A busca pelo entendimento da etiofisiopatogênese da esquizofrenia permanece desafiadora e tratamentos convencionais com medicações antipsicóticas que agem principalmente através da modulação da neurotransmissão dopaminérgica mostramse insuficientes, vistos os elevados índices de refratariedade e superrefratariedade nesta população. Estudos recentes apontam resultados promissores de moduladores do sistema glutamatérgico com ação em receptores NMDA, como o nitroprussiato de sódio (NPS), um doador de óxido nítrico, capaz de reduzir sintomas positivos, negativos e cognitivos do transtorno. O objetivo do presente estudo foi estudar os efeitos da administração repetida de NPS sobre a sintomatologia de pacientes com esquizofrenia. Recrutados 17 pacientes portadores de esquizofrenia acompanhados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP, em idade entre 18-45 anos, submetidos ao protocolo experimental com delineamento cruzado, duplo-cego, randomizado e controlado por placebo. Cada participante recebeu oito infusões intravenosas, sendo destas, quatro de NPS (0,5 ?g/kg/min por 4 horas/sessão) e quatro de placebo, em intervalo de 15 dias entre as sessões. A avaliação dos sintomas positivos, negativos e cognitivos foi feita através dos seguintes instrumentos: Escala de Avaliação das Síndromes Positiva e Negativa para Esquizofrenia (PANSS), Escala de Avaliação Psiquiátrica Breve (BPRS), Escala de Impressão Clínica Geral - Esquizofrenia (CGI-SCH), Stroop Color Word Test (SCWT), N-back, Teste de Fluência Verbal (FAS). Para avaliação de efeitos colaterais das medicações foi usada a Escala de Avaliação de Efeitos Colaterais (UKU). A análise dos dados demográficos e clínicos da amostra foi realizada através de estatística descritiva. As análises estatísticas foram feitas com o programa Statistical Package for the Social Sciences versão 17.0. Para avaliar o efeito do NPS nos escores BPRS, PANSS, SCWT, N-back e FAS, os dados foram submetidos a análise de variância de medidas repetidas para modelos de estudo crossover. Análises independentes para sessões de nitroprussiato de sódio e placebo foram realizadas quando houve significância estatística, seguidas de teste t de Student, que também foi empregado para avaliações pareadas entre dados do ínicio e final das sessões. Para análise da CGI-SCH, foi utilizado o teste de Friedman para medidas não-paramétricas. O nível de significância adotado foi de p<0,05. A população amostral que completou o estudo foi de 14 indivíduos portadores de esquizofrenia crônica, refratária ou superrefratária, com bom nível de escolaridade, idade média de 32,94 anos e quase na totalidade usuários de clozapina. Foram realizadas 121 infusões. Observou-se diminuição estatisticamente significativa nos escores iniciais da BPRS, PANSS positiva e negativa e CGI-SCH, com manutenção da redução dos escores nos dias 15, 30 e 60 após término das sessões experimentais. Nas avaliações cognitivas, houve diferença significativa entre as sessões nos escores da SCWT e não houve diferença na análise da FAS e da Nback. Os resultados confirmaram achados anteriores de que o NPS, doador de NO, pode proporcionar melhora clínica significativa nos sintomas positivos e negativos daesquizofrenia, além de melhora parcial nos sintomas cognitivos. Além disso, o ensaio com administração repetida sugere que a droga é segura, não apresenta efeitos colaterais significativos na maioria dos casos e leva a uma melhora sustentada por até 60 dias nos sintomas da esquizofrenia / The knowledge about etiology of schizophrenia remains challenging and conventional treatments with antipsychotic medications that act mainly through the modulation of dopaminergic neurotransmission have proven insufficient, considering the high rates of treatment resistance in this population. Recent studies point to promising results of modulators of the glutamatergic system with action on NMDA receptors such as sodium nitroprusside (SNP), a nitric oxide donor, capable of reducing the positive, negative and cognitive symptoms of the disorder. The aim of the present study was to study the effects of repeated NPS administration on the symptomatology of patients with schizophrenia. A total of 17 schizophrenia patients were enrolled at the Ribeirão Preto Medical School University Hospital, aged 18-45 years took part in a double-blind, randomized, placebo-controlled, double-blind, experimental design. Each participant received eight intravenous infusions, four of SNP (0.5 ?g/kg/min for 4 hours/session) and four of placebo, with a 15-day interval between sessions. The Positive and Negative Syndromes Scale for Schizophrenia (PANSS), BPRS (Brief Psychiatric Rating Scale), Clinical Global Impression scale - Schizophrenia (CGI-SCH), in addition to the Stroop Color Word Test (SCWT), Nback, and the Verbal Fluency Test (FAS). The Side Effects Assessment Scale (UKU) was used to evaluate side effects. The analysis of the demographic and clinical data of the sample was performed through descriptive statistics. Statistical analyses were performed with the Statistical Package for Social Sciences. To evaluate the effect of SNP on BPRS, PANSS, SCWT, N-back and FAS scores, the data were subjected to repeated measures analysis of variance for crossover studies. Independent analyses for SNP and placebo sessions were performed when there were statistically significant differences between the conditions, followed by Student\'s t-test, which was also used for paired evaluations between data from the beginning and end of the sessions. For the analysis of CGI-SCH data, the Friedman test was used. The level of significance was set at p <0.05. The sample that completed the study consisted of 14 individuals with chronic, refractory or superrefractory schizophrenia, with a good level of education and mean age of 32.94 years . Almost all patients were in treatment with clozapine. A total of 121 infusions were performed. A statistically significant decrease was observed in the initial BPRS, PANSS positive and negative subscales, and CGI-SCH scores, which persisted on days 15, 30 and 60 after the end of the experimental sessions. In the cognitive assessments, there was a significant difference between the sessions in SCWT scores and no difference in respect to the FAS and N-back. The results confirmed earlier findings that SNP, an NO donor, can provide significant clinical improvement in the positive and negative symptoms of schizophrenia, as well as partial improvement in cognitive symptoms. In addition, the repeated administration trial suggests that the drug is safe, has no significant side effects in most cases and leads to sustained improvement for up to 60 days in the symptoms of schizophrenia

O complexo conhecido trans-[Ru(NO)(NH3)4(py)](BF4)3 foi sintetizado e caracterizado por cromatografia líquida de alta eficiência e espectroscopias de RMN de 1H, de absorção eletrônica e de infravermelho e RPE. O espectro de absorção de infravermelho do complexo apresenta o pico de estiramento de NO em 1931 cm-1 e o seu espectro de absorção eletrônica apresenta bandas em 237 nm (e = 5200 mol-1 L cm-1), 267 (e = 2300 mol-1 L cm-1), e 324 nm (e = 160 mol-1 L cm-1), concordantes com a literatura.O corante azul do Nilo (máx = 635 nm) sofre fotoquímica quando irradiado com luz de 577 nm, ao passo que os corantes rodamina-B (máx = 524 e 570 nm), fluoresceína sódica (máx = 437 nm) e tartrazina (máx = 438 nm) não. A fotólise do complexo em solução aquosa, pH ~3, com luz de 313 nm leva à liberação de NO. Soluções aquosas de trans-[Ru(NO)(NH3)4(py)](BF4)3 em pH 7,4 (tampão fosfato) na presença da forma monomérica dos corantes rodamina-B (lirr = 570 nm), fluoresceína sódica (lirr = 440 e 490 nm), tartrazina (lirr = 440 nm) e alaranjado de acridina (lirr = 440 nm) foram irradiadas com laser nas bandas de absorção máxima desses corantes. Para verificar se estava ocorrendo a liberação de NO pelo complexo através da sensibilização por corantes foram utilizados os capturadores de NO mioglobina e carboxy-PTIO. Os resultados indicam que não houve liberação de NO nesses casos, sugerindo que não ocorre transferência de energia de corantes para o complexo trans-[Ru(NO)(NH3)4(py)]3+, ao se irradiar na banda de absorbância máxima dos corantes, pelo mecanismo de Förster (transferência de energia a longa distância). Para que ocorra, a fotoquímica deve estar associada a uma transferência de energia do tipo Dexter, onde o corante é ligado diretamente ao complexo. / The known complex trans-[Ru(NO)(NH3)4(py)](BF4)3 was synthesized and characterized by high performance liquid chromatography, 1H NMR, EPR, and electronic and infrared absorption spectroscopies. The complex infrared absorption spectrum displays the NO stretching peak at 1931 cm-1 and its electronic absorption spectrum shows bands at 237 nm (e = 5200 mol-1 L cm-1), 267 (e = 2300 mol-1 L cm-1), and 324 nm (e = 160 mol-1 L cm-1), in agreement with reported values. The Nile blue dye (max = 635 nm) undergoes photochemistry by irradiation with 577 nm light, while rhodamine-B (max = 524 and 570 nm), sodium fluorescein (max = 437 nm) and tartrazine (max = 438 nm) do not. The photolysis of the complex in pH 3 aqueous solution with 313 nm light results in NO release. Aqueous solutions of trans-[Ru(NO)(NH3)4(py)](BF4)3 at pH 7,4 (BPS) in the presence of the monomeric forms of the rhodamina-B (lirr = 570 nm), sodium fluorescein (lirr = 440 e 490 nm), tartrazine (lirr = 440 nm), and acridine orange (lirr = 440 nm) dyes were irradiated at the their absorption maxima. In order to verify the NO release from the complex through sensitization by the dyes, the NO scavengers myoglobin and carboxy-PTIO were used. The results indicate that NO release does not occur under these circumstances, suggesting, thus, that there is no energy transfer from the dyes to the trans-[Ru(NO)(NH3)4(py)]3+ complex by irradiating at the dyes absorbance maxima bands by the Förster mechanism (long distance energy transfer). For the photochemistry to occur it should be associated to a Dexter type energy transfer, in which the sensitizer is directly attached to the complex.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos incluídos os do sistema reprodutor e parece estar envolvido na maturação oocitária. No entanto, há poucos estudos sobre o papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. Sabe-se que o NO atua pela via da guanilato ciclase (GC) estimulando a produção do nucleotídeo GMPc, que por sua vez é capaz de influenciar nos níveis de outro nucleotídeo (AMPc) via fosfodiesterases (PDE). O AMPc é um importante elemento da via de sinalização do FSH nos complexos cumulus-oócitos e no controle da maturação oocitária. O objetivo do presente projeto foi investigar a influência do FSH na via do NOS/NO e seus componentes em oócitos bovinos maturados in vitro e o envolvimento das células do cumulus (CC) na via de sinalização. Para tanto, complexos cumulus-oócito (CCO) e oócitos desnudos (OD - maturados sem células do cumulus) foram maturados in vitro por 24h na presença ou ausência de FSH. As amostras foram avaliadas quanto a: 1) taxa da maturação nuclear; 2) níveis de produção de NO; 3) níveis de AMPc e GMPc; 4) abundância relativa de RNAm de NOS2, PDE5A, PDE6C, PKG1, PKG2, ADCY6, ADCY9, PDE3A e PKA1. O FSH, na concentração de 0,05UI/mL, estimulou positivamente a maturação nuclear em CCO e OD, com 80,6 e 89% de oócitos maturados, respectivamente. Quando comparados diretamente os grupos CCO e OD, o FSH não influenciou as taxas de maturação (71 e 71,3%, p>0,05), nem os níveis de produção de NO (12,8 e 7,4 µM/mL, p>0,05). Os níveis de GMPc em CCO aumentaram após 1 e 3 h de MIV na presença de FSH (266,3 e 187,2 pmol/pool com FSH e 240,5 e 168,5 pmol/pool sem FSH, respectivamente, p<0,05). Após 6 h os níveis de GMPc declinaram de forma mais acentuada no grupo sem FSH (46,3 e 106,9 pmol/pool, com e sem FSH, respectivamente, p<0,05). Os níveis de AMPc em CCO também foram mais elevados na presença de FSH à 1 e 3 h de MIV (7,60 e 7,81 pmol/pool, respectivamente) em comparação com CCO maturados sem FSH (0.30 e 0,76 pmol/pool, respectivamente, p<0,05). Após 6h, os níveis declinaram e foram similares para ambos os grupos (0,43 pmol/pool, p>0,05). Em relação à expressão dos genes selecionados, todos foram detectados nos oócitos (CCO e OD), porém, em células do cumulus, foram detectados apenas PDE5A, ADCY6, ADCY9 e PKA1. Quando observados os resultados do grupo CCO, apenas os genes PKG1, ADCY6 e PDE3A sofreram influência do FSH (p<0,05), apresentando um aumento destes transcritos. No grupo OD, apenas o gene PKG1 sofreu influência do FSH, também apresentando um aumento destes transcritos (p<0,05). Em células do cumulus, os genes ADCY6 e ADCY9 sofreram influência do FSH, sendo que para a ADCY6 provocou um aumentos destes transcritos, e para a ADCY9 provocou uma queda dos mesmos (p<0,05). Em conclusão, o FSH pode exercer influência positiva na maturação nuclear de oócitos bovinos, agindo sobre os níveis de GMPc e AMPc, mas não sobre o NO. O FSH pode influenciar a expressão gênica em oócitos e em células do cumulus de bovinos. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger generated by the nitric oxide synthase (NOS) enzyme, which was detected in several organs including the reproductive system and appears too involved in oocyte maturation. However, there are few studies on the role of this system in bovine oocytes. NO is known to act via guanylate cyclase (GC) stimulating the production of the nucleotide cGMP, which in turn is capable of influencing the levels of another nucleotide, cAMP via phosphodiesterases (PDE). cAMP is an important factor in FSH signaling in cumulus-oocyte complexes (COC) for the control of maturation. The aim of the present work was to investigate the influence of FSH on the NOS/NO pathway and its components in bovine oocytes matured in vitro and the involvement of cumulus cells (CC) in the signaling pathway. COC and denuded oocytes (DO - matured without cumulus cells) were matured in vitro for 24 h with or without FSH. Samples were assessed for: 1) maturation rate; 2) levels of NO production; 3) levels of cGMP and cAMP; 4) relative abundance for mRNA of NOS2, PDE5A, PDE6C, PKG1, PKG2, ADCY6, ADCY9, PDE3A and PKA1. FSH positively stimulated oocyte maturation at 0.05UI/mL concentration for both COC and OD (80.6 and 89% maturation rates, respectively). When COC and OD were compared directly, FSH did not affect maturation rates (71 and 71.3%, p>0.05) nor NO production levels (12,8 and 7,4 µM/mL), p>0.05). cGMP levels increased after 1 and 3 h in vitro maturation (IVM) with FSH (266.3 and 187.2 pmol/pool with FSH and 240.5 and 168.5 pmol/pool without FSH, respectively, p<0.05). After 6 h IVM, cGMP levels in COC declined more in the group cultured with FSH (46.3 and 106.9 pmol/pool, with and without FSH, respectively, p<0.05). cAMP levels in COC were also increased in the presence of FSH at 1 and 3 h IVM (7.60 and 7.81 pmol/pool, respectively) in comparison to COC cultured without the hormone (0.30 and 0.76 pmol/pool, respectively, p<0.05). After 6 h, the levels declined and were similar for both groups (0.43 and 0.02 pmol/pool, p>0.05). Regarding mRNA expression for the selected genes, all of them were detected in oocytes, but only four of them were detected in cumulus cells: PDE5A, ADCY6, ADCY9 and PKA1. For COC only PKG1, ADCY6 and PDE3A were influenced by FSH (p<0.05), with an increase in transcript relative abundance, For DO, only PKG1 was influenced by FSH and also showed an increase in these transcripts (p<0.05). In cumulus cells, ADCY6 and ADCY9 were affected by FSH, with an increase for ADCY6 and a decrease in ADCY9 transcripts (p<0.05). In conclusion, FSH may positively influence nuclear maturation, acting on cGMP and cAMP levels, but not on NO. FSH may also influence gene expression in bovine oocytes and cumulus cells.

Óxido nítrico (NO) obtido a partir de fonts exógenas estimula a via de sinalização Ras/MAP cinases ERK1/2 em células endoteliais de coelho (RAEC). A ativação desta via também envolve a transativação do receptor de EGF (EGFR) mediada por ERK1/2 (Oliveira, 2003). Agora, nós avaliamos os efeitos de NO gerado endogenamente por bradicinina e \"shear stress\" sobre a fosforilação de resíduos de tirosina em EGFR e no processo de angiogênese; Nós encontramos que após estímulo com bradicinina (1 M) ou \"shear stress\" (16 dynes/cm2) a isoforma endotelial de NO sintetase (eNOS) foi ativada em células RAEC e HUVEC. Além disso, o aumento na produção de NO correlaciona-se com um aumento na fosforilação em resíduos de tirosina de EGFR conforme verificado por imunoprecipitação e western blot. Para determinar a capacidade angiogênica da via de sinalização NO-EGFR, nós usamos um ensaio in vitro baseado em Matrigel®. Em adição nós analisamos as vias de sinalização envolvidas no processo. Nós mostramos que bradicina e \"shear stress\" induz a formação de estruturas semelhantes a capilares em células HUVEC cultivadas em Matrigel®. Células HUVEC expressando um mutante de EGFR com atividade de tirosina cinase defective não forma estruturas semelhantes a capilares após estímulo com bradicinina ou \"shear stress\". Reunidos, estes achados nos sugerem que a ativação da via de NO e EGFR é necessária na promoção de angiogênese em células HUVEC / Nitric oxide (NO) obtained from exogenous sources stimulated the Ras/MAP kinases ERK1/2 signaling pathway in rabbit endothelial cells (RAEC). Activation of this pathway also involved the transactivation of the EGF receptor (EGF-R) mediated by ERK1/2 (FRBM 35:381; 2003). Now, we evaluate the effects of endogenously generated NO elicited by bradykinin and fluid laminar \"shear stress\" on tyrosine phosphorylation of the EGF receptor and in the process of angiogenesis. We found that upon stimulation with bradykinin (1 M) or under shear stress conditions (16 dynes/cm2) the endothelial isoform of NO synthase was activated in RAEC and in human endothelial cells (HUVEC). Furthermore, increase in NO production correlated with enhanced phosphorylation of tyrosine residues of the EGF-R as seen by immunoprecipitation and western blot analysis. To determine the importance of the NO-EGFR signaling pathway in angiogenesis, we used the Matrigel®-based in vitro assay for angiogenesis. In addition, we analyzed the signaling pathway involved in the process. We showed that bradykinin and shear stress induced the formation of capillary-like structures in HUVEC cultures grown in Matrigel®. HUVEC expressing a mutant of the EGF-R lacking tyrosine kinase activity did not form capillary-like structures upon stimulation with bradykinin or shear stress conditions. Taken together, these findings suggest that the activation of the NO-EGFR signaling pathway is necessary to promote angiogenesis in HUVEC

O NO é uma molécula endógena, envolvida em numerosos processos fisiológicos e patológicos. Diversas substâncias capazes de liberar NO in vivo têm sido estudadas, incluindo os complexos nitrosilo de rutênio, como o [Ru(terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3, capaz de liberar NO após fotoestímulo. Considerando que as funções específicas do NO dependem de sua localização e cinética de liberação, e que a sua aplicação tópica pode evitar possíveis efeitos colaterais, o objetivo deste trabalho foi estudar a absorção cutânea passiva e iontoforética do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)(NO)](PF6)3, assim como a do NO dele liberado. A atividade citotóxica do complexo também foi estudada em cultura de células tumorais A431 na presença e ausência de luz e de corrente elétrica. Foi desenvolvido e validado um método analítico para a quantificação do complexo de rutênio por CLAE e estudos de pré-formulação de solubilidade, coeficiente de partilha e estabilidade do complexo foram realizados antes dos estudos de penetração cutânea. O complexo de rutênio manteve-se estável em solução aquosa a temperatura ambiente até o período de 48h, mas instável em contato com a pele inteira, com a degradação de 61% após 8h. Em contato apenas com o estrato córneo (EC), no entanto, a degradação do complexo não foi considerada significativa após 4 h. A aplicação de uma corrente elétrica fraca a uma solução do complexo em pH fisiológico não alterou a estabilidade do mesmo, que não apresentou degradação significativa por 6h. Nos estudos de penetração passiva, observou-se por CLAE e por espectrometria de massas com fonte de plasma acoplado (ICP-MS) que o complexo foi capaz de penetrar o EC sem sofrer degradação, mas liberando parte do NO quando em contato com a epiderme viável. A aplicação da iontoforese aumentou significativamente a quantidade de rutênio na epiderme viável e solução receptora (6 e 15 vezes respectivamente), indicando maior penetração do complexo. O complexo Ru-NO assim como seu aquo complexo (formado após liberação do NO), não apresentaram citotoxicidade às células A431, na ausência de luz. A irradiação das células incubadas com o complexo, passivamente, em 377 e 532nm com diferentes doses também não acarretou morte celular significativa. No entanto, a aplicação de corrente elétrica constante (0,3mA cm-2) seguida de incubação por 4h com o complexo levou a morte celular de aproximadamente 50% das células A431 após irradiação em 377 nm com a dose de 10J cm-2. Para atingir este mesmo resultado com a irradiação em 532nm foi necessário aumentar o tempo de incubação com o complexo para 24h. Conclui-se, resumidamente, que a corrente elétrica aumentou a entrada do complexo na pele e nas células, levando a liberação de maior quantidade de NO dentro delas, com consequente morte celular. A liberação do NO do complexo estudado ocorre não apenas por estímulo luminoso mas também por reações de oxi-redução quando em contato com a pele ou com a cultura de células estudadas. Sendo assim, propõe-se a encapsulação deste complexo em sistemas de liberação com o intuito de controlar a liberação do NO. Experimentos preliminares de nanopartículas contendo o complexo estão descritos no Apêndice 1 desta tese. / NO is an endogenous molecule that is involved in numerous physiological and pathological processes. Several compounds capable of releasing NO in vivo have been studied, including nitrosyl ruthenium complexes such as the [Ru (terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3 that is capable of releasing NO after photo-stimulus. Because the specific role of NO depends on its location and kinetics of release, and its topical application may avoid possible side effects, the aim of this work was to study the passive and the iontophoretic skin absorption of the [Ru(terpy)(bdqi-COOH)NO](PF6)3 complex, as well as its NO release. The cytotoxic activity of the complex was also studied in A431 tumor cells in the presence and absence of light and electrical current. An analytical method for the quantification of the ruthenium complex by HPLC was developed and validated; studies of pre-formulation such as solubility, partition coefficient and stability of the complex were also performed before the penetration studies. The ruthenium complex was stable in aqueous solution at room temperature for 48 hours, but unstable in contact with the full-thickness skin (61% was degraded after 8 h). However, the complexs contact for 4 h with the stratum corneum (SC) alone did not lead to the complex degradation. The application of a weak electric current in a solution of the complex at physiological pH did not affect its stability, which showed no significant degradation for 6 h. In the passive penetration studies it was observed, by HPLC and inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS), that the complex was able to penetrate the SC without degradation, but with some NO release when in contact with the epidermis. The application of iontophoresis significantly increased the amount of ruthenium in the viable epidermis and in the receiver solution (6 and 15 times, respectively), indicating greater complex penetration. The nitrosyl ruthenium complex and its aquo complex (formed after release of NO) showed no cytotoxicity to A431 cells in the absence of light. The irradiation of the cells incubated with the complex, passively, in 377 and 532 nm with different doses also did not cause significant cell death. However, the application of a constant electric current (0.3 mA cm-2) for 30 min followed by incubation for 4 h with the complex led to approximately 50% of A431 cell death after irradiation at 377 nm with a dose of 10J cm-2. To achieve this same result with irradiation at 532 nm it was necessary to increase the incubation time with the complex for 24 hours. In summary, the electric current increased the nitrosyl ruthenium complex skin and cell penetration, leading to release of higher amounts of NO into them, with consequent cell death. Furthermore, the release of NO from the ruthenium complex is showed to happen not only by light stimuli but also by redox reactions when it is in contact with the skin or with the culture of cells studied. Therefore, we propose the encapsulation of this complex in delivery systems in order to control the release of NO. Preliminary experiments with nanoparticles containing the complex are described in Appendix 1.

INTRODUÇÃO: A indução de tolerância oral atenua a resposta inflamatória e a produção de anticorpos anafiláticos secundários presentes em quadros alérgicos pulmonares tanto em humanos quanto em modelos experimentais. Nestas situações, a modulação do remodelamento brônquico e o papel do óxido nítrico não foram previamente estudados. OBJETIVOS: 1. Desenvolver dois modelos de tolerância oral em cobaias com inflamação crônica pulmonar caracterizando: mecânica pulmonar, hiper-responsividade a metacolina, óxido nítrico exalado (NOex), anticorpos IgG1, inflamação brônquica e eosinofilopoiese. 2. Avaliar o remodelamento brônquico e a expressão da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) no epitélio brônquico nestes animais. MÉTODOS: As cobaias receberam inalações de ovoalbumina ou soro fisiológico durante 15 minutos ou até que apresentassem desconforto respiratório (este tempo foi denominado tempo de inalação). O protocolo foi repetido duas vezes por semana durante quatro semanas. Para a indução da tolerância foi administrada ovoalbumina a 2% por via oral e oferecida ad libitum, sendo formados os grupos: 1. TO1 (recebeu ovoalbumina oral a 2% a partir da primeira inalação com ovoalbumina); 2. TO2 (recebeu ovoalbumina oral a 2% a partir da quarta inalação com ovoalbumina); 3. SAL (recebeu água ad libitum e inalações com soro fisiológico); 4. OVA (recebeu água ad libitum e inalações com solução de ovoalbumina). Após os animais serem anestesiados e ventilados, foram avaliados: 1. mecânica pulmonar basal e após inalação com ovoalbumina (30mg/ml) ou soro fisiológico, 2. hiper-responsividade brônquica à metacolina, 3. coletado o NOex. Ao final do experimento, os fragmentos pulmonares foram retirados e corados com hematoxilina e eosina, com a técnica histoquímica cianeto resistente para peroxidase eosinofílica (células EPO+), com a técnica imunoistoquímica para a detecção da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e com resorcina-fucsina, resorcina-fucsina oxidada e picro-sírius. A medula óssea foi retirada e corada com hematoxilina e eosina. O índice de edema peribrônquico, as células EPO+, os mononucleares e os polimorfonucleares brônquicos e os eosinófilos da medula óssea foram avaliados por morfometria. As células epiteliais brônquicas nNOS+ e as fibras elásticas e colágenas foram avaliadas por densitometria óptica. Os anticorpos IgG1 foram detectados por anafilaxia cutânea passiva. A análise estatística foi feita com o programa SigmaStat e considerado significante um P<0,05. RESULTADOS: Nos grupos TO1 e TO2 houve aumento no tempo de inalação, diminuição na resposta máxima de elastância do sistema respiratório após desafio antigênico e com metacolina, diminuição do edema peribrônquico, dos eosinófilos, dos polimorfonucleares, das fibras elásticas e colágenas, da eosinofilopoiese e dos títulos de IgG1 (P < 0,05). Os mononucleares, a resposta máxima de resistência do sistema respiratório depois do desafio antigênico, e a metacolina diminuíram em TO2 (P < 0,05). O NOex e a percentagem de células epiteliais nNOS+ não foram alterados nos grupos tolerizados. CONCLUSÕES: A indução de tolerância oral concomitante ao início da sensibilização ou depois de estabelecida a resposta alérgica foi capaz de atenuar a inflamação eosinofílica, os títulos de IgG1 e o remodelamento brônquico presentes neste modelo de inflamação crônica pulmonar. A redução dos linfomononucleares e da hiper-responsividade brônquica foi mais efetiva quando a indução de tolerância foi feita em animais previamente sensibilizados. A dissociação entre o controle da inflamação eosinofílica e a avaliação do NOex e da expressão da nNOS no epitélio brônquico sugere um mecanismo novo ativado pela indução de tolerância oral / INTRODUCTION: The oral tolerance induction attenuates the inflammatory response and the production of secondary anaphylactic antibodies present in pulmonary allergy pictures in humans as well as in experimental models. In these situations, the bronchial remodeling modulation and the role of nitric oxide have not been previously studied. OBJECTIVES: 1. To develop two models of oral tolerance in guinea pigs with chronic pulmonary inflammation, characterizing: pulmonary mechanics, hyperreponsiveness to methacholine, exhaled nitric oxide (NOex), IgG1 antibodies, bronchial inflammation and eosinophylopoiesis. 2. To evaluate the bronchial remodeling and the expression of the neuronal nitric oxide synthase enzyme (nNOS) in bronchial epithelium of these animals. METHODS: The guinea pigs were submitted to ovalbumin or saline solution inhalation for 15 minutes or until they presented respiratory stress (this time period was called inhalation time). The protocol was repeated twice a week for 4 weeks. Oral tolerance induction was carried out by the administration of 2% oral ovalbumin, offered ad libitum, and the following groups were formed: 1. OT1 (received 2% oral ovalbumin from the first ovalbumin inhalation; 2. OT2 (received 2% oral ovalbumin from the fourth ovalbumin inhalation; 3. SAL (received water ad libitum and saline solution inhalations; and 4. OVA (received water ad libitum and ovalbumin solution inhalations). After being anesthetized, the animals were ventilated and evaluated regarding: 1. basal pulmonary mechanics and after ovalbumin (30mg/ml) or saline solution inhalation; 2. bronchial hyperresponsiveness to methacholine; and 3. NOex was collected. At the end of the experiment, the pulmonary fragments were removed and stained with hematoxylin-eosin, with the cyanide-resistant eosinophilic peroxidase histochemical technique (EPO+ cells), with the immunohistochemical technique for the detection of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and with Resorcin-fuchsin, Resorcin-fuchsin with oxidation and Picrosirius. The bone marrow was removed and stained with hematoxylin-eosin. The index of peribronchial edema, the EPO+ cells, the bronchial mononuclear and polymorphonuclear cells and the eosinophils from the bone marrow were evaluated by morphometry. The epithelial bronchial nNOS+ cells and the elastic and collagen fibers were evaluated by optical densitometry. IgG1 antibodies were detected by Passive Skin Anaphylaxis. Statistical analysis was performed with the SigmaStat software program and a P value < 0.05 was considered significant. RESULTS: The OT1 and OT2 groups showed increased inhalation time, decrease in the maximum elastance response of the respiratory system after the antigenic challenge and with methacholine, decrease of peribronchial edema, eosinophils, polymorphonuclear, elastic and collagen fibers, eosinophylopoiesis, and IgG1 titers (P < 0.05). The mononuclear cells, the maximum resistance response of the respiratory system after the antigenic challenge and methacholine decreased in OT2 (P < 0.05). NOex and the percentage of nNOS+ epithelial cells were not altered in the tolerized groups. CONCLUSIONS: The oral tolerance induction concomitant to the start of sensitization or after the allergic response has been established, was capable of attenuating the eosinophilic inflammation, IgG1 titers and the bronchial remodeling present in this model of chronic pulmonary inflammation. The decrease in lymphomononuclear cells and bronchial hyperresponsiveness was more effective when the tolerance induction was carried out in animals that had been previously sensitized. The dissociation between the eosinophilic inflammation and NOex evaluation and the expression of nNOS in the bronchial epithelium suggests a new mechanism activated by the oral tolerance induction

Biofilmes de Listeria monocytogenes são fontes potenciais de contaminação de alimentos processados e podem diminuir a efetividade de procedimentos de higienização e sanitização nas indústrias. No presente estudo foi avaliada a estrutura e a dispersão de biofilmes formados por duas cepas de L. monocytogenes em diferentes superfícies, como aço inoxidável, vidro e poliestireno. Foram utilizados diferentes sistemas de cultivo como microplacas de 96 poços de poliestireno e de aço inoxidável, microplacas de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável ou de vidro e, câmaras de poliestireno contendo 8 poços com fundo de borossilicato (vidro). Os experimentos foram realizados com incubação por 1, 4 e 8 dias a 25°C. A formação de biofilme foi verificada em microplacas de 96 de poliestireno e de aço inoxidável através do método de quantificação de biomassa do biofilme por coloração com cristal violeta, e também em sistema de microplaca de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável ou de vidro, através de enumeração em placa das células aderidas nas superfícies. As estruturas dos biofilmes foram observadas por meio de microscopia de fluorescência (para o sistema de microplaca de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável) e através de microscopia confocal a laser (para o sistema com câmaras com fundo de vidro). Para isso, os biofilmes foram corados com o kit de viabilidade bacteriana LIVE/DEAD®, a fim de diferenciar as células viáveis (coradas com Syto 9) das células mortas (coradas com iodeto de propídeo), sendo feitas estimativas do número de células aderidas à superfície de vidro através de quantificação por fluorescência. Foram realizados testes de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) de óleos essenciais de plantas de Cymbopogon citratus (capim-limão) e de Zingiber officinale (gengibre) e de dois sanitizantes comerciais (um à base de óleo de coco babaçu e outro à base de dióxido de cloro) frente a L. monocytogenes. Posteriormente, foi testada a eficácia desses antimicrobianos na remoção de biofilmes de L. monocytogenes formados por 4 e 8 dias a 25ºC, em superfície de aço inoxidável e de vidro, através da enumeração em placas de células aderidas e de observações microscópicas. Foi também avaliada a presença de moléculas relacionadas ao estresse oxidativo e nitrosativo em biofilmes maduros de duas cepas de L. monocytogenes formados em superfícies de aço inoxidável e de vidro, para o estudo do possível efeito do óxido nítrico (NO) exógeno e de inibidores de NO na dispersão de células do biofilme e na alteração dos níveis de expressão de genes de L. monocytogenes relacionados ao estresse oxidativo e nitrosativo (Lmo0990, Lmo0807 e Lmo1485), bem como à regulação do gene de virulência e formação de biofilme (PrfA). Foi verificada a presença de intermediários de oxigênio reativo (ROI - reactive oxygen intermediates) e de intermediários de nitrogênio reativo (RNI - reactive nitrogen intermediates) nos biofilmes de L. monocytogenes com 4 e 8 dias de incubação a 25ºC formados em superfícies de aço inoxidável e de vidro, por meio de marcadores ii fluorescentes específicos e visualizações microscópicas. A fim de confirmar indiretamente a presença de óxido nítrico (NO) em cultivos de L. monocytogenes incubados por 4 e 8 dias a 25ºC, foi realizada a dosagem de nitrito com o emprego do reagente Griess. Foram realizados testes de concentração inibitória mínima (CIM) do doador de óxido nítrico como nitroprussiato de sódio (SNP) e dos inibidores de NO como N?-Nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) e 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5- tetrametilimidazolina-1-oxi-3-óxido (Carboxi-PTIO sal de potássio, C-PTIO) frente a L. monocytogenes. Foi testada a eficácia do SNP e dos inibidores de NO na remoção de biofilmes pré-formados por 4 e 8 dias de L. monocytogenes em superfície de aço inoxidável. Os resultados deste trabalho demonstraram que o biofilme de L. monocytogenes formado em vidro e em aço inoxidável apresentou uma arquitetura microscópica semelhante a um \"favo de mel\", com presença de canais de água, bem como cavidades de tamanhos variados devido à dispersão de grupos de células planctônicas ou morte celular. A utilização de óleos essenciais e/ou sanitizantes comerciais por 1h em biofilmes de L. monocytogenes formados por 4 e 8 dias, foi eficaz na redução do número de células aderidas na superfície de aço inoxidável e de vidro. No biofilme de L. monocytogenes foram detectadas moléculas relacionadas ao estresse oxidativo como peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais superóxidos, bem como moléculas de estresse nitrosativo como óxido nítrico (NO) e peroxinitrito. A adição de NO exógeno (por meio do doador SNP) e a adição de inibidores de NO no meio de cultivo não alteraram o crescimento planctônico de L. monocytogenes. Foi observado que a exposição a SNP e a inibidores de NO por 1h em biofilmes de L. monocytogenes pré-formados por 4 e 8 dias, não induziu a dispersão celular. A adição de NO exógeno bem como a remoção de NO do meio de cultura por moléculas inibidoras não alteraram o nível de expressão dos genes Lmo1485, Lmo0990, Lmo0807 e PrfA, em culturas de L. monocytogenes de 8 dias. A utilização de óleos essenciais de plantas e/ou sanitizantes comerciais em biofilmes pré-formados pode ser uma alternativa eficaz na eliminação de L. monocytogenes em superfícies de manipulação de alimentos, mas a melhor estratégia de controle é impedir a formação de biofilme pelo emprego de tratamentos combinados nos estágios iniciais de contaminação. Em conclusão, L. monocytogenes formou biofilme com estruturas bem definidas que podem contribuir para a sobrevivência e disseminação da bactéria no ambiente de processamento de alimentos. Apesar de L. monocytogenes não formar um biofilme espesso com multicamadas, as células aderidas apresentam geralmente maior resistência à ação dos antimicrobianos em comparação com as células planctônicas, conseguindo sobreviver e persistir na superfície, com mecanismos regulatórios bastante eficientes frente a diferentes tipos de estresse. / Biofilms of Listeria monocytogenes are potential sources of contamination of processed foods, and may interfere in the effectiveness of cleaning and sanitizing procedures in food industry. In the present study the structures and dispersion of biofilms formed by two strains of L. monocytogenes on different abiotic surfaces, such as stainless steel, glass and polystyrene were evaluated. Different cultivation systems such as polystyrene and stainless steel 96-wells microplates, 24-wells microplates containing round stainless steel or glass slides, and 8-wells polystyrene chambers with borosilicate bottom were used. The experiments were done for 1, 4 and 8 days of incubation at 25°C. Biofilm formation was observed in 96-wells microplates of polystyrene and stainless steel by the quantification of biofilm biomass by staining with crystal violet, and also in 24-wells microplates system with circular slides of stainless steel or glass, with enumeration of adhered cells on agar plates. The structure of biofilms were observed by fluorescence microscopy (for the system of 24-wells microplates containing circular slides of stainless steel) and by confocal laser scanning microscopy (for the system of glass bottom chambers). For this, biofilms were stained with the LIVE/DEAD® bacterial viability kit, in order to differentiate viable cells (stained with Syto 9) from dead cells (stained with propidium iodide). The estimative of the number of viable cells was done by measurement of fluorescence. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the essential oils plants of Cymbopogon citratus (lemon grass) and Zingiber officinale (ginger) and two commercial sanitizers (babassu coconut oil-based sanitizer and chlorine dioxide-based sanitizer) against L. monocytogenes were also determined. Subsequently, the antimicrobials were evaluated against L. monocytogenes biofilms formed by 4 and 8 days at 25°C on the stainless steel and glass surfaces by enumeration on agar plates of adhered cells and microscopic observations. The presence of molecules related to oxidative and nitrosative stresses in mature biofilms of two strains of L. monocytogenes formed on glass and stainless steel surfaces was also evaluated, and the possible role of exogenous nitric oxide (NO) and inhibitors of NO were studied for induction of biofilm dispersal cells and changed of genic expression levels of L. monocytogenes related to oxidative and nitrosative stress genes (Lmo0990, Lmo0807 and Lmo1485), as well as the regulation of virulence and biofilm formation gene (PrfA). The presence of reactive nitrogen intermediates (RNI) and reactive oxygen intermediates (ROI) was investigated in biofilms of L. monocytogenes formed on stainless steel and glass surfaces with 4 and 8 days-old at 25°C, using specific fluorescent dyes and microscopic views. In order to indirectly confirm the presence of nitric oxide (NO) in cultures of L. monocytogenes incubated for 4 and 8 days at 25°C, the dosage of nitrite was carried out with Griess reagent. The minimum inhibitory concentration (MIC) of a nitric oxide donor as sodium nitroprusside (SNP) and two NO inhibitors such as N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5- tetrametilimidazoline-1-oxy-3-oxide (Carboxy-potassium salt, C-PTIO), were iv evaluated for L. monocytogenes. It was also determined the effectiveness of SNP and of the two inhibitors of NO to eliminate biofilms of L. monocytogenes preformed for 4 and 8 days on stainless steel surfaces. The results of this work showed that L. monocytogenes biofilms formed on glass and on stainless steel surfaces, presented similar microscopic architectures in a \"honeycomb\" like structure, with water channels and hollows of different sizes, possibly due to cell dispersion or death. The exposure to essential oils and/or commercial sanitizers for 1h for L. monocytogenes biofilms formed for 4 and 8 days was effective in reducing the number of cells adhered on stainless steel and on glass surfaces. In biofilms of L. monocytogenes, molecules were detected related to oxidative stress such as hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide radicals, as well as molecules related to nitrosative stress as nitric oxide (NO) and peroxynitrite. The addition of exogenous NO (SNP) and inhibitors of NO in the culture medium did not inhibit planktonic growth of L. monocytogenes, and exposure to SNP and to inhibitors of NO for 1 h for biofilms of L. monocytogenes preformed by 4 and 8 days did not induce cell dispersion. The addition of exogenous NO and NO removal from the culture medium by inhibitory molecules did not alter the level of expression of Lmo1485, Lmo0990, and PrfA Lmo0807 genes in cultures of 8- days-old of L. monocytogenes. The use of essential oils from plants and/or sanitizing commercial agents on pre-formed biofilms can be an effective alternative in the control of L. monocytogenes in food handling surfaces, but the best control strategy is avoid the biofilm formation by applying combined treatments in initial stages of contamination. In conclusion, L. monocytogenes formed biofilms with well defined structures that may contribute to the survival and spread of bacteria in food processing environment. Despite L. monocytogenes do not form a multilayer thick biofilms, adherent cells generally have greater resistance to antimicrobial activity compared to planktonic cells, surviving and persisting on the surface with regulatory mechanisms effective against different types of stress.

Algas são seres adaptados às constantes e bruscas mudanças abióticas característica do ambiente marinho, causadoras de estresse e responsáveis por alterações fisiológicas capazes de danificar funções biológicas básicas. O excesso de PAR pode causar estresse oxidativo em algas marinhas resultando na oxidação de pigmentos e proteínas, comprometendo o crescimento e conduzindo a alterações que podem levar à morte. Esse estresse oxidativo conduz ao acúmulo de ROS e NO que de forma direta ou indireta prejudicam o andamento metabólico do organismo. Para mitigar e controlar os efeitos danosos desses radicais, o organismo conta com diversas defesas antioxidativas, como aumento de compostos fenólicos, degradação de pigmentos fotossintetizantes, disponibilização de polissacarídeos e espessamento da parede e ativação de sistemas enzimáticos e não enzimáticos antioxidativos. Deste modo, com o objetivo de entender o funcionamento da fisiologia de Gracilariopsis tenuifrons em resposta a intensa irradiância foram avaliados teor de pigmentos fotossintetizantes, proteínas solúveis totais, carbono, hidrogênio e nitrogênio tissulares, taxa de crescimento, quantidade de substâncias fenólicas totais, atividade antioxidante total e peroxidação lipídica e produção de ROS e NO. Assim sendo, ápices de 3 cm da macroalga vermelha Gp.tenuifrons foram expostos a dois regimes de irradiância (60 &mu;mol fótons.m-2.s-1 e 600 &mu;mol fótons.m-2.s-1) durante uma semana e coletadas durante o dia e a noite. O excesso de irradiância provocou respostas de estresse oxidativo, que resultaram em significativa redução de pigmentos fotossintetizantes, proteínas solúveis e nitrogênio tissular, elevação do carbono e hidrogênio tissulares, das substâncias fenólicas, da atividade antioxidante total e da quantidade de NO. Gracilariopsis tenuifrons demonsmostrou efetiva ativação de diversos sistemas antioxidativos ao estímulo de elevada irradiância. Esta indução de atividade antioxidante pode ser melhor explorada em aplicações para a indústria alimentícia, medica, farmacêutica e cosmética. Também foram relacionados protocolos metodológicos e resultados inovadores em relação à formação de NO em condições de estresse, que poderão auxiliar abordagens fisiológicas no Laboratório de Algas Marinhas \"Édison José de Paula\" e outros grupos de pesquisa nacionais e internacionais / Algae are organisms adapted to constant and abrupt abiotic changes characteristic of marine environment, that cause stress and are responsible for physiological alterations able to damage basic biological functions. The intense PAR can produces oxidative stress on seaweed, resulting in oxidation of pigments and proteins, affecting the growth and driven to alterations that can conduce to cell death. This oxidative stress leads ROS and NO accumulation that directly or indirectly prejudice the metabolic fitness of the organism. To mitigate and control the deleterious effect of these radicals, the organism has diverse antioxidative defenses, as to increase phenolic compounds, degradation of photosynthetic pigments, providing polysaccharides and wall thickness and activation of enzymatic and non-enzymatic antioxidative systems. Thus, aiming to understand the physiological responses of Gracilariopsis tenuifrons to intense irradiance were evaluated levels of photosynthetic pigments, proteins, tissular carbon, hydrogen and nitrogen, growth rate, amount of total phenolic compounds, total antioxidant activity and lipid peroxidation, and ROS and NO production. Therefore, apices of 3 cm from the red seaweed Gp. Tenuifrons were exposed to 60 &mu;mol photons.m-2.s-1 and 600 &mu;mol photons.m-2.s-1 for one week and sampling during the day and night. The excess of irradiance promoted oxidative stress responses, observing significant reduction of pigments, soluble proteins and tissular nitrogen, and elevation of tissular carbon and hydrogen, phenolic compounds, total antioxidant activity and quantity of NO. Gracilariopsis tenuifrons showed effective activation of diverse antioxidant systems stimulated by high light. This antioxidant induction should be better explored in applications for food, medical, pharmaceutical and cosmetic industries. Moreover this study shows innovative results related to NO production under stress condition and methodological protocols will be of great help for physiological approaches in the Laboratory of Marine Algae \"Édison José de Paula\" and for other national and international research groups

O aumento dos casos de diarreia causados por EPECa evoca a sua capacidade de adaptação e patogenicidade. O objetivo deste estudo foi investigar o comportamento da EPECa na interação com macrófagos (fagocitose e antifagocitose). O estudo da fagocitose das cepas LB7 (O55:H7), LB13 (O111:abH9) e BA487 (O55:H7) em macrófagos J774A1 mostrou sobrevivência intracelular em presença de NO. EPECa impede a maturação do vacúolo parasitóforo. A sobrevivência em macrófago derivado de C3H/HeJ, mutante do tlr4, foi reduzida e em macrófago de C57BL/6 não foi observada. O fator antigagocítico (Fa) secretado pela LB7, já detectado pelo grupo, apresenta natureza peptídica e a sua ação não é específica de EPEC, pois inibe também a fagocitose de Shigella e látex. A secreção do Fa foi avaliada em M9 e DMEM. O produto do fracionamento do sobrenadante do cultivo por SPE apresentou Fa em ambos meios. No entanto, a secreção em M9 é baixa e não foi detectada por HPLC. O Fa do DMEM obtido por HPLC mostrou-se citotóxico. Novos meios de cultivo deverão ser estudados para a identificação do Fa. / The increase in the numbers of diarrhea cases caused by aEPEC denotes its adaptability and pathogenicity. The objective of this study was to investigate the behavior of aEPEC in the interaction with macrophages (phagocytosis and anti-phagocytosis). Strains LB7 (O55:H7), LB13 (O111:abH9) and BA487 (O55:H7) were shown to survive within J774A1 macrophages in the presence of NO. aEPEC prevents maturation of the parasitophorus vacuole. Survival inside C3H/HeJ derived macrophages, mutant for tlr4, decreased and was not observed in C57BL/6 derived macrophages. The anti-phagocytic factor (AF), secreted by LB7 and previously detected by our group, is peptidic and its action is not specific to EPEC as it also inhibits phagocytosis of Shigella and latex. Secretion of AF was evaluated in M9 and DMEM. AF was detected after SPE fractionation of both culture media. However, the secretion in M9 is low and was not detected by HPLC. The DMEM HPLC fraction containing AF was cytotoxic. New culture media will be studied for the identification of AF.

O Nitroxil (HNO), forma reduzida em um elétron e protonada do óxido nítrico (NO), apresenta características químicas diferentes do seu congênere redox, com ações farmacológicas distintas e vantagens terapêuticas. Em conjunto, NO e HNO parecem ter um papel fundamental no controle do tônus vascular. A produção e/ou biodisponibilidade do HNO deve estar preservada durante o estresse oxidativo, ao contrário do que acontece com o NO. O HNO também apresenta potencial atividade antioxidante, atuando assim como citoprotetor e exibindo características desejáveis no tratamento de doenças cardiovasculares. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito relaxante do nitroxil liberado do composto sal de Angeli (SA) e investigar os mecanismos celulares envolvidos nesse efeito em veia cava de ratos. Verificamos que o SA aumentou a concentração citosólica de HNO, medida pela sonda fluorescente DAF-2DA, por citometria de fluxo em células de veia umbilical humana (HUVECs). O aumento na intensidade de fluorescência foi abolido pelo sequestrador de HNO (L-cisteína), mas não foi alterado pelas espécies reativas de oxigênio (EROs). O SA promoveu relaxamento dependente da concentração em aorta e veia cava de ratos, com endotélio. Entretanto, o relaxamento induzido em veia cava foi menor que o relaxamento máximo (Emáx) em aorta. Analisando o tempo necessário para o composto induzir o Emáx, observamos que na aorta de ratos, o tempo máximo foi de 50 seg e na veia cava foi de 20 min. A conversão de HNO a NO pela superóxido dismutase (SOD) não foi necessária para a ativação da via de sinalização, uma vez que o relaxamento foi reduzido na presença de L-cisteína, mas não foi alterado em presença do inibidor da SOD (DDC) e do sequestrador de NO (Hidroxicobalamina). O relaxamento estimulado com o SA também foi inibido pelo L-NAME e ODQ, indicando a participação das enzimas NO-sintase e guanilil-ciclase solúvel (GCs), respectivamente. O bloqueador não seletivo de canais para K+ (TEA) e o sequestrador de ânion superóxido (O2¯) (Tiron) não modificaram o relaxamento para o SA quando realizada a curva concentração-efeito. Porém, ambos inibiram o relaxamento quando estudamos o efeito temporal do composto. Na presença do inibidor da NADPH oxidase (Apocinina), o relaxamento também foi reduzido. Deste modo, canais para K+, O2¯ e a NADPH oxidase parecem contribuir para o relaxamento induzido pelo SA. Aparentemente, não há participação da enzima proteína quinase G (GK), Ca2+-ATPase reticular (SERCA) ou de canais para Ca2+ dependentes de voltagem na via de sinalização. Com relação ao potencial antioxidante, em menor concentração (0,1 mmol/L) o SA apresentou efeito antioxidante, enquanto que em altas concentrações (1 mmol/L) ele atuou como um pró-oxidante. A principal espécie envolvida no efeito pró-oxidante do SA é o O2¯. Este é produzido, pelo menos em parte, pela ação da NADPH oxidase, uma vez que o aumento da produção de EROs estimulado pelo SA foi inibido em pelo Tiron e reduzido em presença de Apocinina. Esses dados foram obtidos por fluorescência da sonda DHE por citometria de fluxo em HUVECs. Apesar da produção de EROs em altas concentrações, o composto não apresentou toxicidade. / Nitroxyl (HNO), the one electron reduced and protonated form of nitric oxide (NO), displays different chemical characteristics compared to its redox sibling, with different pharmacological actions and therapeutic benefits. Together, NO and HNO seem to have an integral role in the control of vascular tone. The production and/or bioavailability of HNO must be preserved during oxidative stress, different from what happens to NO. In addition, HNO also has a potential antioxidant activity, thus acting as a cytoprotector and displaying desirable characteristics in the treatment of cardiovascular diseases. The present study aimed to study the relaxing effect of HNO released from Angeli\'s salt (AS) and to investigate the cellular mechanisms involved in this effect in rat vena cava. We found that AS increased cytosolic concentration of HNO, measured by fluorescent probe DAF-2DA by flow cytometry in human umbilical vein cells (HUVECs). HNO increase was abolished by HNO scavenger (L-cysteine), but it did not change in presence of the reactive oxygen species (ROS). AS promoted concentration-dependent relaxation in aorta and vena cava of rats with endothelium. However, the relaxation induced in vena cava was lower than the maximum relaxation (ME) induced in aorta. Analyzing the time necessary for the compound to induce ME, we observed that the effect in function of time was also significantly different between the vessels. In rat aorta, the maximum time was 50 seconds and in vena cava was 20 minutes. HNO conversion to NO by superoxide dismutase (SOD) was not required for signaling pathway activation, since AS relaxation was reduced in presence of L-cysteine, but it was not modified in presence of SOD inhibitor (DDC) or NO scavenger (Hydroxocobalamin). SA-induced relaxation was reduced by L-NAME and ODQ, indicating the involvement of NO synthase and soluble guanylyl cyclase (sGC), in the relaxation. Non-selective blocker of K+ channels (TEA) and superoxide anion (O2¯) scavenger (Tiron) did not modify the relaxation induced by AS when concentration-effect curve was performed. However, both inhibited relaxation when we performed the temporal effect compound study. Moreover, in the presence of NADPH oxidase inhibitor (Apocynin) relaxation was also reduced. Thus, K+ channels, O2¯ and NADPH oxidase seem to contribute to AS relaxation. Apparently there is no participation of protein kinase G (GK), sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA) or voltage-dependent Ca2+ channels in relaxation signaling pathway. Also, low concentrations (0.1 mmol/L) of AS presented antioxidant effect, whereas in high concentrations (1 mmol/L) it acted as a prooxidant. The main ROS involved in AS prooxidant effect was O2¯, which was produced, at least in part, by the action of NADPH oxidase, since the increase of ROS production by AS was inhibited by Tiron and reduced in the presence of Apocynin. These data were obtained by fluorescence DHE probe by flow cytometry in HUVECs. Despite the production of ROS in high concentrations, the compound did not show toxicity.