- / -

Τα ρετινοειδή αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια οργανικών μορίων που μοιάζουν δομικά με τη βιταμίνη Α. Το all-trans ρετινοϊκό οξύ (atRA) είναι γνωστό πως ρυθμίζει ένα μεγάλο εύρος κυτταρικών βιολογικών διεργασιών μέσω της πρόσδεσής του και της ενεργοποίησης των υποδοχέων του, τους υποδοχείς ρετινοϊκού οξέος (RAR) και τους υποδοχείς ρειτνοειδών Χ (RXR). Κάθε κατηγορία υποδοχέων περιλαμβάνει τρία μέλη, α, β και γ. Τα ρετινοειδή χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία πολλών ασθενειών, από την κοινή ακμή ως την οξεία προμυελωτική λευχαιμία. Η χρήση τους, παρ’ όλα αυτά, περιορίζεται εξαιτίας των σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών τους, και είναι επιτακτική ανάγκη να συντεθούν ανάλογα με λιγότερες ανεπιθύμητες δράσεις. Προς αυτήν την κατεύθυνση έχουν συντεθεί πολλά ανάλογα, ανάμεσα τους και το N12-bis(all-trans-retinoyl)spermine (RA2SPM), ένα σύζευγμα δύο μορίων atRA με σπερμίνη, το οποίο συντέθηκε από την ερευνητική ομάδα του καθηγητή Δ. Παπαϊωάννου, στο Τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δράση του atRA και του RA2SPM στην αγγειογένεση και την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων προστάτη. Το atRA ανέστειλε με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο την αγγειογένεση στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης (CAM) εμβρύου όρνιθας, παρόλο που η δράση του ήταν χαμηλότερη από αυτή που είχε δείξει παλιότερα το RA2SPM στο ίδιο σύστημα. Παρ’ όλο που το atRA προκάλεσε επαγωγή στην έκφραση του αγγειογενετικού αυξητικού παράγοντα πλειοτροπίνη (PTN) στην CAM, ανέστειλε την αλληλεπίδρασή της με τον υποδοχέα της RPTPβ/ζ, κάτι που συνάδει με μειωμένη επαγωγική δράση της PTN στην αγγειογένεση της CAM εμβρύου όρνιθας. Τα δύο ρετινοειδή μείωσαν των αριθμό των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων φλέβας ομφαλίου λώρου (HUVEC) και των προστατικών καρκινικών κυττάρων LNCaP και PC3, με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε όλες τις περιπτώσεις, το RA2SPM ήταν πιο αποτελεσματικό σε σχέση με το atRA. Η δράση και των δύο ρετινοειδών στα καρκινικά κύτταρα προστάτη ήταν μεγαλύτερη από τη δράση τους στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Αυτές οι δράσεις φαίνεται να σχετίζονται με αύξηση των επιπέδων του mRNA του ογκοκαταστατλικού γονιδίου RARβ και από τις δύο ουσίες που μελετήθηκαν. Ενδιαφέρον είναι ότι η δράση του atRA και του RA2SPM βρέθηκε να διαμεσολαβείται από τον RARα και ήταν μεγαλύτερη στα PC3 κύτταρα, τα οποία δεν εκφράζουν τον RARβ και θεωρούνται πιο επιθετικά. Στα κύτταρα που εκφράζουν τον RARβ, δηλαδή στα HUVEC και στα LNCaP, οι δύο ουσίες ήταν λιγότερο αποτελεσματικές. Τέλος, τόσο το atRA όσο και το RA2SPM μείωσαν τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης της PTN, η οποία είναι γνωστό πως παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι το RA2SPM φαίνεται να είναι πιο αποτελεσματικό από το atRA στην αναστολή της αγγειογένεσης και της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων προστάτη. Επίσης, καταδεικνύουν τον RARα ως τον υποδοχέα μέσω του οποίου τα δύο υπό μελέτη ρετινοειδή προκαλούν αύξηση της έκφρασης του RARβ και αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων προστάτη. / Retinoids constitute a large family of organic compounds structurally related to the naturally occurring vitamin A. All-trans-retinoic acid (atRA) is known to modulate a wide range of cellular biological processes through binding to and activation of its specific receptors, retinoic acid receptors (RAR) and retinoid X receptors α, β and γ. Retinoids are being used for the treatment of various diseases, ranging from acne vulgaris to acute promyelotic leukemia. Their use however is limited due to serious adverse effects and there is a great need for analogues with minimized adverse effects. Towards this direction, many analogues are being synthesized, among which N1,N12-bis(all-trans-retinoyl)spermine (RA2SPM), a conjugate of all-trans retinoic acid with spermine, which has been synthesized by the research group of Prof. D. Papaioannou at the Dept. of Chemistry of the University of Patras. In the present work, the effect of atRA and RA2SPM on angiogenesis and prostate cancer cell growth has been studied. ATRA dose-dependently inhibited angiogenesis in the chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model, although its effect was lower that the previously shown effect of RA2SPM on the same system. Although atRA increased the expression of the angiogenic growth factor pleiotrophin (PTN) in the CAM, it decreased its interaction with its receptor RPTPβ/ζ, in line with a possible decreased effect of PTN in stimulating CAM angiogenesis. Both retinoids decreased the number of human umbilical vein endothelial (HUVEC) and prostate cancer LNCaP and PC3 cells in a concentration-dependent manner. In all cases, RA2SPM was more effective and potent compared with atRA and the effect of both retinoids on prostate cancer cells was higher than their corresponding effect on endothelial cells. These effects seem to be related to an increase of the mRNA of the RARβ tumour repressing gene by both substances tested. Interestingly, the effect of atRA and RA2SPM was mediated by RARα and was higher in PC3 cells that do not express RARβ and are considered more aggressive; in cells that express RARβ, i.e. HUVEC and LNCaP, both substances were less effective. Finally, both atRA and RA2SPM decreased mRNA and protein levels of PTN, which is known to be significant for prostate cancer PC3 cell growth. These data suggest that RA2SPM seems to be more effective than atRA in decreasing angiogenesis and prostate cancer cell growth and identify RARα as the receptor through which it causes RARβ up-regulation and decrease of prostate cancer cell growth.

In the current thesis, spatio-temporal evaluation of the endogenous angiogenic response to ischemia was perfomed. After vascular occlusion, ischemic angiogenesis is an important reparative mechanism and can ameliorate the outcome of ischemic disease. Diabetic foot ulcers affect almost 15% of diabetic patients and are the leading cause of amputations worldwide (Yoon et al., 2005). Diminished blood flow because of atherosclerotic occlusive disease of the peripheral arteries of diabetic patients, in conjunction with anatomic and functional microcirculatory impairments contribute to development of trophic ulcerations, infections and gangrene of the lower extremities, frequently requiring amputation of the leg (Sasso et al., 2005). Numerous studies have confirmed the impaired post-ischemic angiogenesis in diabetes (Yoon et al., 2005; Sasso et al., 2005). Consequently, wound healing patterns are disturbed in diabetes mainly due to decreased ischemia-driven angiogenesis (Yoon et al., 2005). Integrin ανβ3 is a promising imaging target of angiogenic activity which is up-regulated on activated endothelial cells (ECs) but not on quiescent ones. Molecular imaging (MI) of ανβ3 integrin expression with the aid of a dedicated high resolution gamma camera, is a very sensitive imaging approach for the evaluation of angiogenesis in the rabbit hindlimb ischemia model. Furthermore, diabetes mellitus (DM) was induced, to study the effects of this pathology on the spatio-temporal distribution of angiogenesis. In order to evaluate the whole spectrum of endogenous process of collateralization after occlusion of an artery, Digital Subtraction Angiography (DSA) was also used for the visualization of larger collaterals. During the first part of the study DM experimental protocol was investigated in order to find the appropriate protocol for the induction of long-term diabetic animal model, as it is a methodology that has not yet been standardized. At the same time a cohort of animals underwent endovascular embolization for the establishment of hindlimb ischemia and were imaged with the aid of a MI radiotracer technique in order to deal with unresolved issues and establish the imaging protocol. The study included seven New Zealand White (NZW) rabbits that underwent unilateral percutaneous endovascular embolization of the femoral artery, for the establishment of hindlimb ischemia that triggers the endogenous process of collateralization. The contralateral limb was not embolized and served as a control. The employed radiotracer for angiogenesis imaging, was a 99mTc labeled cyclic RGD peptide [c RGDfk-His]-99mTc that binds specifically to ανβ3 integrin via the three amino acid sequence Arginine-Glycine-Aspartic acid or RGD. Image acquisition was performed with a high resolution gamma camera and all animals underwent molecular imaging on the 3rd and the 9th day post-embolization. In all animals DSA was performed on the 9th day post-embolization. The acquired images demonstrated that retention of the radiotracer at the ischemic tissue is remarkably increased compared to the non-ischemic hindlimb (normal limb) (16020 ± 2309 vs. 13139 ± 2493 on day 3; p=0.0014 and 21616 ± 2528 vs. 13362 ± 2529 on day 9; p<0.0001, respectively). In addition, radiotracer retention in normal limbs seems to be increased at day 9 in normal limbs compared to day 3 (p=0.0112). DSA at day 9, demonstrated that the mean vessel length detected was significantly superior in the normal compared to the ischemic limb (mean value 3680 ± 369.8 vs.2772 ± 267.7; p< 0.0001, respectively). Angiogenesis was successfully detected using a 99mTc labeled cyclic RGD peptide MI technique and was significantly more pronounced in the ischemic compared to normal limbs, both at day 3 and day 9 after embolization. The peak of the phenomenon was detected at day 9. Increased mean vessel length in the normal compared to the ischemic limb demonstrates that although angiogenesis is pronounced in day 9, arteriogenesis is not sufficiently pronounced and that the phenomenon of arteriogenesis has just initiated. The study of the angiogenic response to ischemia, has not yet been completed as MI of diabetic animals with hindlimb ischemia is underway and not completed due to many difficulties and delay in different phases of the experiment. With the conclusion of the MI of diabetic animals with hindlimb ischemia, the study will be completed and we expect to demonstrate the effect of DM on the spatio-temporal pattern of angiogenesis, providing a valuable tool in clinical practice for the precise and early diagnosis and therapy assessment of the ‘diabetic foot’. / Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η χωρο-χρονική εκτίμηση της ενδογενούς αγγειογενετικής διαδικασίας ως απόκριση στο ερέθισμα της προκλητής ισχαιμίας. Μετά από απόφραξη αρτηρίας, η επαγόμενη αγγειογένεση είναι ένα σημαντικός μηχανισμός αποκατάστασης που μπορεί να περιορίσει το αποτέλεσμα της ισχαιμίας. Το έλκος του ‘διαβητικού ποδιού’ εμφανίζεται στο 15% περίπου των ασθενών που πάσχουν από διαβήτη και αποτελεί την κύρια αιτία ακρωτηριασμού του κάτω άκρου, μετά τα ατυχήματα (Yoon et al., 2005). Η μειωμένη αιματική ροή λόγω της αποφρακτικής αρτηριοπάθειας που οφείλεται στην αθηροσκληρωτική προσβολή των περιφερικών αρτηριών των διαβητικών, σε συνδυασμό με ανατομική και λειτουργική φθορά του αγγειακού δικτύου της μικροκυκλοφορίας, οδηγούν στην ανάπτυξη ελκών, μολύνσεων και γάγγραινας των κάτω άκρων που πολύ συχνά οδηγεί στον ακρωτηριασμό του ποδιού (Sasso et al., 2005). Πολυάριθμες μελέτες όμως έχουν δείξει ότι η αγγειογένεση που επάγεται από κρίσιμη ισχαιμία, στην παθολογία του διαβήτη δεν είναι φυσιολογική (Yoon et al., 2005; Sasso et al., 2005). Συνεπώς στον διαβήτη και ο μηχανισμός επούλωσης πληγών δεν συμβαίνει φυσιολογικά κυρίως λόγω ελαττωματικής ενδογενούς αγγειογένεσης ως απόκριση στην ισχαιμία (Yoon et al., 2005). Το μόριο της ιντεγκρίνης ανβ3 υπερεκφράζεται στα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα που συμμετέχουν στην αγγειογενετική διαδικασία αλλά όχι στο ανενεργό ή αλλιώς «σιωπηλό» ενδοθήλιο. Συνεπώς αποτελεί έναν πολύ καλό μοριακό στόχο για απεικόνιση και δείκτη της αγγειογενετικής δραστηριότητας. Η Μοριακή Απεικόνιση (ΜΑ) του επιπέδου έκφρασης του μορίου ιντεγκρίνης ανβ3 με τη χρήση ραδιοϊσοτοπικών τεχνικών έχει το πλεονέκτημα υψηλής ευαισθησίας ανίχνευσης πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων του ραδιοϊχνηθέτη σε σχέση με τις συμβατικές τεχνικές (x-ray computed tomography (CT) angiography, contrast-enhanced ultrasound και high-resolution magnetic resonance angiography). Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να ερευνήσουμε τις δυνατότητες της ΜΑ με την βοήθεια γ-κάμερας υψηλής διακριτικής ικανότητας και πειραματικού μοντέλου κονίκλου με ίσχαιμο οπίσθιο άκρο. Επιπλέον ένα σημαντικό μέρος της μελέτης αφορούσε την εφαρμογή του πρωτοκόλλου για τη πρόκληση διαβήτη ώστε να γίνει μελέτη της επίδρασης της συγκεκριμένης παθολογίας στην χωρο-χρονική κατανομή της αγγειογένεσης. Προκειμένου να αποδοθεί μία συνολική εκτίμηση του ενδογενούς μηχανισμού αποκατάστασης του αγγειακού δικτύου, εφαρμόστηκε Ψηφιακή Αφαιρετική Αγγειογραφία για την εκτίμηση της δημιουργίας παράπλευρου δικτύου. Στη πρώτη φάση της μελέτης, έγινε διερεύνηση του πρωτοκόλλου πρόκλησης διαβήτη δεδομένου ότι η μεθοδολογία παρουσιάζει έλλειψη προτυποποίησης. Παράλληλα εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο ισχαιμίας σε μια ομάδα λευκών κονίκλων Νέας Ζηλανδίας για την διερεύνηση του πρωτοκόλλου ΜΑ. Στην μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν συνολικά επτά κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας οι οποίοι υπεβλήθησαν σε εμβολισμό της μηριαίας αρτηρίας ενός από τα δύο οπίσθια άκρα για την πρόκληση οξείας ισχαιμίας. Στους κόνικλους έγινε ενδοφλέβια έγχυση του κυκλικού επισημασμένου πεπτιδίου [c RGDfk-His]-99mTc που περιέχει την αλληλουχία τριών αμινοξέων Αργινίνης-Γλυκίνης-Ασπαρτικού οξέος (Arginine-Glycine-Aspartic acid or RGD), μέσω της οποίας δεσμεύεται το πεπτίδιο στο μόριο της ιντεγκρίνης ανβ3. Η απεικόνιση του επιπέδου έκφρασης του μορίου ιντεγκρίνης ανβ3 πραγματοποιήθηκε με γ-κάμερα υψηλής διακριτικής ικανότητας την 3η και την 9η ημέρα μετά την απόφραξη της μηριαίας αρτηρίας. Ψηφιακή Αφαιρετική Αγγειογραφία πραγματοποιήθηκε την 9η ημέρα μετά την απόφραξη της μηριαίας αρτηρίας. Τα δεδομένα από την ποσοτικοποίηση των απεικονιστικών δεδομένων, έδειξαν ότι υπάρχει αυξημένη πρόσληψη του ραδιοϊχνηθέτη στη περιοχή ισχαιμίας σε σχέση με τη περιοχή φυσιολογικής αιμάτωσης του ετερόπλευρου άκρου (16020 ± 2309 έναντι 13139 ± 2493 την 3η ημέρα, p=0.0014 και 21616 ± 2528 έναντι 13362 ± 2529 την 9η ημέρα, p<0.0001, αντίστοιχα). Επιπλέον η πρόσληψη του ραδιοϊχνηθέτη στα φυσιολογικά άκρα φαίνεται να είναι αυξημένη την 9η ημέρα σε σχέση με την 3η ημέρα (p=0.0112), γεγονός που μπορεί να αποδοθεί στην σταδιακή συγκέντρωση ενεργοποιημένου ενδοθηλίου και στους φυσιολογικούς ιστούς. Η Ψηφιακή Αφαιρετική Αγγειογραφία έδειξε ότι την 9η ημέρα που έγινε η λήψη δεδομένων, το μέσο μήκος αγγείων στα φυσιολογικά άκρα ήταν αρκετά μεγαλύτερο σε σχέση με τα ίσχαιμα άκρα (μέση τιμή 3680 ± 369.8 έναντι 2772 ± 267.7, p< 0.0001, αντίστοιχα). Η ραδιοϊσοτοπική τεχνική που εφαρμόστηκε για την απεικόνιση του επιπέδου έκφρασης του μορίου ιντεγκρίνης ανβ3 στη παρούσα μελέτη, έδειξε ότι υπάρχει αυξημένη πρόσληψη του ραδιοϊχνηθέτη στη περιοχή ισχαιμίας σε σχέση με τη περιοχή φυσιολογικής αιμάτωσης του ετερόπλευρου άκρου, την 3η ημέρα και την 9η ημέρα μετά την απόφραξη της μηριαίας αρτηρίας. Τα πειραματικά δεδομένα δείχνουν επίσης ότι το φαινόμενο της αγγειογένεσης κορυφώνεται την 9η ημέρα μετά την πρόκληση ισχαιμίας. Επιπλέον τα δεδομένα από τη Ψηφιακή Αφαιρετική Αγγειογραφία την 9η ημέρα, δείχνουν ότι ο ενδογενής μηχανισμός σχηματισμού παράπλευρου δικτύου αν και έχει πυροδοτηθεί δεν έχουν σχηματιστεί ακόμα μεγαλύτερα αγγεία και γι αυτό το λόγο η αρτηριογένεση υπολείπεται της αγγειογένεσης σε αυτή τη φάση. Για την ολοκλήρωση της μελέτης, εκκρεμεί η απεικόνιση των διαβητικών κονίκλων με ίσχαιμο οπίσθιο άκρο η οποία καθυστέρησε λόγω επιμέρους δυσκολιών στη διαδικασία των πειραμάτων. Η ΜΑ δεικτών της αγγειογένεσης σε άκρο που πάσχει από ισχαιμία παρουσία διαβήτη, δύναται να έχει τεράστια εφαρμογή στην κλινική πράξη για την ιατρική παρακολούθηση του ‘διαβητικού ποδιού’.

Η πλειοτροπίνη αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων και την αγγειογένεση. Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η πλειοτροπίνη επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, μέσω πρόσδεσής της στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης ανβ3, αλλά όχι έναντι της α5β1, ανέστειλε την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η πλειοτροπίνη βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη ανβ3 και η αλληλεπίδραση αυτή είναι ανεξάρτητη από τη θέση δέσμευσης της αλληλουχίας RGD της ιντεγκρίνης. Αντίθετα, ένα συνθετικό πεπτίδιο το οποίο αντιστοιχεί στην κυστεϊνική θηλιά (177CYDMKTTC184) στο εξωκυτταρικό τμήμα της υπομονάδας β3 ανέστειλε την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη ανβ3 και την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, η ιντεγκρίνη ανβ3 βρέθηκε να αλληλεπιδρά και με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, ενώ η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της ιντεγκρίνης β3 διαμεσολαβείται μέσω του RPTPβ/ζ και της καθοδικής αυτού κινάσης c-Src, η οποία επιπλέον αλληλεπιδρά και με την ιντεγκρίνη β3. Η midkine βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, αλλά όχι με την ιντεγκρίνη ανβ3, ενώ προκάλεσε μια μικρή, αλλά στατιστικά σημαντική αναστολή στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στο ίδιο πλαίσιο, η πλειοτροπίνη ανέστειλε τη μετανάστευση διαφορετικών κυτταρικών σειρών γλοιώματος τα οποία εκφράζουν τον RPTPβ/ζ, αλλά όχι την ιντεγκρίνη ανβ3¬, ενώ προκάλεσε επαγωγή της μετανάστευσης στα κύτταρα U87MG, που εκφράζουν την ιντεγκρίνη ανβ3 στην κυτταρική τους μεμβράνη. Υπερέκφραση της ιντεγκρίνης β3 σε κύτταρα γλοιώματος είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση. Παρόμοια, η πλειοτροπίνη δεν είχε καμία δράση στη μετανάστευση κυττάρων CHO που δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη β3, ενώ προκάλεσε σημαντική επαγωγή στη μετανάστευση των ίδιων κυττάρων σταθερά διαμολυσμένων ώστε να υπερεκφράζουν την ιντεγκρίνη β3. Σε κύτταρα CHO σταθερά διαμολυσμένα ώστε να υπερεκφράζουν μία μεταλλαγμένη μορφή της ιντεγκρίνης β3, στην οποία οι τυροσίνες 773 και 785 έχουν αντικατασταθεί με φαινυλαλανίνη, η πλειοτροπίνη δεν είχε καμία δράση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 είναι απαραίτητη για τη μεταγωγή του σήματος της πλειοτροπίνης που οδηγεί σε κυτταρική μετανάστευση. Το γεγονός ότι και η midkine προκάλεσε επαγωγή της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης 773 δείχνει επιπλέον ότι η φωσφορυλίωση αυτή από μόνη της δεν είναι ικανή να οδηγήσει σε επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ιντεγκρίνη ανβ3 είναι ένα μόριο που καθορίζει την επαγωγική ή ανασταλτική δράση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, στα πλαίσια της παρούσας εργασίας εξιχνιάσθηκε ο μηχανισμός δράσης ενός πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της πλειοτροπίνης (πεπτίδιο S1), και το οποίο έχει βρεθεί να αναστέλλει την αγγειογένεση in vivo και την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση και το σχηματισμό αυλών των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro. Το πεπτίδιο S1 βρέθηκε ότι αναστέλλει την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη ανβ3, ενώ δεν επηρεάζει την αλληλεπίδρασή της με τον RPTPβ/ζ στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ανταγωνιστική δράση μεταξύ της πλειοτροπίνης και του πεπτιδίου S1 για πρόσδεση στην ιντεγκρίνη ανβ3 θα μπορούσε να εξηγήσει την ανασταλτική δράση του πεπτιδίου στις επαγόμενες από την πλειοτροπίνη βιολογικές δράσεις, αλλά το κυριότερο, δείχνει ότι η το καρβοξυτελικό άκρο της πλειοτροπίνης είναι υπεύθυνο τμήμα για τη δέσμευσή της στην ιντεγκρίνη ανβ3. Επιπλέον, ανοίγει το δρόμο για την ανάπτυξη μορίων που θα αναστέλλουν τις δράσεις της πλειοτροπίνης μέσω της ιντεγκρίνης ανβ3 και θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν θεραπευτικά σε καταστάσεις, στις οποίες η αλληλεπίδραση αυτή παίζει σημαντικό ρόλο. / Pleiotrophin is a growth factor that among other functions, plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. Our group has previously shown that pleiotrophin is able to induce migration of endothelial cells through binding to its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ). In the present study we show that a monoclonal antibody against ανβ3 but not α5β1 integrin abolished pleiotrophin-induced human endothelial cell migration in a concentration-dependent manner. Integrin ανβ3 was found to directly interact with pleiotrophin in an RGD-independent manner, whereas a synthetic peptide corresponding to the specificity loop of the β3 integrin extracellular domain (177CYDMKTTC184) inhibited pleiotrophin-ανβ3 interaction and totally abolished pleiotrophin-induced endothelial cell migration. Interestingly, ανβ3 was also found to directly interact with RPTPβ/ζ, and pleiotrophin-induced Y773 phosphorylation of β3 integrin was dependent on both RPTPβ/ζ and the downstream c-Src kinase activation, which furthermore interacts with β3 integrin. Midkine was found to interact with RPTPβ/ζ, but not with ανβ3, and caused a small but statistically significant decrease in cell migration. In the same line, pleiotrophin decreased migration of different glioma cell lines that express RPTPβ/ζ but do not express ανβ3, while it stimulated migration of U87MG cells that express ανβ3 on their cell membrane. Overexpression of β3 in glioma cells stimulated the effect of pleiotrophin on cell migration. In the same line, pleiotrophin had no effect on migration of CHO cells that do not express β3, while it induced proliferation of the same cells, stably transfected to over-express wild-type β3. In cells over-expressing mutant β3 with replacement of cytoplasmic tyrosines 773 and 785 to phenylalanines, PTN had no effect on migration, suggesting that PTN-induced phosphorylation of tyrosine 773 is required for PTN-induced cell migration. However, the fact that midkine also induces phosphorylation of tyrosine 773 suggests that it is not sufficient by itself to transducer the stimulatory effect of PTN. Collectively, these data suggest that ανβ3 is a key molecule that determines the stimulatory or inhibitory effect of pleiotrophin on cell migration. Furthermore, the mode of action of a synthetic peptide that corresponds to the last 26 aminoacids of the C-terminal region of pleiotrophin (S1 peptide) and has inhibitory effects on angiogenesis in vivo and on pleiotrophin-induced endothelial cell migration and tube formation in vitro was further clarified. The peptide was found to inhibit pleiotrophin binding to ανβ3 integrin whereas it did not affect pleiotrophin binding to RPTPβ/ζ in human endothelial cells. These data explain the inhibitory effects of peptide S1 on pleiotrophin-induced biological activities and clarify that the C-terminal region of pleiotrophin is the domain responsible for the interaction with ανβ3 integrin. Finally, peptide S1 can be used to develop effective molecules in inhibiting actions of pleiotrophin through integrin ανβ3, in order to be used for treating pathologies where pleiotrophin seems to have significant role.

Η αγγειογένεση είναι η βασική διαδικασία κατά την οποία τα αγγεία αναπτύσσονται από ήδη υπάρχοντα. Αποτελεί βασική προϋπόθεση για ένα μεγάλο αριθμό φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών. Πρόσφατα καθιερώθηκε ο όρος αρτηριογένεση εστιάζοντας στην διαδικασία με την οποία ένα προϋπάρχον μικρό αρτηριόλιο ωριμάζει και αναδιαμορφώνεται σε ένα μεγαλύτερο αρτηρίδιο που μπορεί να άγει πολύ μεγαλύτερη ποσότητα αίματος στη μονάδα του χρόνου ως απάντηση στην αυξημένη ενδαγγειακή ροή και πίεση αίματος. Έτσι, η ενεργοποίηση της αρτηριογένεσης και η αιμοδυναμική υποβοήθηση των υπαρχόντων παραπλεύρων αγγείων (θεραπευτική αγγειογένεση) αποτελεί σήμερα έναν ελκυστικό ερευνητικό στόχο με σκοπό την επαναιμάτωση και συνεπώς σωτηρία ευαίσθητων στην ισχαιμία ιστών όπως η καρδιά, ο εγκέφαλος και τα άκρα. O τομέας της θεραπευτικής αγγειογένεσης και αρτηριογένεσης αποτελεί σήμερα ένα ταχέως εξελισσόμενο πεδίο στην σύγχρονη έρευνα του καρδιαγγειακού συστήματος. Η στεφανιαία και περιφερική αρτηριακή αθηροσκλήρωση αποτελεί παγκοσμίως την πρωτεύουσα καρδιαγγειακή αιτία θνησιμότητας και νοσηρότητας. Σε πολλούς ασθενείς δεν είναι εφικτή ούτε η διαδερμική ενδοαγγειακή αντιμετώπιση με αγγειοπλαστική και μεταλλικές ενδοπροθέσεις (stents) ούτε η χειρουργική επαναγγείωση του ισχαιμούντος ιστού μέσω αρτηριακής παράκαμψης (bypass). Έτσι η έρευνα για τα καρδιαγγειακά νοσήματα έχει εστιάσει την προσοχή της σε νέους ελάχιστα επεμβατικούς τρόπους επαναιμάτωσης, όπως είναι η θεραπευτική αγγειογένεση με ενδοαρτηριακή, ενδομυϊκή ή περιαγγειακή έγχυση διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων οι οποίοι διεγείρουν τα ενδογενή αγγειογενετικά βιοχημικά μονοπάτια και προάγουν την ανάπτυξη παράπλευρου δικτύου (αρτηριογένεση) ικανού να αναστρέψει την ιστική ισχαιμία και υποξία. Διάφοροι αγγειογενετικοί παράγοντες έχουν δοκιμαστεί στην κλινική πράξη για την ενίσχυση του παράπλευρου αρτηριδιακού δικτύου στην στεφανιαία νόσο και στην περιφερική αγγειοπάθεια με αμφιλεγόμενα μέχρι τώρα αποτελέσματα. Η θρομβίνη είναι ένα ένζυμο με δραστικότητα σερινοπρωτεάσης που αποτελεί μόριο κλειδί στους βιοχημικούς καταρράκτες της πήξης και αιμόστασης. Πρόσφατες έρευνες έχουν αποδείξει επίσης ότι η θρομβίνη ενεργοποιεί την διαδικασία της αγγειογένεσης μέσω μηχανισμών εξαρτώμενων και ανεξάρτητων από την πήξη του αίματος. Πρόσφατα βρέθηκε ότι η θρομβίνη συμμετέχει στις διεργασίες επιβίωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτό μπορεί να ανοίξει νέους ορίζοντες όσον αφορά το γενικότερο ρόλο της θρομβίνης στην αγγειοπροστασία και τη συμβολή της στη διατήρηση της ακεραιότητας του τοιχώματος των αγγείων. Η αλληλεπίδραση των αγγειογενετικών αυξητικών παράγοντων και των διαφόρων μηχανισμών αγγειοπροστασίας είναι ουσιώδης τόσο για την ανάπτυξη όσο και για την ωρίμανση των νέων αιμοφόρων αγγείων κατά την εξέλιξη των φαινομένων της αγγειογένεσης και της αρτηριογένεσης. Σκοπός της συγκεκριμένης ερευνητικής δουλειάς ήταν η δοκιμασία, επιβεβαίωση, και κατά κύριο λόγο η σύγκριση της αγγειογενετικής δραστηριότητας της θρομβίνης με άλλους καταξιωμένους αυξητικούς παράγοντες σε ένα in vivo μοντέλο ισχαιμίας κάτω άκρων, με απώτερο στόχο την εφαρμογή της για την πρόκληση θεραπευτικής αγγειογένεσης και επαναιμάτωσης στα πλαίσια κλινικών συνδρόμων ισχαιμίας. Παράλληλα, αναπτύχθηκαν και εφαρμόστηκαν καινοτόμες πειραματικές μεθοδολογίες για την πρόκληση, μορφολογική απεικόνιση και λειτουργική μελέτη της αγγειογένεσης και αρτηριογένεσης στα κάτω άκρα κονίκλων. Μελετήσαμε τις αρτηριογενετικές ιδιότητες της θρομβίνης σε ένα μοντέλο αμφοτερόπλευρης ισχαιμίας κάτω άκρων κονίκλου και δείξαμε για πρώτη φορά ότι η εξωγενής χορήγηση θρομβίνης ενισχύει το σχηματισμό νέων λειτουργικών και σταθερών παράπλευρων αγγειακών δικτύων και αποκαθιστά την αιματική άρδευση των ίσχαιμων κάτω άκρων. Η παρούσα μελέτη παρέχει τα πρώτα επιστημονικά δεδομένα για την αρτηριογενετική δράση της θρομβίνης, η οποία πιθανόν υπερέχει άλλων κλασσικών αγγειογενετικών παραγόντων (bFGF, VEGF). Επιπλέον εξετάσαμε διάφορα δοσολογικά σχήματα χορήγησης του μορίου της θρομβίνης και επιβεβαιώσαμε την αγγειογενετική της δράση τόσο σε ένα χειρουργικό, όσο και σε ένα ελάχιστα επεμβατικό ενδοαγγειακό μοντέλο αμφοτερόπλευρης ισχαιμίας των οπίσθιων άκρων του κονίκλου. Η επιτυχία της επαναιμάτωσης με θρομβίνη επαληθεύτηκε τόσο μορφολογικά με ψηφιακή αγγειογραφία όσο και λειτουργικά με σύγχρονα πρωτόκολλα υπολογιστικής τομογραφίας αιματώσεως. / Compared with angiogenesis, arteriogenesis is a distinct process based on the remodeling and maturation of pre-existing arterioles into large conductance arteries. Therapeutic angiogenesis has been proposed as a potential treatment for ischemic atherosclerotic diseases. Since a variety of angiogenic factors have been tested with inconsistent so far clinical results, the challenge remains in identifying the factor(s) that will stimulate functional neovascularization. Thrombin has been reported to play a pivotal role in the initiation of angiogenesis by regulating and organizing a network of angiogenic mediators. Also, it was recently demonstrated that thrombin is a potent anti-apoptotic factor for endothelial cells, providing evidence on a potential role of thrombin in vascular protection and maintenance of vessel integrity. Based on these observations, we hypothesized that thrombin may promote the development of mature functional blood vessels. We have shown that thrombin promoted the formation of large collateral vessels and improved the perfusion of distal ischemic tissue in a rabbit hindlimb ischemia model. These results provide new insights in understanding the involvement of thrombin in vascular formation and point to a novel role of thrombin in arteriogenesis. Interplay between angiogenic growth factors and vascular maturation mechanisms are essential for the cascade of reactions involved in arteriogenesis, i.e. development of large conductance collateral vessels that may adequately compensate for atherosclerotic arterial occlusions. Thrombin stimulated robust collateral networks in the ischemic limbs, which was associated with a significant recovery of ischemic tissue perfusion as assessed by in-vivo perfusion studies. This may provide the basis for applications of thrombin and its nonthrombogenic analogs in therapeutic angiogenesis.

Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Τα κακοήθη γλοιώματα συνιστούν τον πιο κοινό τύπο καρκίνου του κεντρικού νευρικού συστήματος στους ενήλικες και χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθμό αγγειογένεσης και διήθησης στον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Αν και οι θεραπευτικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία, ποσοστό μεγαλύτερο του 90% των ασθενών εμφανίζουν υποτροπή της νόσου και η συνολική επιβίωση είναι εξαιρετικά χαμηλή. Τα παραπάνω γεγονότα εντείνουν την ανάγκη για την εφαρμογή πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών σχημάτων, καθώς και την ανακάλυψη νέων μορίων-στόχων για τη θεραπεία του συγκεκριμένου τύπου καρκίνου. Η HARP είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας με μοριακό βάρος 18 kDa που έχει ισχυρή συγγένεια με την ηπαρίνη. Η HARP εκφράζεται κυρίως κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και απομονώθηκε για πρώτη φορά ως πρωτεΐνη που προάγει την επέκταση των νευριτών στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο. Στην HARP έχει αποδοθεί ένας σημαντικός αριθμός βιολογικών δράσεων, όπως η συμμετοχή της στον πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση και στη διαφοροποίηση των κυττάρων, στο σχηματισμό οστών, στη χονδρογένεση, στη σπερματογένεση, στην ογκογένεση και στην αγγειογένεση. Η HARP εκφράζεται σε διάφορες καρκινικές σειρές από μηνιγγίωμα, νευροβλάστωμα, αστροκυττάρωμα, μελάνωμα, μικροκυτταρικό τύπο καρκίνου του πνεύμονα και γλοιοβλάστωμα. Κλινικές μελέτες έχουν αναφέρει αυξημένα επίπεδα της HARP στον ορό αίματος ασθενών με καρκίνο του κόλον του εντέρου, με καρκίνο του παγκρέατος και με καρκίνο του μαστού. Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε το ρόλο της HARP στην ανάπτυξη όγκου και στην αγγειογένεση που προκαλούν τα κύτταρα C6, μετασχηματίζοντας τα κύτταρα αυτά με την αντινοηματική αλληλουχία για το cDNA της HARP και καταστέλλοντας την έκφρασή της στα κύτταρα C6. Μείωση της ενδογενούς έκφρασης της πρωτεΐνης της HARP στα κύτταρα C6 (κύτταρα AS-C6) προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό, στην ανάπτυξη των κυττάρων σε τρισδιάστατο περιβάλλον και στη μετανάστευση. Όταν κύτταρα AS-C6 εμβολιάστηκαν σε χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας, οδήγησαν σε σημαντική αύξηση της καρκινικής αγγειογένεσης, σε σύγκριση με τις μεμβράνες που είχαν εμβολιαστεί με μη μετασχηματισμένα κύτταρα C6 ή με κύτταρα C6 που είχαν μετασχηματιστεί μόνο με το πλασμίδιο-φορέα (κύτταρα ΡC-C6). Με παρόμοιο τρόπο, θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων AS-C6 προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση και στο σχηματισμό ψευδαγγείων των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro σε σύγκριση με την επίδραση του θρεπτικού μέσου καλλιέργειας των κυττάρων C6 και ΡC-C6. Η έκφραση της HARP φαίνεται να είναι απαραίτητη για την ανασταλτική δράση αυξημένων ενδοκυτταρικών επιπέδων cAMP στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων C6 και αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων cAMP οδήγησε σε αύξηση της έκφρασης και έκκρισης HARP, πιθανά μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα AP-1. Τέλος, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων του mRNA και της πρωτεΐνης του αυξητικού παράγοντα των ενδοθηλιακών κυττάρων (vascular endothelial growth factor, VEGF) σε καλλιέργειες των κυττάρων AS-C6 σε σχέση με τα κύτταρα C6 και PC-C6. H HARP βρέθηκε να συν-ανοσοκατακρημνίζεται με τον VEGF σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων C6 και pC-C6, το οποίο υποδηλώνει μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο αυτών αυξητικών παραγόντων. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προτείνουν ότι ο αυξητικός παράγοντας HARP έχει αρνητικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξη όγκου και της αγγειογένεση που επάγουν τα κύτταρα C6, πιθανά ρυθμίζοντας την έκφραση ή/και τη διαθεσιμότητα άλλων αυξητικών παραγόντων. / Malignant gliomas, the most common type of brain tumors in adults, present a remarkable degree of neovascularisation and invasiveness into surrounding tissues. Although combinations of surgery, radiotherapy and chemotherapy are used, more than 90% of the patients experience local recurrence and their survival is extremely low. These facts stress the need for more effective therapeutic strategies and new targets for tumour therapy. Heparin affin regulatory peptide (HARP), also known as pleiotrophin or heparin-binding growth-associated molecule, is an 18-kDa secreted growth factor that has high affinity for heparin. HARP is mainly expressed during embryonic development, in early postnatal rat and bovine brain and was first isolated as a major neurite outgrowth-promoting protein of developing brain. Since then, a number of biological activities have been well established for HARP, such as its role in cellular proliferation, migration and differentiation and its involvement in bone formation, chondrogenesis, spermatogenesis, tumor growth and angiogenesis. HARP is expressed in various cancer cell lines, derived from meningiomas, neuroblastomas, astrocytomas, melanomas, small cell lung cancer (SCLC) cell lines and glioblastomas. Clinical studies have shown elevated serum levels and tumor expression of HARP in patients with colon, stomach, pancreatic and breast cancer. Ιn the present study, we tried to elucidate the role of HARP in the growth and angiogenicity of C6 glioma cells by using an antisense strategy for inhibition of HARP expression in rat C6 glioma cells. Decrease of the expression of endogenous HARP protein in C6 cells (AS-C6 cells) significantly increased proliferation rate and anchorage-independent growth of cells. Implantation of AS-C6 cells onto chicken embryo chorioallantoic membranes resulted in a significant increase of tumor-induced angiogenesis, compared with those induced by non transfected or C6 cells transfected with the plasmid alone (PC-C6 cells). In the same line, conditioned medium from AS-C6 cells significantly increased endothelial cell proliferation, migration and tube formation in vitro compared with the effect of C6 or PC-C6 cells. HARP expression is required for cAMP-induced inhibition of C6 cell proliferation and migration and cAMP increased the expression and secretion of HARP by C6 cells, possibly through activation of Activator Protein 1. Finally, a significant increase in vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA and protein levels were observed in cultures of AS-C6 cells compared with C6 or PC-C6 cells. HARP was co-immunoprecipitated with VEGF from the conditioned medium of C6 and PC-C6 cells, which indicates a direct interaction between the two factors. Collectively, these data suggest that HARP negatively regulates tumor growth and angiogenesis induced by C6, possibly through regulation of the expression or/and activation of other growth factors.

Η Heparin affin regulatory peptide (HARP) είναι ένας αυξητικός παράγοντας με μοριακό βάρος 18 kDa, που έχει μεγάλη συγγένεια με την ηπαρίνη. Είναι συντηρημένη μεταξύ διαφόρων ειδών και παρουσιάζει 50% ομολογία με τη Midkine και την RI-HBP. Οι πρωτεΐνες αυτές συγκροτούν μια σχετικά νέα οικογένεια αυξητικών παραγόντων που έχουν συγγένεια με την ηπαρίνη. Η HARP απομονώθηκε για πρώτη φορά από τον εγκέφαλο νεογέννητου βοός ως ένα μόριο που μπορεί να επάγει την προέκταση των νευρικών κυττάρων. Επίσης, εκφράζεται στη μήτρα, στους χόνδρους και στα οστά. Αρκετές αναφορές αποδεικνύουν ότι υπάρχει μεγάλη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της HARP και της ανάπτυξης καρκινικού όγκου και της αγγειογένεσης. Υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης έχουν ανιχνευθεί σε πολλούς καρκινικούς όγκους, αλλά και κυτταρικές σειρές που προέρχονται από διάφορους τύπους καρκίνου σε ανθρώπους. Η HARP αποτελεί μιτογόνο παράγοντα για διάφορους τύπους ενδοθηλιακών κυττάρων, ενώ μπορεί να επάγει την αγγειογένεση in vivo και in vitro. Ασκεί τη βιολογική της δράση μετά από αλληλεπίδραση με πρωτεογλυκάνες της επιφάνειας του κυττάρου, όπως η N-συνδεκάνη, ή μετά από δέσμευση σε πιο ειδικούς υποδοχείς. Η RPTPβ/ζ, η εκκρινόμενη μορφή της (φωσφακάνη), αλλά και η κινάση ALK, έχει αναφερθεί ότι μπορούν να δεσμεύουν τη HARP και να συμμετέχουν στη μεταγωγή του σήματός της. Παλαιότερες αναφορές έχουν δείξει ότι η HARP μπορεί να επάγει τις MAP-κινάσες και το μονοπάτι PI3K-Akt, ενώ αναστολείς των Erk½, ή της PI3K καταστέλλουν τη σύνθεση του DNA που επάγεται από τη HARP. Επιπλέον, η Shc και οι Erk ½ φωσφορυλιώνονται μετά από επώαση κυττάρων με HARP. Ωστόσο, τα ενδοκυτταρικά σήματα ειδικών υποδοχέων της HARP προς την PI3K ή τις MAPK δεν έχουν ακόμα χαρακτηριστεί ικανοποιητικά. Στην εργασία αυτή μελετήσαμε την επίδραση της HARP στη μετανάστευση κυττάρων HUVEC, στη δημιουργία αυλών σε υπόστρωμα matrigel, καθώς και το μονοπάτι μεταγωγής σήματος που ενεργοποιείται από τη HARP. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η HARP επάγει τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC μετά από δέσμευσή της στην RPTPβ/ζ. Η δέσμευση αυτή οδηγεί σε ενεργοποίηση της Src, της FAK, της PI3K και των Erk ½. Το ορθοβαναδικό νάτριο, η θειική χονδροϊτίνη-C, το ΡΡ1, η wortmannin, το LY294002 και το U0126 αναστέλλουν τη μεταγωγή σήματος της HARP, καθώς και την επαγωγή της μετανάστευσης και διαφοροποίησης των HUVEC. Επιπλέον, η μείωση της έκφρασης της RPTPβ/ζ με τη χρησιμοποίηση παρεμβαλλόμενου RNA παρεμποδίζει τα ενδοκυτταρικά σήματα, καθώς και την επαγωγή της μετανάστευσης και της διαφοροποίησης που επάγεται από τη HARP. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η RPTPβ/ζ αποτελεί υποδοχέα της HARP σε ενδοθηλιακά κύτταρα και αποσαφηνίζουν το μονοπάτι μεταγωγής σήματος της HARP στα κύτταρα αυτά. / Heparin affin regulatory peptide (HARP) is an 18 kDa growth factor that has a high affinity for heparin. HARP is highly conserved among species and shares 50% homology with Midkine and RI-HBP. The above proteins constitute a relatively new family of growth factors with high affinity for heparin. HARP has been originally purified from perinatal rat brain as a molecule that induces neurite outgrowth. HARP is also expressed in uterus, cartilage and bone extracts. Several reports have established a strong correlation between HARP expression and tumour growth and angiogenesis. High levels of this protein were found in many human cancers and cell lines derived from human tumours. HARP has been reported to be mitogenic for different types of endothelial cells and angiogenic in vivo and in vitro. HARP exerts its biological activity through interactions with cell surface proteoglycans, such as N-syndecan, or binding to more specific cell surface receptors. Receptor-type protein tyrosine-phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and its secreted variant phosphacan, as well as ALK, have been recently reported to bind HARP and to be implicated in its signalling.HARP has been previously shown to activate both the MAPK and PI3K - Akt signalling axes. Inhibitors of Erk½ or PI3K inhibit DNA synthesis stimulated by HARP. Additionally, analysis of tyrosine phosphorylated proteins following HARP stimulation, revealed induction of Shc and Erk ½ phosphorylation. Nevertheless, the signals from specific receptors to PI3K or MAPK are not well documented. In the present work, we examined the effect of HARP on migration and tube formation on matrigel of HUVEC and investigated the signalling pathway induced by HARP. We report that HARP induces migration and differentiation of endothelial cells through binding to RPTPβ/ζ, leading to activation of Src, FAK, PI3K and Erk½. Sodium orthovanadate, chondroitin sulfate-C, PP1, wortmannin, LY294002 and U0126 inhibit HARP-mediated signalling and HARP-induced HUVEC migration and differentiation. In addition, RPTPβ/ζ suppression using siRNA technology, interrupts intracellular signals, as well as HUVEC migration and differentiation that are induced by HARP. These results establish the role of RPTPβ/ζ as a receptor of HARP in HUVEC and elucidate the HARP signalling pathway in endothelial cells.

H οικογένεια των γουανυλικών κυκλασών περιλαμβάνει δύο μέλη, μία διαλυτή μορφή (sGC) και μια μορφή που είναι συνδεδεμένη στην κυτταρική μεμβράνη (pGC). Αυτές ενεργοποιούνται από τα διαφορετικούς προσδέτες. Η μεν sGC από το μονοξείδιο του αζώτου (NO), η δε pGC από τα νατριουρητικά πεπτίδια και με την ενεργοποίησή τους παράγουν την κυκλική GMP (cGMP). Σε πολλές περιπτώσεις, η ξεχωριστή αυτή παραγωγή του cGMP από sGC έναντι αυτής που προέρχεται από την pGC οδηγεί σε διαφορετικές βιολογικές δράσεις. Προηγούμενη εργασία στο εργαστήριό μας έχει δώσει έμφαση στη σημασία της από sGC παραγόμενης cGMP στην αγγειογένεση. Ωστόσο, περιορισμένες πληροφορίες είναι διαθέσιμες όσον αφορά στις αγγειογενετικές δράσεις της pGC στο ενδοθήλιο. Επομένως επιδιώξαμε να καθορίσουμε τα αποτελέσματα της ενεργοποίησης pGC στις ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται με την αγγειογένεση. Αρχικά, ερευνήσαμε την επίδραση του κολπικού νατριουρητικού πεπτιδίου (ANP) στο σχηματισμό αγγείων αίματος in vivo, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο μοντέλο τη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας (CAM). Το ANP (0.1-10 μmole) ενίσχυσε τη νεοαγγειογένεση με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, όπως διαπιστώθηκε από την αύξηση στα σημείων διακλάδωσης και το μήκος αγγείων. In vitro, το ANP ενίσχυσε τον πολλαπλασιασμό (0.01-1 μΜ) και τη μετανάστευση (10 μΜ) ενδοθηλιακών κυττάρων ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC) και υποκίνησε το σχηματισμό δομών αγγειακού τύπου από τα HUVEC 10 μΜ) σε υπόστρωμα Matrigel. Προκειμένου να μελετηθούν οι μηχανισμοί που ενέχονται στην επαγόμενη από ANP αγγειογένεση, εξετάσαμε τη φωσφορυλίωση δύο κινασών (MAPK), των ERK1/2 και p38, ως πιθανά μόρια-στόχουςστο μονοπάτι της σηματοδότησης του ANP. Το ANP ενεργοποίησε τόσο την ERK1/2, όσο και την p38 MAPKs κατά χρονοεξαρτώμενο τρόπο. Για να εξασφαλίσουμε στοιχεία για τη λειτουργική σημασία p38 χρησιμοποιήσαμε ένα φαρμακολογικό της αναστολέα, τον παράγοντα SB203580. Προεπώαση των κυττάρων με SB203580 ανέστειλε εν μέρει τη μετανάστευση των HUVEC. Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το ANP προάγει την αγγειογένεση in vivo και ενισχύει τις σχετιζόμενες με αγγειογένεση, ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρω in vitro με τη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης των MAPK. Η ενεργοποίηση λοιπόν της pGC να είναι ευεργετική όταν απαιτείται ο σχηματισμός νέων αγγείων αίματος. / The guanylyl cyclase (GC) family comprises of two members, a soluble one (sGC) and a membrane-bound GC, the particulate GC (pGC). These are activated by different ligands; sGC by nitric oxide (NO) and pGC by natriuretic peptides and upon activation produce cyclic GMP (cGMP). In many instances compartmentalized production of cGMP by sGC vs pGC results in different biological responses. Previous work in our laboratory has highlighted the importance of sGC-derived cGMP in angiogenesis. However, limited information is available with regard to the angiogenic actions of pGC in the endothelium. We therefore sought to determine the effects of pGC activation on angiogenesis-related properties of EC. Initially, we investigated the effects of atrial natriuretic peptide (ANP) on blood vessel formation in vivo, using as a model the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM). ANP (0.1-10 μmole) enhanced neovascularization in a dose-dependent manner, as shown by the increase in branching points and vessel length. In vitro, ANP increased human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) growth (0.01-1 μΜ) and migration (10 μΜ) and stimulated the assembly of HUVEC into tube-like networks (10 μΜ) on Matrigel. In order to study the mechanisms implicated in ANP-induced angiogenesis, we examined the phosphorylation of two MAP Kinases (MAPK), ERK1/2 and p38, as possible downstream targets of ANP signaling. ANP activated both ERK1/2 and p38 MAPKs in a time-dependent manner. To provide evidence for the functional significance of p38 we used the pharmacological inhibitor SB203580. Pretreatment of cells with SB203580 inhibited ANF-stimulated migration of HUVEC. In summary, our data show that ANP promotes angiogenesis in vivo and enhances angiogenesis-related properties of endothelial cells in vitro by modulating phosphorylation of MAPK. pGC activation might be beneficial when new blood vessel formation is desired.

Στόχος της διπλωματικής εργασίας ήταν η εφαρμογή της Μοριακής Απεικόνισης για την λήψη εικόνων παθολογικής αγγειογένεσης σε πειραματικό μοντέλο λευκού κόνικλου Νέας Ζηλανδίας με καρκίνωμα VX2. Στη πρώτη φάση της διπλωματικής εργασίας προσδιορίσαμε ως κατάλληλο μοριακό στόχο για την απεικόνιση της αγγειογένεσης, την ιντεγκρίνη ανβ3. Η επιλογή του στόχου βασίστηκε στο γεγονός ότι το επίπεδο έκφρασης της ιντεγκρίνης ανβ3 αυξάνεται σημαντικά κατά την αγγειογένεση, η οποία έχει διαπιστωθεί ότι συμμετέχει στην ανάπτυξη ενός όγκου και επάγεται από χημικούς παράγοντες σε καταστάσεις ισχαιμίας, ενώ σχετίζεται και με πολλές άλλες ασθένειες. Στη δεύτερη φάση στόχος μας ήταν να γίνει εμφύτευση καρκινικών κυττάρων της σειράς VX2 σε κόνικλο και η δημιουργία ενός carrier animal με όγκο VX2. Η δημιουργία ενός δότη κυττάρων VX2 χρησιμεύει για την επίτευξη συνεχών μετεμφυτεύσεων του όγκου σε κόνικλους που προορίζονται για απεικόνιση του επιλεγμένου μοριακού στόχου. Για τη μελέτη του επιπέδου έκφρασης της ιντεγκρίνης ανβ3 επιλέχθηκαν ως μόρια προς επισήμανση πεπτίδια τα οποία φέρουν την αλληλουχία RGD (Arginine-Glycine-Aspartic acid) μέσω της οποίας αντιδρούν με το μόριο της ιντεγκρίνης ανβ3 και ως κατάλληλο σύστημα απεικόνισης περιστρεφόμενη γ κάμερα. Τελικός στόχος είναι μέσω του δείκτη ανβ3 να μελετήσουμε πως εξελίσσεται χρονικά και χωρικά σε σχέση με τον όγκο η αγγειογένεση. Μελλοντικές προοπτικές είναι η ακριβής παρακολούθηση σε κλινικό επίπεδο της διαδικασίας της αγγειογένεσης μετά από χορήγηση προ-αγγειογενετικών ή αντι-αγγειογενετικών παραγόντων σε περιπτώσεις ισχαιμίας ή καρκίνου αντίστοιχα. / The aim of the study was the aquisition of images of tumor angiogenesis by implementing Molecular Imaging techniques. The small animal experimental platform that was required for the study was the New Zealand White rabbit with VX2 carcinoma. The molecular target for imaging angiogenesis was integrin ανβ3, which is found to be overexpressed in endothelial cells participating in angiogenesis. Angiogenesis is found to be crucial for the development of solid tumors (excessive angiogenesis) and other pathological conditions (insufficient angiogenesis). Tracers that interact with ανβ3 are RGD (Arginine-Glycine-Aspartic acid residues)peptides labeled with radionuclides and suitable imaging modality is rotating gamma camera. Targeted molecular imaging may visualize the early activation of the angiogenic type of endothelial cells.To that end, we hope to gain further insights into the specific temporal and spatial characteristics of the onset of angiogenesis.

H νουκλεολίνη είναι μια πρωτεΐνη μοριακού βάρους 110 kDa και απαντάται στον πυρήνα, το κυτταρόπλασμα αλλά και στην επιφάνεια των κυττάρων, ενώ υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα και σε ενεργά ενδοθηλιακά κύτταρα. Πρόσφατες έρευνες υποδεικνύουν την συμμετοχή της στις διαδικασίες ανάπτυξης καρκινικών όγκων και στην αγγειογένεση. Στην επιφάνεια του κυττάρου δρα ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας αυξητικών παραγόντων, μορίων κυτταρικής προσκόλλησης (ιντεγκρίνες και σελεκτίνες) λιποπρωτεϊνών και ορισμένων ιών (HIV-1 και coxsackie B). Παρουσιάζει πλήθος λειτουργιών, αλληλεπιδρώντας τόσο με πρωτεΐνες, όσο και με νουκλεϊνικά οξέα. Το HB-19 και το Ν6L είναι συνθετικά πεπτίδια που προσδένονται στην νουκλεολίνη της κυτταρικής επιφάνειας και καταστέλλουν τόσο την ανάπτυξη καρκίνου όσο και την αγγειογένεση. Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήσαμε την βιολογική δράση των πεπτιδίων αυτών και βρέθηκε ότι αναστέλλουν τον in vitro πολλαπλασιασμό και την in vitro προσκόλληση των κυττάρων HUVEC. Τα πεπτίδια αυτά παρουσιάζουν in vivo ογκοκατασταλτική δράση και βρέθηκε να αναστέλλουν την αγγειογένεση στο σύστημα της χοριοαλλαντοϊδικής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας. Επίσης αναστέλλουν τη μετανάστευση των κυττάρων HUVEC στο in vitro σύστημα μελέτης της μετανάστευσης Boyden chamber. Το πεπτίδιο HB-19 αναστέλλει την έκφραση διαφόρων αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων όπως ο FGF, VEGF και των υποδοχέων τους σε επίπεδο mRNA. Το HB-19, όπως και το Ν6L επηρεάζουν την έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης MMP-2 τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο έκφρασης γονιδίου. Επιπλέον, κανένα από τα δύο πεπτίδια δεν προκαλεί απόπτωση in vitro στα κύτταρα HUVEC. Τα πεπτίδια HB-19 και Ν6L δεσμεύονται στη νουκλεολίνη της επιφάνειας του κυττάρου και φαίνεται ότι για την άσκηση των βιολογικών τους δράσεων διαμεσολαβούν οι κινάσες SRC, ERK1/2, AKT και FAK καθώς αναστέλλουν την ενεργοποίησή τους σε κύτταρα HUVEC. Τέλος, μείωση της έκφρασης της νουκλεολίνης με χρήση siRNA επιβεβαίωσε τον ρόλο της νουκλεολίνης στην βιολογική δράση των πεπτιδίων HB-19 και N6L. Συνοψίζοντας τα παραπάνω αποτελέσματα, φαίνεται ότι τόσο το HB-19 όσο και το Ν6L εμφανίζουν βιολογικές δράσεις που τα καθιστούν υποψήφια μόρια για αντινεοπλασματική χρήση. / Nucleolin is a 110 kDa protein, located in the nucleus and the cytoplasm while it is over expressed on the surface of tumor and endothelial cells. Recent studies have demonstrated the involvement of nucleolin in tumor growth and angiogenesis. Thus, this cell surface molecule serves as a receptor for various ligands implicated in pathophysiological processes such as growth factors, cell adhesion molecules (integrins and selectins), laminin-1, lipoproteins and viruses (HIV and coxsackie B). HB-19 and N6L are synthetic peptides that bind cell surface expressed nucleolin and inhibit both tumor growth and angiogenesis. In the present work, we investigated the biological actions of peptides HB-19 and N6L. Our results show that both peptides inhibit the in vivo angiogenesis on the chicken embryo CAM assay and inhibit the in vitro adhesion, proliferation, migration and motility of HUVEC cells. HB-19 peptide inhibits the expression of growth factors FGF and VEGF mRNA as well as the expression of their receptors FGFR1 and FLT-1 respectively. We also found that both enzyme activity and expression of MMP-2 was inhibited by HB-19 and N6L. Furthermore, we found that HB-19 and N6L treatment shows no toxicity in HUVEC cells in vitro. The above biological actions seem to be regulated by SRC, ERK1/2, AKT and FAK kinases as we found that HB-19, as well as N6L, inhibit their activation in HUVEC cells. Finally, down regulation of nucleolin using siRNA confirmed the implication of nucleolin in the biological actions of these peptides. Taken all the above results into account, it is indicated that HB-19 and N6L could constitute an interesting tool for tumor therapy strategy targeting nucleolin.