+ T cells. The dermis contains CD1a+CD1c- cells, which present similarities with LCs and probably correspond to LC in migration through dermis. It also contains CD1a+CD1c+ dermal dendritic cells (DDCs), CD163highCD11b+ resident macrophages, and CD3+ T cells. We found CD66+ polymorphonuclear cells in healthy dermis in some of the animals. Immune cell populations in the macaque are similar to those in humans despite moderate differences in phenotype. This characterization has allowed us to study the impact of vaccination on immune populations of the skin. We have demonstrated a recruitment of granulocytes and inflammatory monocytes/macrophages in epidermis and dermis, as well as a population of inflammatory dendritic epithelial cell (IDEC) in epidermis after vaccination. In epidermis, 24h after treatment, we have observed an initial increase of LC with an up-regulation of HLA-DR, CD86 and CD83, demonstrating their maturation. Between 24h and 72h, LC number decreased, suggesting that mature LC has leaved epidermis to migrate to skin draining lymph node. All these cellular events were almost due to EP process, independently of DNA vaccine presence. The skin microenvironment reveals a release of pro-inflammatory soluble factors, as MCP-1, IL-18, IL-15, IL-8 and anti-inflammatory mediators as IL-1RA and sCD40L by 24h, all considerably enhanced in the presence of DNA.Our results suggest that EP, independently of the presence of DNA, is sufficient to induce cells mobilization and DC maturation at the vaccinated site, suggesting an important adjuvant effect of EP. However, it seems that DNA is required to generate a favorable microenvironment essential for correct APC activation. This work provides important clues to local inflammation mechanisms and opens up new possibilities for vaccine strategies.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Des mutations hétérozygotes faux-sens dans le gène de la tubuline gamma TUBG1, ont été identifiées dans le contexte des malformations du développement cortical, associées à une déficience intellectuelle et à l'épilepsie. Ici, nous avons étudié par la technique d’électroporation in-utero et par des études in vivo, l’effet de quatre de ces variantes sur le développement cortical. Nous montrons que les mutations dans TUBG1 affectent le positionnement neuronal dans la plaque corticale, en perturbant la locomotion des neurones nouvellement nés, mais sans affecter la neurogenèse. Nous proposons que la γ-tubuline mutante affecte le fonctionnement global de ses complexes, et en particulier leur rôle dans la régulation de la dynamique des microtubules. De plus, nous avons développé un modèle de souris knock-in Tubg1Y92C/+ et évalué les conséquences de la mutation sur le développement cortical, les caractéristiques neuroanatomiques et le comportement. Les souris mutantes présentent une microcéphalie globale, des anomalies du néocortex et de l'hippocampe, des altérations du comportement et une susceptibilité épileptique. Ainsi, nous montrons que les souris Tubg1Y92C/+ miment au moins partiellement le phénotype humain et représentent donc un modèle pertinent pour d'autres investigations de la physiopathologie des malformations du développement cortical. / Missense heterozygous variants in the gamma tubulin gene TUBG1 have been linked to malformations of cortical development, associated with intellectual disability and epilepsy. Here, we investigated through in-utero electroporation and in-vivo studies, how four of these variants affect cortical development. We show that TUBG1 mutants affect neuronal positioning within the cortical wall, by a disrupting the locomotion of newly born neurons but without affecting neurogenesis. We propose that mutant γ-tubulin affects overall functioning of γ-tubulin complexes, and in particular their role in the regulation of microtubule dynamics. Additionally, we developed a knock-in Tubg1Y92C/+ model and assessed consequences of the mutation on cortical development, neuroanatomical features and behaviour. Mutant mice present with global microcephaly, neocortical and hippocampal abnormalities, behavioural alterations and epileptic susceptibility. Thus, we show that Tubg1Y92C/+ mice partially mimic the human phenotype and therefore represent a relevant model for further investigations of the physiopathology of malformations of cortical development.

Les cellules de la lignée d'hépatome HepaRG sont des progéniteurs bipotents capables de se différencier à confluence en cellules biliaires et en hépatocytes exprimant un large éventail de fonctions spécifiques du foie notamment plusieurs enzymes clés de détoxication. Ce système cellulaire constitue un modèle unique pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires régissant le processus de différenciation du progéniteur hépatique vers l'hépatocyte ou encore certains aspects de régulation du cycle cellulaire de l'hépatocyte. Par ailleurs, il offre un modèle cellulaire alternatif aux cultures primaires d'hépatocytes humains pour des applications en pharmacotoxicologie. Cependant, ces cellules expriment un niveau relativement limité d'un important cytochrome P450, le CYP2E1, restreignant leur utilisation pour les études de toxicologie des drogues métabolisées par cette voie. Nous avions comme objectif d'établir des protocoles efficaces de transfection afin d'augmenter l'expression du CYP2E1 dans les cellules HepaRG. Des protocoles de transfection efficaces ont été établis en utilisant l'électroporation et des lipides cationiques appartenant aux lipophosphonates et lipophosphoramidates. Ces approches nous ont permis d'augmenter significativement le niveau d'expression et d'activité du CYP2E1 dans les cellules HepaRG différenciées ouvrant de nouvelles perspectives pour des études de métabolisme et de toxicité des drogues dépendantes du CYP2E1. La mise au point de ces protocoles de transfection a été mise à profit pour aborder d'autres applications notamment la répression par siARN de l'expression du récepteur aux amines aromatiques hétérocycliques AhR. Nous avons pu par électroporation dans des cellules HepaRG différenciées démontrer que AhR est au moins en partie responsable de l'induction des CYP1A1 et 1A2 par les amines aromatiques hétérocycliques PhIP et MeIQx. Toujours en utilisant un protocole d'électroporation, nous avons également établi une lignée HepaRG recombinante exprimant de façon constitutive l'hepcidine en fusion avec la Green Fluorescent Protein (GFP). Cette lignée constitue un nouvel outil d'étude du processus de maturation et de sécrétion de l'hepcidine un régulateur hormonal central du métabolisme du fer. Enfin, dans une dernière partie du travail, nous avons abordé un nouveau type de vectorisation : des nanoparticules synthétisées à partir de poly-acide malique dans le but d'encapsuler des principes actifs anticancéreux pour des applications potentielles dans le ciblage du carcinome hépatocellulaire. Une première étape a consisté à étudier la toxicité in vitro de ces particules sur plusieurs lignées cellulaires puis d'évaluer leur potentiel d'encapsulation de principe actif en utilisant la doxorubicine comme molécule de référence.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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Pour diversifier leur matériel génétique, s’adapter aux perturbations environnementales et coloniser de nouvelles niches, les bactéries utilisent plusieurs processus évolutifs dont l’acquisition de matériel génétique par transfert horizontal de gènes comme la conjugaison, la transduction et la transformation. À ces trois mécanismes naturels s’ajoute l’électrotransformation due aux phénomènes électriques liés à la décharge de foudre. La présence dans les nuages de bactéries aérosolisées capables de former des noyaux de glace à l’origine des précipitations et impliquées dans le déclenchement de la foudre, telles que la bactérie phytopathogène à répartition mondiale Pseudomonas syringae, nous a conduit à proposer que l’électrotransformation naturelle dans les nuages pouvait affecter les bactéries, contribuant ainsi à augmenter leur potentiel adaptatif. Dans un premier temps, nous avons déterminé si la bactérie glaçogène P. syringae pouvait survivre à des électroporations simulant des décharges de foudre et acquérir du matériel génétique exogène dans les nuages. Comparée à deux autres bactéries, P. syringae se révèle être mieux adaptée pour la survie et l’électrotransformation génétique, ce qui suggère qu’elle serait capable de survivre et d’évoluer durant son transport dans les nuages. Nous avons ensuite évalué l’impact d’électroporations simulant les décharges de foudre sur la survie, le potentiel d’électrotransformation et la diversité de bactéries présentes dans des échantillons de pluie comme substitut des communautés bactériennes des nuages. Ces dernières étaient plus résistantes que les souches de laboratoire et certaines étaient capables d’acquérir de l’ADN exogène par électrotransformation. Les bactéries de la pluie isolées provenaient de différentes origines et présentaient différents modes de vie, représentatifs des sources probables d’émissions de bactéries terrestres. Cette étude montre que les bactéries aérosolisées de divers écosystèmes terrestres sont susceptibles de se disséminer dans de nouveaux habitats grâce aux nuages tout en étant capable d’acquérir de nouveaux gènes par éléctrotransformation, et d’augmenter ainsi potentiellement leur diversité génétique. La dernière partie de mon travail a évalué si l’électrotransformation appliquée aux bactéries indigènes du sol pouvait être employée pour dépolluer les sols contaminés par un pesticide largement utilisé autrefois, le lindane. L’optimisation des expériences met en évidence l’incorporation par les bactéries indigènes d’un plasmide contenant le gène codant les premières déchlorinations du lindane au travers d’une combinaison de transformation naturelle et d’électrotransformation. En conclusion, nous avons montré que l’électrotransformation naturelle liée aux décharges électriques, comme celles se produisant dans les nuages ou atteignant le sol, peut être impliquée dans le transfert horizontal de gènes chez les bactéries et, considérant l’importance de la foudre à travers le monde, pourrait jouer un rôle dans l’adaptation et l’évolution de ces organismes. / To diversify their genetic material, allowing adaptation to environmental disturbances and colonization of new ecological niches, bacteria use various evolutionary processes, including the acquisition of new genetic material by horizontal transfer mechanisms such as conjugation, transduction and transformation. Electrotransformation mediated by lightningrelated electrical phenomena may constitute an additional gene transfer mechanism occurring in nature. The presence in clouds of bacteria capable of forming ice nuclei that lead to precipitations and are involved in the triggering of lightning, such as the global phytopathogen Pseudomonas syringae, led us to postulate that natural electrotransformation in clouds may affect bacteria, by contributing to increase their adaptive potential. We first determined if the ice nucleator bacterium P. syringae could survive when in clouds and acquire exogenous genetic material through lightning shock-simulating in vitro electroporation. In comparison to two other bacteria, P. syringae appears to be best adapted for survival and for genetic electrotransformation under these conditions, which suggests that this bacterium would be able to survive and evolve whilst being transported in clouds. Secondly, we evaluated the impact of lightning shock-simulating in vitro electroporation on the survival, the electrotransformation potential and the diversity of bacteria collected from rain samples. These isolates better resisted lightning than the laboratory strains and some were able to electrotransform exogenous DNA. The rain bacteria we isolated were of different origins and were representative of life modes of the various sources of bacterial emissions on Earth. Our study suggests that bacteria aerosolized from diverse terrestrial ecosystems can spread to new habitats through clouds whilst also being able to acquire new genetic material via lightning-based electrotransformation, thereby potentially enhancing their genetic diversity. The final part of our work consisted of evaluating whether electrotransformation could be applied to the engineering of indigenous soil bacteria in order to develop a tool for the bioremediation of lindane, a once widely used pesticide. Optimized experiments revealed that both natural and electrotransformation contributed to the incorporation of a plasmid harboring a gene encoding the first lindane dechlorination steps by indigenous soil bacteria. In conclusion, we showed that natural electrotransformation mediated by electrical discharges such as those occurring in clouds or reaching soils can be involved in the horizontal gene transfer process among bacteria and, considering the importance of lightning worldwide, may play a role in the adaptation and evolution of these organisms.

L’électroporation (EP) in vivo est utilisée comme stratégie d’amélioration de la réponse immune induite par les vaccins ADN. Cependant son effet sur les acteurs du système immunitaire inné reste méconnu. Dans l’objectif de mettre en évidence le comportement cellulaire sur le site de la vaccination, nous avons développé des approches d’imagerie par fluorescence in vivo chez le macaque. Nos résultats montrent que l’EP locale, augmente non seulement la quantité et la distribution de l’antigène vaccinal, mais induit également la mobilisation et la migration des cellules de Langerhans. De plus, l’EP cause un recrutement de leucocytes dans la peau et le tissu sous-cutané et favorise la production de cytokines pro-inflammatoires dans la peau. Ces évènements précoces, qui résultent de l’utilisation de l’EP en tant que système de délivrance des vaccins ADN, mettent en évidence le potentiel de l’EP en tant qu’adjuvant vaccinal. / In vivo electroporation (EP) is used as a strategy to improve the immune response induced by DNA vaccines. However, its local effect on the innate immune cells has not been fully described. We developed in vivo fluorescence imaging approaches to highlight the cell behavior in the site of vaccination in macaques. Our results show that the local EP not only increases the amount and the distribution of the vaccine antigen, but also induces the mobilization and migration of Langerhans cells. Furthermore, EP causes the recruitment of leukocytes into the skin and subcutaneous tissue and promotes the production of pro-inflammatory cytokines. These early events that result from the use of the EP as a delivery system for DNA vaccines, highlight its potential as a vaccine adjuvant.