Το ασβέστιο αποτελεί ένα σημαντικό δεύτερο μήνυμα που ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση. Η αύξηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου αυξάνει την παραγωγή της IL-10 στα Τ-λεμφοκύτταρα, αλλά δεν είναι σαφές ποια ενδοκυττάρια μόρια εμπλέκονται σε αυτή τη ρύθμιση. Σκοπός της μελέτης είναι η αποσαφήνιση της συμμετοχής του ασβεστίου στην παραγωγή της IL-10 από Τ-λεμφοκύτταρα και η εντόπιση των πιθανών ενδοκυττάριων στόχων. Ο ρόλος των ενζύμων κλειδιών στην οδό ενεργοποίησης μέσω ασβεστίου καλσινευρίνης και CaM Kinase II μελετήθηκε με χρήση είτε ειδικών αναστολέων, κυκλοσπορίνης και ΚΝ-62 αντίστοιχα, είτε με πλασμίδια που κωδικοποιούν τις καταλυτικές υπομονάδες των ενζύμων καλσινευρίνη και CaM Kinase II. Ανθρώπινα Τ-λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος διεγέρθηκαν με anti-CD3/anti-CD28 (διέγερση μέσω TCR), ή Ionomycin/PMA (ενδοκυττάρια στόχευση Ca++ και PKC) παρουσία ή απουσία των ειδικών αναστολέων. Το πρωτεϊνικό προϊόν της IL-10 μετρήθηκε με ELISA ενώ η παραγωγή mRNA της IL-10 με Real Time PCR. Η ενεργότητα του υποκινητή της IL-10, IL-2, IL-4 παρουσία ή απουσία των ενεργών ενζύμων ελέγχθηκε με διαμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδια που φέρουν τον υποκινητή του γονιδίου (1327 bp) ή τμήματα αυτού (-1010, -500, -310, -235, -135 bp Η δράση των ίδιων ενζύμων στην ενεργότητα των μεταγραφικών παραγόντων MEF2, CREB και NF-κB ελέγχθηκε με ταυτόχρονη έκφρασή τους in vivo με πειράματα διαμολύνσεως με πλασμίδια που ελέγχουν την ενεργότητα της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο τους και in vitro σε πυρηνικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα με πειράματα EMSA. Η επίδραση του μεταγραφικού παράγοντα MEF2 στον υποκινητή της IL-10 έγινε μέσω υπερέκφρασης του in vivo σε πειράματα διαμόλυνσης. Η IL-10 ανιχνεύεται 24 ώρες μετά τη διέγερση των κυττάρων, φτάνει στο μέγιστο στις 48 ώρες και μειώνεται μετά τις 72 ώρες. Παρουσία κυκλοσπορίνης η παραγωγή της IL-10 μειώθηκε κατά 80%-100%, ενώ παρουσία ΚΝ-62 η παραγωγή της IL-10 μειώθηκε κατά 70%-90%, σε όλα τα χρονικά διαστήματα στα οποία μελετήθηκε. Τα ποσοστά αναστoλής ήταν ίδια και κατά τους δύο τρόπους διέγερσης. Οταν τα κύτταρα διεγέρθηκαν μέσω TCR και του συνδιεγερτικού μορίου CD28, η αναστολή των παραπάνω ενζύμων δεν επηρεάζει την συσσώρευση του mRNA της IL-10, υποδηλώνοντας ότι η ρύθμιση γίνεται σε μεταγενέστερα της μεταγραφής στάδια, επηρεάζοντας πιθανά τη σταθερότητα του mRNA ή το ρυθμό μετάφρασής του. Όταν ο τρόπος διέγερσης των κυττάρων παρέκαμπτε τον TCR τότε η ελάττωση της παραγωγής της IL-10 αντανακλούσε και σε επίπεδο mRNA. Η ενεργοποίηση του υποκινητή της IL-10 που παρατηρείται μετά από διέγερση με ΙON/PMA και CD3/CD28 αυξήθηκε κατά 5 και 3 φορές αντίστοιχα σε Τ λεμφοκύτταρα τα οποία είχαν διαμολυνθεί με τις ενεργές μορφές των ενζύμων καλσινευρίνη και CaM Kinase II σε σχέση με τα κύτταρα τα οποία είχαν διαμολυνθεί μόνο με το όχημα pSRa. Η δράση της CaM Kinase II είναι εκλεκτική για τον υποκινητή της ΙL-10 εφόσον το ίδιο ένζυμο μειώνει την δραστικότητα του υποκινητή τόσο μιας άλλης Th2 κυτταροκίνης όπως η IL-4 όπως επίσης και της IL-2, ενώ η καλσινευρίνη έχει θετική επίδραση στους υποκινητές και των τριων κυτταροκινών. Το τμήμα του υποκινητή της IL-10 που επηρεάζεται από τα προαναφερθέντα ένζυμα καλσινευρίνη και CaM Kinase II βρίσκεται στις πρώτες 500 bp πριν το TATA box, και περιέχει σημεία πρόσδεσης των μεταγραφικών παραγόντων MEF-2, CREB και NFκΒ όπως ελέγχθηκε με το πρόγραμμα Consite. Η in vitro δραστικότητα του MEF-2 σε πυρηνικά εκχυλίσματα διεγερμένων Τ-λεμφοκυττάρων μειώθηκε κατά 50% παρουσία των αναστολέων της καλσινευρίνης και της CaM Kinase II ενώ η ενεργότητα του αυξήθηκε μετά από υπερέκφραση της CaM Kinase II. Αντίθετα η ενεργότητα τόσο του μεταγραφικού παράγοντα CREB όσο και του NFκB μειώθηκε παρουσία της CaM Kinase II, γεγονός που υποδεικνύει τον MEF2 ως ενδοκυττάριο στόχο της ασβεστιοεξαρτώμενης οδού ενεργοποίησης στη ρύθμιση της παραγωγής της IL-10 από ανθρώπινα T λεμφοκύτταρα. Το γεγονός ότι η υπερέκφραση του MEF2D σε Τ-λεμφοκύτταρα αύξησε την ενεργότητα του υποκινητή της IL-10 αποδεικνύει ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας στη ρύθμιση της παραγωγής της. / Calcium is a second messenger playing a crucial role in the signal transduction which controls the immune response, while IL-10 is considered to be an important regulator of this response. Elevation of intracellular concentration of calcium has been shown to increase IL-10 production. The aim of this study was the elucidation of the role of calcium in IL-10 production by normal T lymphocytes, a mechanism that remains unclear. Fresh Human Τ-lymphocytes derived from PBMC of healthy donors where stimulated with anti-CD3/anti-CD28 or Ionomycin/PMA, in the presence or absence of the specific inhibitors of calcineurin and CaM Kinase II, CsA and KN-62 respectively while there were used plasmids coding the catalytic subunits of calcineurin and CaM Kinase II. The protein product of IL-10 was measured by ELISA, the production of IL-10 mRNA by Real Time PCR. The activity of IL-10 promoter was measured by luciferase reporter assay, after transfection of cells with plasmids carrying the wild type promoter (1327bp) or promoter fragments (constructs of -1010, -500, -310, -235, -135bp).Similarly, we studied the activity of IL-2 and IL-4 promoter The presence of binding sites of transcription factors in the first 500bp of the IL-10 promoter, was validated using the web-based program CONSITE The activity of MEF2 NF-kB and CREB was investigated independently with transfection experiments using plasmids containing the lusiferase reporter under the control of the transcription factors.. Binding of the transcription factor MEF2 was investigated in nuclear extracts of stimulated human T cells with EMSA experiments, whilw his effect on IL-10 promoter was determined through transfecrtion experiments, using a MEF2D plasmid. IL-10 production reaches its peak at 48 hours and it is diminished after 72 hours. We observed a 80-100% reduction of IL-10 production in the presence of CsA and a 70-90% reduction in the presence of KN-62. The inhibition was the same regardless the way of stimulation. When the cells are stimulated through TCR and costimulatory molecule CD28 the inhibition of calcineurin and CaM Kinase II does not affect mRNA accumulation, suggesting that the mechanism of regulation is post-transcriptional, possibly through changes in mRNA stability or through different translation rate, while when cells are Ion/PMA stimulated the reduction of IL-10 protein is also observed at the mRNA level. The induction of IL-10 promoter observed after Ion/PMA stimulation and CD3/CD28 is 3 and 5-fold increased in T cells transfected with the active forms of the enzymes calcineurin and CaM Kinase II. The effect of CaM Kinase II is selective only for the Il-10 promoter, as the same enzyme decreases the activity of IL-2 and IL-4 promoter, while Calcineurin has the same effect on all three promoters. The part of the promoter of IL-10 that shows to be affected by the previously mentioned enzymes is the first 500 bp after the TATA box. This part contains binding sites for the transcription factors MEF-2 and CREB, as validated by the web-based program Consite. The binding of MEF2 to nuclear extracts of stimulated T cells is reduced by 50% in the presence of CsA and KN-62, while his activity is induced in t cells transfected with CaM Kinase II. On the contrary, CREB and NF-kB activities are reduced in the presence of CaM Kinase II, a fact indicating MEF2 as an impotant transcription factor for the regulation of IL-10 production. This is also shovn by the fact that overexpression of MEF2D in T cells increases the activity of IL-10 promoter.

Τα φυσικά φονικά κύτταρα (NK) αποτελούν περίπου το 10% των κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων και παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρώτη γραμμή άμυνας του ανοσοποιητικού συστήματος. Έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν καρκινικά και μολυσμένα κύτταρα, τα οποία μπορούν να θανατώνουν απελευθερώνοντας κυτταροτοξικά κοκκία και κυτταροκίνες. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της έκκριση IFN-γ και TNF-α, από τα περιφερικά μονοπύρηνα (PBMCs) και ΝΚ κύτταρα, έπειτα από διέγερση με Gram θετικά και Gram αρνητικά βακτήρια (αναλογία ΝΚ κύτταρα προς βακτήρια 10:1), παρουσία ή απουσία εξωγενούς IL-2. Μικρή παραγωγή IFN-γ παρατηρήθηκε μόνο στα PBMCs, με μεγαλύτερη συγκέντρωση στις 20 ώρες έπειτα από διέγερση με L.monocytogenes, ενώ δεν παρατηρήθηκε παραγωγή TNF-α. Ο λόγος ΝΚ κύτταρα: βακτήρια (10:1) που χρησιμοποιήθηκε, η έλλειψη βοηθητικών κυττάρων και ο μικρός χρόνος διέγερσης, πιθανώς να ήταν και οι αιτίες που δεν παρήχθησαν καθόλου κυτταροκίνες από τα ΝΚ κύτταρα, ενώ η χαμηλή παραγωγή IFN-γ από τα PBMCs, πιθανώς να οφείλεται, είτε στην παραγωγή IL-10 από τα μακροφάγα είτε στο ότι το ερέθισμα διέγερσης δεν ήταν αρκετό, ώστε να ενεργοποιηθούν πλήρως. Περαιτέρω μελέτες χρειάζονται για την πλήρη κατανόηση της έκκρισης των κυτταροκινών από τα ΝΚ κύτταρα, παρουσία παθογόνων και δυνητικά παθογόνων μικροοργανισμών. / Natural killer (NK) cells comprise about 10% of all circulating lymphocytes and play crucial role to innate immune responses. NK cells can recognize tumor or infected cells and kill them by the release of cytotoxic molecules and cytokines. The aim of the study was to identify IFN-γ and TNF-α production from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and purified ΝΚ cells, after stimulation with Gram positive and Gram negative bacteria (in ratio 10 NK:1 bacteria), in the presence or the absence of exogenous IL-2. Only PBMCs produced IFN-γ, with greater amounts after 20 hours stimulation with L.monocytogenes, while no production of TNF-α was observed. The low ratio, the absence of accessory cells and the short time of stimulation, probably, were responsible for the fact that no cytokine were produced from NK cells, whereas the low production of IFN-γ from PBMCs was, probably, due to the production of IL-10 from macrophages Alternatively, it is possible that the ratio and the time points were not enough for the full stimulation of PBMCs. Additional studies are needed to demonstrate the NK cytokine profile pattern, in the presence of pathogens and potential pathogen microorganisms.

Η παρούσα διατριβή είχε ως στόχο τη μελέτη των Th1 και Th2 τύπου κυτταροκινών σε αυτοάνοσες νόσους και τη διερεύνηση του τρόπου με τον οποίο η έκφρασή τους επηρεάζεται από παράγοντες όπως πεπτιδικά ανάλογα της βασικής πρωτείνης της μυελίνης και ανοσοτροποποιητικοί παράγοντες όπως το μόριο της λεπτίνης. Η μελέτη αυτών των παραγόντων εστιάστηκε στη νόσο της Σκλήρυνσης Κατά Πλάκας, επειδή πρόκειται για οργανοειδικό CD4+ Τ κυτταρομεσολαβούμενο αυτοάνοσο νόσημα με χαρακτηριστικό Th1 κυτταροκινικό προφίλ. Αυτά τα χαρακτηριστικά, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι διαθέτει το καλύτερα μελετημένο αντίστοιχο ζωικό μοντέλο, την Επαγόμενη Αλλεργική Εγκεφαλομυελίτιδα, καθιστούν τη νόσο αυτή ένα ιδανικό πειραματικό σύστημα για την επίτευξη του στόχου της παρούσας εργασίας. / -

Το σύνδρομο Sjögren (ΣΣ) είναι μια αυτοάνοση νόσος που προσβάλλει κυρίως τους σιελογόνους και δακρυϊκούς αδένες οδηγώντας στην ξηρά επιπεφυκίτιδα και την ξηροστομία. Ιστοπαθολογικά χαρακτηρίζεται από λεμφοκυτταρική διήθηση Τ και Β κυττάρων, με επικράτηση των ενεργοποιημένων CD4 + Τ βοηθητικών κυττάρων. Οι ακριβείς παθογενετικοί μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για το ΣΣ δεν είναι ακόμη πλήρως γνωστοί, ωστόσο φαίνεται ότι συμμετέχουν περιβαλλοντικοί, ορμονικοί και γενετικοί παράγοντες. Ακόμη, απορρύθμιση των κυτταροκινών που παράγονται από Th1, Th2 και Th17 κύτταρα εμπλέκονται στην ανάπτυξη του ΣΣ. Σκοπός: Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε την έκκριση κυτταροκινών από υποσύνολα Τ-κυττάρων από το περιφερικό αίμα ασθενών με πρωτοπαθές ΣΣ, χρησιμοποιώντας συνθετικά πεπτίδια τα οποία αντιστοιχούσαν σε επιτόπους Τ-κυττάρων των αυτοαντιγόνων La / SSB. Μέθοδοι: Μονοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) απομονώθηκαν από 23 ασθενείς με πρωτοπαθές σύνδρομο Sjogren (πΣΣ) και 14 από την ομάδα ελέγχου και καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία μιτογόνου διέγερσης (ΡΗΑ) και σε διάφορες συγκεντρώσεις των πεπτιδίων. Τo PBMC υποβλήθηκε σε κυτταρική ανοσοφαινοτύπιση και κυτταρομετρία ροής μετά από επώαση με το πεπτίδιο. ELISA χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, ΤGF-β και IFN-γ σε υπερκείμενα από καλλιέργειες κυττάρων των PBMC ή καθαρές ομάδες κυττάρων. Αποτελέσματα: Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στο περιφερικό αίμα των υγιών είτε παρουσία είτε απουσία PHA ενώ ανεστάλη ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός σε ασθενείς με πΣΣ παρουσία PHA. Το ποσοστό των CD4 + CD25 + Τ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα αυξήθηκε σε ασθενείς με πΣΣ σε σύγκριση με τους υγιείς. Οι IL-4, IL-2, ΙFΝ-γ και IL-5 δεν ανιχνεύθηκαν στα υπερκείμενα των υγιών και ασθενών, είτε τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν μόνα ή υπό την παρουσία των πεπτιδίων. Η L-10 και ο TGF-β, έδειξαν μια διαφοροποίηση στην έκκριση τους σε σχέση με τους υγιείς. Συμπεράσματα: Το αυξημένο ποσοστό των CD4+CD25+ Τ κυττάρων δείχνει την ύπαρξη ανοσορυθμιστικού μηχανισμού που είναι παρόν στο ΣΣ, ενώ η αύξηση της IL-10 μπορεί τελικά να συμβάλλει στην παθογένεια της νόσου. / Sjögren’s syndrome (SS) is a common autoimmune disease mainly of salivary and lachrymal glands, leading το xerostomia and keratoconjunctivitis sicca. Histopathological findings in SS include focal lymphocytic infiltrates that contain T cells and B cells with a predominance of activated CD4+ helper T cells. The exact pathogenetic mechanisms responsible for SS are not yet fully known, however environmental, hormonal and genetic factors may be involved in SS pathogenesis. Dysregulation of several cytokines produced by the infiltrating Th1, Th2 and also Th17 cells have also been implicated in the development and progression of SS. Purpose: In this study, we analyzed the cytokine expression patterns of peripheral blood T-cell subsets in primary SS (pSS) patients using synthetic peptides that map to T-cell epitopes of the La/SSB autoantigen. Methods: Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) were isolated from 23 patients with pSS and 14 controls and were cultured in the presence or absence of mitogenic stimulation (PHA) and various concentrations of the peptides. PBMC were subjected to cell phenotyping and FACS analysis after incubation with peptide. ELISA was used to measure IL-2, IL-4, Il-5, Il-10, TGF-b and IFN-γ cytokine production in culture supernatants from cell culture of PBMC or purified cell groups. Results: No significant difference in cellular proliferation was observed in isolated PBMCs from healthy donors in the presence or absence PHA, whereas an inhibition of cellular proliferation was noticed in the presence of PHA in pSS patients. The percentage of CD4+CD25+ T lymphocytes in peripheral blood (PB) was increased in pSS patients compared with controls. IL-4, IL-2, IFN-γ and IL-5 were not detected in the supernatants of both controls and patients, whether the cells were cultured alone or in the presence of the peptides. IL-10 and TGF-b showed a differentiation in their secretion from controls. Conclusion: The increased percentage of the CD4+CD25+ T cells, shows that an enhanced immunoregulatory mechanism is present in SS and increased production of IL-10 in SS patients may contribute to the pathogenesis of the disease.

Οι ανοσολογικές διαταραχές στην οξεία θρομβοπενική πορφύρα (ΙΘΠ) της παιδικής ηλικίας εξακολουθούν να αποτελούν αντικείμενο μελέτης. Η έκφραση των Th1/Th2 κυτταροκινών έχει μελετηθεί σε αυτοάνοσα νοσήματα και φαίνεται ότι παίζει ανοσορυθμιστικό ρόλο. Έτσι, θεωρήθηκε σκόπιμη η μελέτη της έκφρασης Th1/Th2 κυτταροκινών καθώς και των επιπέδων του TGF-β1 στο πλάσμα σε 18 παιδιά (μέση ηλικία 6,4 χρόνια) με οξεία ΙΘΠ πριν και 24 ώρες μετά τη χορήγηση IVIG, καθώς και μετά από 0,5-5 χρόνια. Οι ασθενείς αυτοί παρουσίαζαν μειωμένο αριθμό CD4 κυττάρων και ανεστραμμένη αναλογία CD4/CD8. Μελετήθηκε η έκφραση των αποπτωτικών γονιδίων Fas και Bcl-2 και παρατηρήθηκε μειωμένη έκφραση του γονιδίου Fas στους ασθενείς, και φυσιολογική έκφραση του Bcl-2. Η θεραπεία με IVIG δε φάνηκε να επηρεάζει αυτές τις παραμέτρους. 12 από τα 18 παιδιά παρουσίαζαν χαμηλή έκφραση Th0/Th1 κυτταροκινών, με ταυτόχρονη έκφραση IL-10, ή δεν εξέφραζαν καμία κυτταροκίνη in vivo. 24 ώρες μετά τη χορήγηση IVIG, 5/12 παιδιά δεν εξέφραζαν καμμία κυτταροκίνη ενώ τα υπόλοιπα έδωσαν είτε ένα Th2, είτε ένα Th0/Th1 πρότυπο. Μελέτες που έγιναν κάποια χρόνια αργότερα έδειξαν ότι αυτά τα 12 παιδιά δεν παρουσίασαν δεύτερο επεισόδιο και in vivo δεν εξέφραζαν καμμία κυτταροκίνη ή μόνο IL-4. Σε 4/18 παιδιά παρατηρήθηκε ένα Th1 ή Th0/Th1 πρότυπο έκφρασης κυτταροκινών και έκφραση IL-10, το οποίο διατηρήθηκε και μετά τη θεραπεία με IVIG. 0,5-5 χρόνια αργότερα παρατηρήθηκε έκφραση Th1 κυτταροκινών και IL-10 και στα 4 παιδιά, τα οποία ανέπτυξαν μία υποτροπιάζουσα μορφή ΙΘΠ με σπάνια επεισόδια επαγόμενα από ιογενείς λοιμώξεις. 2/18 παιδιά παρουσίασαν κατά την εμφάνιση της νόσου ένα καθαρό Th1 πρότυπο, που χαρακτηριζόταν από αυξημένη έκφραση IFN-γ και το οποίο διατηρήθηκε τόσο μετά τη χορήγηση IVIG, όσο και αργότερα και σ’ αυτά η νόσος χαρακτηρίστηκε σαν χρόνια IΘΠ. Τα επίπεδα του TGF-β1 στο πλάσμα των ασθενών ήταν χαμηλά όταν ή νόσος ήταν σε έξαρση και αυξάνονταν όταν ή νόσος ήταν σε ύφεση. Γενικά, φαίνεται ότι μια σταθερή κατάσταση ύφεσης της νόσου σχετίζεται με απουσία έκφρασης κυτταροκινών ή με Τh2 πρότυπο. Έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων AP-1, NFAT και NFκΒ υπήρχε στα Τ κύτταρα των ασθενών κατά την εμφάνιση της νόσου και όχι όταν η νόσος ήταν σε ύφεση, ενώ ο NFAT-S απουσίαζε. / Childhood ITP resolves usually after the rst episode, although it may recur, and in 10-20% of cases develops into a chronic disorder. Evidence of the immunoregulatory role of Th1/Th2 responses in autoimmune diseases, prompted us to perform a prospective study of Th1/Th2 gene expression proles and TGF-β plasma levels in 18 children (median age 6.4 years) with acute ITP, before and after IVIG infusion, and during a follow- up period (0.5-5 years). The patients had a decreased CD4 cell population and an inverted CD4/CD8 ratio. RT-PCR of their Fas and Bcl-2 genes revealed increased Fas activity but normal expression of Bcl-2. IVIG therapy had no effect on these parameters. 12 of 18 patients had either low Th0/Th1+IL-10 or no in vivo cytokine gene expression (0). 24h after IVIG infusion this pattern became 0 or Th2 or remained low Th0/Th1. During follow-up these patients did not relapse and maintained 0 or Th2 pattern without IL-10. Of the remaining 6 patients, 4 presented with a Th1 or Th0/Th1 pattern +IL-10 that persisted after IVIG treatment (though IFN-γ expression diminished) and stabilized to Th1+IL-10 at follow-up, which was marked by infrequent episodes of ITP. Two patients presenting with a strict Th1 pattern characterized by high expression of IFN-γ which remained unchanged after IVIG and at follow-up, can be characterized as chronic ITP. TGF-β plasma levels were low in patients with active disease and increased in remission. Overall, acute ITP presents with Th1, Th0/Th1 or 0 in vivo cytokine gene expression. Stable remission is associated with a 0 or Th2 pattern. A 0 or Th2 pattern after IVIG gave the best prognosis, whereas sustained high expression of IFN-γ and refractoriness to IVIG were the main indicators of poor prognosis. The transcription factors AP-1, NFAT and NFκΒ were studied in 2 patients in acute phase and in remission. They were found to be constitutive in the patients’ ex-vivo and stimulated T cells, but absent from the patients’ ex-vivo T cells in remission, while the NFAT transcriptional silencer was missing.

Η IL-27 είναι μια ετεροδιμερής κυτταροκίνη, που παράγεται κυρίως από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και αποτελείται από τις υπομονάδες p28 και EBI3. Στα κύτταρα-στόχους ενεργοποιεί το μονοπάτι ενδοκυττάριας σηματοδότησης Jak-STAT και έχει τόσο αντι-φλεγμονώδεις όσο και προ-φλεγμονώδεις λειτουργίες. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ως κυριότερη προ-φλεγμονώδης δράση της IL-27 η επαγωγή του αρχικού σταδίου διαφοροποίησης των Th1 λεμφοκυττάρων. Εμείς επιπλεόν διαπιστώσαμε ότι η IL-27 ενισχύει την φλεγμονώδη απόκριση των μονοκυττάρων στους TLR-ligands. Οι αντι-φλεγμονώδεις δράσεις της συνοψίζονται 1) στην αναστολή των Th1, Th2 και Th17 λεμφοκυττάρων και 2) στην παραγωγή IL-10 από τα Τ-λεμφοκύτταρα. Ενώ ο ρόλος της στην πορεία των λοιμώξεων έχει μελετηθεί εκτενώς, ελάχιστα γνωρίζουμε για τις δράσεις της στο πλαίσιο χρόνιων φλεγμονωδών παθήσεων, όπως είναι η Ρευματοειδής Αρθρίτιδα. Στην παρούσα εργασία δείξαμε ότι ο TNF-α προκαλεί την παραγωγή της IL-27 από τα μονοκύτταρα και μακροφάγα, κάτι που ίσως ερμηνεύει την προέλευση της IL-27 που ανιχνεύεται στον αρθρικό υμένα ασθενών με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα. Αποδείξαμε ότι η IL-27 έχει ισχυρές αντι-φλεγμονώδεις δράσεις αποτρέποντας τη φλεγμονώδη ενεργοποίηση των μονοκυττάρων και των μακροφάγων από τις κυτταροκίνες TNF-α και IL-1β. Σε αυτό το πλαίσιο, θεωρούμε ότι η IL-27 ίσως αποτελεί έναν αντιρροπιστικό μηχανισμό, που αποσκοπεί στον περιορισμό της έντασης της φλεγμονής. Επιπλέον βρήκαμε ότι είναι ισχυρός αναστολέας της οστεοκλαστογένεσης ελαττώνοντας την έκφραση των υποδοχέων RANK και TREM-2 στην επιφάνεια των προ-οστεοκλαστών. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγωγής των βιοχημικών σημάτων (MAPK και NFκ-B) και των μεταγραφικών παραγόντων (NFATc1 και c-jun), που είναι αναγκαία για την ευόδωση της οστεοκλαστογένεσης. Τα ευρήματά μας, σε συνδυασμό με τις κατασταλτικές δράσεις της στα Τ-λεμφοκύτταρα, υποδεικνύουν ότι η IL-27 θα μπορούσε ίσως να θεωρηθεί μια ελκυστική θεραπευτική προοπτική σε ασθενείς με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα αφού στοχεύει τόσο στην καταστολή της χρόνιας φλεγμονής όσο και στην αναχαίτιση των οστικών διαβρώσεων. Αυτή όμως η προοπτική προσκρούει πάνω στο γεγονός ότι, όπως διαπιστώσαμε, φλεγμονώδη ερεθίσματα (το αρθρικό υγρό ασθενών με ΡΑ, ο TNF-α και η IL-1β) καθιστούν τα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα ανθεκτικά στις δράσεις της IL-27. Συγκεκριμένα βρήκαμε ότι τα μακροφάγα που προέρχονται από τις φλεγμαίνουσες αρθρώσεις ασθενών δεν απαντούν στην IL-27 και ότι ο TNF-α αναστέλλει την IL-27 μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από την ενεργοποίηση του p38. Επιπλέον αποδείξαμε ότι η IL-1β καθιστά τα κύτταρα ανθεκτικά στην IL-27 μέσω ελάττωσης της έκφρασης του μεμβρανικού υποδοχέα της IL-27. Είναι πολύ πιθανό τέτοιοι μηχανισμοί αντοχής να ενεργοποιούνται και στο φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον του αρθρικού υμένα και να καθιστούν τα κύτταρα ανθεκτικά στην δράση των αντιφλεγμονωδών παραγόντων, που είναι παρόντες στην άρθρωση (όπως IL-27, IL-10 και TGF-β), συμβάλλοντας έτσι στη διαιώνιση της υμενικής φλεγμονής. / IL-27 is a cytokine mainly produced by antigen presenting cells and is comprised of p28 and EBI3 subunits. IL-27 activates the Jak-STAT signaling pathway and has both anti- and pro-inflammatory functions. The main pro-inflammatory function of IL-27 is the initiation of Th1 differntiation. We have also found that IL-27 primes human monocytes for more robust responses to TLR-ligands. The dominant anti-inflammatory functions of IL-27 are: 1) the inhibition of Th1, Th2 and Th17 differentiation and 2) the production of IL-10 by lymphocytes. While the functions of IL-27 in the course of infections are well-known, the potential role of IL-27 in chronic inflammatory diseases, like Rheumatoid Arthritis (RA), is still unclear. In our current study we have found that TNF-α stimulates production of IL-27 from monocytes and macrophages and this is a potential explanation for the reported expression of IL-27 in synovial tissues from patients with RA. We have also found that IL-27 has potent anti-inflammatory functions by inhibiting the effects of TNF-α and IL-1β on human monocytes and macrophages. In this context we hypothesize that IL-27 represents a feed-back inhibition mechanism that aims to restrain inflammation. Additionally, we observed that IL-27 is a potent inhibitor of human osteoclastogenesis by down-regulating the expression of RANK and TREM-2 on osteoclast precursors and abrogating RANKL-mediated activation of MAPK and NFκ-B pathways and induction of NFATc1 and c-jun. Our observations suggest that IL-27, by targeting concurrently inflammation and joint destruction, could be a potential attractive therapeutic strategy for RA. The main limitation for this perspective is that inflammatory stimuli (including synovial fluids derived from RA patients, TNF-α and IL-1β) render monocytes and macrophages refractory to the regulatory functions of IL-27. We have found that: 1) synovial macrophages derived from RA do not respond to IL-27 and 2) TNF-α and IL-1β inhibit IL-27 functions by a p38-dependent mechanism and by down-regulating expression of IL-27 receptor respectively. In rheumatoid arthritis, within the inflammed synovium, p38 is active and the cytokines TNF-α and IL-1β are abundant. In this context, we believe that these inflammatory stimuli render cells refractory to the anti-inflammatory factors that are expressed within the synovial microenvironment (including IL-27, IL-10 and TGF-β), contributing to the perpetuation of joint inflammation.

Η λεπτίνη, μια ορμόνη που ρυθμίζει την όρεξη έχει βρεθεί να ενισxύει την τύπου 1 ανοσολογική απόκριση και να αναστέλλει την παροδική ανοσοπάρεση που παρατηρείται στα ζώα με έλλειψη λεπτίνης ή στους ανθρώπους που υποφέρουν από εγγενή ή φυσιολογική έλλειψη λεπτίνης. Οι ασθενείς που υποφέρουν από β-θαλασσαιμία έχει παρατηρηθεί ότι έχουν έλλειψη λεπτίνης, ένα φαινόμενο που αποδίδεται κυρίως στην υπερφόρτωση με σίδηρο και τις πολλαπλές ενδοκρινοπάθειες που συνοδεύουν αυτή τη νόσο. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να καθοριστούν τα επίπεδα λεπτίνης και φερριτίνης του ορού των ασθενών που υποφέρουν από μείζονα β-θαλασσαιμία και να διερευνηθεί η επίδραση της λεπτίνης στην Th1 (IL-2, IFN-γ ) και Th2 (IL-4, IL-10) έκκριση κυτταροκινών από περιφερικά Τ κύτταρα που απομονώθηκαν από ασθενείς και controls. Τα δείγματα αίματος προήλθαν από143 ασθενείς και 58 υγιείς κατά αντιστοιχία ηλικίας και ΒΜΙ (δείκτη μάζας σώματος). Από όλους τους ασθενείς το μόνο γκρουπ που έδειξε μια ασθενή θετική συσχέτιση μεταξύ ΒΜΙ και λεπτίνης ήταν αυτό των ενήλικων γυναικών που λάμβαναν θεραπεία ορμονικής υποκατάστασης. Μια αρνητική συσχέτιση λεπτίνης και φεριττίνης παρατηρήθηκε σε όλους τους ασθενείς. Η ανασυνδυασμένη λεπτίνη όταν προστέθηκε στα Τ κύτταρα των controls δεν επηρέασε σημαντικά την έκκριση της IFN-, IL-2 ή της IL-4 ενώ μείωσε ελαφρώς την έκκριση της IL-10. Στα Τ-κύτταρα των ασθενών η ανσυνδυασμένη λεπτίνη οδήγησε στην έκκριση μόνο της IFN-γ. Οι ομόζυγοι θαλασσαιμικοί ασθενείς λαμβάνουν πολλαπλές μεταγγίσεις και χρειάζονται μια ισχυρή Th1 ανσολογική απόκριση για να χειριστούν αποτελεσματικά την συνεχή έκθεση σε παθογόνα. Η ικανότητα της λεπτίνης να αλλάζει την έκφραση των κυτταροκινών στους ασθενείς με θαλασσαιμία προς έναν ευνοϊκό γι’ αυτούς τύπου 1 φαινότυπο θα μπορούσε να ληφθεί υπόψη για τον σχεδιασμό νέων θεραπευτικών σχημάτων. / Leptin, a hormone that regulates appetite, has been shown to enhance the type 1 immune response and reverse the partial immunoparesis observed in leptin-deficient animals or humans suffering from congenital or physiological leptin deficiency. Patients suffering from -thalassemia have also been reported to be leptin deficient, a phenomenon attributed mainly to the iron overload and multiple endocrinopathies that accompany this disease. The purpose of our study was to determine the serum leptin and ferritin levels of patients suffering from -thalassemia major and investigate the effect of leptin on Th1 (IL-2, IFN- ) and Th2 (IL-4, IL-10) cytokine secretion patterns of peripheral blood T-cells isolated from thalassemic patients and controls. Blood samples were drawn from 143 patients and 58 age- and Body Mass Index-matched controls. From all the patients, the only group that showed a week positive correlation between BMI and leptin values was this of adult females that were treated with sex hormones. A negative correlation of leptin and ferritin levels was observed in all patients. Recombinant leptin (rleptin) added alone to control T-cells did not significantly influence IFN-, IL-2 or IL-4 production whereas it weakly induced IL-10 secretion. In patients’ T-cells, rleptin induced IFN- secretion only. Homozygous thalassemic patients receive multiple blood transfusions and need a strong Th1 immune response to cope with the resulting exposure to pathogens. Leptin’s ability to skew the cytokine secretion pattern in thalassemic patients towards a beneficial for them Th1 phenotype, could be taken into consideration for the design of new therapeutics.

Από την δεκαετία του '70 είναι γνωστό ότι οι αλλογενείς μεταγγίσεις αίματος (ABT) προκαλούν ανοσοκαταστολή, ωστόσο, μετά το 1990 έγινε γνωστό ότι για το φαινόμενο αυτό ευθύνεται ο Τ λεμφοκυτταρικός πληθυσμός των ρυθμιστικών κυττάρων (Tregs). Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η επίδραση της μετάγγισης σε ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε ολική ή μερική αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου, στον πληθυσμό των φυσικών (nTreg) και επαγώγιμων (iTreg) Τ ρυθμιστικών κυττάρων. Στους ίδιους ασθενείς μελετήθηκε και η αλλαγή προτύπου στην έκκριση των κυτταροκινών. Συλλέχθηκαν δείγματα ολικού αίματος από 46 ασθενείς, 7 άντρες και 39 γυναίκες. Από αυτούς, οι 36 ασθενείς έλαβαν μετάγγιση (Group1) ενώ οι 10, δεν έλαβαν. Η συλλογή των δειγμάτων έγινε πριν την εγχείρηση (BS), αμέσως μετά το χειρουργείο (Day0), μια εβδομάδα μετά (Day7), ένα μήνα μετά (1month) και κατά τον επανέλεγχο των ασθενών (>3months). Στα δείγματα έγινε απομόνωση των PBMC και καθορίστηκε το ποσοστό των CD4+CD25+Foxp3+ και CD4+CD25high/+CD127low/- Tregs με την μέθοδο FACS ενώ στο πλάσμα καθορίστηκαν τα επίπεδα των κυτταροκινών με τις μεθόδους Cytometric Bead Array (CBA) και ELISA. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η λειτουργικότητας των Treg από δείγμα αίματος ασθενών μέσα στην πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο. Καλλιεργήθηκαν διάφοροι λόγοι Tregs: Teff για 72 ώρες, παρουσία PHA και CFSE. Με την μέθοδο Cytometric Bead Array (CBA) καθορίστηκαν τα επίπεδα των κυτταροκινών IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ ενώ με την μέθοδο της ELISA καθορίστηκαν τα επίπεδα των TNF-α και των υποδοχέων TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) καθώς επίσης και οι TGF-β1 και TGF-β2. Από τα πειράματα προέκυψε ότι οι πληθυσμοί τόσο των φυσικών CD4+CD25+Foxp3+ όσο και των επαγώγιμων CD4+CD25high/+CD127low/- Tregs, αυξάνονται μετά το χειρουργείο (day 0), μετά την μετάγγιση, ενώ μειώνονται την πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο. Αντίθετα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στους ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργείο αλλά δεν μεταγγίστηκαν. Με τα πειράματα λειτουργικότητας, φάνηκε ότι τα Tregs ήταν λειτουργικά και ικανά να προκαλούν αναστολή του πολλαπλασιασμού των Teff. Σχεδόν όλες οι κυτταροκίνες που αναλύθηκαν, οι IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ, ο υποδοχέας TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) και TGF-β2 εμφάνισαν αύξηση μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση. Ωστόσο, μόνο η αύξηση της IL-6, και των υποδοχέων TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) ήταν στατιστικώς σημαντική μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση. Τα επίπεδα του TGF-β1 μειώθηκαν μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση (Th3 απόκριση). Συμπερασματικά, τα ποσοστά των Tregs αυξήθηκαν στους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε αρθροπλαστική και μεταγγίστηκαν. Οι πληθυσμοί των Tregs παρέμειναν αυξημένοι μέχρι και τον πρώτο μήνα μετά το χειρουργείο. Τα Tregs είναι λειτουργικά και ικανά να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Teff, παρουσία PHA. Μετά το χειρουργείο, ύστερα από μετάγγιση, τα επίπεδα των IL-6, TNF-RI και TNF-RII αυξάνονται ως αντίδραση κατά του μοσχεύματος. Μετά την εγχείρηση (day 0) και μετά από μετάγγιση, οι ασθενείς αναπτύσσουν Th1 απόκριση και πολλαπλασιασμό των Tregs. Σταδιακά, τα Tregs καταστέλλουν τις προφλεγμονώδης αποκρίσεις μέχρι να επανέλθει η ισορροπία των ληπτών μετά την εγχείρηση. / Clinical and experimental studies have established that allogeneic blood transfusion (ABT) can cause immunosuppression. In this work we determined whether and to which extend Tregs contribute to this effect. Material and methods: Heparinized peripheral blood samples were collected from 46 patients (7 male and 39 female, age 28-88 years) that underwent joint replacement surgery. The samples were collected immediately before surgery (BS) and after surgery (AS) on days 0, 7, 1 month, and 3 months to 1 year. Thirty six patients received ABT and 10 did not. PBMC were isolated and the numbers and % of CD4+CD25+Foxp3+ Tregs and CD4+CD25high/+CD127low/- Tregs were determined by FACS. Tregs and T effectors (Teff) were isolated from patients on days 0-7 and Treg functional assays were performed by culturing Tregs with PHA-stimulated Teff at different ratios for 72h with CFSE, and analyzed by FACS. Cytokine serum level determined with Cytometric Bead Array (CBA) for IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ and ELISA for TNF-α, the receptor TNF-RI(p55/p60) and II(p75/p80), TGF-β1 and β2. Results: Both, natural (CD4+CD25+Foxp3+) and inducible (CD4+CD25high/+CD127low/-) Tregs increased in day 0 and decreased in day 7 until BS levels, after ABT. Opposite results (small reduction) observed in patients without ABT. With functional assays proved that Tregs are functional and suppress the T-cell proliferation. IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ, the receptor TNF-RI(p55/p60) and II(p75/p80), TGF-β1 and β2 increased after the surgery, after ABT. IL-6, TNF-RI(p55/p60) and II(p75/p80) levels increased with SSD after the surgery, after ABT. TGF-β1 levels decreased in day 0 until BS levels (Th3 response). Th3 cells growth from CD4+CD25- FoxP3- Th0 peripheral cells. Th3 prevents maturation of DCs, Th2 T-cells. Induce the TGF-β secretion and inhibit IL-2 and antibodies secretion. Conclusion: In patients underwent scheduled joint replacement surgery, Tregs increased after ABT until 1 month and are functional and suppress Teff proliferation under PHA condition. IL-6, TNF-RI and TNF-RII are activation markers of immune system and suppressed after ABT. In day 0, IL-6, TNF-RI and II levels increased as a reaction graft against host’s antigen. After surgery (day 0), patients develop Th1 response and Tregs proliferation, after ABT. Gradually, Tregs suppress the proinflammatory responses until the balance in the recipient, after the surgery.

Η ΙgΑ νεφροπάθεια αποτελεί την πιο συχνή μορφή πρωτοπαθούς σπειραματονεφρίτιδας η οποία αντιμετωπίζεται με την εφαρμογή διαφόρων θεραπευτικών σχημάτων. Στο πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα θεραπευτικών σχημάτων που χορηγήθηκαν με βάση τα κλινικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών με ΙgΑ νεφροπάθεια για περίοδο παρακολούθησης 5 ετών. Στη μελέτη συμπεριελήφθησαν 50 ασθενείς, οι οποίοι χωρίστηκαν σε 4 ομάδες. Ασθενείς με φυσιολογική νεφρική λειτουργία και πρωτεϊνουρία <1,0 g/24h δεν έλαβαν ειδική αγωγή (Ομάδα Α, n=6). Ασθενείς με φυσιολογική νεφρική λειτουργία, πρωτεϊνουρία >1,0 g/24h και με ήπια έως μέτρια μεσαγγειακή υπερπλασία και διαμεσοσωληναριακή συμμετοχή αντιμετωπίστηκαν με αγωγή που περιελάμβανε α-ΜΕΑ και κορτικοστεροειδή (Ομάδα Β, n=23). Ασθενείς με αρχική κρεατινίνη ορού Scr<2,5 mg/dL, πρωτεϊνουρία >3,5 g/24h και/ή μέτριες έως σοβαρές ιστολογικές αλλοιώσεις αντιμετωπίστηκαν με συνδυασμό α-ΜΕΑ, κορτικοστεροειδών και άλλων ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων (Ομάδα Γ, n=18). Ασθενείς με αρχική τιμή Scr >2,5 mg/dL, με παρουσία σοβαρής σπειραματοσκλήρυνσης και διαμεσοσωληναριακής βλάβης αντιμετωπίστηκαν μόνο με α-ΜΕΑ και ιχθυέλαια (Ομάδα Δ, n=3). Από τους 50 ασθενείς, οι 9 (18%) παρουσίασαν διπλασιασμό της αρχικής κρεατινίνης ορού, 2 από την ομάδα Β (8,7%), 5 από την ομάδα Γ (27,7%) και 2 από την ομάδα Δ (66,7%). Από τους 7 ασθενείς που εμφάνισαν νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου, ένας ήταν από την ομάδα Β (4,3%), 4 από την ομάδα Γ (22%) και 2 από την ομάδα Δ (66,7%). Ύφεση της πρωτεϊνουρίας παρατηρήθηκε σε όλους τους ασθενείς της ομάδας Β και σε 15 ασθενείς της ομάδας Γ (83,3%). Παρενέργειες παρατηρήθηκαν σε 3 (7,3%) ασθενείς που έλαβαν ανοσοκατασταλτική αγωγή. Σε ασθενείς με IgA νεφροπάθεια η χορήγηση εξατομικευμένου θεραπευτικού σχήματος που βασίζεται στα κλινικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά ενός εκάστου των ασθενών φαίνεται ότι μπορεί να οδηγήσει στην επίτευξη του μέγιστου θεραπευτικού αποτελέσματος με τον ελάχιστο κίνδυνο ανεπιθύμητων ενεργειών. Στο δεύτερο σκέλος μελετήθηκαν δυνητικά πρώιμοι δείκτες εξέλιξης της νεφρικής βλάβης τόσο στον νεφρικό ιστό, όσο και σε ούρα ασθενών. Μελέτες στο γονιδίωμα και το πρωτέωμα υποδηλώνουν ότι η τρανσγελίνη πιθανόν εμπλέκεται στην νεφρική βλάβη μέσω ενεργοποίησης των μυοϊνοβλαστών. Σε τομές νεφρικού ιστού 67 ασθενών έγινε ανίχνευση με ανοσοϊστοχημική μέθοδο και ανοσοφθορισμό και ποσοτική εκτίμηση της παρουσίας αφενός μεν της τρανσγελίνης αφετέρου της α-ακτίνης των λείων μυϊκών ινών (α-SMA), γνωστού δείκτη ενεργοποίησης των μυοϊνοβλαστών στο νεφρικό ιστό. Έκφραση της τρανσγελίνης και της α-SMA εντοπίστηκαν στα σπειράματα και στο διάμεσο χώρο. Σε ασθενείς με IgA νεφροπάθεια και εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρυνση η έκφραση της τρανσγελίνης ήταν εντονότερη από αυτήν της α-SMA. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της τρανσγελίνης σχετιζόταν με το βαθμό σπειραματικής σκλήρυνσης (p=0,035) και ίνωσης του διάμεσου χώρου (p=0,047), με το βαθμό μεσαγγειακής υπερπλασίας (p=0,034), με την ύφεση της λευκωματουρίας (p=0,041) και την έκβαση της νεφρικής λειτουργίας (p=0,009). Η μελέτη συνεντοπισμού των τρανσγελίνης και α-SMA στο νεφρικό ιστό έδειξε ότι σε κάποιες περιοχές οι δύο πρωτεΐνες εκφράζονταν ταυτόχρονα και σε άλλες περιοχές κάθε πρωτεΐνη εκφραζόταν χωριστά. Έντονη παρουσία της τρανσγελίνης παρατηρήθηκε στο νεφρικό ιστό ασθενών με διάφορους τύπους σπειραματονεφριτίδων. Η παρουσία μυοϊνοβλαστών που παράγουν τρανσγελίνη ή α-SMA ή και τις δύο πρωτεΐνες μαζί, υποδηλώνει την πιθανή παρουσία διαφορετικών υποπληθυσμών μυοϊνοβλαστών στο νεφρικό ιστό ασθενών με διάφορους τύπους σπειραματονεφριτίδων. Επιπλέον, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα απέκκρισης προφλεγμονωδών (IL-2, IL-17, TNF-α, INF-γ, IL-6) και αντιφλεγμονωδών (IL-4, IL-10, TGF-β1) κυτταροκινών καθώς και της χημειοκίνης MCP-1 σε ούρα ασθενών με IgA νεφροπάθεια και συγκρίθηκαν με αυτά υγειών εθελοντών δοτών καθώς και ασθενών με διαφόρους τύπους σπειραματο-νεφρίτιδας που βρίσκονταν σε κλινική ύφεση της νόσου. Μελετήθηκαν 97 ασθενείς με πρωτοπαθή σπειραματονεφρίτιδα και όλοι ήταν σε κλινική ύφεση μετά από ανοσοκατασταλτική αγωγή. Από τους 97 ασθενείς, οι 31 είχαν IgA νεφροπάθεια (IgAΝ), οι 36 μεμβρανώδη (MN) και οι 30 νόσο ελαχίστων αλλοιώσεων ή εστιακή τμηματική σπειραματοσκληρυνση (MC/FSGS). Τα επίπεδα των Th-κυτταροκινών και της MCP-1 μετρήθηκαν σε τυχαίο δείγμα ούρων και συγκρίθηκαν με τα επίπεδα 17 υγειών εθελοντών δοτών. Οι ασθενείς με σπειραματονεφρίτιδα, σε σύγκριση με τους υγιείς, είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα απέκκρισης σε όλες τις κυτταροκίνες που μελετήθηκαν, εκτός από την IL-4 και τον TNF-α. Στην ομάδα των ασθενών διαπιστώθηκε ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του TGF- β1 και της MCP-1 (p=0,000, r=0,721). Σε ασθενείς με IgAΝ εντοπίστηκαν σημαντικές διαφορές στην απέκκριση των IL-2 (p=0,0345), IL-17A (p=0,005), TNF-α (p=0,0098), TGF-β1 (p=0,0092) και MCP-1 (p=0,0301) σε σύγκριση με ασθενείς με MN και στην απέκκριση της IL-2 σε σχέση με ασθενείς με MC/FSGS (p=0,0018). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει τη συνεχιζόμενη παρουσία φλεγμονώδους διαδικασίας στο νεφρικό ιστό των ασθενών με διαφόρους τύπους σπειραματονεφριτίδων ακόμα και μετά την επίτευξη ύφεσης. Η διαφορετική έκφραση των Th κυτταροκινών μεταξύ των διαφόρων τύπων σπειραματονεφριτίδων μπορεί να αντανακλά ειδικούς δείκτες εξέλιξης της νεφρικής βλάβης αλλά αυτό απαιτεί περαιτέρω μελέτη. Η συνύπαρξη τόσο της Th1/Th17 όσο και της Th2 απόκρισης ενδεχομένως υποδηλώνει την πιθανή ύπαρξη ενός ανοσορυθμιστικού μηχανισμού που στοχεύει στην ανοσολογική ομοιόσταση του νεφρικού ιστού, ο οποίος χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. / IgA nephropathy represents a common glomerular disease treated by various therapeutic regimens. In the first part of the current thesis, the effect of different therapeutic regimens based on the severity of clinical and histological involvement, in the clinical outcome of patients with IgA nephropathy over a follow-up period of 5 years was estimated. Fifty patients were included in the study and were divided in four groups. Patients with normal renal function and proteinuria <1g/24h received no treatment (Group A, n=6). Patients with normal renal function, proteinuria >1g/24h and mild to moderate histological lesions received angiotensin converting enzyme inhibitors (ACEi) and corticosteroids (Group B, n=23). Patients with baseline serum creatinine (Scr) <2.5mg/dl, proteinuria >3.5g/24h and severe histological lesions received ACEi, corticosteroids and other immunosuppressive drugs (Group C, n=18). Patients with Scr >2.5mg/dl, glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis received ACEi and fish oil (Group D, n=3). Doubling of baseline Scr was observed in 9 of 50 patients (18%), 2 from group B (8.7%), 5 from group C (27.7%) and 2 from group D (66.7%). Out of 7 (14%) who reached ESRD, 1was from group B (4.3%), 4 from group C (22%) and 2 from group D (66.7%). Reduction of proteinuria was observed in all patients from group B and in 15 from group C (83.3%). Adverse reactions occurred in 3 (7.3%) patients treated with immunosupressive drugs. The choice of therapeutic regimen used in the treatment of patients with IgA nephropathy could be based on the severity of clinical and histological involvement in order to achieve the maximun effect with less adverse reactions. In the second part potential early markers for progression of renal injury in both kidney tissue and urine of patients were studied. Genomic and proteomic studies suggest that transgelin represents a protein that may be involved in renal injury. Transgelin was identified in biopsy sections of 67 patients by immunohistochemistry and immunofluorescence. Its distribution was compared to that of α-smooth muscle actin (α-SMA), a marker of myofibroblast activation in the kidney. Transgelin and α-SMA expression was identified within glomeruli and interstitium. In patients with IgA nephropathy and focal segmental glomerulosclerosis, glomerular expression of transgelin was higher than that of α-SMA. The extent of transgelin immunostaining was related to mesangial proliferation (p=0.034), glomerular sclerosis (p=0.035), interstitial fibrosis (p=0.047) and to the clinical course (p=0.009). Colocalization studies showed that in some areas of kidney tissue both proteins were expressed with comparable intensity, whereas in other areas expression of either transgelin or α-SMA was predominant. Strong transgelin expression was observed in renal tissue of patients with glomerulonephritis. The observed differences in the pattern of transgelin and α-SMA expression suggest that either different subpopulation of myofibroblasts exist, or that these proteins are activated at different stages of renal injury/scarring. Moreover, the levels of pro-inflammatory (IL-2, IL-17, TNF-α, INF-γ, IL-6) and anti-inflammatory (IL-4, IL-10, TGF-β1) cytokines as well as chemokine MCP-1 excretion in the urine of patients with IgA nephropathy were measured and compared with those of healthy individuals and patients with various types of glomerulonephritis after clinical remission of the disease. Ninety seven patients with primary glomerulonephritis were studied. All patients were in clinical remission following immunosuppressive treatment. The original diagnoses were IgA nephropathy (IgAN) in 31, membranous nephropathy (MN) in 36, and minimal changes disease or focal segmental glomerulosclerosis (MC/FSGS) in 30 out of 97 patients. Th- cytokine and MCP-1 levels were measured in a random urine sample and compared to those of 17 healthy individuals. Subgroup analysis of various types of GN was also performed. Patients with glomerulonephritides had significantly higher urinary levels of all tested cytokines, apart from IL-4 and TNF-α, in comparison to healthy individuals. A strong positive correlation of TGF- β1 concentration in the urine with that of MCP-1 was noted in patients with various glomerulonephritides (p=0.000, r=0.721). Subgroup analysis showed statistically significant differences in the concentration of IL-2 (p=0.0345), IL-17A (p=0.005), TNF-α (p=0.0098), TGF-β1 (p=0.0092) and MCP-1 (p=0.0301) between patients with IgAN and MN. Furthermore, a significant difference was observed in the urinary levels of IL-2 between patients with IgAN and those with MC/FSGS (p=0.0018). Th-cytokines and MCP-1 urinary levels of IgAN patients in clinical remission showed an ongoing inflammation of renal tissue. The different concentration of Th cytokines in various types of GN, may represent specific markers of disease activity but this needs to be further investigated. The coexistence of Th1/Th17 and Th2 immune responses may suggest the presence of an immunoregulatory mechanism that triggers renal immune homeostasis.

Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα αποτελούν ετερογενή ομάδα νοσημάτων, με δυσμενή πρόγνωση και δυσκολία θεραπευτικής προσέγγισης. Η κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών που διέπουν την παθολογική αιμοποίηση που παρατηρείται στα σύνδρομα αυτά in vitro και in vivo, μπορεί να βοηθήσει στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπισή τους. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η μελέτη της αιμοποίησης των ΜΔΣ με τη μέθοδο των καλλιεργειών αιμοποιητικών κυττάρων μακράς διάρκειας και η επίδραση διαφόρων παραγόντων στην in vitro αιμοποίηση, με στόχο την αναγωγή των ευρημάτων και στην in vivo διαδικασία. Οι καλλιέργειες βραχείας διάρκειας ανέδειξαν την αδυναμία των προγονικών κυττάρων των ασθενών να δημιουργήσουν φυσιολογικές αποικίες. Η προσθήκη μίγματος αυξητικών παραγόντων στο καλλιεργητικό υλικό είχε θετική επίδραση στην πλειοψηφία των περιπτώσεων. Με μακράς διάρκειας καλλιέργειες συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα των ΜΔΣ με αυτά φυσιολογικών μαρτύρων και των υποκατηγοριών ΜΔΣ μεταξύ τους. Αξιολογήθηκαν η έκταση του στρώματος, η διάρκεια ζωής, η εβδομαδιαία και η συνολική κυτταρική απόδοση. Σε όλες τις περιπτώσεις η ανάπτυξη υπολειπόταν ποιοτικά και ποσοτικά στους ασθενείς, σε σχέση με τους μάρτυρες. Η προσθήκη παραγόντων στο καλλιεργητικό υλικό αποσκοπούσε στη βελτίωση των παραμέτρων που προαναφέρθηκαν. Η IFN-α, η βιταμίνη D3, η Ara-c και ο συνδυασμός της με IFN-α δεν βελτίωσαν τα αποτελέσματα. Η προσθήκη IL-3 είχε ευοδωτική επίδραση κυρίως στις κυτταρικές αποδόσεις. Η IL-6 είχε επίσης ευοδωτική δράση, κυρίως στον σχηματισμό στρώματος. Ο συνδυασμός IL-3+IL-6 απέβη ο πιο σημαντικός τροποποιητής της συμπεριφοράς των καλλιεργειών των ασθενών με ΜΔΣ ευοδώνοντας όλες τις παραμέτρους και προκάλεσε διαφορές πολύ σημαντικές σε σχέση με την control καλλιέργεια. Αναδείχθησαν λοιπόν ευρήματα συνέργειας των δύο ιντερλευκινών, σε όλες τις άλλες παραμέτρους αξιολόγησης των καλλιεργειών μακράς διάρκειας. Με βάση τον τρόπο ανάπτυξης και την συμπεριφορά των κυττάρων των ασθενών με ΜΔΣ στην προσθήκη των κυτταροκινών, διακρίθηκαν δύο μοντέλα in vitro ανάπτυξης της καλλιεργειών: Το δυσπλαστικό και το λευχαιμικό. Συμπερασματικά οι μακράς διάρκειας καλλιέργειες στους ασθενείς με ΜΔΣ αποτελούν χρήσιμη προγνωστική μέθοδο και μπορούν να διακρίνουν τους ασθενείς που θα εξελιχθούν ταχέως, από εκείνους που θα έχουν χρονιότερη και ηπιότερη πορεία. Συνδυασμός κυτταροκινών και άλλων παραγόντων μπορεί να βελτιώσει την προβληματική-παθολογική in vitro αιμοποίηση των προγονικών κυττάρων των ασθενών με ΜΔΣ. / Myelodysplastic syndromes comprise a heterogeneous group of hematopoietic stem-cell disorders, with dismal prognosis and difficulty in their therapeutic approach. The revealing of the underlying pathogenetic mechanisms, implicated in the impaired hematopoiesis of these syndromes, is crucial for the development a more comprehensive and effective treatment approaches. The aim of this thesis was the study of hematopoiesis of MDS, by using long term cultures of hemopoietic cells and the investigation of the influence of various exogenous modulating factors-drugs in vitro, in an effort to obtain results, which could direct their use in vivo. Short term cultures revealed the disability of the progenitor cells of patients to form normal colonies. The addition of a mixture of growth factors in the conditioned medium had a positive influence in the majority of cases. By using long term cultures we compared the results obtained from patients with MDS, with those from normal controls, and between the different MDS subgroups For this comparison we used: the extent of the area of the stroma-layer formed, the longevity of the culture, the weekly cell production and the total cell yield of each culture. In all cases the development of cultures derived from patients was inferior to those of controls. The addition of modulating factors to the culture medium was aimed to improve the above parameters. IFN-α, vitamin D3, Ara-c and the combination of IFN-α and Ara-c did not improve any of the culture’s parameter. The addition of IL-3 had a clearly favorable effect mainly to the weekly and the total cell yield. Interleukin-6 had similarly a favourable effect, particularly promi-nent in the stroma-cell formation. The combination of IL-3 plus IL-6 was proved as the most important favourable modulator of the MDS cultures. It improved all culture parameters and produced statistically significant differences in comparison to the control cultures. According to the developmental model obtained by the long-term culture the dysplastic and the leukemic pattern of in vitro growth could be distinguished. In conclusion, long term cultures of hematopoietic cells of MDS patients represent a useful prognostic tool and can distinguish patients who will more rapidly evolve to leukemia from those who will have a more prolonged and stable clinical course. The use of a combination of cytokines and might have a favourable effect on in vitro hematopoiesis of the progenitor cells of MDS patients.