Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι τα Τ ρυθμιστικά κύτταρα (Tregs), προάγουν την ανοσολογική ανοχή στην μεταμόσχευση. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστούν τα επίπεδα των Τregs σε 39 ασθενείς, οι οποίοι είχαν υποβληθεί σε μεταμόσχευση νεφρού και ήταν σε σταθερή κατάσταση, και να καθοριστούν οι αριθμητικές αναλογίες των Τregs πληθυσμών, όπως και η δράση των ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων σ’ αυτούς τους κυτταρικούς πληθυσμούς. Όλοι οι ασθενείς (19 ασθενείς είχαν καλή νεφρική λειτουργία, ενώ 20 ασθενείς είχαν χρόνια νεφροπάθεια του μοσχεύματος), είχαν λάβει ως θεραπεία επαγωγής basiliximab και ήταν σε τριπλό ανοσοκατασταλτικό σχήμα με αναστολείς της καλσινευρίνης (κυκλοσπορίνη ή tacrolimus), μουκοφαινολικό οξύ (MMF) ή everolimus και στεροειδή. Ως ομάδα ελέγχου μελετήθηκαν 20 υγιείς εθελοντές. Δείγματα από αίμα σημάνθηκαν με αντι-CD4, CD25, CD127 και foxp3 αντισώματα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, με σκοπό να καθοριστούν τα επίπεδα των CD4+CD25+Foxp3± και CD4CD25highCD127-/low Treg. Όλοι οι ασθενείς είχαν στατιστικά σημαντικά μειωμένα επίπεδα CD4+CD25highFoxP3± , άλλα όχι όμως και CD4+CD25highCD127-/low Treg, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η νεφρική λειτουργία των μοσχευμάτων δεν συσχετιζόταν με τα επίπεδα των Τregs. Ανευρέθει σημαντική στατιστική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων CD4+CD25highFoxp3+ Tregs και των επιπέδων του tacrolimus, όπως επίσης και των CD4+CD25highFoxp3- Tregs με τα HLA-DR μη συμφωνούντα (mismatching) αλλοαντιγόνα. Οι ασθενείς οι οποίοι ελάμβαναν MMF είχαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα επίπεδα CD4+CD25highFoxp3+ Tregs σε σύγκριση με τους ασθενείς οι οποίοι ελάμβαναν everolimus, παρά το γεγονός ότι οι ασθενείς της ομάδας του everolimus ελάμβαναν και χαμηλότερες δόσεις αναστολέων της καλσινευρίνης. Συμπερασματικά, τα ανοσοκατασταλτικά φάρμακα μειώνουν στατιστικά σημαντικά τα επίπεδα των CD4+CD25highFoxP3± Treg στην περιφέρεια στους ασθενείς πού έχουν υποβληθεί σε νεφρική μεταμόσχευση. Επιπλέον, τα διάφορα ανοσοκατασταλτικά φάρμακα έχουν διαφορετική επίδραση στα CD4+CD25highFoxP3+ Tregs, και το γεγονός αυτό θα μπορούσε να επηρεάσει την μακροχρόνια επιβίωση των άλλο-μοσχευμάτων. / Recent studies indicate that regulatory T-cells (Tregs) promote transplant tolerance. We studied Tregs levels in 39 stable renal transplant recipients, to determine the sizes of Tregs populations and the effects of treatment regimens thereof. All patients (19 with good graft function and 20 with chronic allograft nephropathy) had received induction therapy (basiliximab) and were on triple immunosuppressive regimens with calcineurin inhibitors (cyclosporine or tacrolimus), mycophenolate mofetil (MMF) or everolimus and steroids. Twenty healthy subjects served as controls. Whole blood samples were stained with anti-CD4, CD25, CD127, and FoxP3 antibodies and analyzed by flow cytometry to determine CD4+CD25highFoxP3± and CD4+CD25highCD127-/low Tregs levels. All patients had significantly reduced CD4+CD25highFoxP3± but no CD4+CD25highCD127-/low Tregs levels compared to controls. Renal allograft function did not correlate with Tregs levels. Statistically significant correlations between CD4+CD25highFoxp3+ Tregs and tacrolimus levels and CD4+CD25highFoxp3- Tregs and HLA-DR mismatching were detected. Patients receiving MMF had significantly higher CD4+CD25highFoxp3+ Tregs compared to patients on everolimus who were also receiving lower doses of calcineurin inhibitors. Overall, immunosuppression lowers CD4+CD25highFoxP3± Tregs levels significantly in the periphery in renal transplant recipients. In addition, different immunosuppressive regimens have different impact on CD4+CD25highFoxP3+ Tregs, a fact that may influence long-term allograft survival.

Η παρούσα διδακτορική εργασία αφορά στο σχεδιασμό και εφαρμογή ελέγχου σε κατανεμημένη παραγωγή ηλεκτρικής ενέργειας ώστε να είναι δυνατή η ένταξή της σε μικροδίκτυα στο δίκτυο χαμηλής τάσης. O σχεδιασμός του ελέγχου αποσκοπεί: 1) Στην δυνατότητα σύνδεσης-αποσύνδεσης (Plug and play) της κατανεμημένης παραγωγής στο μικροδίκτυο χωρίς καμμία ιδιαίτερη παρέμβαση από κεντρικό έλεγχο. 2) Η κατανεμημένη παραγωγή, που περιλαμβάνει συστοιχία κυττάρων καυσίμου και ανεμογεννήτρια, πρέπει να παρέχει στήριξη ενεργού και άεργου ισχύος στο μικροδίκτυο διανομής όταν συμβαίνουν διαταραχές φορτίου. 3) Να τροφοδοτεί όλο το φορτίο σε κατάσταση νησιδοποίησης, στην οποία θα μπορεί να μεταβαίνει είτε λόγω σφάλματος στην μέση τάση είτε γιατί το μικροδίκτυο είναι επιθυμητό να λειτουργεί εσκεμμένα στην προαναφερθείσα κατάσταση. 4) Η μετάβαση από τη διασυνδεδεμένη κατάσταση του μικροδικτύου στη νησιδοποίηση και αντίστροφα να γίνεται με τον ομαλότερο δυνατό τρόπο. Λόγω της έντονης μη γραμμικότητας των υπό μελέτη συστημάτων, στο σχεδιασμό των συστημάτων ελέγχου εφαρμόζεται ασαφής λογική. Τα αποτελέσματα της έρευνας αφορούν τόσο τον θεωρητικό σχεδιασμό των παραπάνω συστημάτων με την βοήθεια προγράμματος εξομοίωσης (Matlab/Simulink) όσο και την πειραματική επιβεβαίωση των συμπερασμάτων στο εργαστήριο. Αρχικά, εξομοιώνεται μια συστοιχία κυττάρων καυσίμου συνδυασμένη με μια μπαταρία (υβριδικό σύστημα) και ενσωματώνεται σε ένα ασθενές δίκτυο διανομής. Ο έλεγχος δοκιμάζεται για τοπικές μεταβολές φορτίου και για μετάβαση από την διασυνδεδεμένη σε νησιδοποιημένη κατάσταση προκειμένου να διαπιστωθούν τα επιθυμητά χαρακτηριστικά του ελέγχου που αναφέρθηκαν. Επιπλέον, γίνεται μια διερεύνηση για το εύρος της αποτελεσματικότητας του ελέγχου για διαφορετικού τύπου γραμμών διανομής. Η συμπεριφορά του ελέγχου κρίνεται ικανοποιητική σε όλες τις περιπτώσεις. Στην συνέχεια, το ίδιο υβριδικό σύστημα (μεγαλύτερης όμως ισχύος) και μια ανεμογεννήτρια με γεννήτρια διπλής τροφοδότησης ενσωματώνονται σε ένα μικροδίκτυο που συνδέεται σε ασθενές δίκτυο διανομής στο πρόγραμμα εξομοίωσης. Ο έλεγχος του υβριδικού συστήματος δεν αλλάζει λόγω της ευελιξίας της ασαφούς λογικής. Ο έλεγχος των μικροπηγών δοκιμάζεται για τοπικές μεταβολές φορτίου και για μετάβαση από την διασυνδεδεμένη σε νησιδοποιημένη κατάσταση και αντιστρόφως για μετάβαση από νησιδοποιημένη σε διασυνδεδεμένη κατάσταση. Επιπλέον, γίνεται μια διερεύνηση της δυναμικής απόκρισης του μικροδικτύου κατά την ύπαρξη μπαταρίας και κατά την απομάκρυνσή της από το μικροδίκτυο. Η συμπεριφορά του ελέγχου κρίνεται ικανοποιητική σε όλες τις περιπτώσεις. Για την πειραματική επιβεβαίωση, αξιοποιείται ένα σύστημα συστοιχίας κυττάρων καυσίμου (Ballard& Nexa System) συνδυασμένο με μια μπαταρία στο χώρο του εργαστηρίου. Εφαρμόζεται η τεχνολογία ψηφιακού ελέγχου σήματος μέσω ενός ψηφιακού επεξεργαστή σήματος (DSP). Έτσι, δίνεται η δυνατότητα σε τμήματα του ελέγχου που έχουν ήδη σχεδιαστεί να μεταφέρονται μέσω ειδικού λογισμικού στον επεξεργαστή και να ενσωματώνονται στην κατανεμημένη παραγωγή με ελάχιστο κόστος. Το πραγματικό σύστημα που δημιουργείται δοκιμάζεται για τοπικές μεταβολές φορτίου. Η συμπεριφορά του ελέγχου κρίνεται ικανοποιητική σε όλες τις περιπτώσεις. Μέσω εκτενών αποτελεσμάτων εξομοίωσης αλλά και πειραματικών, αποδεικνύεται πως ο προτεινόμενος έλεγχος συγκεντρώνει τα επιθυμητά χαρακτηριστικά που αναφέρθηκαν. Αποδεικνύεται, μάλιστα, ιδιαίτερα ευέλικτος και πρακτικός όχι μόνο σε θεωρητικές εφαρμογές αλλά και σε πραγματικά δεδομένα. Το τελευταίο είναι ιδιαίτερα σημαντικό αφού δίνει την δυνατότητα στον μηχανικό με ελάχιστο κόστος και με εύκολο χειρισμό λόγω της ασαφούς λογικής και του ψηφιακού επεξεργαστή να ελέγχει οποιαδήποτε κατανεμημένη παραγωγή (easy engineering) με ελάχιστες διορθωτικές κινήσεις. / Σhe present Ph.d thesis regards to the design and application of the control of the distributed generation (or microsource) so that distributed generation integrates into microgrids at the low voltage side. The design of the control has to achieve the following: 1) Meet the «plug and play» operation mode that implies that a microsource can be added to the microgrid without reengineering the central control and protection of units that are already part of the system. 2) The distributed generation that is a fuel cell system and a wind turbine in this case, have to provide active and reactive power support to the low voltage microgrid in cases of local load disturbances. 3) The distributed generation have to supply the whole demanded power in case of islanding mode of operation either because of a fault at the mean voltage side or because of an intentional disconnection e.g. maintenance work. 4) The transitioning from the interconnected mode to the islanded mode of operation and vice-versa has to be smooth. Due to the intense non linearity of the system, the control design is based on fuzzy logic. The results of this research regard not only to the theoretical design of the above systems via the simulation program Matlab/Simulink but also to the experimental affirmation of the results in the laboratory. Firstly, a fuel cell system combined with a battery bank forming a hybrid system is simulated and integrated into a weak distribution grid. The response of the control system is simulated firstly under a severe step load change under grid connected mode and secondly when a transitioning to islanded operation mode is caused by an upstream supply outage. Also, a study is made in order to ascertain the range of the efficiency of the proposed control for different types of distribution lines. The performance of the control revealed good in all cases. Secondly, the same hybrid system (of bigger nominal power though) and a wind turbine with doubly induction generator are integrated into a microgrid which is connected to a weak distribution grid via the simulation program. The control of the hybrid system remains the same due to the flexibility of fuzzy reasoning. The response of the control system is simulated firstly under a severe step load change under grid connected mode and secondly when a transitioning to islanded operation mode happens and vice-versa when a transitioning from islanded to interconnected operation mode occurs. Also, the transient response of the system is investigated in the cases when the battery bank is part of the microgrid and when it is eliminated. The performance of the control revealed good in all cases. The experimental setup includes a fuel cell system (Ballard& Nexa System) combined with a battery bank. In order to transfer parts of the designed control and integrate them into the experimental setup, the technology of the digital signal control via the digital signal processor (DSP) is exploited. The transfer of the control to the DSP is done through a software program at the minimum costs. The response of the real system is evaluated under a step load. The performance of the control revealed good in all cases.Through a large number of simulation and experimental results, the proposed control proves to meet the desirable requirements that already are mentioned. The proposed controller, also, prove to be particular flexible and practical in real systems. The latter remark makes the designed control suitable in real systems where the engineer tunes the local controller of each distributed generation easier due to fuzzy logic (easy engineering). It has to be reminded, also, that through the digital control technology, the integration of the control by the engineer is at minimum costs.

Η ακτινοθεραπεία αποτελεί μέρος της θεραπείας πολλών αιματολογικών κακοηθών νοσημάτων επηρεάζοντας τον αριθμό και την λειτουργικότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων CD34+ Το DNA των κυττάρων αποτελεί το βασικότερο και ίσως καλύτερα μελετημένο μόριο-στόχο της ακτινοβολίας. Ο μηχανισμός που προκαλεί βλάβη στο DNA είναι άμεσος αλλά και έμμεσος. Η άμεση επίδραση και βλάβη της ακτινοβολίας στο DNA αφορά στην απευθείας δράση της στο μόριο του DNA που είναι δυνατόν να οδηγήσει σε αντικατάσταση ή απώλειας μιας βάσης, αλλαγές στην τεταρτοταγή δομή του DNA και κατά συνέπεια στις αλληλεπιδράσεις του με άλλα μόρια του κυττάρου (cross links), σπασίματα της διπλής έλικας DSB (Double Strand Breaks) ή της μίας μόνο εκ των δύο αλυσίδων SSB (Single Strand Breaks), σημειακές μεταλλάξεις ή απώλεια τμήματος των χρωμοσωμάτων. Ο έμμεσος μηχανισμός δράσης της ακτινοβολίας στο DNA αφορά την δημιουργία ελευθέρων ριζών από την αλληλεπίδραση της ακτινοβολίας με τα μόρια του νερού, ενδοκυττάρια και εξωκυττάρια από τη μία αλλά και από την απευθείας βλάβη του μιτοχονδρίου που αποτελεί κύρια ενδοκυττάρια πηγή ελευθέρων ριζών. Οι παραγόμενες ελεύθερες ρίζες με τη σειρά τους προκαλούν απευθείας βλάβη στο μόριο του DNA, με αποτέλεσμα την πυροδότηση ενός φαυλού κύκλου ενδοκυττάριας παραγωγής ελευθέρων ριζών και πρόκλησης βλαβών στο μόριο του DNA. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της δράσης χαμηλών και υψηλότερων δόσεων ακτινοβολίας (1, 2 και 5Gy) σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα CD34+ προερχόμενα από αίμα ομφαλίου λώρου φυσιολογικών νεογνών, και ο πιθανός προστατευτικός μηχανισμός που ενεργοποιείται από την παρουσία του ινσουλινικού αυξητικού παράγοντα IGF-1. Η προκαλούμενη από την ακτινοβολία ενδοκυττάρια παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνου μελετήθηκε παρουσία ή απουσία του IGF-1, 30 λεπτά και 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με χρήση κυτταρομετρίας ροής. Η έκφραση του αντιοξειδωτικού ενζύμου MnSOD εκτιμήθηκε ποσοτικά με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης και ποιοτικά μέσω ανοσοφθορισμού. Η προκαλούμενη από την ακτινοβολία απόπτωση και η δράση του υπό μελέτη αυξητικού παράγοντα εκτιμήθηκε με τις ακόλουθες τεχνικές: • Διπλή χρώση των κυττάρων με Αννεξίνη και Ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση με κυτταρομετρία ροής • Ανάλυση DNA σε γέλη αγαρόζης • Εκτίμηση σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης του λόγου των μορίων BCL-2 και BAX • Εκτίμηση της έκφρασης του μορίου κασπάση -9, με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού Εκτιμήθηκε επίσης ο πολλαπλασιασμός και η κλωνογόνος ικανότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Η ενδοκυττάρια παραγωγή της ρίζας του υπεροξειδίου παρουσίασε αύξηση 30 λεπτά και 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση, και η παρουσία του IGF-1 ανέτρεψε το φαινόμενο αυτό, μειώνοντας και επιστρέφοντας τα ενδοκυττάρια επίπεδα του ανιόντος του υπεροξειδίου στα επίπεδα του δείγματος ελέγχου. Αμέσως μετά την ακτινοβόληση των κυττάρων τα ενδοκυττάρια επίπεδα του υπεροξειδίου του υδρογόνου ανευρέθηκαν υψηλά σε σύγκριση με τα αυθόρμητα ενδογενή επίπεδα μη ακτινοβολημένων κυττάρων για όλες τις δόσεις ακτινοβολίας, όμως στον όψιμο χρόνο μελέτης, των 24 ωρών, παρέμειναν σχεδόν σταθερά, παρουσιάζοντας τάση μείωσης, χωρίς όμως να σημειώνονται στατιστικά σημαντικές διαφορές. Είκοσι τέσσερεις ώρες μετά την ακτινοβόληση τα επίπεδα του αντιοξειδωτικού ενζύμου MnSOD αυξήθηκαν, και η παρουσία του IGF-1 οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση της έκφρασης του. Ο IGF-1 ανέστειλε την ενεργοποίηση του μιτοχονδριακού μηχανισμού απόπτωσης ρυθμίζοντας σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο την έκφραση των BCL-2, ΒΑΧ και του λόγου BCL-2/BAX, και μειώνοντας την έκφραση του προαποπτωτικού μορίου κασπάση-9. Θετική ήταν και η δράση του IGF-1 στον πολλαπλασιασμό και στην ικανότητα αποδοτικής αιμοποίησης των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, ενισχύοντας την ικανότητα πολλαπλασιασμού των ακτινοβολημένων κυττάρων αλλά και την κλωνογόνο ικανότητα τους ως προς τον σχηματισμό BFU-e και CFU-GM αποικιών. Συνοψίζοντας, μπορούμε να υποστηρίξουμε ότι ο IGF-1 συμμετέχει στη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης του ενδοκυττάριου περιβάλλοντος των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων μειώνοντας τα ενδοκυττάρια επίπεδα των παραγόμενων ενεργών μορφών οξυγόνου. Μέσω θετικής ρύθμισης του αντιοξειδωτικού μηχανισμού MNSOD και συμμετέχοντας προστατευτικά στο μιτοχονδριακό καταρράκτη της απόπτωσης οδηγεί σε προστασία των ακτινοβολημένων αιμοποιητικών κυττάρων επιτρέποντας τους να διατηρήσουν την λειτουργικότητα τους και την ικανότητα αιμοποίησης. / Radiation exerts direct as well as indirect effects on DNA through the generation of reactive oxygen species (ROS). Irradiated hematopoietic progenitor cells (HPCs) experience DNA strand breaks, favoring genetic instability, due to ROS generation. Our aim was to study the effect of a range of radiation doses in HPCs and the possible protective mechanisms activated by insulin-like growth factor-1 (IGF-1). ROS generation was evaluated, in the presence or absence of IGF-1 in liquid cultures of human HPCs-CD34+ irradiated with 1-, 2- and 5-Gy X-rays, using a flow cytometry assay. Manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression was studied by western blot analysis and visualized by an immunofluorescence assay. Apoptosis was estimated using the following assays: Annexin-V assay, DNA degradation assay, BCL-2/BAX mRNA and protein levels and caspase-9 protein immunofluorescence visualization. Viability and clonogenic potential were studied in irradiated HPCs. The generation of superoxide anion radicals at an early and a late time point was increased. This linear increase was reversed by the IGF-1 presence, restoring O.- generation at the levels of the innate production as manifested in control non irradiated samples. The hydrogen peroxide generation was increased at early time point but at late time point was stable. IGF-1 presence further enhanced the radiation-induced increase of MnSOD at 24 h post irradiation. IGF 1 inhibited the mitochondria- mediated pathway of apoptosis by regulating the m-RNA and protein expression of BAX, BCL-2 and the BCL-2/BAX ratio and by decreasing caspase-9 protein expression. IGF-1 presence in culture media of irradiated cells restored the clonogenic capacity and the viability of HPCs as well. In conclusion, our data support that IGF-1 anticipates oxidative microenvironment of HPCs by reducing the oxidative stress in intracellular environment due to a range of doses of radiation. IGF-1 succeeds to eliminate free radicals by favoring scavenger’s mechanisms and by regulating elements responsible for the mitochondrial pathway of apoptosis, allowing the sustained clonogenic capacity of hematopoietic progenitor cells.

Οι μέχρι τώρα ενδείξεις από τη βιβλιογραφία εισηγούνται ένα πιθανό προστατευτικό ρόλο των οιστρογόνων στην καρκινογένεση στο παχύ έντερο. Η έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων στο φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου, στα αδενώματα και τα καρκινώματα και οι αλληλεπιδράσεις τους με διάφορους συμπαράγοντες θα πρέπει να μελετηθούν υπό το πρίσμα των πολύπλοκων μοριακών δικτύων μεταξύ επιθηλιακών κυττάρων και μυοϊνοβλαστών του στρώματος, αλλά και της θεωρίας των βλαστικών κυττάρων που φαίνεται να ενέχονται στην καρκινογένεση. Η έκφραση των ERα, ERβ1, ΑΙΒ-1, TIF-2, PELP1, NCoR και ALDH1 μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά σε 107 καρκινώματα παχέος εντέρου, σε 77 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου και σε 29 αδενώματα του ίδιου οργάνου. Εκτιμήθηκαν τόσο τα επιθηλιακά κύτταρα όσο και οι μυοϊνοβλάστες. Για την ακριβέστερη εκτίμηση των μυοϊνοβλαστών, συνεχόμενες ιστολογικές τομές υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημικό έλεγχο με χρήση των anti-αSMA και CD34 αντισωμάτων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση των ERβ1, ΑΙΒ-1, ΤΙF-2 και PELP1 ήταν πιο συχνή σε μυοϊνοβλάστες του στρώματος των καρκινωμάτων σε σχέση με τα αδενώματα και το φυσιολογικό βλεννογόνο. Επίσης, στους μυοϊνοβλάστες των καρκινωμάτων, ο NCoR εντοπιζόταν αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Αντίθετα, δεν υπήρχε διαφορά στο ποσοστό έκφρασης των δεικτών αυτών στα επιθηλιακά κύτταρα μεταξύ του φυσιολογικού βλεννογόνου, των αδενωμάτων και των καρκινωμάτων. Ωστόσο, η κυτταροπλασματική εντόπιση του ERβ1 ήταν συχνότερη στα επιθηλιακά κύτταρα των καρκινωμάτων σε σχέση με το φυσιολογικό βλεννογόνο και τα αδενώματα. Επίσης, ο NCoR εκφραζόταν πιο συχνά στο κυτταρόπλασμα και σπανιότερα στον πυρήνα των κακοήθων επιθηλιακών κυττάρων σε σχέση με τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα. Η κυτταροπλασματική έκφραση του NCoR στα επιθηλιακά κύτταρα σχετιζόταν με μεγαλύτερη ελεύθερη νόσου και συνολική επιβίωση και αποτελούσε ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη της ελεύθερης νόσου επιβίωσης. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ένα πιθανό ρόλο της ενεργοποίησης του μονοπατιού των οιστρογονικών υποδοχέων στους μυοϊνοβλάστες του στρώματος, στην ανάπτυξη των καρκινωμάτων του παχέος εντέρου. Επίσης, η κυτταροπλασματική μετατόπιση, από τον πυρήνα, του NCoR στα επιθηλιακά κύτταρα, πιθανότατα επηρεάζει διάφορα μοριακά δίκτυα στον πυρήνα των κυττάρων, επιφέροντας ταυτόχρονα ογκοπροαγωγές δράσεις στα επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου και ογκοκατασταλτικές επιδράσεις στα αναπτυσσόμενα νεοπλάσματα. Δεδομένου ότι, η πυρηνική έκφραση του NCoR έχει προταθεί ως δείκτης των stem κυττάρων, τα ελάχιστα κύτταρα, στα οποία παρατηρήθηκε πυρηνική έκφραση στον καρκίνο παχέος εντέρου, πιθανότατα, αντιστοιχούν σε καρκινικά stem κύτταρα. Η ALDH1 αποτελεί, επίσης, δείκτη φυσιολογικών και καρκινικών stem κυττάρων σε διάφορα όργανα. Στη μελέτη μας η ALDH1 εκφράστηκε έντονα σε κύτταρα του φυσιολογικού βλεννογόνου, τα οποία βρίσκονταν στη βάση των κρυπτών και πιθανότατα αντιπροσωπεύουν τα stem/προγονικά κύτταρα του εντερικού επιθηλίου. Κατά αντιστοιχία, η έκφραση της ALDH1 στα καρκινικά κύτταρα σχετιζόταν με παρουσία μεταστάσεων και χειρότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση. Το εύρημα αυτό, πιθανόν, να αποτελεί ένα δείκτη των καρκινικών stem/προγονικών κυττάρων. Αντίθετα, η έκφραση ALDH1 στους μυοϊνοβλάστες των καρκινωμάτων σχετιζόταν με ευνοϊκούς προγνωστικούς παράγοντες και μεγαλύτερο ελεύθερο νόσου διάστημα. Επίσης, περιστατικά με χαμηλή έκφραση ALDH1 στους μυοϊνοβλάστες και υψηλή έκφραση στα επιθηλιακά κύτταρα σχετιζόταν με μικρότερο διάστημα ελεύθερη νόσου επιβίωσης, αλλά και συνολικής επιβίωσης. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν το σημαντικό ρόλο των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων επιθηλίου-στρώματος κατά την καρκινογένεση στο παχύ έντερο και επισημαίνουν τα πολύπλοκα μοριακά δίκτυα που ρυθμίζουν τη λειτουργία των κυττάρων. Η συστημική προσέγγιση των επιθηλιακών κυττάρων και της παθολογίας τους προϋποθέτει τη μελέτη των μορίων τους μέσα σε πολύπλοκα δίκτυα που επηρεάζουν τη δράση τους με μη γραμμικό τρόπο και περιλαμβάνει αμφίδρομες αλληλεπιδράσεις από τα περιβάλλοντα κύτταρα. / Background. The stochastic model of carcinogenesis is recently challenged by the stem cell model. The later suggests that cancer develops from uncontrolled proliferation and aberrant differentiation of adult stem cells or progenitor cells that acquire stem cell-like properties. Microenvironment regulates function and differentiation of normal epithelial cells creating a protective niche for stem cells. Additionally, microenvironment plays a critical role in induction and progression of carcinomas. Both mutations in adult stem cells and changes in signals emanating from the stem cell niche contribute to the initiation of carcinomas. Recent findings suggest a protective role of estrogens in colorectal carcinogenesis. However, estrogens exert various actions on cells depending on the molecular microenvironment and their cross-talk with intracellular cascades and coregulators of transcription. Additionally, estrogens modulate the function of stromal cells and might influence carcinogenesis by indirect actions. Elucidation of the molecular networks implicated in estrogen signaling is very important in view of the potential use of selective estrogen receptor modulators in chemoprevention and targeted anticancer therapy. Materials and methods. An immunohistochemical study was designed to analyze the estrogen receptors α and β and the various co-regulators of transcription expression of along with that of a proposed functional stem cell marker, ALDH1, in normal colonic mucosa, adenomas and colorectal carcinomas. One hundred seven cases of colorectal carcinoma were retrieved from the Pathology files of the University Hospital of Patras, Greece. None of the patients had received preoperative chemotherapy or radiotherapy. All female patients were at the postmenopausal age. Follow-up was available for all patients. Paired normal mucosa and adenoma specimens were evaluated in 77 and 29 cases, respectively, in an effort to examine the whole spectrum of the multistage progression of colorectal carcinogenesis. Primary antibodies against ERα, ERβ1, AIB-1, TIF-2, PELP1, NCoR and ALDH1 and the Envision polymer-based detection system were employed. Epithelial cells and stromal myofibroblasts were separately assessed. α-SMA and CD34 staining of serial histologic sections was valuable for the recognition of the myofibroblastic nature of the cells. Results. ERα expression was extremely rare and was noted in <1% of the epithelial cells in two cases of colorectal carcinoma. ERβ1, TIF-2, and NCoR were expressed in the nuclei and cytoplasm of epithelial cells and myofibroblasts. AIB-1 and PELP-1 were expressed in the nuclei of epithelial cells and myofibroblasts. PELP-1 displayed a dot-like pattern of staining in the nuclei of cells that is possibly attributed to the presence of focally increased concentration of PELP1 in multiprotein co-regulator complexes within the nuclei of cells. Statistical analysis revealed that nuclear and cytoplasmic expression of ERβ1 and TIF-2 and nuclear expression of AIB-1 and PELP1 in myofibroblasts increased from normal mucosa through adenoma to carcinomas. NCoR was expressed in the cytoplasm of carcinoma-associated fibroblasts but not in myofibroblasts of normal mucosa. Thus, various components of estrogen signaling namely ERβ1 (both genomic and non-genomic actions-associated localization) and co-regulators of transcription, are enhanced in cancer associated myofibroblasts, whereas co-repressor NCoR is expressed in the cytoplasm of the cells implying that ER signaling is enhanced in myofibroblasts of carcinomas. In contrast, nuclear expression of ERβ1, AIB-1, TIF-2, and PELP-1 in epithelial cells was not different among normal mucosa, adenomas and carcinomas. Cytoplasmic expression of ERβ1 was higher in colorectal carcinomas, implying activation of non-genomic actions of ERβ in colorectal carcinogenesis. A translocation of NCoR from the nucleus to the cytoplasm was noted in colorectal carcinomas, since nuclear expression was more common in normal mucosa and cytoplasmic expression was noted in the majority of carcinomas. Cytoplasmic expression of NCoR in epithelial cells was associated with favorable prognosis. These findings might suggest that derepression of NCoR repressed transcription is an important feature of colorectal carcinogenesis and correlates with patients’ prognosis. ALDH1 expression was noted in the nuclei and the cytoplasm of myofibroblasts and epithelial cells. Expression in myofibroblasts was more often noted in carcinomas compared to normal mucosa and was associated with absence of metastasis and favorable prognosis. Epithelial cells of normal mucosa expressed high levels of ALDH1 expression. A distinct pattern of ALDH1 expression along the crypt axis was noted. Nuclear expression was more common and cytoplasmic expression was intensified at the base of the crypts (compartment where epithelial stem cells reside) compared to superficial epithelium. Carcinomas displayed heterogenous expression of ALDH1 in epithelial cells. Increased cytoplasmic expression was associated with the presence of metastasis and poor prognosis. Thus, ALDH1 expression had distinct impacts on metastatic potential of carcinomas and patients’ prognosis, accordingly to the cell where it is expressed. Additionally, patients with increased expression in epithelial cells and decreased expression in myofibroblasts had worse prognosis compared to patients displaying all other combinations of ALDH1 expression in epithelial cells and myofibroblasts. Our findings imply a possible role of ALDH1 as a stem/progenitor cell marker in normal mucosa. The association of ALDH1 expression in malignant cells with metastatic potential and worse prognosis implies that it might represent a marker of carcinomas with increased stem/progenitor cell content. The favorable prognostic role of ALDH1 expression in myofibroblasts might be associated with its role in local retinoic acid production. Retinoic acid has various tumor suppressive roles in colorectal carcinomas and can potentially be used in chemopreventive or chemotherapeutic strategies especially in patients with low local production levels. Thus, a comprehensive analysis of molecular networks both in any single cell and among the different cells of colorectal carcinomas and non neoplastic mucosa are mandatory in order to elucidate the role of estrogen signaling in colorectal carcinogenesis in view of development of targeted clinical applications. Conclusions 1.ERβ is the predominant estrogen receptor in colonic tissue. 2.ERβ1 dependent signaling is enhanced in cancer-associated myofibroblasts. 3.PELP1 is associated with genomic actions in both epithelial cells and myofibroblats. 4.In epithelial cells, loss of NCoR nuclear expression correlates with colorectal carcinogenesis possibly through derepression of transcription mediated by various transcription factors. 5.ALDH1 emerges as a marker of normal and cancer stem cells of colorectal carcinomas.

Το Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο (ΜΔΣ) αποτελεί νόσημα με διαταραχή σε επίπεδο αρχέγονου αιμοποιητικού κυττάρου (stem cell) που χαρακτηρίζεται από μη αποδοτική αιμοποίηση και κυτταροπενίες του περιφερικού αίματος που περιλαμβάνουν μία ή περισσότερες αιμοποιητικές σειρές. Διάφορες ανοσολογικές διαταραχές των ασθενών με ΜΔΣ, όπως, αυξημένη ευαισθησία σε βακτηριακές λοιμώξεις, αυτοάνοσα φαινόμενα και υψηλή συχνότητα κακοηθειών του λεμφικού ιστού, υποδεικνύουν αδυναμία των ασθενών με ΜΔΣ για ανοσολογική απάντηση, οι αιτίες των οποίων παραμένουν άγνωστες μέχρι σήμερα. Τα Δενδριτικά Κύτταρα (ΔΚ) είναι κύτταρα του ανοσολογικού μηχανισμού που προέρχονται από το μυελό των οστών. Ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC), είναι εξειδικευμένα για τη πρόσληψη, επεξεργασία, μεταφορά και παρουσίαση του αντιγόνου στα Τ λεμφοκύτταρα. Στη παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε ανάλυση διαφορετικών ποσοτικών και λειτουργικών παραμέτρων των ΔΚ από ασθενείς με Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο, in vivo ή in vitro. Αρχικά διερευνήθηκε ο αριθμός, ο φαινότυπος, η ικανότητα ενδοκύττωσης και η αλλογενής διεγερτική δυνατότητα των ΔΚ, προερχόμενων από μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος (ΜοΔΚ) ασθενών με ΜΔΣ και υγιών μαρτύρων, σε διαφορετικά στάδια διαφοροποίησης. Τα μονοκύτταρα των ασθενών με ΜΔΣ χαρακτηρίστηκαν από μειωμένη ικανότητα διαφοροποίησης σε ΔΚ, λόγω του μειωμένου αριθμού των διαφοροποιημένων κυττάρων και τη χαμηλή έκφραση του CD1a αντιγόνου επιφανείας. Τα ΜοΔΚ των ΜΔΣ ασθενών παρουσίασαν χαμηλή έκφραση του υποδοχέα της μανόζης και μειωμένη ικανότητα ενδοκύττωσης. ΜοΔΚ των ΜΔΣ ασθενών επέδειξαν μειωμένη απάντηση ύστερα από διέγερση με TNF-α, καθώς η έκφραση των CD83, CD80 και CD54 αντιγόνων και η αλλοδιεγερτική ικανότητα ήταν μειωμένη, ενώ η επίδραση με LPS είχε ως αποτέλεσμα να εμφανίσουν φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και ικανότητα διέγερσης των Τ-κυττάρων, όμοια με τα ΜοΔΚ των φυσιολογικών μαρτύρων. Σε δύο από τους ασθενείς με σύνδρομο 5q-, σχεδόν όλα τα μονοκύτταρα και τα ΜοΔΚ περιείχαν τη χρωμοσωμική διαταραχή, υποδηλώνοντας την προέλευσή τους από τον παθολογικό κλώνο. Στη συνέχεια διερευνήθηκε το δυναμικό πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των CD34+ προγονικών κυττάρων του μυελού ασθενών με ΜΔΣ σε δενδριτικά κύτταρα (CD34-ΔΚ) σε υγρή καλλιέργεια παρουσία κυτοκινών. Παράλληλα, έγινε ανάλυση των κυκλοφορούντων ΔΚ περιφερικού αίματος στους ίδιους ασθενείς. Τα CD34+ προγονικά κύτταρα παρουσίασαν χαμηλή δυνατότητα ανάπτυξης ΔΚ in vitro, καθώς ο αριθμός των παραγόμενων ΔΚ ανά CD34+ κύτταρο ήταν χαμηλότερος συγκριτικά με τα δείγματα των υγιών μαρτύρων. Παρά την αυξημένη απόπτωση των προγονικών κυττάρων του μυελού των ΜΔΣ ασθενών, η επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός των CD34+ κυττάρων στην καλλιέργεια, δεν συσχετίστηκε με την απόπτωση και αποτελεί αξιοσημείωτη παρατήρηση. Φαινοτυπικά, τα CD34-ΔΚ των ΜΔΣ ασθενών δεν διέφεραν από τα ΔΚ που παρήχθησαν από τα CD34+ κύτταρα του μυελού των φυσιολογικών μαρτύρων καθώς επέδειξαν όμοια έκφραση των CD83, CD80, CD40, HLA-DR και CD54 αντιγόνων. Κυτταροεπιλεγμένα CD1a+ κύτταρα ασθενών είχαν όμοια διεγερτική ικανότητα αλλογενών Τ κυττάρων με τα CD34-ΔΚ των φυσιολογικών ατόμων. Το ποσοστό των κυκλοφορούντων μυελοειδών- και πλασματοκυτταροειδών- ΔΚ στους ασθενείς με ΜΔΣ ήταν σημαντικά μειωμένο συγκριτικά με τους υγιείς μάρτυρες. Στους ασθενείς με 5q έλλειψη, τόσο τα CD34-ΔΚ, όσο και τα ΔΚ του αίματος, είχαν τη χρωμοσωμική ανωμαλία. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η διαδικασία παραγωγής δενδριτικών κυττάρων από το μυελό (‘δενδριτοποίηση’) των ασθενών με ΜΔΣ, είναι μέρος της κλωνικής διαταραχής με αποτέλεσμα την μη αποδοτική παραγωγή ΔΚ από τα προγονικά κύτταρα του μυελού και το χαμηλό ποσοστό των κυκλοφορούντων πρόδρομων ΔΚ. Όλες οι ΔΚ υποομάδες προέρχονται από τον παθολογικό κλώνο και χαρακτηρίζονται από ποσοτικές και ποιοτικές ανωμαλίες. Το σύνολο αυτών των διαταραχών που παρατηρήθηκαν στα ΔΚ πολύ πιθανόν να συμβάλει στη διαταραγμένη ανοσολογική απάντηση έναντι παθογόνων οργανισμών, στην επιβίωση και στην επικράτηση του παθολογικού κλώνου, όπως επίσης και στην εμφάνιση αυτοάνοσων φαινομένων, που παρατηρούνται στους ασθενείς με ΜΔΣ. / Myelodysplastic syndrome (MDS) is a stem cell disorder characterized by ineffective hematopoiesis and blood cytopenias involving one or several myeloid lineages. Various immune disturbances in MDS such as increased susceptibility to bacterial infections, autoimmune phenomena and high incidence of lymphoid malignancies reveal an underlying defect of the immune response in MDS patients, the reasons for which still remain unclear. Dendritic cells (DCs) are bone marrow derived cells. As the most potent antigen presenting cells (APC), they are specialized for the uptake, processing, transport and presentation of Ag to T cells. In the present study different quantitative and functional parameters of DCs in patients with MDS were analyzed either in vivo or in vitro. The number, phenotype, endocytic ability, and allostimulatory capacity of DCs derived from peripheral blood monocytes (MoDCs) were investigated in patients with MDS and healthy controls at different stages of differentiation using the maturation stimuli-TNF-á and LPS. Monocytes in MDS showed low potential to differentiate into DCs, as determined by low cell yield and CD1a expression. MDS-MoDCs exhibited low expression of Mannose receptor and reduced endocytic capacity. When stimulated with TNF-á, MoDCs obtained from MDS patients showed a diminished response with low CD83, CD80 and CD54 expression and allostimulatory capacity, whereas in the presence of LPS MDS-MoDCs acquired phenotypic characteristics and ability to stimulate T-cells similar to MoDCs derived from controls. In two patients with 5q- syndrome the vast majority of both monocytes and MoDCs were positive for the 5q deletion, suggesting that they originate from the malignant clone. Second, we investigated the potential of bone marrow CD34+ progenitors in patients with MDS to proliferate and differentiate into DCs in a liquid cytokine supplemented culture system and also analyzed the status of blood DC subsets in those patients. CD34+ progenitors had low potential to generate DCs in vitro, as the number of DCs obtained from one CD34+ cell was significantly lower compared to controls. Interestingly, although the increased apoptotic level of bone marrow progenitors in MDS, the survival and proliferation of CD34+ cells in culture was not correlated to the degree of apoptosis. Phenotypically the MDS CD34-DCs did not differ from DCs obtained from normal BM CD34+ cells, exhibiting similar expression of CD83, CD80, CD40, HLA-DR, and CD54. FACsorted CD1a+ cells from MDS patients were as efficient stimulators of allogeneic T cells as normal CD34-DCs. The percentage of both circulating DC subsets, MDCs and PDCs in MDS patients was extremely diminished compared to controls. In cases with the 5q deletion both CD34-DCs and blood DCs harbor the cytogenetic abnormality. The results indicate that “dendritopoiesis” in MDS is affected by the transformation process resulting in ineffective production of DCs from bone marrow progenitors with low circulating blood precursors. All DC subsets were derived from the malignant clone and exhibited quantitative and qualitative abnormalities. This constellation of DCs defects probably contribute to the defective immune response against pathogens, escape and expansion of the malignant clone, as well as autoimmune phenomena, observed in MDS patients.

Tο πρώτο μέρος της εργασίας αφορούσε την παρακολούθηση της ερυθρολευχαιμική σειρά ποντικού (MEL) διαμολυσμένη με το επισωματικό αυτό-αναπαραγώμενο όχημα pEPI-EGFP, τα κύτταρα της οποίας δεν παρουσίαζαν φθορισμό ενώ παρέμεναν ανθεκτικά στο αντιβιοτικό (G418). Αποδείχθηκε η επισωματική κατακράτηση του οχήματος για δύο μήνες μετά τη δημιουργία της διαμολυσμένης σειράς. Η διαπίστωση επίσης ότι το μεταφερόμενο γονίδιο μπορεί να μην εκφράζεται αλλά το όχημα να παραμένει για τουλάχιστον 60 ημέρες επισωματικό και χωρίς ενσωμάτωση μας ώθησε σε νέες προοπτικές αναζήτησης. Το δεύτερο μέρος της εργασίας έγινε παρασκευή δύο οχημάτων τα οποία διαφέρουν ως προς τον υποκινητή του γονιδίου αναφοράς ΕGFP τόσο μεταξύ τους όσο και από το όχημα pEPI-EGFP, το βασικό όχημα μελέτης έως τώρα. Η παρασκευή αυτή βασίστηκε στην αντικατάσταση του υποκινητή pCMV από: 1 τον υποκινητή pSFFV για την παρασκευή του οχήματος pEPI-pSFFV και 2 τον υποκινητή της β-σφαιρίνης (pβ-globin) για την παρασκευή του αντίστοιχου οχήματος pEPI-pβ-globin. Η παρασκευή των δύο αυτόν οχημάτων, του pEPI-pSFFV και pEPI-pβ-globin αποτελεί ένα σημαντικό βήμα στη ανάπτυξη νέων οχημάτων που αποτελέσουν οχήματα μεταφοράς γονιδίων σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. / The first part of this work concerned the observation of the mouse erithroid cell line (MEL) transected with the Replicating Episomal Vector pEPI-EGFP. The cells even thought that they had lost their florescence a few days after the transfection with the Vector pEPI-EGFP, they still endure to the antibiotic (G418). In the fist place we have shown that the Replicating Episomal Vector pEPI-EGFP remains in episomatic condition at list two months after the transfect ion of the cell line with out any insertion eventhought the transferred gene is not translated. The second part of this work concerned the construction of two new vectors. The new vectors have the same reference gene with the pEPI-EGFP vector the EGFP gene but they have tow totally deferent new promoters for the EGFP gene. This contract was based on the replacement of the promoter pCMV 1. with the promoter pSFFV for the contraction of the pEPI-pSFFV new vector 2. with the promoter pβ-globin for the contraction of the pEPI-pβ-globin new vector These two new vectors the pEPI-pSFFV and the pEPI-pβ-globin were tested for their ability of being used as Replicating Episomal Vectors to Hematopoietic Stem Cells, HSC sach as CD34+ cells.

Το Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο (ΜΔΣ) αποτελεί μια ετερογενή ομάδα κλωνικών αιματολογικών διαταραχών με κοινό χαρακτηριστικό τη μη αποδοτική αιμοποίηση που οδηγεί σε ανθεκτικές κυτταροπενίες και συχνή εκτροπή προς Οξεία Λευχαιμία (ΟΛ). Η παράδοξη συνύπαρξη ενός πληθωρικού ή νορμοκυτταρικού μυελού των οστών και κυτταροπενιών στην περιφέρεια έχει αποδοθεί στην αυξημένη απόπτωση προγονικών και ώριμων αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των ασθενών αυτών. Παρ'όλ'αυτά, αιτιοπαθογενετική σχέση της υπέρμετρης απόπτωσης με την ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων του μυελοδυσπλαστικού μυελού δεν τεκμηριώνεται επαρκώς από τα υπάρχοντα ερευνητικά δεδομένα. Αντίθετα, αδιαμφισβήτητη είναι η συσχέτιση της κατάργησης των μηχανισμών του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου στο προχωρημένο ΜΔΣ με την εκτροπή της νόσου προς ΟΛ. Η αυξημένη έκφραση αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών όπως οι Bcl-2, Bcl-xL, IAPs, survivin έχει προταθεί ότι υποστηρίζει την πρόοδο της νόσου και την επακόλουθη λευχαιμική εξέλιξη. Οι Heat Shock Proteins αποτελούν θεμελιώδεις πρωτεΐνες, ως προς τις αποφάσεις των κυττάρων σχετικά με την επιβίωση ή το θάνατό τους. Η Hsp73, ένα σταθερά εκφραζόμενο μέλος, και οι Hsps 72 και 27, δύο ισχυρά επαγόμενες από ποικίλα στρεσσογόνα ερεθίσματα πρωτεΐνες, είναι τρεις από τις πιο σημαντικές Hsps εκδηλώνοντας πολυδιάστατη αντι-αποπτωτική δράση και παρέχοντας ισχυρή κυτταροπροστασία. Σε αρκετά είδη συμπαγών όγκων αλλά και αιματολογικών κακοηθειών έχει δειχθεί υπερέκφραση των Hsps, ενώ έχει προταθεί ακόμη και αιτιοπαθογενετική σχέση της διαταραχής της έκφρασης των πρωτεϊνών αυτών με την ογκογένεση. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η εκτίμηση του βαθμού της απόπτωσης στα προγονικά και ώριμα κύτταρα μυελού ασθενών με ΜΔΣ και η περαιτέρω διερεύνηση της ουσιαστικής συνεισφοράς του φαινομένου στην ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών κυττάρων και, κατ' επέκταση, στη μη αποδοτική αιμοποίηση που χαρακτηρίζει το σύνδρομο. Εν συνεχεία, διερευνήθηκαν οι αποπτωτικές μεταβολές κατά την πρόοδο της νόσου οι οποίες συσχετίσθηκαν με την έκφραση των αντι-αποπτωτικών Heat Shock Proteins. Η έκφραση των Hsps 72, 27 & 73 μελετήθηκε υπό συνθήκες ηρεμίας (βασική έκφραση, ΒΕ), ενώ ελέγχθηκε η επαγωγιμότητα των Hsps 72 και 27 κατόπιν εφαρμογής θερμικού shock ή ο-αποπτωτικής διέγερσης με συνδυασμό κυτταροκινών (TNFα+IFNγ). Η προσδιοριζόμενη έκφραση των Hsps συσχετίσθηκε, κατόπιν, με την απόπτωση και το στάδιο της νόσου. Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει την παρουσία αυξημένης απόπτωσης τόσο στα ώριμα CD34- όσο και στα προγονικά CD34+ κύτταρα του μυελού ασθενών με ΜΔΣ με αξιοσημείωτη ετερογένεια να διέπει τα αποτελέσματα ακόμη και μεταξύ ασθενών της ίδιας κατά FAB κατηγορίας νόσου. Τα επίπεδα ανιχνευόμενης απόπτωσης υπερείχαν σημαντικά στο μυελό των ασθενών με "πρώιμη" (RA και RARS) έναντι εκείνων με "προχωρημένη" (RAEB και RAEB-t) νόσο, ενισχύοντας τη θεωρία της κατάργησης των αποπτωτικών μηχανισμών κατά την πρόοδο της νόσου. Μετά από 24 ώρες υγρής καλλιέργειας, το ποσοστό των ανιχνευόμενων πρώιμων αποπτωτικών CD34+ κυττάρων μυελού ασθενών με ΜΔΣ μειώθηκε σημαντικά. Προκειμένου να διερευνηθεί η πραγματική συμβολή της απόπτωσης στη μη αποδοτική αιμοποίηση του ΜΔΣ in vitro, αποπτωτικά και μη αποπτωτικά προγονικά CD34+ φρέσκα κύτταρα μυελού διαχωρίστηκαν με τη μέθοδο του Κυτταροδιαχωρισμού ενεργοποιούμενου από φθορισμό και τοποθετήθηκαν σε βραχείας διάρκειας ημιστερεές καλλιέργειες, όπου ελέγχθηκε η σχετική κλωνογόνος ικανότητά τους. Τόσο τα αποπτωτικά όσο και τα μη αποπτωτικά CD34+ κύτταρα των ασθενών με ΜΔΣ επέδειξαν εξίσου ανεπαρκή ανάπτυξη in vitro, υποδεικνύοντας ότι η παρουσία απόπτωσης δεν επηρεάζει σημαντικά τη συμπεριφορά των κυττάρων στην καλλιέργεια. Η βασική ενδοκυττάρια έκφραση των αντιαποπτωτικών Hsps 27, 72 και 73 βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ. Η υπερέκφραση των Hsps αφορούσε κυρίως τα ολικά μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού των ασθενών, ενώ τα προγονικά CD34+ κύτταρα δεν επέδειξαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα των υπό μελέτη πρωτεϊνών. Επιπλέον, η εφαρμογή θερμικού shock οδήγησε επιτυχώς στην επαγωγή των Hsps 27 και 72 στο μυελό ασθενών και μαρτύρων, προσεγγίζοντας όμως υψηλότερα τελικά επίπεδα έκφρασης στο μυελό των ασθενών. Tόσο η βασική όσο και η εκ θερμικού stress επαγόμενη έκφραση της Hsp72 βρέθηκε σημαντικά ενισχυμένη στα μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού ασθενών με "προχωρημένου τύπου" ΜΔΣ, ενώ σημαντικά θετική συσχέτιση τεκμηριώθηκε μεταξύ της έκφρασης ηρεμίας των τριών Hsps και του ποσοστού των βλαστών του μυελού των ασθενών. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ενδεχόμενο ρόλο της υπερέκφρασης των Hsps στην ευνοϊκή επιλογή και εξάπλωση των κλωνικών κυττάρων και, συνεπακόλουθα, στην πρόοδο της νόσου. Η συνδυασμένη επίδραση κυτταροκινών σε κύτταρα φυσιολογικών μυελών οδήγησε σε σημαντική μείωση της έκφρασης της Hsp72, ενώ στο 36% των ασθενών παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης της Hsp72. Τέλος, αρνητική ήταν η συσχέτιση της βασικής ή επαγόμενης έκφρασης των Hsps με την αυτόματη ή προκλητή απόπτωση σε ολικά ή προγονικά κύτταρα μυελού ασθενών με ΜΔΣ, επιβεβαιώνοντας τον κυτταροπροστατευτικό τους ρόλο. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης επιβεβαιώνουν την παρουσία αυξημένης απόπτωσης στο μυελό των ασθενών με ΜΔΣ, ιδιαίτερα πρώιμου τύπου. Τα πρώιμα αποπτωτικά προγονικά κύτταρα επιδεικνύουν δυνατότητα διαφυγής από τον κυτταρικό θάνατο και σχετική λειτουργική ανάνηψη κατά την απομάκρυνσή τους από το προαποπτωτικό μικροπεριβάλλον του μυελού. Εναλλακτικά, πρόκειται για κύτταρα που, εξ'αιτίας αποτυχίας του αποπτωτικού μηχανισμού να περατωθεί, υφίστανται "ατελή απόπτωση" και διασώζονται, φέροντα όμως δυνητικά ογκογόνες μεταλλάξεις. Η γενική αντίληψη, πάντως, που καθιστά την απόπτωση ως την αιτία της μη αποδοτικής αιμοποίησης του συνδρόμου κλονίζεται, καθώς αποπτωτικά και μη αποπτωτικά προγονικά κύτταρα διαθέτουν παρόμοια κλωνογόνο ικανότητα, in vitro; φαίνεται ότι επιπρόσθετες ενδογενείς ανωμαλίες περιορίζουν το κλωνογόνο δυναμικό αποπτωτικών και μη προγονικών κυττάρων. Η υπερέκφραση Hsps που τεκμηριώθηκε στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ ενδεχομένως υποστηρίζει την διαδικασία κακοήθους εξαλλαγής μέσω της σιωπηρής συσσώρευσης μεταλλάξεων στα κύτταρα του κλώνου. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα των αντι-αποπτωτικών αυτών πρωτεϊνών θα μπορούσε να ευθύνεται για την προτεινόμενη ατελή απόπτωση των κυττάρων του μυελοδυσπλαστικού μυελού. Όπως προκύπτει από τη σημαντική συσχέτιση της έκφρασης των Hsps τόσο με το ποσοστό βλαστών όσο και με το στάδιο της νόσου, τα υπερεκφράζοντα ώριμα με τα αντίστοιχα προγονικά τους παθολογικά κύτταρα, ενέχοντας πλεονέκτημα επιβίωσης έναντι των φυσιολογικών στο προ-αποπτωτικό μικροπεριβάλλον του δυσπλαστικού μυελού, φαίνεται ότι επιλέγονται και επικρατούν κατά την πρόοδο της νόσου. Σε ένα τέτοιο υπόστρωμα αντίστασης στην απόπτωση ένα επιγενετικό συμβάν που αναστέλλει τη διαφοροποίηση ενδέχεται να πυροδοτήσει τη λευχαιμική εκτροπή. / Myelodysplastic syndrome comprises a heterogeneous group of clonal stem cell disorders characterized by ineffective hematopoiesis leading to refractory cytopenias and frequent evolution to acute myeloid leukemia (AML). The existing inconsistency between normal or hypercellular bone marrow and peripheral blood cytopenias remains a paradox that has been attributed to excessive intramedullary apoptosis. However, a causative relationship of apoptosis to the progenitor’s defective clonogenic growth has not been sufficiently demonstrated. On the other hand, it is widely accepted that abrogation of apoptotic control in advanced MDS favours the expansion of the malignant clone and contributes to the frequently observed evolution to acute myeloid leukaemia (AML). Enhanced expression of antiapoptotic proteins Bcl-2, Bcl-xL, IAPs, survivin has been proposed to contribute to elimination of apoptosis, disease progression and subsequent leukemic evolution. Heat Shock Proteins (Hsps) are fundamental for cell life and death decisions and essential for the coordination between proliferation, differentiation and apoptosis. Hsp73, one of the constitutively expressed Hsps, and Hsps 72 and 27, two strongly inducible by several stress stimuli proteins, are three of the most important Hsps. These three Hsps regulate programmed cell death by interfering with multiple key-regulatory points of the apoptotic cascade, acting as apoptosis inhibitors and conferring strong cytoprotection. Hsps 72 and 27 are overexpressed in a number of human cancers and haematological malignancies, while a causative relationship of these proteins to oncogenesis has even been proposed. The aim of our study was to determine the degree of programmed cell death in progenitor and mature bone marrow cells of MDS patients. Moreover, apoptosis' actual contribution to defective clonogenic capacity of MDS progenitors and, subsequently, to ineffective hematopoiesis in MDS was assessed. Furthermore, apoptosis modifications during disease progression were detected and correlated to the expression of antiapoptotic Hsps. Hsps 72, 27 and 73 intracellular expression was studied under conditions of tranquillity in bone marrow and progenitor cells of MDS patients, while the inducibility of Hsps 27 and 72 was further tested after application of an environmental type of stress (heat shock) and pro-apoptotic stimulation under combined cytokine treatment (TNFα+IFNγ). Finally, we determined an existing link between Hsps' levels, apoptosis and disease progression. Apoptosis was significantly augmented in both progenitor and mature bone marrow cell fractions from MDS patients. Apoptosis determined in the bone marrow of patients with "early" MDS (RA and RARS) significantly exceeded cell death levels detected in those with "advanced" (RAEB and RAEB-t) disease, supporting the theory of apoptosis' abrogation as the disease evolves. We should remark, however, that even inside the same FAB-category, a great heterogeneity existed in results. After 24 hours of liquid culture the percentage of early apoptotic progenitors in MDS BM significantly decreased. In order to determine apoptosis' actual contribution to defective clonogenic capacity of MDS progenitors, “apoptotic” and “non-apoptotic” bone marrow CD34+ cells were sorted by FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) and their differential clonogenic capacity was assessed in a short-term semisolid culture system. There was no correlation between apoptosis’ existence and culture performance, since non-apoptotic as well as apoptotic CD34+ bone marrow cells both exhibited similar defective growth. Basal intracellular expression of antiapoptotic Hsps 27, 72 and 73 was found significantly elevated in bone marrow cells of MDS patients. Hsps overexpression mainly involved total BMMC, while higher protein levels were also detected within patients’ progenitor bone marrow cells, but the differences noted did not attain statistical significance. Moreover, HS treatment provoked the effective induction of Hsps 27 and 72 in both MDS and normal subjects leading to the achievement of even higher final protein levels in the patients’ marrow, despite the already enhanced basal expression. Both basal and HS-induced Hsp72 expression were significantly enhanced in BMMC of MDS patients with advanced disease, while a positive correlation between all three Hsps basal expression and blast percentage was established in the patients' marrow. These findings suggest a probable role of Hsps overexpression in the favored selection and expansion of clonal cells, further hematopoiesis depression and disease progression. Combined pro-apoptotic treatment of normal BM cells caused a significant downregulation of Hsp72. On the contrary, BM cells from MDS patients responded by elevating the expression of cytoprotective Hsp72 in about 36% of cases. Finally, in accordance to the well-demonstrated cytoprotective role of Hsps, an inverse correlation was noted between spontaneous or induced apoptosis and Hsps basal or induced expression. In conclusion, our findings support the previous observations of increased apoptosis in MDS marrow, especially in "early" disease. Interestingly, early apoptotic MDS progenitors exhibit the potential to escape from apoptosis and even recover functionally, as shown in CFU-assays, when separated from the bone marrow microenvironment, the main source of pro-apoptotic signalling. Alternatively, these cells, due to intrinsic defects in cell death activated pathways, may undergo incomplete apoptosis and get rescued possibly carrying, though, potentially transforming mutations. However, apoptosis does not seem to be the only cause of impaired clonogenic growth in MDS, as apoptotic and non-apoptotic progenitors exhibit similar patterns of growth, both defective compared to normal. Apparently, additional intrinsic abnormalities limit the clonogenic potential of apoptotic and non-apoptotic progenitors. Augmented Hsps expression established in MDS marrow may support the underlying transformation process through the suppression and silent gathering of mutations, probably promoting viability and growth of otherwise mutant cells. Moreover, increased levels of anti-apoptotic Hsps may account for the proposed incomplete apoptosis of MDS marrow cells. Hsps appear to provide resistance against spontaneous or induced apoptosis to the overexpressing cell population. Hsps' positive correlation to blast count and disease stage implies that the overexpressing mature cells along with their abnormal progenitors, encompassing a survival advantage over normal cells in the pro-apoptotic MDS marrow, get selected and expanded during disease progression. On such a background of non-susceptibility to apoptosis a secondary event blocking differentiation could lead to leukaemic transformation.

Ο έλεγχος της έκφρασης των πρωτεϊνών που χαρακτηρίζουν τον Λείο Μυικό Φαινότυπο (ΛΜΦ) είναι εξαιρετικής σημασίας για την κατανόηση, σε μοριακό επίπεδο, διεργασιών που σχετίζονται με πολλές φυσιο-παθολογικές καταστάσεις στον άνθρωπο. Μεταξύ των ασθενειών όπου ο ΛΜΦ είναι καθοριστικής σημασίας για την ανάπτυξη και εξέλιξή τους, είναι η αθηροσκλήρωση, η υπέρταση, η επαναστένωση των αρτηριών μετά από αγγειοπλαστική, η ίνωση οργάνων όπως οι πνεύμονες, το ήπαρ και οι νεφροί, και η ανάπτυξη μεταστάσεων από συμπαγείς όγκους. Επομένως, κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που οδηγούν σε τροποποίηση του ΛΜΦ είναι βασικής σημασίας για την αναγνώριση στρατηγικών περιορισμού της εξέλιξης των νόσων αυτών και της εκδήλωσης των κλινικών συνεπειών τους. Αρχικό στόχο αποτέλεσε η ανάπτυξη και καθιέρωση ενός in vitro προτύπου συστήματος για την διαφοροποίηση μη διαφοροποιημένων κυττάρων προς φαινότυπο που προσομοιάζει με αυτό των Λείων Μυικών Κυττάρων (ΛΜΚ), ώστε να χρησιμεύσει στη μελέτη του μοριακού καθορισμού και ελέγχου του φαινότυπου των κυττάρων αυτών. Πρώτα-πρώτα, χαρακτηρίσαμε βασικά, σημαντικά «μοριακά εργαλεία» για την διαπίστωση και μοριακή διερεύνηση του ΛΜ-φαινοτύπου. Χρησιμοποιώντας τα, αναπτύξαμε και χαρακτηρίσαμε πρωτογενώς ένα πρότυπο σύστημα διαφοροποίησης σε ΛΜΚ, βασιζόμενο σε Μεσεγχυματικά Βλαστικά Κύτταρα (ΜΒΚ) προερχόμενα από γέλη Wharton ομφάλιου λώρου. Στα κύτταρα αυτά, η έκφραση γονιδίων και πρωτεϊνών που χαρακτηρίζουν τον ΛΜΦ εξαρτάται από την επαρκή έκφραση της πρωτεΐνης Serum Response Factor (SRF), από την ύπαρξη αλληλουχιών Serum Response Element (SRE) στον υποκινητή των εξεταζόμενων ΛΜΚ-ειδικών γονιδίων, και επάγεται από εξωγενή έκφραση της Μυοκαρδίνης. Επομένως, όπως έχει περιγραφεί και για άλλα πρότυπα συστήματα, η διαφοροποίηση των κυττάρων αυτών σε κύτταρα που προσομοιάζουν ΛΜΚ στηρίζεται στην συνέργεια δύο μεταγραφικών παραγόντων, του SRF και της Μυοκαρδίνης. Το πρότυπο αυτό θα είναι χρήσιμο για να διερευνήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς δράσης φυσιολογικών και φαρμακολογικών παραγόντων στον έλεγχο του ΛΜΦ. Επί πλέον, το πρότυπο σύστημα αυτό δύναται να αποβεί χρήσιμο για την κατανόηση εν γένει διεργασιών που οδηγούν στην βασική κυτταρική αλλαγή γνωστή ως Επιθηλιακή-Μεσεγχυματική Μετάβαση (ΕΜΤ) και κατ’ επέκταση για την κατανόηση μηχανισμών παθογένειας πλείστων νόσων που χαρακτηρίζονται από ΕΜΤ. Παράλληλα, έγινε προσπάθεια διερεύνησης αν η κυτταρική σειρά A7r5 αγγειακών ΛΜΚ αποτελεί βιώσιμο φαρμακολογικό σύστημα για την διερεύνηση των μηχανισμών μέσω των οποίων η έκφραση του ΛΜΦ ελέγχεται σε μοριακό επίπεδο από τους αδρενεργικούς υποδοχείς, μία οικογένεια υποδοχέων που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση του αγγειακού τοιχώματος και στην αρτηριακή παθοφυσιολογία. Δείξαμε ότι ο κυτταρικός πληθυσμός A7r5 δεν απαντά σε α1-αδρενεργική διέγερση διότι στερείται α1-αδρενεργικών υποδοχέων. Διέγερση αποκτάται με εισαγωγή μέσω πλασμιδίου α1-αδρενεργικών υποδοχέων, άρα το ενδογενές σηματοδοτικό σύστημα είναι παρόν και λειτουργικό. Επιπρόσθετα, ανακαλύψαμε ότι τα κύτταρα A7r5 εκφράζουν ενδογενώς λειτουργικούς β-αδρενεργικούς υποδοχείς. Θέτουμε έτσι τα θεμέλια για μία σε βάθος διερεύνηση του τυχόν ρόλου των β-αδρενεργικών υποδοχέων στον έλεγχο του φαινοτύπου των αγγειακών ΛΜΚ, ο οποίος είναι καθοριστικός για την γένεση και πορεία των καρδιαγγειακών νοσημάτων εν γένει. Συμπερασματικά λοιπόν α) τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα προερχόμενα από τη γέλη Wharton ανθρώπινου ομφάλιου λώρου αποτελούν κατάλληλο πρότυπο σύστημα διερεύνησης της ρύθμισης των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση προς ΛΜΚ από μόρια φαρμακολογικής σημασίας, και β) τα κύτταρα A7r5 αποτελούν καλό πρότυπο σύστημα για την διερεύνηση του τυχόν ρόλου των β-αδρενεργικών υποδοχέων στον έλεγχο του φαινοτύπου των ΛΜΚ των αγγείων. / The control of the genes that specify the Smooth Muscle Cell Phenotype is of great importance for our understanding, at a molecular level, of the processes central in a number of human pathologies. Among the diseases whose onset and progress is influenced by alterations in Smooth Muscle-Like (SM-L) phenotype are atherosclerosis, organ fibrosis (lung, liver and kidney), and metastasis associated with solid tumors. For these reasons, the understanding of the cell and molecular mechanisms that lead to changes in the SM phenotype expression are of central importance in our efforts to identify new approaches in limiting the progress of these diseases and the manifestation of the associated clinical symptoms. The first Aim of this work was the development and initial characterization of an in vitro model of differentiation towards a Smooth-Muscle-Like phenotype, to serve for the study of its molecular control. Initially, we characterized basic important molecular tools useful in determining the SM-L phenotype. With their aid, we developed and characterized a model system based on Wharton’s Jelly-derived Mesenchymal stem Cells (MSCs). In these cells, the expression of genes and proteins characteristic of the SM Phenotype depends on the protein levels of Serum Response Factor (SRF) and on the existence of SRF-binding elements on the promoters of the SM-specific genes; it is also potently induced by the exogenous expression of the transcription factor Myocardin. Therefore, this population of MSCs behaves as other characterized model systems, in that their differentiation to a SM-L phenotype is supported by the synergistic action of SRF and Myocardin. This novel model system based on Wharton’s Jelly MSCs will be useful to study the role of specific physiological and pharmacological agents in the control of the SM phenotype. In addition, such a system can offer insights in the basic cellular process of Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) and by extent, in the pathological mechanisms of diseases characterized by EMT. In parallel, we investigated whether the differentiated SMC line A7r5 is a viable pharmacological model system to investigate the control of the SMC phenotype by adrenergic receptors, a family of receptors that plays a crucial role in the homeostasis of the vessel wall. We showed that A7r5 cells do not express functional α1-adrenergic receptors; however, the intracellular signaling system linked to α-adrenergic receptors is present and functional. In contrast, A7r5 cells endogenously express functional β-adrenergic receptors, and A7r5 cells are therefore an attractive model to study the role of these receptors in the control of the SMC-phenotype. In conclusion, a) Mesenchymal Stem Cells from Wharton’s Jelly surrounding the human umbilical cord are a suitable in vitro model for the study of the molecular mechanisms that modulating Smooth Muscle Cell differentiation, and b) A7r5 cells are a good in vitro model system to investigate the role of the β-adrenergic receptor in controlling the phenotype of Vascular Smooth Muscle cells.

Τα πυρρολοκαρβαζολικά ανάλογα του ινδολοκαρβαζολικού αρωματικού σκελετού φυσικών προϊόντων είναι μία νέα τάξη ενώσεων που εξετάζονται ως πιθανά αντικαρκινικά φάρμακα. Διακρίνονται σε αναστολείς πρωτεϊνικών κινασών και σε παράγοντες που δρουν στη DNA τοποϊσομεράση Ι ή ΙΙ και βλάπτουν το DNA, ανάλογα με το μηχανισμό δράσης τους και τη δομή τους. Μελετώντας την επίδραση επτά πυρρολο[2,3-α]καρβαζολικών αναλόγων στην ενεργότητα της κυκλινο-εξαρτώμενης κινάσης 1 (cyclin dependent kinase 1, CDK1) βρήκαμε ότι μόνο ένα από τα ανάλογα (1e) ανέστειλε πλήρως και με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο το ένζυμο, ενώ όλα αναστέλλουν μερικώς ή πλήρως την ενεργότητα της τοποϊσομεράσης Ι in vitro. Στηn παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση των ίδιων αναλόγων στον πολλαπλασιασμό και μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro και στην αγγειογένεση in vivo, στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας. Διαπιστώθηκε ότι όλα τα ανάλογα αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro, καθώς και την αγγειογένεση in vivo, αλλά διαφέρουν ως προς την αποτελεσματικότητα ή την ισχύ. Από προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας είναι γνωστό ότι ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη (PTN) επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων in vitrο, δρώντας μέσω του υποδοχέα της με δράση φωσφατάσης τυροσίνης RPTPβ/ζ και της ιντεγκρίνης ανβ3. Με δεδομένο ότι στη βιβλιογραφία η CDK1 έχει αναφερθεί να συμμετέχει στην επαγόμενη από ενεργοποίηση της ανβ3 μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, μελετήσαμε την επίδραση των πυρρολο[2,3-α]καρβαζολικών αναλόγων στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Μόνο το ανάλογο 1e ανέστειλε τη δράση της ΡΤΝ, τόσο στα ενδοθηλιακά, όσο και στα ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG, τα οποία εκφράζουν RPTPβ/ζ και ιντεγκρίνη ανβ3 και μεταναστεύουν ως ανταπόκριση στη διέγερση με ΡΤΝ. Ίδια δράση είχε και η ροσκοβιτίνη, γνωστός αναστολέας των CDK1/2 και CDK5 και στα δύο είδη κυττάρων, ενώ ο εκλεκτικός μόνο για CDK1/2 αναστολέας NU2058 δεν είχε καμία δράση στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων δεν εξαρτάται από τις κινάσες CDK1 και CDK2, αλλά από την κινάση CDK5, δεδομένο που επιβεβαιώθηκε με μείωση της έκφρασης της CDK5 με την τεχνική του siRNA. Η ΡΤΝ δρα επαγωγικά στην ενεργότητα της CDK5, με μέγιστη δράση 5 λεπτά μετά την επίδραση της ΡΤΝ. Σε αυτήν την ενεργοποίηση συμμετέχει και ο υποδοχέας της ΡΤΝ RPTPβ/ζ, αλλά όχι η ιντεγκρίνη ανβ3. Από παλιότερες μελέτες μας είναι δεδομένο πως η πρόσδεση της ΡΤΝ στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση της κινάσης c-SRC, η οποία απαιτείται για την επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Για πρώτη φορά αναφέρουμε την αλληλεπίδραση της c-SRC με την CDK5 σε εκχυλίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και το ότι η επαγόμενη από ΡΤΝ ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 επιτυγχάνεται μέσω ενεργοποίησης της κινάσης c-SRC. Τέλος, η κινάση CDK5 δεν εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης ανβ3 και των ERK1/2 από την ΡΤΝ. Συμπερασματικά, η κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 5 (CDK5) φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται με αγγειογένεση και τα αποτελέσματά μας προσφέρουν σημαντικά δεδομένα προς αυτήν την κατεύθυνση. Eίναι η πρώτη φορά που περιγράφεται η έκφραση του βασικού ρυθμιστή της CDK5 p35 σε άλλο είδος κυττάρων, εκτός των νευρικών, και ιδιαίτερα στα ενδοθηλιακά. Ο εξέχων ρόλος της κινάσης CDK5 σε διάφορες λειτουργίες και σε παθολογικές καταστάσεις, αρχικά στο νευρικό και στη συνέχεια στα περισσότερα συστήματα, καθιστά ιδιαίτερα σημαντικό το σχεδιασμό και την ανάπτυξη αναλόγων που επιδρούν στην ενεργότητά της άμεσα ή έμμεσα, με βάση τη δομή του αναλόγου 1e. / Indolocarbazole alkaloids constitute a group of natural products that have attracted great attention because of their potential therapeutic applications. Ιndolopyrrolocarbazoles are a new class of antitumor drugs, which can be divided into two major groups, depending on their mechanisms of action and structural features: protein kinase inhibitors and DNA-damaging agents. We have previously evaluated the effect of 7 pyrrolo[2,3-a]carbazole analogues on CDK1/cyclinB (Cyclin Dependent Kinase 1, CDK1) activity and found that only compound1e totally inhibited the enzyme in a dose-dependent manner, while all analogues partially or totally inhibited the activity of topoisomerase I in vitro, with compound 1e being the least effective. In this thesis, the effect of all the pyrrolo[2,3-a]carbazole analogues on angiogenesis was investigated, using the in vivo model of the chick embryo chorioallantoic membrane, as well as proliferation and migration of human endothelial cells in vitro. All the analogues had an effect on the proliferation and migration of endothelial cells in vitro and angiogenesis in vivo, but with differences in their effectiveness or potency. We have previously shown that PTN induces migration of endothelial cells through binding to its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and ανβ3 integrin. The recent report that ανβ3 expression up-regulates CDK1, which then modulates cell migration, led us to test the effect of the CDK1 inhibitor compound 1e and the other pyrrolo[2,3a]carbazole analogues on the PTN induced migration of human endothelial cells. Only compound 1e inhibited PTN induced migration of human endothelial cells, a result also confirmed in human glioblastoma U87MG cells, which are known to express both RPTPβ/ζ and ανβ3 and migrate in response to PTN. Roscovitine, a synthetic inhibitor of CDKs with selectivity towards CDK1/2 and CDK5, completely attenuated PTN-induced migration of endothelial cells, while the CDK1/2 selective inhibitor NU2058 had no effect, suggesting that inhibition of CDK5 is responsible for inhibition of PTN-induced cell migration. The complete attenuation of PTN-induced migration of endothelial cells following the down-regulation of CDK5 by siRNA further confirmed that CDK5 plays an important role in PTN-induced migration of endothelial cells. PTN increased CDK5 kinase activity with the maximum increase observed within 5 min after stimulation of cells with PTN. This was confirmed by both direct kinase assays, as well as by measuring interaction of CDK5 with its activator protein p35. PTN-induced activation of CDK5 is independent of ανβ3, but depends on RPTPβ/ζ and its downstream activated c-SRC kinase. This is the first time that an interaction between CDK5 and c-SRC is reported in extracts of endothelial cells, as well as the fact that PTN induced CDK5 activation requires c-SRC activation in these cells. Finally, we report no immediate effect of kinase CDK5 on PTN induced activation of ανβ3 integrin and ERK1/2 phosphorylation. Accumulating data favour the notion that CDK5 plays an important role in angiogenesis-related functions of endothelial cells and our data reinforce this observation. The expression of p35 in endothelial cells, the prime regulator of CDK5, is reported here for the first time in other type of cells apart from neuronal. The basic role of CDK5 in several pathologies point out the importance of research and development of compounds that can be effective in inhibiting this kinase, based on the structure of analogue 1e.

Η διδακτορική μου διατριβή εστιάζει στη λειτουργική ανάλυση του μοριακού μηχανισμού λειτουργίας της ιντεγκρινο-συνδεόμενης κινάσης (ILK) κατά την ανάπτυξη στη Drosophila. Έγινε διερεύνηση: α) της λειτουργικής συντήρησης της ILK κατά την εξέλιξη, β) του πιθανού ρόλου συγκεκριμένων αμινοξικών μοτίβων στον κυτταρικό εντοπισμό και τη λειτουργία της πρωτεΐνης και γ) των λειτουργικών ιδιοτήτων της ILK όταν είναι ομοιοπολικά συζευγμένη στην πλασματική μεμβράνη. Παράλληλα, αναζητήσαμε νέους λειτουργικούς ρόλους της ILK κατά την ανάπτυξη: α) σε άλλους ιστούς εκτός από το μυϊκό σύστημα και β) στην ωογένεση. Η ILK στο επίπεδο της αμινοξικής αλληλουχίας παρουσιάζει 60% ταυτότητα και 75% ομολογία με την αντίστοιχη πρωτεΐνη των θηλαστικών. Με βάση αυτή την ομολογία, ελέγξαμε την πιθανή φυλογενετική συντήρηση της λειτουργίας της ILK. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν διαγονιδιακά στελέχη που περιείχαν την κωδική περιοχή της ILK του ανθρώπου (hILK) και του ποντικού (mILK) αντίστοιχα. Η ILK του ποντικού και του ανθρώπου ακολουθεί παραπλήσιο πρότυπο υποκυτταρικής κατανομής με την ενδογενή πρωτεΐνη στα μυϊκά κύτταρα Drosophila. Οι δυο ετερόλογες πρωτεΐνες υποκαθιστούν τη λειτουργία της ILK στη Drosophila. Ωστόσο, η ILK του ανθρώπου παρουσιάζει μειωμένη δυνατότητα πρόσδεσης με την parvin της Drosophila. Προκειμένου να διερευνήσουμε το μοριακό μηχανισμό ρύθμισης και δράσης της ILK κατά την ανάπτυξη, ελέγξαμε εάν η φωσφορυλίωση των αμινοξέων S176 και T180 υπεισέρχεται στη ρύθμιση της λειτουργίας της ILK. Σε πειράματα κυτταρικών σειρών έχει δειχθεί ότι στις θέσεις αυτές η φωσφορυλίωση ελέγχει την υποκυτταρική κατανομή της πρωτεΐνης στον πυρήνα. Ωστόσο, αποδείξαμε ότι η πιθανή φωσφορυλίωση στις ισχυρά συντηρημένες θέσεις S176 και T180 δεν είναι απαραίτητη για τον εντοπισμό της ILK στις μυοτενοντικές συνδέσεις και τη λειτουργία της ILK. Ένα άλλο αμινοξικό κατάλοιπο που είναι απαραίτητο για τον εντοπισμό της ILK στις εστιακές θέσεις προσκόλλησης είναι το F436, το οποίο εδράζεται στην τελευταία α έλικα του καρβοξυτελικού λοβού της περιοχής κινάσης. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός της ILK και η λειτουργία της δεν επηρεάζονται από τη σημειακή μεταλλαγή F436Α σε αντίθεση με πειράματα σε κυτταρικά μοντέλα. Η σημειακή μεταλλαγή F436A αποδυναμώνει την ικανότητα αλληλεπίδρασης της ILK με την parvin. Εξετάσαμε αν η μεμβρανοδεσμευόμενη ILK μέσω παλμυτυλίωσης ή φαρνεσυλίωσης μπορεί να υποκαταστήσει την απουσία της ενδογενούς, καθώς και εάν μπορεί να προσελκύσει πρωτεΐνες του συνδεοσώματος ανεξάρτητα των ιντεγκρινών. Κατασκευάστηκαν δυο εναλλακτικές μορφές μεμβρανοδεσμευμένης ILK, οι GAP-ILK-GFP και ILK-GFP-HRAS εντοπίζονται με επιτυχία σταθερά στην πλασματική μεμβράνη των εμβρυϊκών μυϊκών κυττάρων. Επίσης, οι GAP-ILK-GFP και ILK-GFP-HRAS υποκαθιστούν πλήρως την ενδογενή ILK σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια της ζωής της μύγας. Τέλος, η GAP-ILK-GFP συγκεντρώνει στις ΜΤΣ τα άλλα δυο μέλη του IPP συμπλόκου αλλά και την talin στις ΜΤΣ εμβρύων τελικού σταδίου τόσο αγρίου τύπου όσο και ομοζυγώτων για aPS2. Παράλληλα, μελετήσαμε , τόσο σε γενετικό όσο και σε μοριακό επίπεδο, το ρόλο της ILK στη μορφογένεση του ωοθυλακίου, την οργάνωση και ομοιόσταση του θυλακώδους επιθηλίου κατά τη διάρκεια της ωογένεσης στη Drosophila. Αποσιωπήσαμε την ilk κατασκευάζοντας γενετικά μωσαϊκά αλλά και ιστοειδικά διασωσμένα άτομα. Παρατηρήσαμε ότι η ILK είναι απαραίτητη για τη διαδικασία της ωογένεσης στη μύγα. Η απουσία της ILK προκαλεί διαταραχές στο σχηματισμό των διαθυλιακών μίσχων και ανωμαλία στο διαχωρισμό των νεοσχηματιζόμενων διαδοχικών ωοθυλακίων (σιαμαία ωοθυλάκια). Επίσης, τα πειράματά μας αποκάλυψαν ότι η ILK είναι απαραίτητη για την οργάνωση των ινιδίων ακτίνης κατά τα τελευταία στάδια της ωογένεσης και για την ομοιόσταση του κυτταροσκελετού ακτίνης κατά τον ακραιο-βασικό άξονα του κυττάρου. Ακόμη, η ILK είναι απαραίτητη για την οργάνωση και διατήρηση των βασο-πλευρικών κυτταρικών συνδέσεων στα θυλακιοκύτταρα, αλλά όχι των συνδέσεων ζώνης. Η απουσία της ILK διαταράσσει τον εντοπισμό των ιντεγκρινών στα άκρα των ινιδίων τάσης της ακτίνης στα θυλακιοκύτταρα των τελευταίων σταδίων. Επιπλέον, η ILK συμμετέχει στη ρύθμιση της δυναμικής της F-ακτίνης μειορρυθμίζοντας το Dia και αυξορρυθμίζοντας την profilin. H ILK εμπλέκεται στον έλεγχο της συσταλτότητας των ινιδίων ακτο-μυοσίνης στα θυλακιοκύτταρα των τελευταίων σταδίων, πιθανότατα μέσω της διαταραχής στον υποκυτταρικό εντοπισμό του RhoI, καθώς και μέσω της εκτοπικής συσσώρευσης της μυοσίνης (zipper). Τέλος, η ilk αλληλεπιδρά γενετικά με τη dpak στο επιθήλιο του ωοθυλακίου. Η ΙLK επηρεάζει τον εντοπισμό της dPAK στα θυλακιοκύτταρα τελευταίων σταδίων. Επίσης, η dPAK είναι απαραίτητη για τον εντοπισμό των ιντεγκρινών και της ILK στα άκρα των ινιδίων τάσης της ακτίνης. Ενώ, η απουσία της dpak, όπως και της ilk, διαταράσσoυν την οργάνωση και των ινιδίων τάσης της ακτίνης σε θυλακιοκύτταρα τελευταίων σταδίων. / My thesis is focused on the functional analysis of the molecular mechanism of the integrin-linked kinase (ILK) during development in Drosophila. We studied: a) the functional conservation of ILK in evolution, b) the possible role of specific amino acid motifs in the subcellular localization and function of ILK and c) the functional properties of ILK, when covalently bound to the plasma membrane. Furthermore, we sought new functional roles for ILK during development: a) in other tissues besides muscle system and b) in oogenesis. ILK protein sequence shares 60% identity and 75% similarity with the mammalian ILK. Based on these data, we tested the possible phylogenetic conservation of ILK function. For this purpose, we generated transgenic lines carrying the coding sequence of either human ILK (hILK) or mouse ILK (mILK). The mammalian ILK has localizes similarly to the endogenous protein, in the muscle cells of Drosophila. Both mammalian proteins can substitute for the ILK function in Drosophila. However, human ILK binds to Dparvin with reduced affinity compared to the fly ILK. In order to investigate the molecular mechanism through which ILK regulates and acts during development, we tested whether the phosphorylation on the amino acids S176 and T180 contributes to the regulation of ILK function. It has been shown, in cell culture models, that the phosphorylation on these sites controls the subcellular localization of the protein in the nucleus. However, we proved that the possible pgoshorylation of these highly conserved residues is dispensable for the ILK localization at the muscle attachment sites (MAS) as well as for the function of ILK. Another residue which is necessary to localise ILK at the focal adhesion sites is F436. It is located on the last a helix of the carboxyl-terminal lobe of the kinase-like domain. The subcellular localization and the ILK function are unaffected by the point mutation F436A, in contrast to the experimental data on cell culture models. The point mutation F436A affects the ability of ILK to bind to parvin. We examined, whether membrane-bound ILK, through palmytoylation or farnesylation, is able to substitute the absence of the endogenous ILK, if ii can recruit proteins of the adhesome, independently of integrins. We generated two alternative forms of membrane-bound ILK, GAP-ILK-GFP and ILK-GFP-HRAS, which both localize successfully at the plasma membrane of the embryonic muscle cells. Also, GAP-ILK-GFP and ILK-GFP-HRAS can substitute for the endogenous ILK throughout development. Moreover, GAP-ILK-GFP is able to recruit both PINCH and Parvin, as well as talin at the MAS, in both wild type and aPS2 mutant embryonic muscle cells. Furthermore, we studied, in genetic molecular level, the role of ILK in the morphogenesis of the egg chambers, the organization and the homeostasis during oogenesis in Drosophila. We used two experimental approaches in order to silence ilk: a) we generated genetic mosaics for ilk and b) we used conditionally rescued ilk-/- flies. We observed that ILK is indispensable for the process of oogenesis in the fly. Loss of ILK disrupts the stalk cell formation and the separation of the successive newly formed egg chambers (twin egg chambers). Also, our experiments revealed that ILK is essential for the organization of the actin stress fibers at the late developmental stages of oogenesis and for the homeostasis of the actin cytoskeleton along apico-basal axis of the cell. ILK is indispensable for the organization and the maintenance of the baso-lateral cell junctions in the follicle cells, but not for the adherens junctions. Loss of ILK disrupts the localization of integrins at the tips of the actin stress fibers of the follicle cells at late developmental stages. Moreover, ILK participates in the regulation of the F-actin dynamics by down-regulating Dia and up-regulating profilin. ILK is involved in the control of the contractility of the acto-myosin fibers in the follicle cells at late developmental stages, probably by affecting the subcellular localization of Rho1, and causing ectopic accumulation of myosin (zipper). Finally, ilk interacts genetically with dpak in the follicular epithelium. ILK affects dPAK localization in the follicle cells at late developmental stages. Furthermore, dPAK is essential for the localization of both integrins and ILK at the tips of actin stress fibers. Loss of dpak, similarly to ilk, disrupts the organization of actin stress fibers in follicle cells at late developmental stages.