This Master Thesis presents a novel classification approach for microcalcifications (MCs) extracted from core biopsy tissue samples digitized using micro-CT, a high-resolution 3D imaging modality. MCs are tiny spots of calcium that may occur in the female breast. Although they are common in healthy woman, they are often an early sign of breast cancer. The shape of the MCs is an important factor used to discriminate between benign and malignant abnormalities. However, the current standard imaging modalities (i.e. mammography) are not efficient for a clear shape based analysis. In case of suspiciousness, a biopsy is conducted and the extracted tissue is anatomopathologically investigated for the presence of cancer cells. Nevertheless, only 20-35% of biopsies turn out to be positive. As such, the question whether some unnecessary biopsies can be avoided if the shape of the MCs could be analysed in more detail has been raised. In addition, the MCs themselves are not analysed, but they are characterised as benign (or malignant) according to whether they were found into a benign (or malignant) tissue. As a result, there is a ground truth for the tissue samples but not for the individual MCs. So, when a classifier of a Computer Aided Diagnosis System will be asked to classify a MC according to its shape, there will be a degree of ambiguity and uncertainty. This master thesis investigates whether the use of a clustering method as a preprocessing step before training the classifier could avoid the ground truth issues and could improve the obtained classification results. / Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία παρουσιάζει μια νέα μέθοδο για την ταξινόμηση μικροαποτιτανώσεων μαστού που έχουν εξαχθεί από βιοψίες και έχουν ψηφιοποιηθεί με χρήση micro-CT, μια υψηλής ανάλυσης, τρισδιάστατη τεχνική απεικόνισης. Οι μικροαποτιτανώσεις (ή αλλιώς μικροασβεστώσεις) αποτελούν μικρά αποθέματα ασβεστίου στον μαστικό αδένα. Παρόλο που μπορεί να εμφανιστούν και σε υγιείς γυναίκες, μπορούν να αποτελέσουν ένα πρώιμο σημάδι καρκίνου του στήθους. Το σχήμα είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες ο οποίος βοηθάει στη διάκριση ανάμεσα σε καλοήθεις και κακοήθεις μικροασβεστώσεις, ωστόσο δεν μπορεί να απεικονιστεί επαρκώς μέσω των στανταρ απεικονιστικών τεχνικών (μαστογραφία). Σε περίπτωση υποψίας κακοήθειας, διεξάγεται βιοψία με σκοπό την απομάκρυνση ιστού από την ύποπτη περιοχή και την ανατομοπαθολογική του εξέταση για την παρουσία καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, μονο το 20%-35% των βιοψιών αποδεικνύονται κακοήθεις. Ως εκ τούτου, έχει τεθεί το ερώτημα κατά πόσο μπορούν να αποφευχθούν οι μη απαραίτητες βιοψίες εάν το σχήμα των μικροασβεστώσεων μπορούσε να μελετηθεί πιο λεπτομερώς. Επιπροσθέτως, οι μικροασβεστώσεις αυτές καθ’ εαυτές δεν αναλύονται αλλά χαρακτηρίζονται ως καλοήθεις (ή κακοήθεις) με βάση το αν βρέθηκαν μεσα σε καλοήθες (ή κακοήθες) ιστό. Ως αποτέλεσμα, υπάρχει βάση αναφοράς για τα δείγματα ιστού αλλά όχι για τις μικροασβεστώσεις. Έτσι, όταν ζητηθεί από έναν ταξινομητή ενός συστήματος υποβοηθούμενης διάγνωσης με υπολογιστή να ταξινομήσει μικροασβεστώσεις με βάση το σχήμα τους υπάρχει ένα μεγάλο ποσοστό ασάφειας και αβεβαιότητας. Αυτή η μεταπτυχιακή εργασία έχει σκοπό να ερευνήσει εάν η εισαγωγή ενός βήματος συσταδοποίησης πριν αυτού της ταξινόμησης μπορεί να αποφύγει το πρόβλημα έλλειψης βάσης αναφοράς και να βελτιώσει τα αποτελέσματα της ταξινόμησης.

Παρά τις προόδους των κλασικών θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο, η μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών υποτροπιάζει και καταλήγει. Η ανάγκη για την αντιμετώπιση της νόσου με εναλλακτικό τρόπο οδήγησε στην ανάπτυξη ανοσοθεραπευτικών μεθόδων. Η ιδέα της ανοσοθεραπείας του καρκίνου έγινε γνωστή στα τέλη του δέκατου ένατου αιώνα, όταν ο William Coley χρησιμοποίησε ζωντανά στελέχη του πυογενούς βακτηρίου Streptococcus erysipelas με σκοπό τη δημιουργία γενικευμένης ανοσολογικής απάντησης, μέρος της οποίας να κατευθυνθεί ενάντια σε όγκους σαρκώματος. Οι σποραδικές θετικές αποκρίσεις που παρατήρησε οφείλονταν κατά πάσα πιθανότητα σε ενίσχυση της ανοσολογικής απάντησης από τις φλεγμονώδεις αντιδράσεις που προκάλεσαν τα βακτήρια. Για να επαχθεί όμως ειδική ανοσολογική απάντηση ενάντια σε όγκους απαιτείται να χαρακτηριστούν στα καρκινικά κύτταρα συγκεκριμένα αντιγόνα, ώστε να δύναται το ανοσολογικό σύστημα να τα αναγνωρίσει ως στόχους. Συνεπώς, το πρώτο βήμα στην προσπάθεια για ανοσοθεραπεία του καρκίνου είναι η απομόνωση αντιγόνων που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα, τα οποία κατά προτίμηση να μην εκφράζονται από τους φυσιολογικούς ιστούς ώστε να αποφευχθεί η αυτοάνοση απάντηση. Η ταυτοποίηση ογκοειδικών αντιγόνων, τα οποία αναγνωρίζονται από τα Τ λεμφοκύτταρα, έδωσε ιδιαίτερη ώθηση στην ανάπτυξη της κατευθυνόμενης από τα Τ κύτταρα ανοσολογικής απάντησης, στο επίπεδο τόσο της έρευνας της ανοσολογίας του καρκίνου, όσο και της κλινικής ανοσοθεραπευτικής εφαρμογής και έθεσε τις βάσεις για τη χρησιμοποίηση πεπτιδικών εμβολίων στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Από την πληθώρα των γνωστών καρκινικών αντιγόνων, έχουν ταυτοποιηθεί κατά κύριο λόγο επίτοποι ικανοί να συνδεθούν με μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC) τάξης Ι και συνεπώς να επάγουν την ενεργοποίηση των CD8+ T κυττάρων, δεδομένου ότι οι περισσότεροι όγκοι είναι θετικοί ως προς τα μόρια MHC τάξης Ι, αλλά αρνητικοί ως προς τα μόρια MHC τάξης ΙΙ. Επιπρόσθετα, τα CD8+ Τ κύτταρα μπορούν να καταστρέφουν τα καρκινικά κύτταρα απευθείας, μέσω της αναγνώρισης του συμπλόκου MHC τάξης Ι-πεπτιδίου που εκφράζεται στην επιφάνεια του όγκου. Τα τελευταία χρόνια, δεδομένης της αναγνώρισης του κεντρικού ρόλου των CD4+ Τ λεμφοκυττάρων στην έναρξη, οργάνωση και διατήρηση της ανοσολογικής απάντησης, έχουν αναγνωριστεί και αρκετοί επίτοποι που αναγνωρίζονται από μόρια MHC τάξης ΙΙ. Πρόσφατες κλινικές μελέτες και προκλινικά μοντέλα έδειξαν ότι ο εμβολιασμός με επιτόπους που δύνανται να συνδεθούν με μόρια MHC τάξης ΙΙ, οι οποίοι εμπεριέχουν αλληλουχίες σύνδεσης για τα μόρια MHC τάξης Ι, είναι αποτελεσματικοί στην ταυτόχρονη ανάπτυξη βοηθητικών και κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων με μακρά διάρκεια ζωής in vivo. Από τα γνωστά καρκινικά αντιγόνα, η πρωτεΐνη HER-2/neu παρουσιάζει το πλεονέκτημα της υπερέκφρασης σε ποικίλους τύπους καρκίνου, ενώ οι ασθενείς των οποίων όγκοι την υπερεκφράζουν παρουσιάζουν προϋπάρχουσα ανοσία ενάντια σε πεπτίδια αυτής. Η αυξημένη έκφρασή της στα καρκινικά κύτταρα και το γεγονός ότι πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη την καθιστούν στόχο για ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις που περιλαμβάνουν τόσο κυτταρική όσο και χυμική ανοσία. Κλινικές έρευνες με χρήση πεπτιδίων της HER-2/neu έχουν δείξει την πρόκληση ανοσολογικής απάντησης στην πλειονότητα των ασθενών. Παρόλα αυτά, οι μεταστατικοί τύποι καρκίνου που υπερεκφράζουν τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη παραμένουν μη θεραπεύσιμοι. Συνεπώς, υπάρχει άμεση ανάγκη για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις και στο σημείο αυτό η διερεύνηση των πιο ανοσογονικών τμημάτων της αλληλουχίας της πρωτεΐνης HER-2/neu, καθώς και της αντίδρασης των ασθενών σε αυτά, αποτελούν στόχο για ειδικές νέες αντικαρκινικές θεραπείες. O εγκλεισμός του αντιγόνου σε μικροσφαίρες πολυ-γαλακτικού-γλυκολικού οξέος (PLGA) έχει δειχθεί ότι επάγει ισχυρή και παρατεταμένη ανοσοαπόκριση. Μέχρι σήμερα, δεν φαίνεται να έχει αναφερθεί μελέτη στην οποία να αναλύεται η επίδραση των χαρακτηριστικών του PLGA συμπολυμερούς και του σχήματος ανοσοποίησης στον τύπο της λαμβανόμενης ανοσοαπόκρισης μετά την χορήγηση PLGA μικροσφαιρών του αντιγόνου in vivo. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο τύπος της ανοσοαπόκρισης που λαμβάνεται in vivo μετά την χορήγηση πεπτιδίων της HER-2/neu (πρότυπα αντιγόνα) συνδεμένων σε πολυ-γαλακτικού οξέος (PLA) και PLGA μικροσφαίρες. Τα πρότυπα αντιγόνα ήταν δύο: * το πεπτίδιο GSPYVSRLLGICLTSTVQLVQL, που αντιστοιχεί στην περιοχή 778-799 της ογκοπρωτεΐνης HER-2/neu. Η πεπτιδική αυτή ακολουθία περιλαμβάνει τον κυτταροτοξικό επίτοπο CLTSTVQLV (789-797) σε συνδυασμό με τον T βοηθητικό (Th) επίτοπο GSPYVSRLLGICL (778-790) της συγκεκριμένης ογκοπρωτεΐνης. * καθώς και το πεπτίδιο CLTSTVQLV (789-797), δηλαδή μόνο ο κυτταροτοξικός (CTL) επίτοπος. Ως πειραματόζωα στην συγκεκριμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν HHD διαγονιδιακοί μύες, οι οποίοι εκφράζουν ανθρώπινα HLA-A2.1 μόρια ιστοσυμβατότητας, δεδομένου ότι η ακολουθία του πεπτιδίου που έχει επιλεγεί προέρχεται από την ανθρώπινη HER-2/neu. Η μετατροπή της ανοσοαπόκρισης Th2 τύπου, εναντίον διαλυτών αντιγόνων που εκφράζονται σε καρκινικούς όγκους, σε Τh1 τύπο ανοσοαπόκρισης είναι σημαντική στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Η δημιουργία αντιγονο-ειδικών CD8+ κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων, σε συνέργεια με τα αντίστοιχα βοηθητικά Τ (CD4+) λεμφοκύτταρα, πιστεύεται ότι θα οδηγήσουν στην απόρριψη του όγκου ή στην επιβράδυνση της ανάπτυξης αυτού. Η ταυτοποίηση του τύπου της ανοσοαπόκρισης έγινε με την ανάπτυξη ανοσοαναλυτικών τεχνικών για την μέτρηση των ολικών ειδικών ανοσοσφαιρινών IgG, των ισοτύπων αυτών (IgG1 και IgG2a). Επίσης προσδιορίσθηκε ο τύπος της ανοσοαπόκρισης σε κυτταρικό επίπεδο με την ανάπτυξη τεχνικών μέτρησης της ικανότητας του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων και με μέτρηση των κυτοκινών, κυρίως σε υπερκείμενα καλλιεργειών λεμφοκυττάρων, αλλά και στο αίμα. Για την χορήγηση χρησιμοποιήθηκαν μικροσφαίρες PLA και PLGA με φορτωμένο το αντιγόνο με δύο διαφορετικούς τρόπους (προσροφημένο ή απλά αναμεμιγμένο). Η in vivo χορήγηση του πεπτιδικού αντιγόνου που απλά και μόνο αναμίχθηκε με PLA μικροσφαίρες προκάλεσε μια ισχυρή ανοσολογική απόκριση που ήταν συγκρίσιμη με αυτήν που προκλήθηκε από το συνδυασμό του αντιγόνου με πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund (CFA). Επιπλέον, μετά από ανάλυση του προφίλ των κυτοκινών που εκκρίνονται από τα Τ λεμφοκύτταρα των ανοσοποιημένων μυών, αποδείχθηκε ότι ο συνδυασμός του αντιγόνου πεπτιδίων με τις PLA μικροσφαίρες προκάλεσε μια ισχυρή Th1 ανοσολογική απόκριση στο αντιγόνο. Ο χρόνος της επώασης πεπτιδίων με τις μικροσφαίρες πριν από τη χορήγηση δεν είχε επιπτώσεις στην ανοσολογική απόκριση, γεγονός που απλοποιεί περαιτέρω την παραγωγή σε ευρεία κλίμακα αυτού του τύπου εμβολίων. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από αυτή τη μελέτη δικαιολογούν την περαιτέρω διερεύνηση σε in vivo πειραματικά μοντέλα καρκίνου της δυνατότητας επαγωγής ισχυρής κυτταρικής ανοσοαπόκρισης έναντι των καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την HER-2/neu πρωτεΐνη με απλή ανάμιξη κατάλληλων πεπτιδικών αντιγόνων της HER-2/neu με PLA μικροσφαίρες. / Despite the progress of classic therapeutic strategies developed concerning cancer the greatest number of patients deteriorates and eventually dies. The need to confront this disease in an alternative way has led to the development of new immunotherapeutic methods. The novel idea of cancer immunotherapy was born in the 19th century when William Coley used live live species of bacteria Streptococcus erysipelas in order to induce an overall immune response targeted in part against sarcoma tumors. Occasional positive immune responses that were observed were possibly due to the enhancement of the immune response from the inflammatory reactions caused by the bacteria. In order to induce a special immune response against tumors it is necessary for some specific antigens to be identified at cancer cells. So the first step in the effort to induce immunotherapy is the isolation of antigens expressed by cancer cells that are preferably not expressed at healthy tissues, to prevent autoimmune response. The identification of tumor-specific antigens that are identified by T cells gave a great boost to the development of T-cell-mediated specific immune response, both in research for tumor immunology as in its clinical appliance. That led to the beginning of peptide use in vaccines in cancer immunotherapy. From the plethora of already known cancer antigens, epitopes have been identified as capable of forming complex with MHC (Major Histocompatibility Complex) class I molecules, which consequently induce the activation of CD8+ T cells, given that most tumors are positive for the MHC class I molecules, but negative to MHC class II molecules. Moreover, CD8+ T cells can kill cancer cells directly, through identification of the MHC class I–peptide complex that is expressed on the tumor surface. Recently many epitopes that are recognized by MHC class II molecules have been identified, since it is well known that the CD4+ T cells play an important role in the initiation, organization and maintenance of the immune response. Recent clinical studies and preclinical models have shown that immunization with epitopes that are eminent to form a complex with MHC class II molecules, which comprise amino acid sequences that can connect with MHC class I molecules, are effective in the simultaneous induction of helper and cytotoxic long life T-cell in vivo. Among all known cancer antigens, the HER-2/neu protein demonstrates the advantage of being overexpressed in various types of cancer, while patients whose tumors overexpress the protein exhibit preexisting immunity against its peptides. HER-2/neu is a transmembrane protein that is overexpressed in cancer cells and therefore the perfect target for immunotherapy concerning both cellular and humoral immunity. Clinical studies using HER-2/neu peptides have shown induction of immune response in the majority of patients. However, metastatic tumors overexpressing HER-2/neu protein still remain incurable. As a result, there is ample need for respective new therapeutic strategies and at this point more potent immunogenic sequences of the protein are under investigation, as is the response of patients to those sequences, in hope of creating more specific anticancer therapies. Encapsulation of antigen into poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) microspheres has proven to induce potent and long lasting immune response. Up to date, there is no study analyzing the influence of PLGA polymer characteristics or the immunization scheme, regarding the type of the immune response following the administration of PLGA antigen microspheres in vivo. In the current study, the type of the immune response after in vivo administration of HER-2/neu peptide adsorbed on poly-lactic acid (PLA) and PLGA microspheres is investigated. The model antigens used were the following two: • GSPYVSRLLGICLTSTVQLVQL peptide corresponds to the 779-799 amino acid sequence of the HER-2/neu protein. This amino acid sequence contains the cytotoxic epitope CLTSTVQLV (789-797) in combination with the Th epitope GSPYVSRLLGICL (778-790) of the HER-2/neu protein. • CLTSTVQLV (789-797) peptide, which corresponds to merely the cytotoxic epitope. HHD transgenic mice expressing human HLA-A2.1 histocompatibility molecules were used as subjects, given the fact that the amino acid sequence chosen has derived from the human HER-2/neu protein. Converting the preexisting Th2 type of immune response, against soluble antigens expressed in tumors, to the Th1 type is extremely important in curing cancer. The production of antigen-specific CD8+ cytotoxic lymphocytes with the relevant helper T (CD4+) lymphocytes is believed to trigger the rejection of the tumor or the delay of its development. The type of the immune response was identified with immuno-analytic techniques developed for measuring the total amount of IgG immunoglobulins, and their isotypes (IgG1 and IgG2a). Moreover the type of the immune response has been determined at cellular level using proliferation assay and cytokine measurement assay, usually at cell culture supernatants but also in blood samples. For the peptide administration, PLA and PLGA microspheres were used. The antigen was administered in two different ways, either absorbed or adsorbed (just mixed). The in vivo administration of the peptide antigen just admixed with PLA microspheres induced potent immune response, comparable to that caused by the antigen administration using complete Freund’s adjuvant (CFA). Moreover, upon the analysis of the cytokine profile secreted from T lymphocytes of immunized mice, the PLA admixed peptide proved to induce a specific and potent Th1 immune response. The incubation time of the peptide with PLA microspheres had no implications to the immune response, therefore further simplifying future mass production of such vaccine types. The results extracted by this study justify further investigation of the in vivo experimental cancer models for inducing potent cellular immune response against cancer cells that overexpress the HER-2/neu protein by simply mixing the appropriate HER-2/neu peptide antigens with PLA microspheres.

The aim of this project is the application of Dual Energy technique in breast phantoms using Complimentary-Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)Active-Pixel-Sensor (APS). This includes both, lab experimentation on developed breast phantoms, as well as simulations validating the results. Initially, phantoms were carefully prepared simulating the properties of real breast tissue and were imaged using X-ray unit. The next step in this project involved image processing and data representation. Using the dual energy technique, different concentrations of contrast agent (Iodine) were measured to relate clinical to medium kinetic measurements. With respect to this projects‟ clinical application, the implementation of this technique can be used to evaluate the iodine projected thickness (mg/cm2) using Contrast Enhanced Digital Mammography (CEDM) based on Dual Energy technique for the breast cancer detection. / Ο στόχος του εργασίας αυτής είναι η εφαρμογή της τεχνικής Διπλής Ενέργειας σε ομοιώματα μαστού χρησιμοποιώντας Complimentary-Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) Active-Pixel-Sensor (APS). Αυτό περιλαμβάνει, τον πειραματισμό σε αναπτυγμένα ομοιώματα μαστού, καθώς και προσομοιώσεις για την επικύρωση των αποτελεσμάτων. Αρχικά, κατασκευάστηκαν προσεκτικά τα ομοιώματα μαστού όπου προσομοιώνουν τις πραγματικές ιδιότητες των ιστών του μαστού και στη συνέχεια απεικονίστηκαν με χρήση μονάδων ακτίνων-Χ . Το επόμενο βήμα σε αυτό την εργασία ήταν η επεξεργασία εικόνας και παρουσίαση δεδομένων. Χρησιμοποιώντας την τεχνική της διπλής ενέργειας, διαφορετικές συγκεντρώσεις σκιαγραφικού (ιώδιο) μετρήθηκαν ώστε να σχετίζουν κλινικά την μέτρηση της αγγειογένεσης εν συναρτήση του χρόνου. Η εφαρμογή αυτής της τεχνικής μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αξιολογήσει το προβλεπόμενο πάχος του ιωδίου (mg/cm^2) χρησιμοποιώντας Ενίσχυση Αντίθεσης στην Ψηφιακή Μαστογραφία βασίσμένη στην τεχνική της διπλής ενέργειας για την ανίχνευση του καρκίνου του μαστού.

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί τον πιο συχνό τύπο καρκίνου των γυναικών. Παρότι η σχετική έρευνα είναι αρκετά εκτεταμένη, οι υποκείμενοι μηχανισμοί δεν έχουν πλήρως αποσαφηνιστεί. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει τη σημαντικότητα της διαντίδρασης των καρκινικών κυττάρων και του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος ως μια κομβική συνιστώσα στη παθοφυσιολογίας της νόσου. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της ανοσοϊστοχημικής έκφραση του υποδοχέα CXCR4, της χημοκίνης SDF-1, της μεταλλοπρωτεϊνάσης MMP-9 και του παράγοντα HIF-1α σε διηθητικά καρκινώματα του μαστού και στον παρακείμενο μη καρκινικό ιστό (τόσο στο επιθηλιακό όσο και στο στρωματικό στοιχείο), καθώς και οι συσχετίσεις των ποικίλων ανοσοεντοπίσεων με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και την επιβίωση. η επιλογή των μορίων έγινε βάσει της σημαντικότητάς τους σε ποικίλα στάδια της παθογένειας της νόσου (υποξία, νεοαγγείωση, ανάπτυξη κτλ). Η έκφραση όλων των υπό εξέταση μορίων ήταν στατιστικά σημαντικότερη στον καρκινικό ιστό σε σχέση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό. Από τα αποτελέσματα προκύπτει επίσης συσχέτιση μεταξύ ανοσοϊστοχημικών εντοπίσεων της MMP-9 και των υπολοίπων υπό διερεύνηση μορίων. Προέκυψαν επίσης ποικίλες συσχετίσεις μεταξύ συγκεκριμένων προτύπων έκφρασης (pattern) και προγνωστικών παραγόντων. Η έκφραση της MMP-9 στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων σχετίστηκε θετικά με τη λεμφαδενική προσβολή, αλλά αρνητικά με το μέγεθος του όγκου. Επίσης, η έκφραση του CXCR4 και της SDF-1 στα καρκινικά κύτταρα σχετίστηκε με την παρουσία οστικών μεταστάσεων και με τον ιστολογικό βαθμό κακοήθειας, αντίστοιχα. Επιπλέον, η ανοσοεντόπιση της SDF-1 στους ινοβλάστες του καρκινικού στρώματος συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση του Ki67 και με το στάδιο κατά ΤΝΜ, ενώ η ανοσοεντόπιση της SDF-1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα του καρκινικού στρώματος με την έκφραση του Her2. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση του HIF-1α συσχετίστηκε αρνητικά με την έκφραση των στεροειδικών υποδοχέων ER και PR. Επιπλέον, η έκφραση της MMP-9 στους ινοβλάστες του καρκινικού στρώματος και η έκφραση της SDF-1 στα επιθηλιακά κύτταρα και στους ινοβλάστες του παρακείμενου μη καρκινικού ιστού συσχετίστηκαν με δυσμενέστερη επιβίωση. Το εύρημα αυτό τονίζει τη σημαντικότητα τόσο του στρώματος όσο και του ξενιστή στην παθογένεια του καρκίνου. Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν τη σημαντικότητα των υπό μελέτη μορίων στην καρκινογένεση και στην εξέλιξη της νόσου. Για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων αυτών απαιτείται η διενέργεια μελετών μεγαλύτερης κλίμακας ενώ προσεγγίσεις με λειτουργικές μεθοδολογίες θα μπορούσαν να αναδείξουν πιθανώς κοινά ή διαπλεκόμενα υποκείμενα μηνυματοδοτικά μονοπάτια στα οποία εμπλέκονται τα ως άνω μόρια. / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women. Despite the ongoing research in breast cancer tumorigenesis the underlying mechanisms are not yet well elucidated. In recent years, the interaction between tumour cells and tumour microenvironment has gained appreciation as an active participant in cancer pathophysiology. In the present study we attempt to investigate the immunohistochemical staining of CXCR4, SDF-1, MMP-9 and HIF-1a in invasive breast cancer and adjacent normal breast tissue (including epithelial and stromal components) and to determine the relationship between different expression patterns and various tumor clinicopathological parameters and survival. The understudy molecules where chosen due to their crucial role in different steps of breast cancer progression (tumor growth, hypoxia, neovascularisation, invasiveness etc). All molecules showed statistically significant higher expression in cancer tissue compared to expression in the adjacent noncancerous tissue. Our results reveal a correlation between expression patterns of MMP9 and the other understudy molecules (SDF1, CXCR4 and HIF-1a). Furthermore, MMP9 expression in fibroblasts of cancer stroma and SDF1 expression in normal epithelial cells and fibroblasts of adjacent normal stroma were associated with poorer survival, underscoring the importance of tumor microenvironment and host derived molecules in tumor progression. There were also various correlations between specific expression patterns and prognostic factors: MMP9 expression in cancer cells was positively correlated with lymph node involvement, but negatively with tumor size,¬ while CXCR4 and SDF-1 expression in cancer cells was positively correlated with bone metastases and tumor grade, respectively. Furthermore, SDF-1 immunoexpression of cancer stromal fibroblasts was positively correlated with Ki67 expression and TNM stage, whereas SDF1 immunoexpression in endothelial cells of cancer stroma was positively correlated with Her2 expression. HIF-1a expression in cancer cells was negatively correlated with expression of steroid receptors. The abovementioned results underline the importance of the understudy molecules in carcinogenesis and tumor progression. Larger scale studies are necessary to confirm our results, while functional approaches could possibly reveal common or interwoven molecular pathways for the understudy molecules.

Στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο μαστού, θετικό για οιστρογονικούς υποδοχείς, μετά από χειρουργική θεραπεία, η μακροχρόνια χορήγηση της ταμοξιφαίνης (SERM πρώτης γενεάς), έχει αποδειχθεί ευεργετική. Ο σκοπός της παρούσης μελέτης, ήταν να διαπιστώσει, εάν οι πολυμορφισμοί του γονιδίου των ER (PvuII & XbaI του ERα και οι RsaI & AluI του Erβ), οι οποίοι έχουν συσχετισθεί με καρκίνο μαστού, σχετίζονται με το στάδιο του καρκίνου του μαστού ή την ανταπόκριση του ενδομητρίου στην μακροχρόνια αγωγή με ταμοξιφαίνη, στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο του μαστού. Η μελέτη περιέλαβε 87 μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο μαστού θετικό για οιστρογονικούς υποδοχείς, στις οποίες χορηγήθηκε ταμοξιφαίνη. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 58,7± 4,7 έτη, και η μέση διάρκεια της αγωγής με ταμοξιφαίνη ήταν 3,9 ± 1,1 έτη. Το γονιδιακό DNA απομονώθηκε από τα λευκά αιμοσφαίρια δειγμάτων περιφερικού αίματος με την κλασσική μέθοδο φαινόλης - χλωροφορμίου. Τα κλάσματα των γονιδίων των ERα και Erβ, τα οποία συμπεριελάμβαναν τις θέσεις των πολυμορφισμών, πολλαπλασιάσθηκαν με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Ο προσδιορισμός της παρουσίας των πολυμορφισμών στο DNA πραγματοποιήθηκε με την χρήση ενζύμων περιορισμού. Συμπερασματικά, στις Ελληνίδες μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο του μαστού υπό αγωγή με ταμοξιφαίνη, οι πολυμορφισμοί των οιστρογονικών υποδοχέων, δεν συνδέθηκαν, ούτε με την παρουσία παθολογίας του ενδομητρίου, ούτε με το στάδιο του καρκίνου του μαστού. / In postmenopausal women with estrogen receptor (ER) positive breast cancer, after surgical treatment long term tamoxifen administration has been proved beneficial. The aim of the present study was to identify whether these ER gene polymorphisms are associated with breast cancer stage or endometrial responsiveness to long-term tamoxifen treatment in postmenopausal women with breast cancer. The study included 87 postmenopausal women with estrogen receptor positive breast cancer treated with tamoxifen. The mean age of patients was 58,7 ± 4,7 years and the mean duration of Tamoxifen treatment was 3.9 ± 1,1 years. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocyte samples by the standard phenol/chloroform procedure. Fragments of the ERα and ERβ genes encompassing the polymorphic sites were amplified by the polymerase chain reaction (PCR). The determination of presence of polymorphisms in the DNA was realised with restriction endonucleases. Ιn conclusion, in Greek postmenopausal women with breast cancer under tamoxifen treatment, Estrogen Receptors polymorphisms were not linked to either the presence of endometrial pathology or the stage of breast cancer.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δείχθηκε ότι το γονίδιο της ανθρώπινης καλλικρεΐνης 6 μπορεί να ενεργοποιηθεί φαρμακολογικά σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού και μελετήθηκε ο μοριακός μηχανισμός της ενεργοποίησης. Το cDNA της ανθρώπινης καλλικρεΐνης 6 αρχικά κλωνοποιήθηκε με την τεχνική της διαφορικής παράθεσης των mRNAs βάσει της υπερέκφρασης σε πρωτοπαθή όγκο μαστού σε σχέση με την πλήρη αποσιώπηση στην μετάστασή του στον πνεύμονα, καθώς και στις περισσότερες μεταστατικές καρκινικές σειρές μαστού και δείγματα ιστών. Λόγω της καταστολής της έκφρασής της σε μεταστατικούς όγκους του μαστού, θεωρήθηκε ότι η κωδικοποιούμενη πρωτεΐνη (hK6)-μια νέα σερινοπρωτεάση- θα μπορούσε να έχει ογκοκατασταλτική δράση. Πρόσφατα δεδομένα δείχθουν ότι η hK6 αντιπροσωπεύει έναν νέο μοριακό δείκτη του καρκίνου, αφού αυξημένες συγκεντρώσεις της στον ορό είναι διαγνωστικές για τον καρκίνο των ωοθηκών και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση της θεραπευτικής αγωγής. Οι φυσιολογικές λειτουργίες της hK6 δεν έχουν βρεθεί. Πρόσφατα, αλλαγές στην έκφραση του γονιδίου KLK6 έχουν συσχετιστεί με την παθογένεση των πιο κοινών νευροεκφυλιστικών νόσων, όπως Alzheimer’s και Parkinson’s. Σημαντικό, είναι το γεγονός της αποικοδόμησης της μυελίνης από την hK6, που πιστοποιεί την συμμετοχή της στην σκλήρυνση κατά πλάκας. Για τους παραπάνω λόγους η hK6, καθώς και το γονίδιο KLK6 αποτελούν ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο. Στην παρούσα εργασία, δείχθηκε ότι οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την μεταγραφή καθώς και την ιστο-εξειδικευμένη έκφραση του γονιδίου KLK6 περιλαμβάνουν την δραστικότητα δύο υποκινητών. Επίσης κλωνοποιήθηκαν νέες ισομορφές του γονιδίου που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα και αντιστοιχούν στο 10-20% των KLK6 mRNAs. Προηγούμενη έρευνα δεν είχε παρατηρήσει εκτεταμένες γονιδιωματικές αλλαγές σε καρκινικούς όγκους στην γενετικό τόπο 19q13.4 που εδρεύει το γονίδιο KLK6, και σε συνδυασμό με την πιθανή ογκοκατασταλτική δράση της hK6, διερευνήθηκε η συμμετοχή επιγενετικών μηχανισμών στην αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου KLK6. Κατεργασία των καρκινικών κυτταρικών σειρών μαστού T47D και MDA-MB-231 με το απομεθυλιωτικό αντιδραστήριο 5-αζα-2΄-δεοξυκυτιδίνη επανενεργοποίησε την έκφραση του γονιδίου KLK6. Η τριχοστατίνη Α, αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών, επανενεργοποίησε την έκφραση KLK6 μόνο στα MDA-MB-231 κύτταρα. Επίσης, βρήκαμε ότι η καταστολή της έκφρασης KLK6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού συνδέεται με την μεθυλίωση συγκεκριμένων δινουκλεοτιδικών αλληλουχιών CpGs που βρίσκονται στον εγγύς υποκινητή του γονιδίου και σε θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Sp1. Η αποσιώπηση της έκφρασης λαμβάνει χώρα με την πρόσδεση του εξαρτώμενου από μεθυλίωση μεταγραφικού καταστολέα MeCP2 και την δημιουργία ετεροχρωματινικής δομής λόγω αποακετυλίωσης των ιστονών. Επειδή η επιγενετική αποσιώπηση του γονιδίου KLK6 υποδηλώνει ογκοκατασταλτικό ρόλο στον καρκίνο του μαστού, διαμολύνθηκε σταθερά το KLK6 cDNA στην μεταστική σειρά MDA-MB-231 με σκοπό τη διαπίστωση του πιθανού αυτού ρόλου. Τα σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα που προέκυψαν, είχαν μικρότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού, ενώ δεν μπορούσαν να σχηματίσουν αποικίες σε μαλακό άγαρ. Συμπερασματικά στην παρούσα διατριβή δείχθηκε ότι το γονίδιο KLK6 αποτελεί πιθανό ογκοκατασταλτικό γονίδιο, που αποσιωπάται σε καρκινικές σειρές μαστού μέσω μεθυλίωσης του γονιδιωματικού DNA, καθώς και δημιουργίας ετεροχρωματινικής δομής στον εγγύς υποκινητή του. Η φαρμακολογική ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου KLK6 μέσω επιγενετικών φαρμάκων, είναι πιθανό να ανοίξει νέους δρόμους για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού. / In the present thesis it was shown that the human kallikrein 6 gene is pharmacologically modulated in breast cancer cell lines and the molecular mechanism accounting for the modulation was analyzed. The cDNA encoding human kallikrein 6 (protease M) was originally cloned by mRNA differential display as being over expressed in a primary breast tumor but completely inactivated in its lung metastasis, and in the majority of metastatic breast cancer cell lines and tissue specimens. Based on this expression pattern, it was suggested that the encoded protein (hK6)-a novel serine protease-could play a suppressor role in cancer progression. Recent evidence suggests that hK6 represents a novel cancer biomarker, since elevated serum concentrations of hK6 are diagnostic of ovarian cancer and can be exploited for monitoring therapeutic response to treatment. The physiological function(s) of hK6 have not been elucidated. Recently, aberrant expression of the KLK6 gene has been implicated in the pathogenesis of most common neurodegenerative disorders, such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. In addition, hK6 is involved in enhanced proteolysis of myelin basic protein associated with multiple sclerosis. Therefore, hK6 and KLK6 gene, represent potential therapeutic targets for pharmacological intervention. In the present study, we have shown that the mechanisms regulating KLK6 transcription and tissue-specific expression involve the action of two different promoters. Also, new KLK6 splice variants were cloned, and shown to account for 10-20% of all KLK6 mRNA species. Previous study had shown no gross genomic alterations in tumor speciments in the KLK6 genomic locus 19q13.4, and in accordance with putative tumor suppressor activity the involvement of epigenetic mechanisms in KLK6 gene silencing in breast cancer was studied. Treatment of KLK6-negative T47D and MDA-MB-231 human breast cancer cell lines with the demethylating agent 5-aza-2\\\\\\\\