Parmi les protéoglycannes à héparane sulphate (HSPGs) des lames basales, le perlécane présente un rôle majeur dans la morphogénèse de l'épiderme mais également dans la survie et la différenciation des kératinocytes. Celui‐ci régulerait ces processus en contrôlant la biodisponibilité des facteurs de croissance. Au cours de ce travail, nous avons étudié l'expression du perlécane dans la peau humaine au cours du vieillissement intrinsèque et son implication dans les défauts de l'épiderme liés à l'âge. Une analyse immunohistologique sur une cohorte de peau normale humaine provenant de donneurs allant de 22 à 73 ans, a révélé une diminution drastique du perlécane au niveau de la jonction dermo‐épidermique et des capillaires dermiques au cours de l'âge. Des études biochimiques combinées à des analyses génomiques ont pu démontrer que la diminution de l'expression du perlécane n'était pas due à une dégradation de la protéine mais à une diminution de sa régulation transcriptionnelle par les kératinocytes. Par ailleurs, la conception et la caractérisation de modèles de peaux reconstruites in vitro combinant des cellules provenant de différents âges a permis d'établir une corrélation entre le défaut de synthèse du perlécane et l'épaisseur de l'épiderme. Nous avons montré que l'addition de perlécane natif purifié dans le milieu de culture d'un modèle contenant des kératinocytes âgés a permis de restaurer l'architecture épidermique. L'ensemble de ces résultats démontre ainsi l'importance du perlécane dans l'homéostasie cutanée. Un criblage de composés a permis la sélection de molécules candidates capables de restaurer spécifiquement l'expression du perlécane dans des cultures de kératinocytes et de cellules endothéliales microvasculaires dermiques âgés. Des tests fonctionnels sur les modèles de peaux reconstruites précédemment mis au point, ont permis de démontrer leur capacité à améliorer la morphogénèse de l'épiderme en accord avec les fonctions du perlécane d'origine épithéliale. L'ensemble de nos résultats indique qu'une diminution significative de synthèse du perlécane par les kératinocytes au cours de l'âge participe à l'affinement et aux défauts de différenciation de l'épiderme observés durant le vieillissement cutané / Among basement membrane heparan sulphate proteoglycans (HSPGs), perlecan is known to be involved in epidermal formation and renewal by regulating keratinocyte survival and differentiation. HSPGs are known to be regulators of growth-factor signalling through different mechanisms. We have investigated the expression of perlecan during skin ageing and have examined whether its expression correlates with age-dependant modifications of the epidermal compartment. The immunohistochemical analysis of perlecan in a cohort of human skin samples from donors of ages ranging from 22 to 73 years revealed a strong decrease of its expression with age in good correlation with reduction of the epidermal thickness. Genomic analyses of keratinocytes isolated from these biopsies combined with further characterization of perlecan from aged donors revealed that the observed decreased expression is most likely a consequence of a reduced synthesis rather than a protein degradation or a deficient supramolecular exposure. The design and characterization of human skin models engineered with cells from donors of various ages confirmed this hypothesis and revealed that aged keratinocytes showing deficiency in perlecan production and deposit in the basement membrane, also displayed inability to form a multilayed epidermis. Addition of purified perlecan in the culture medium of these skin equivalents enhanced the epidermal thickness and restored a well-differentiated multilayed epithelium. Biological screening of a library compounds allowed the selection of candidates able to increase the expression of epithelial and endothelial-derived perlecan with high specificity. Skin engineering models mimicking ageing human skin demonstrates the capacity of one candidate to restore the perlecan functional failure in promoting epidermal renewal and morphogenesis. Our results suggest that the presence of perlecan in the skin basement membrane appears to be crucial for the maintenance of the epidermal integrity and that its decrease with age may contribute to the epidermal thinning

Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la réépithélialisation des plaies cutanées, des expériences ont été réalisées chez la souris et à l'aide d'un nouveau modèle tridimensionnel humain issu du génie tissulaire. Bien qu'ayant eu lieu en fonction du temps, les expériences réalisées montrent que les changements, qui se produisent lors de la réépithélialisation, dépendent de la localisation des cellules dans l'épiderme en régénération. L'étude de l'expression des protéines de stress chez la souris révèle que chacune possède son propre patron d'expression au long de l'épiderme en régénération : Hsp60 et Hsp70 semblent associées à la prolifération des kératinocytes; Hsp27 et Hsp90, à leur différenciation. Les observations recueillies avec le modèle in vitro de guérison des plaies suggèrent deux mécanismes complémentaires de réépithélialisation : 1) le déplacement passif des couches superficielles à partir des marges de la plaie; 2) la régénération épidermique au centre des plaies à partir de la prolifération des kératinocytes locaux et leur migration les uns par-dessus les autres afin de faire progresser l'épiderme en régénération.

3 domaines cellulaires définissent l'épiderme de la queue de Ciona intestinalis. Le domaine des lignes médianes, donne naissance à deux structures différenciées larvaires, la nageoire et système nerveux périphérique. Il a été montré que les voies de signalisation BMP et FGF sont respectivement les inducteurs des lignes médianes ventrale et dorsale. Ce travail a consisté en la caractérisation des mécanismes moléculaires, situés à l'interface des signaux inducteurs et des processus de différenciation, définissant l'identité cellulaire des lignes médianes. L'identification des relations épistatiques reliant 7 facteurs de transcription impliqués dans ce processus suggère un fonctionnement en réseau hiérarchisé et place Msxb comme gène clé. Cette hiérarchie est validée par: un atlas d'expression spatio-temporelle, la perte de fonction de Msxb, l'analyse des régions cis-régulatrices de la transcription. Nous avons identifié 2 types d'enhancers, contrôlant respectivement les gènes précoces et tardifs du réseau. L'expression précoce de Msxb dans les précurseurs dorsaux est controlée par un enhancer distinct régulé par la voie FGF relayée par Otx et Nodal. Cette signature transcriptionnelle est retrouvée dans les enhancers de gènes co-exprimés, et chez l'orthologue de Msxb chez une autre ascidie. Enfin, nous montrons que la partie la plus postérieure des lignes médianes constitue un troisième compartiment, déployant un programme génétique distinct. Ce travail nous renseigne sur la structure, les mécanismes moléculaires de formation des lignes médianes, l'existence d'une signature transcriptionnelle évolutivement conservée pour le gène clé de l'acquisition de ce destin cellulaire. / Ciona intestinalis tail epidermis has 8 rows of cells defining 3 domains. One of them, the midline domain, gives rise to differentiated cells which form the larval fin and part of peripheral nervous system. Previous work has shown that BMP and FGF signalling are the inducers of ventral and dorsal midlines respectively. My work consisted in the identification of molecular events which lead epidermal cells to adopt midline fate, from induction to tail differentiation. We identified 7 transcription factors involved in this process. Identification of epistatic relationships suggest that these genes are in a hierarchical network where Msxb is a key gene. This hierarchy is validated by 1) a spatio-temporal expression atlas, 2) loss of function of Msxb, 3) cis-regulatory regions analysis for each network gene. We identified 2 types of enhancers, one capable to decouple ventral / dorsal signals used by early genes, and the other used by later genes, acting as a global response in both midlines. We showed that the early expression of Msxb in dorsal precursors is controled by a distinct enhancer, regulated by FGF9/16/20 via Otx and Nodal. This transcriptional signature is found in enhancers of co-expressed genes and in Msxb orthologue in another ascidian. Finally, we showed the most posterior part of the midlines is controlled by a distinct genetic program than the one used in dorsal and ventral midlines. This work gives insight into midlines structure, the mechanisms involved in their formation and a conserved transcriptional signature for the key gene involved in midline cell fate.

Le récepteur à l'IGF1 (IGF-1R) ainsi que ses voies de régulation sous-jacentes ont été largement étudié pour leur importance au cours du développement et leur rôle mitotique sur divers types cellulaires. A l'échelle de la peau, l'IGF-1R contribue à l'homéostasie épidermique et est souvent associé au compartiment basal pour son effet pro-prolifératif. Très peu d'études ont montré son implication au niveau de la différenciation épidermique et celles-ci présentent des résultats contradictoires. Au cours du vieillissement, la peau s'amincit et la barrière épidermique présente des défauts de perméabilité. Parallèlement, l'activité de l'IGF- 1R, maximale à l'adolescence, diminue avec l'âge. Cette étude a contribué à éclaircir le rôle de l'IGF-1R sur la différenciation épidermique et à montrer un lien entre vieillissement, perte en qualité de la peau et diminution d'activité de l'IGF-1R. L'élaboration de modèles 2D et 3D mimant le vieillissement par diminution d'activité de l'IGF-1R, nous a permis de confirmer le rôle mitotique de l'IGF-1R sur les kératinocytes et les progéniteurs et de démontrer son effet régulateur sur la différenciation épidermique par augmentation ou diminution de ces marqueurs. L'IGF-1R renforce l'adhésion cellulaire sur différentes matrices, impliquant de possibles interactions avec les intégrines α6 et β1. Ces résultats ont été corrélés aux observations de biopsies de peaux jeunes et âgées. Nous avons aussi montré que l'IGF-1R conférait un état sénescent aux cellules soumises à de fortes doses d'H2O2. Ces travaux montrent ainsi que l'IGF-1R est nécessaire pour le processus de différenciation épidermique et pour en assurer sa protection face au stress oxydant / Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) and its signaling pathway have been widely studied for their growth promoting role on many cell types and their implication in development. On skin, the IGF-1R function has been associated to basal proliferation and contributes to epidermal morphogenesis, but very little is known about its involvement on keratinocytes differentiation and the few studies existing depict contradictory results. IGF-1R activity is maximal during teenage and tend to decrease during aging. Aged skin depicts major thinning and defects in permeability of skin barrier. Our work consisted in clarifying IGF-1R role on epidermal differentiation process and emphasized a correlation between aging, loss of skin quality and IGF-1R activity. By building 2D and 3D aging like models with low IGF-1R activity, we confirmed IGF-1R mitogenic role on both basal and progenitor-like keratinocytes. We demonstrated that IGF-1R activity regulated keratinocytes differentiation by either enhancing or slowing down differentiation markers deposition. More importantly, we highlighted the importance of IGF-1R activity for keratinocytes adhesion on both laminin-332 and collagen I/IV coatings, implying possible interactions with α6 and β1 integrins. This relationship was further correlated on skin biopsies of young and aged donors. In a parallel study, we showed that IGF-1R could induce cell senescence under acute H2O2 stress. Taken together, IGF-1R is necessary for the epidermal differentiation process and protects epidermis from acute oxidative stress induced damages

Les cellules souches de l’épiderme interfolliculaire humain, appelées cellules souches kératinocytaires (CSK), assurent l’homéostasie et le renouvellement du tissu durant toute la vie d’un individu grâce à leur importante capacité d’autorenouvellement. Ma thèse de doctorat a porté sur l’étude des effecteurs moléculaires impliqués dans la balance entre prolifération et quiescence dans un modèle in vitro de CSK, isolées de manière clonale et définies par le terme holoclone. Je me suis tout d’abord intéressée à la réponse des holoclones à l’effet d’un régulateur important de la prolifération et de la quiescence des cellules souches adultes : le facteur de croissance TGF β1. Mon travail s’est ensuite focalisé sur l’étude d’un gène agissant en aval de la voie de signalisation TGF β, le facteur de transcription Klf4, et dont le rôle dans la biologie des cellules souches adultes reste largement méconnu. Klf4 est en effet surtout décrit pour son rôle dans la reprogrammation des cellules somatiques en cellules iPS. Le maintien de la sensibilité des holoclones aux signaux inhibiteurs de la croissance constitue un gage de la normalité des CSK. Notre étude de la réponse des holoclones à l’effet antiprolifératif du TGF β1 montre que les holoclones, dotés d’un fort potentiel de croissance, caractéristique des CSK, conservent leur sensibilité à l’effet du TGF β1. Ces résultats nous ont permis de valider les holoclones comme constituant un modèle pertinent pour caractériser la biologie normale des CSK et décrypter les contrôles moléculaires de l’état souche. Le modèle des holoclones a été exploité dans le cadre d’une approche de génomique fonctionnelle visant à déterminer le rôle du facteur de transcription Klf4 dans les CSK. L’utilisation de vecteurs lentiviraux exprimant un shARN dirigé contre l’ARNm de Klf4 nous a permis d’étudier l’impact d’une modulation fine du niveau d’expression de Klf4 sur les propriétés des holoclones. La répression transcriptionelle de Klf4, d’environ un facteur 2, favorise de manière significative l’expansion du compartiment clonogénique au sein des holoclones. Ce gain de fonction concerne à la fois les potentiels de croissance et de reconstruction épidermique des holoclones. Un aspect important de ce travail a concerné la recherche des réseaux moléculaires régulés par Klf4 dans les holoclones. Une analyse du transcriptome nous a permis de montrer que Klf4 participe au contrôle des mécanismes de cycle cellulaire et de différenciation. Klf4 interviendrait également dans la régulation des voies de signalisation TGF β/BMP et Wnt, connues pour exercer des rôles clés dans la biologie des cellules souches. Klf4 constituerait donc un censeur de l’activité du compartiment immature dans l’épiderme interfolliculaire. Il participerait aux mécanismes de régulation du cycle cellulaire et serait susceptible d’intervenir dans le contrôle de l’autorenouvellement du compartiment souche. / Stem cells present within the human interfollicular epidermis, which are defined as keratinocytes stem cells (KSC), ensure the homeostasis and renewal of the tissue throughout the whole individual life. These functions are related to their important self-renewal capacity. My PhD project was focused on the knowledge of the molecular effectors involved in the control of the balance between proliferation and quiescence in KSC. This scientific question was investigated in an in vitro model of KSC which were clonally derived and characterized as holoclones. Holoclones are controlled by mitogenic growth factors and also by antiproliferative signals. One of these regulators is the growth factor TGF β1 which plays an important role in the control of quiescence and cell proliferation within several adult stem cell systems. In the context of growth inhibition by TGF β1, I have studied the role of a downstream gene of the TGF β pathway, the transcription factor Klf4, whose role in adult stem cell biology remains unclear. In fact, Klf4 is mostly described for its involvement in the reprogramming process of somatic cells into iPS cells. The maintenance of holoclone sensitivity to cell growth inhibitors is a critical parameter of KSC normal physiology. Holoclones possess an extensive growth capacity, which is characteristic of KSC. Despite this high proliferation rate, holoclones are still responsive to the antiproliferative effect of TGF β1. These results allowed us to validate the use of holoclone as a relevant model of non-transformed KSC suitable for the characterization of the role of candidate stemness genes in KSC biology, such as Klf4. The holoclone model was exploited to perform a functional genomic approach to investigate the role of Klf4 in KSC. We have developed a shRNA-based gene knock-down method using lentiviral vectors to assess the impact of Klf4 down-modulation on holoclone functional properties. Our results show that Klf4 down modulation controls the expansion of the clonogenic compartment present within holoclone progeny. This gain-of-function, which is maintained at the long term level, leads to an increase in holoclone 3D epidermis reconstruction capacity. A major point of this project was to elucidate the molecular networks controlled by Klf4 in holoclones. Microarray data show that Klf4 regulates the expression of several genes related to pathways involved in the control of stem cell fate. In particular, we identified many transcripts related to TGF β/BMP and Wnt signallings. Interestingly, the majority of the modulated transcripts are involved in the regulation of cell cycle and in keratinocyte differentiation process. All together these results suggest a critical role Klf4 as a stemness censor of the most immature compartment activity. Klf4 is likely to be involved in cell cycle regulation of KSC compartment and in the control of KSC self-renewal process.

Le récepteur à l'IGF1 (IGF-1R) ainsi que ses voies de régulation sous-jacentes ont été largement étudié pour leur importance au cours du développement et leur rôle mitotique sur divers types cellulaires. A l'échelle de la peau, l'IGF-1R contribue à l'homéostasie épidermique et est souvent associé au compartiment basal pour son effet pro-prolifératif. Très peu d'études ont montré son implication au niveau de la différenciation épidermique et celles-ci présentent des résultats contradictoires. Au cours du vieillissement, la peau s'amincit et la barrière épidermique présente des défauts de perméabilité. Parallèlement, l'activité de l'IGF- 1R, maximale à l'adolescence, diminue avec l'âge. Cette étude a contribué à éclaircir le rôle de l'IGF-1R sur la différenciation épidermique et à montrer un lien entre vieillissement, perte en qualité de la peau et diminution d'activité de l'IGF-1R. L'élaboration de modèles 2D et 3D mimant le vieillissement par diminution d'activité de l'IGF-1R, nous a permis de confirmer le rôle mitotique de l'IGF-1R sur les kératinocytes et les progéniteurs et de démontrer son effet régulateur sur la différenciation épidermique par augmentation ou diminution de ces marqueurs. L'IGF-1R renforce l'adhésion cellulaire sur différentes matrices, impliquant de possibles interactions avec les intégrines α6 et β1. Ces résultats ont été corrélés aux observations de biopsies de peaux jeunes et âgées. Nous avons aussi montré que l'IGF-1R conférait un état sénescent aux cellules soumises à de fortes doses d'H2O2. Ces travaux montrent ainsi que l'IGF-1R est nécessaire pour le processus de différenciation épidermique et pour en assurer sa protection face au stress oxydant

Skin is daily exposed to sun radiation. Among them, UVA reach the basal layer of epidermis composed of keratinocyte stem cells (KSC) and progenitors commonly called transitory amplifying cells (TA). KSC and TA, responsible of the epidermal renewal, are sensitive to genotoxic agents and more particularly to UV. Indeed, KSC, usually quiescent but composing the stem cell pool all lifelong, as well as TA, are specific targets for photocarcinogenesis and photoageing. In this context, the aim of the project was to develop a method able to isolate KSC and TA for characterizing their response to UVA, and in a more industrial objective, to value a photoprotective and/or genoprotective ingredient by investigating their mechanisms of action. A parallel aim was to define culture conditions suitable for maintaining the stemness of KSC in culture, which is quickly lost from their enter into a proliferative state. Thus we showed that adjunction of adipose derived stem cells (ASC) to fibroblasts in dermis of a skin equivalent model (SE) in order to reproduce the physiological environment of KSC, significantly increases the thickness of the epidermis and preserves the keratinocytes from their senescence. ASC act partially via the increase of fibroblasts proliferation in dermis and potentially via a synergic effect of factors secreted by the combination of ASC and fibroblasts. To compare the behavior of KSC to the one of TA, we firstly optimized the rapid adhesion method ; then compared it to the cell sorting by flow cytometry following the alpha6high/CD71low phenotype, which appeared more efficient. Thus, KSC (alpha6high/CD71low) and TA (alpha6high/CD71high) were then irradiated to UVA. KSC showed a photoresistance compared to TA with a better cell viability and a clonogenic potential superior as well as a better ability to reconstruct a pluristratified epidermis in vitro. We also investigated mechanisms of resistance. Our results demonstrate that the induction of the three types of DNA damage immediately induced by UVA is similar in both populations, but that the repair of single strand breaks (SSB) and of thymin dimers (CPDs) is faster for KSC. Finally, PE1, ingredient preselected by Gattefossé was characterized for its photoprotective and genoprotective effect. We showed that PE1 is able to i) preserve capacity of keratinocytes to form holoclones after UVA radiation, ii) decrease DNA damage, notably 8oxoGuanin and CPDs, and iii) improve several repair genes expression and activities. To conclude, this thesis project showed for the first time that KSC are more resistant to UVA radiation than their direct progeny, TA notably via improved DNA repair systems. Moreover, it allowed to identify a plant extract (PE1) able to protect genome of proliferative keratinocytes to UVA radiation / La peau est quotidiennement exposée aux rayons UV du soleil dont les UVA qui atteignent la couche basale de l'épiderme, composée de cellules souches kératinocytaires (KSC) et de cellules progénitrices appelées communément les cellules d'amplification transitoire (TA). Les KSC et TA, responsables du renouvellement de l'épiderme, sont vulnérables à l'action des agents génotoxiques et plus particulièrement aux rayonnements UV. En effet, Les KSC normalement quiescentes mais constituant la réserve de cellules souches tout au long de la vie de l'organisme, comme les TA, sont des cibles préférentielles pour la photocarcingénèse et le photovieillissement cutanés. Dans ce contexte, le but du projet était de développer une méthode capable d'isoler les KSC et les TA afin de caractériser leur réponse biologique vis-à-vis des UVA et dans un objectif plus industriel, de valoriser un actif photoprotecteur et/ou génoprotecteur par l'investigation de ses mécanismes d'action. Un objectif parallèle était de définir des conditions de culture optimales pour garder le phénotype souche des KSC en culture, qui est rapidement perdu dès leur entrée en prolifération. Ainsi, nous avons montré que l'ajout des cellules souches adipeuses (ASC) aux fibroblastes d'une peau reconstruite (PR), pour reproduire l'environnement des KSC, augmente significativement l'épaisseur de l'épiderme et surtout préserve les kératinocytes de leur entrée en sénescence, en partie par l'augmentation de la prolifération des fibroblastes au niveau du derme et potentiellement par un effet synergique des facteurs solubles sécrétés par la combinaison des ASC/fibroblastes. Afin de comparer le comportement des KSC à celui des TA nous avons donc tout d'abord optimisé la méthode d'adhésion rapide, puis l'avons comparée au tri par cytométrie de flux selon le phénotype alpha6high/CD71low, qui s'est avérée plus efficace. Les KSC (alpha6high/CD71low) et les TA (alpha6high/CD71high) ont ensuite été irradiés aux UVA. Les KSC ont montré une photorésistante plus importante que les TA avec une viabilité cellulaire et un potentiel clonogénique supérieurs ainsi qu'une meilleure capacité à reconstruire un épiderme pluristratifié in vitro. Nous avons aussi recherché les mécanismes de résistance. Nos résultats démontrent que l'induction des 3 types de dommages à l'ADN immédiatement après irradiation est identique pour les deux populations mais que la réparation des cassures simple brin (SSB) et des dimères de pyrimidine (CPDs) est plus rapide pour les KSC. Enfin, PE1, actif préselectionné par Gattefossé, a été caractérisé pour son effet photoprotecteur et génoprotecteur. Nous avons montré que PE1 est capable de (i) préserver la capacité des kératinocytes à former des holoclones après irradiation, (ii) diminuer les lésions à l'ADN, notamment la 8oxoGuanine et les CPDs (iii) améliorer l'expression de plusieurs gènes et les activités de réparation de l'ADN. Pour conclure, ce travail de thèse a montré pour la première fois que les KSC (alpha6high/CD71low), sont plus résistantes vis-à-vis des UVA que les TA (alpha6high/CD71high) notamment grâce à des systèmes de réparation de l'ADN plus actifs dans les KSC, et a permis d'identifier un extrait végétal (PE1) capable de protéger le génome des kératinocytes proliférants contre les UVA

Les microARNs sont de petits ARN non codants régulant négativement l'expression génique au niveau post-transcriptionnel. Ils interviennent dans de nombreux processus biologiques et leur rôle dans la régulation de l'homéostasie cutanée est clairement démontrée. Cependant, leur fonction durant le vieillissement épidermique n'a jamais été étudiée. Nous avons donc réalisé une analyse exhaustive du miRnome épidermique durant son vieillissement afin d'identifier les microARNs différentiellement exprimés avec l'âge dans ce tissu. Plusieurs microARNs significativement modulés dans des kératinocytes âgés, nous ont permis d'établir une signature du vieillissement épidermique. Parmi eux, les deux brins du microARN miR-30a sont induits dans les épidermes âgés. La construction d'un lentivirus permettant la surexpression stable et inductible de ce microARN a facilité son étude fonctionnelle dans un modèle organotypique d'épiderme reconstruit. Nous avons observé que la surexpression de ce microARN dans un modèle de culture tridimensionnelle induit un phénotype épidermique présentant des similitudes avec celui observé durant son vieillissement chronologique et caractérisé par une forte altération de la différenciation des kératinocytes, par une perturbation de sa fonction barrière et par une augmentation de l'abondance des cellules apoptotiques. Ce projet de thèse a permis l'identification de 3 cibles directes de miR-30a dans les kératinocytes. Il s'agit de LOX, codant pour la lysyl oxydase qui intervient dans la balance prolifération/différenciation des kératinocytes, d'AVEN, un inhibiteur de caspase et d'IDH1, codant pour l'isocitrate déshydrogénase, enzyme du métabolisme énergétique. Ainsi, ce projet de thèse a révélé un nouveau microARN acteur du vieillissement épidermique et a permis de de mettre à jour de nouveaux mécanismes moléculaires expliquant certaines altérations phénotypiques observées dans l'épiderme avec l'âge / MicroRNAs are small non-coding RNA that negatively regulate gene expression at the post-transcriptional level. There are involved in many biological processes and play a key role in the regulation of skin homeostasis. However, their function during epidermal aging has never been studied. We performed an exhaustive analysis of the epidermal miRnome during its aging in order to identify microRNAs differentially expressed with age in this tissue. Several microRNAs significantly modulated in elderly keratinocytes, allowed us to establish a signature of epidermal aging. Among them, the two strands of the microRNA miR-30a are induced in aged epidermis. The construction of a lentivirus allowing inducible and stable overexpression of this microRNA facilitated its functional study in an organotypic model of reconstructed epidermis. We observed that the overexpression of this microRNA in a three-dimensional culture model induces an epidermal phenotype similar of those observed during its chronological aging characterized by a strong alteration of keratinocyte differentiation, by a disturbance of its barrier function and by an increase in the abundance of apoptotic cells. This thesis project allowed the identification of three miR-30a targets in keratinocytes : LOX encoding lysyl oxidase, which plays a role in proliferation/differentiation balance of keratinocytes, AVEN encoding a caspase inhibitor and IDH1 encoding isocitrate deshydrogenase, a key enzyme of cellular metabolism.Our work revealed a new miRNA actor and deciphered new molecular mechanisms to explain some alterations observed in epidermis during aging, especially those concerning keratinocytes differentiation and apoptotic death

Le facteur de transcription HIF-1 est un hétérodimère composé d’une sous-unité α et d’une sous-unité ß. HIF-1 est capable de reconnaître une séquence consensus appelée HRE (HIF Response Element) et de réguler l’expression de plus de 200 gènes cibles impliqués dans divers mécanismes cellulaires. Nous nous intéressons à étudier le rôle de HIF-1α dans la peau, d’une part dans la régulation des enzymes de la réparation de l’ADN suite à l’irradiation UVB, d’autre part dans la physiologie cutanée.Nos résultats montrent bien que HIF-1α régule l’expression des gènes participant à la réparation de l’ADN (XPC et XPD). Ces gènes contiennent dans leurs régions promotrices des HRE de HIF-1α. La quantification de l’immunoprécipitation de chromatine révèle des HRE putatifs dans les gènes codant pour d'autres protéines de la réparation de l'ADN (XPB, XPG, CSA et CSB), ce qui suggère que HIF-1α est un régulateur clé de la machinerie de réparation de l'ADN. Nous avons prouvé que HIF-1α est indispensable à l’adhésion des kératinocytes par sa régulation exercée sur la laminine-332 et les intégrines (α6 et ß1). L’absence de l’expression de HIF-1α empêche aussi la reconstruction des épidermes à partir des kératinocytes humains. Nos résultats ont montré que les souris invalidées pour HIF-1α développent avec l’âge un phénotype d’inflammation dans plusieurs régions. Ces souris sont très sensibles au moindre stress consécutif à une blessure et une irradiation UVB. L’induction de l’inhibition de HIF-1α dans des souris inductibles avec le tamoxifène indique un détachement de l’épiderme au niveau des couches supra-basales. Ces souris meurent deux semaines après injection du tamoxifène / The transcription factor HIF-1 is a heterodimer composed of an α and ß subunit. HIF-1 is capable of recognizing a consensus sequence called HRE (hypoxia Response Element) and regulate the expression of more than 200 target genes involved in various cellular mechanisms. We are interested in studying the role of HIF-1α in the skin physiology.Our results show that HIF-1α regulates the expression of two main factors (XPC and XPD) involved in nucleotide excision repair through binding on HRE in their promoter regions. Quantitative chromatin immunoprecipitation assays further revealed putative HREs in the genes encoding other DNA repair proteins (XPB, XPG, CSA and CSB), suggesting that HIF-1α is a key regulator of the DNA repair machinery. We proved that HIF-1α is essential for keratinocyte adhesion through its regulation exerted on laminin-332 and integrins (α6, ß1). The lack of HIF-1α expression also prevents the reconstruction of epidermis by human keratinocytes. Our results showed that mice constitutively depleted for HIF-1α in their epidermis develop with age a phenotype of inflammation in several regions. These mice are very sensitive to the stress resulting from wound injury and UVB irradiation. HIF-1α depletion in the epidermis of inducible mice using tamoxifen results in a detachment of the epidermis in suprabasal layers. These mice die within two weeks after injection of tamoxifen

La peau est un organe très exposé à l’environnement et fournit la première ligne de défense contre de nombreux pathogènes. Cette fonction est remplie dans l’épiderme murin par les cellules de Langerhans (LCs) et les cellules T dendritiques de l’épiderme (DETCs). Alors que le développement de ces cellules a bien été étudié, peu d’expériences ont été effectuées sur leur renouvellement en condition homéostatique chez des animaux adultes sans manipulations. Nous avons alors développé un système de traçage cellulaire par fluorescence multicolore pour étudier l’homéostasie des LCs et des DETCs. Cette approche de «fate mapping» m’a permis de mettre en évidence un modèle dans lequel le réseau adulte des LCs est formé d’unités prolifératives adjacentes composées de LCs en division et leurs cellules filles. Nous avons identifié que les cellules en division étaient majoritairement représentées par la fraction la plus immature des LCs, suggérant que ces LCs peuvent régénérer leur réseau grâce à une capacité de prolifération limitée. Lors d’une inflammation importante, les LCs sont renouvelées par des progéniteurs issus de la moelle osseuse et s’organisent également en unités de prolifération. Je me suis ensuite intéressé à l’homéostasie des DETCs. Ce réseau est formé de la même manière par des unités prolifératives de DETCs. Un modèle de greffe de peau nous a permis de montrer que les DETCs semblent renouveler les cellules disparues dans une zone restreinte. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de révéler les dynamiques cellulaires qui régissent l’homéostasie des cellules immunitaires de l’épiderme. / The skin is an organ very much exposed to the environment and supplies the primary line of defence against several pathogens. In the mouse model epidermis, this function is fulfilled by Langerhans’ cells (LCs) and dendritic T cells (DETCs). While LCs and DETCs development have thoroughly been studied, few experiences have been carried out concerning the renewal of these cells through homeostatic conditions in adult “nonmanipulated” animals. Then we have designed a new system of fate mapping, by way of multi-coloured fluorescence to study the LCs and DETCs homeostasis. This method of fate mapping allowed me to highlight a model in which the adult network of LCs is made up of adjacent proliferating units, made of dividing LCs and of their daughter cells. We have identified that the dividing cells were mainly represented by the most immature fraction of LCs, suggesting that these LCs can renew their network thanks to a limited ability to proliferate. During significant inflammation, LCs are renewed by progenitors coming from the bone marrow and organize themselves in proliferation units as well. I also took an interest in the homeostasis of DETCs. In the same way as for the LCs, this network seems to be made up of DETCs proliferating units. A model of skin graft led us to show that the DETCs seem to renew the missing cells in a restricted area. As a conclusion, my research work allowed me to reveal the cellular dynamism which governs the homeostasis of the epidermis’ immune cells.