The human leukocyte antigen-G (HLA-G has been considered to be an important tolerogeneic molecule playing an essential role in maternal-fetal tolerance, which constitutes the perfect example of successful physiological immunotolerance of semi-allografts. In this context, we investigated the putative role of this molecule in the allogeneic hematopoietic cell transplantation setting. The percentage of HLA-G+ cells in peripheral blood of healthy donors and allo-transplanted patients was evaluated by flow cytometry. Their immunoregulatory and immunotolerogeneic properties were investigated in in vitro immunostimulatory and immunosuppression assays. Immunohistochemical analysis for HLA-G expression was performed in skin biopsies from allo-transplanted patients and correlated with the occurrence of graft-versus-host disease. We identified a CD14+ HLA-Gpos population with an HLA-DRlow phenotype and decreased in vitro immunostimulatory capacity circulating in peripheral blood of healthy individuals. Naturally occurring CD14+HLA-Gpos cells suppressed T cell responses and acted immunotolerogenic on T cells by rendering them hyporesponsive and immunosuppressive in vitro. After allogeneic hematopoietic cell transplantation, HLA-Gpos cells increase in blood. Interestingly, besides an increase of CD14+HLA-Gpos cells there was also a pronounced expansion of CD3+HLA-Gpos cells. Of note, CD3+HLA-Gpos and CD14+HLA-Gpos cells from transplanted patients were suppressive in in vitro lymphoproliferation assays. Furthermore, we found an upregulation of HLA-G expression in skin specimens from transplanted patients which correlated with graft-versus-host disease. Inflammatory cells infiltrating the dermis of transplanted patients were also HLA-Gpos. Here, we report the presence of naturally occurring HLA-Gpos monocytic cells with in vitro suppressive properties. HLA-G epressing regulatory blood cells were found in increased numbers after allogeneic transplantation. Epithelial cells in skin affected by graft-versus-host disease revealed elevated HLA-G expression. / Το ανθρώπινο λεμφοκυτταρικό αντιγόνο -G (HLA-G) θεωρείται ένα σημαντικό ανοσορρυθμιστικό μόριο, το οποίο κατέχει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στην προαγωγή εμβρυο-μητρικής αντοχής, η οποία αποτελεί το ιδανικό παράδειγμα επιτυχούς φυσιολογικής ανοσοαντοχής του ημι-αλλομοσχεύματος. Στο πλαίσιο αυτό, στοχεύσαμε στη διερεύνηση του πιθανού ρόλου του μορίου HLA-G στην αλλογενή μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (άλλο-ΜΑΚ). Το ποσοστό των HLA-G+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα των υγιών ενηλίκων και των μεταμοσχευμένων ασθενών ελέγθηκε με κυτταρομετρία ροής. Ο ανοσορρυθμιστικός τους ρόλος και οι ανοσοκατασταλτικές τους ικανότητες ελέγθηκαν σε in vitro ανοσοδιεγερτικές και ανοσοκατασταλτικές δοκιμασίες. Ανοσοιστοχημική ανάλυση της έκφρασης του HLA-G πραγματοποιήθηκε σε δερματικές βιοψίες από άλλο-μεταμοσχευμένους ασθενείς και συσχετίστηκε με την εμφάνιση της νόσου του μοσχεύματος έναντι του ξενιστή(GvHD). Ένας CD14+HLA-Gθετ πληθυσμός με HLA-DRlow φαινότυπο και μειωμένη in vitro ανοσοδιεγερτική ικανότητα ανιχνεύτηκε στο περιφερικό αίμα των υγιών ενηλίκων. Τα φυσικώς εμφανιζόμενα CD14+HLA-Gθετ κύτταρα κατέστειλαν τον Τ λεμφοκυτταρικό πολλαπλασιασμό και είχαν ανοσοκατασταλτική επίδραση στα Τ κύτταρα, μετατρέποντάς τα σε υπο-απαντητικά και ανοσοκατασταλτικά κύτταρα in vitro. Μετά την αλλογενή μεταμόσχευση, τα HLA-Gθετ κύτταρα αυξάνουν στο αίμα. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι πέραν της αύξησης των CD14+HLA-Gθετ κυττάρων παρατηρήθηκε επίσης μια ιδιαίτερη αύξηση των CD3+HLA-Gθετ κυττάρων στο αίμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα CD14+HLA-Gθετ και CD3+HLA-Gθετ κύτταρα των άλλο-μεταμοσχευμένων ασθενών ήταν ικανά να καταστέλλουν τον Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό in vitro. Επιπλέον ανιχνεύθηκε μια αύξηση της έκφρασης του HLA-G στις δερματικές βιοψίες των μεταμοσχευμένων ασθενών, η οποία συσχετίζονταν με τη νόσο GvHD. Τα φλεγμονώδη κύτταρα που είχαν διεισδύσει στο δέρμα των ασθενών ήταν επίσης HLA-G θετικά. Στη συγκεκριμένη εργασία αναφέρουμε την παρουσία φυσικώς εμφανιζόμενων HLA-Gθετ μονοκυττάρων με in vitro ανοσοκατασταλτικές ικανότητες. HLA-G εκφραζόμενα ρυθμιστικά κύτταρα ανιχνεύονται στο αίμα μετά τη μεταμόσχευση σε αυξημένους αριθμούς. Τα επιθηλιακά κύτταρα του δέρματος που είναι προσβεβλημένο από τη νόσο GvHD εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του HLA-G.

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής, ήταν η διερεύνηση της διεπιφάνειας ανθρώπινων μεσεγχυματικών κυττάρων (Human Mesenchymal Stem Cells, hMSCs) -Νανοσωλήνων Άνθρακα Πολλαπλού Τοιχώματος (Multi Walled Carbon Nanotubes, MWCNTs) υπό στατικές και δυναμικές συνθήκες. Οι MWCNTs έχει αποδειχθεί ότι, έχουν μοναδικές ηλεκτρικές και φυσικές ιδιότητες, μηχανική αντοχή και χαμηλή πυκνότητα, χαρακτηριστικά που τους καθιστούν εξαιρετικά ελκυστικούς για το σχεδιασμό βιοϋλικών για ορθοπαιδικές εφαρμογές. Αρχικά, μελετήθηκε η βιοσυμβατότητα των hMSCs σε επιφάνειες MWCNTs, ως προς την κυτταροτοξικότητα, τη μορφολογία, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την οργάνωση του κυτταροσκελετού. Το υπόστρωμα των MWCNTs ευνόησε την εξάπλωση των κυττάρων, προήγαγε τον πολλαπλασιασμό και προώθησε τη διαφοροποίηση των hMSCs σε οστεοβλάστες, όπως έδειξε η έκφραση αλκαλικής φωσφατάσης, οστεοποντίνης και οστεοκαλσίνης. Μελετήθηκε η γονιδιακή έκφραση των ιντεγκρινικών υποδοχέων, υπεύθυνων για την προσκόλληση των κυττάρων στους MWCNTs. Με την τεχνική του περιστρεφόμενου δίσκου, εκτιμήθηκε η δύναμη προσκόλλησης των hMSCs στους MWCNTs και η επίδραση της κάθε ιντεγκρίνης στη μεταβολή της δύναμης προσκόλλησης. Για τη διερεύνηση της απόκρισης των οστεοβλαστών στη μηχανική φόρτιση, τα προσκολλημένα κύτταρα στους MWCNTs καταπονήθηκαν για 3 και 24 ώρες, με σύστημα μηχανικής φόρτισης βασισμένο στην Αρχή Κάμψης Τεσσάρων Σημείων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, η φόρτιση επηρεάζει θετικά την έκφραση γονιδίων προσκόλλησης και δεικτών διαφοροποίησης. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η συμπεριφορά των hMSCs ως προς την κυτταροτοξικότητα, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την οργάνωση του κυτταροσκελετού και την έκφραση γονιδίων προσκόλλησης, σε τροποποιημένες επιφάνειες MWCNTs με υδροξυλομάδες, καρβοξυλομάδες και αμινομάδες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, η αμινοτροποποιημένη επιφάνεια ευνόησε σημαντικά την κυτταρική συμπεριφορά σε σύγκριση με τις άλλες δύο επιφάνειες. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της τοπογραφίας με χρήση κάθετα ευθυγραμμισμένων MWCNTs, σε σύγκριση με τυχαία προσανατολισμένους MWCNTs. Η απόκριση των hMSCs στους κάθετα ευθυγραμμισμένους MWCNTs ήταν καλύτερη σε σύγκριση με τους τυχαία προσανατολισμένους, τόσο ως προς τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση, όσο και ως προς την οργάνωση του κυτταροσκελετού. Τα αποτελέσματα της διατριβής είναι υποσχόμενα για το μελλοντικό σχεδιασμό βιοϋλικών με MWCNTs, με τελικό σκοπό την εφαρμογή σε θεραπείες στις οποίες απαιτείται ανακατασκευή του οστού. / The aim of the present study was the investigation of the interface of human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) – Multiwalled Carbon Nanotubes (MWCNTs), under static and dynamic conditions. MWCNTs have been proven to obtain unique electric and physical properties, mechanical strength and low density, which render them highly attractive for the design of biomaterials for orthopaedic applications. Firstly, the biocompatibility of MWCNTs was studied, in terms of hMSCs cytotoxicity, morphology, proliferation, differentiation, cytoskeleton organization and toxicity. The substrate of MWCNTs favored cell spreading, increased proliferation and promoted cell differentiation, as measured by the expression of alkaline phosphatase, osteopontin and osteocalcin. The gene expression of integrin receptors responsible for cell attachment on MWCNTs was studied. Using the Spinning Disc Technique, the attachment strength of hMSCs on MWCNTs was evaluated, as well as the impact of each integrin to the alteration of attachment strength. In order to investigate the cell response to mechanical loading, the attached cells on MWCNTs were stressed for 3 and 24 hours, using a system for mechanical loading based on the 4-point bending principle. Results showed that loading positively induces the expression of genes associated with attachment and differentiation markers. Additionally, the cell behavior concerning proliferation, differentiation, cytoskeleton organization, apoptosis and gene expression associated with attachment, was studied on MWCNTs after surface modification with hydroxyl-, carboxyl-, and amino- groups. The findings indicated that the amino- modified surface significantly favored the cell behavior, compared to the other two surfaces. Lastly, the topography effect was studied using vertically aligned MWCNTs. Cell response was found better on the vertically compared to the randomly oriented, in terms of proliferation, differentiation and cytoskeleton organization. The findings of the study are promising for the future design of biomaterials of MWCNTs, aiming for application in therapies where bone reconstruction is demanded.

Οι αυτοαναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς γονιδιακής μεταφοράς αποτελούν πολλά υποσχόμενους φορείς γονιδιακής θεραπείας. Στην παρούσα εργασία δημιουργήθηκε ο φορέας Zif-VP64-EP2 στα πλαίσια των μελετών γονιδιακής θεραπείας για τις αιμοσφαιρινοπάθειες. Πρόκειται για ένα κυκλικό πλασμίδιο, που φέρει το γονίδιο ενός τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα της γ-σφαιρίνης του Zif-VP64 υπό την επενέργεια του ισχυρού υποκινητή pSFFV καθώς και τo γονίδιο της eGFP με το S/MAR στοιχείο από την περιοχή 5’ του γονιδίου της ανθρώπινης ιντερφερόνης β υπό την επενέργεια του υποκινητή pCMV. Διαπιστώθηκε ότι το Zif-VP64-EP2 μεσολαβεί γονιδιακή μεταφορά σε διαμολυσμένα κύτταρα της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς Κ562. Η μακράς διάρκειας διαμολυσμένη καλλιέργεια (3 μήνες) καταδεικνύει ότι το όχημα είναι λειτουργικό και διατηρείται ως επισωματικό σε Κ562 κύτταρα διαμολυσμένα κύτταρα με το Zif-VP64- ΕΡ2. / Self-replicating episomal vectors for gene transfer are a new and very promising experimental approach to gene therapy. In this study, it was created the vector Zif-VP64-EP2, within the context of developing self-replicating episomal vectors for the gene therapy of hemoglobinopathies. Zif-VP64-EP2 is a circular plasmid which includes the gene of an artificial transcription factor for gamma globin: Zif-VP64 under the control of pSFFV promoter and the gene of eGFP with the S/MAR element from the region 5’ of the human interferon β gene under the control of pCMV promoter. It was established that Zif-VP64-EP2 was retained within the transfected Κ562 hematopoietic progenitor cell. Its episomal situation for a long time (3 months) and its normal expression in K562 human cells constitutes a proof of the utility of Zif-VP64- ΕΡ2 system in gene therapy applications.

Απο τις απαρχές της μελέτης του PAR1, είχε βρεθεί οτι βρίσκεται σε στενή συνάφεια με τον καρκίνο, με ποικιλία πειραμάτων που έγιναν σε καρκινικές σειρές και σε διάφορα πειραματικά μοντέλα ζώων. Οι σκοποί της παρούσας εργασίας μπορούν να συνοψιστούν ως εξης: Η διερεύνηση της έκφρασης του υποδοχέα 1 της θρομβίνης (PAR1) σε καρκινικές σειρές προερχόμενες από ανθρώπινους όγκους και συγκεκριμένα: Στις σειρές από καρκίνο του προστάτη PC3 και LNCaP και στις σειρές από καρκίνο του μαστού MDA-231 και MCF-7. Η διερεύνηση της λειτουργικότητας του παραπάνω υποδοχέα στις προαναφερθείσες σειρές και το αποτέλεσμα της αναστολής του υποδοχέα στην επιβίωση και στον πολλαπλασιασμό των μελετώμενων κυττάρων. Η διερεύνηση της ενεργοποίησης της ΜΑΡ κινάσης μέσω του PAR1. Και τελικά, η διερεύνηση της έκφρασης του PAR-1 σε ασθενείς που χειρουργήθηκαν για καρκίνο του πνεύμονα στην Παν/μιακη Καρδιοθωρακοχειρουργική κλινική της Πάτρας, απο τον Καθηγητή Κο Δ. Δουγένη και την ομάδα του. Ο ανταγωνιστής του PAR-1, SCH 79797, προκάλεσε μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των προαναφερθέντων καρκινικών σειρών, όπως μελετήθηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ και την ενσωμάτωση ραδιενεργού θυμιδίνης. Αυτή η μη ειδική ανταπόκριση όλων των μελετώμενων σειρών στον SCH, αποδόθηκε κατόπιν στο γεγονός ότι αυτοί οι ανταγωνιστές δεν ήταν απολύτως εκλεκτικοί για τον PAR-1 όπως πιστευόταν, όταν σχεδιάστηκαν. Ο συγκεκριμένος ανταγωνιστής επιλέχθηκε μεταξύ των λίγων, της μοναδικής κατηγορίας που υπήρχε, όταν ξεκίνησαν τα πειράματα. Η θρομβίνη υπερδιπλασίασε τον πολλαπλασιασμό της σειράς PC3 και δεν είχε κανένα αποτέλεσμα στον πολλαπλασιασμό της σειράς MDA-231. Το τελευταίο συμφωνεί και με προηγούμενη έρευνα όπου καταδείχθηκε ότι η θρομβίνη δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό, αλλά μειώνει τη μεταστατικότητα της σειράς MDA-231 (Kamath et al., 2001). Η αύξηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη PC3, από τη θρομβίνη γίνεται μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα της PAR-1, και μέσω ενεργοποίησης της ΜΑΡ κινάσης, όπως φάνηκε από τα πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε ο ειδικός αγωνιστής του PAR1, το εξαπεπτίδιο SFLLRN. Από κάποια πρώτα ενδεικτικά πειράματα φαίνεται ότι η ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ λαμβάνει χώρα μέσω διενεργοποίησης του EGFR, κάτι που έχει αποδειχθεί για άλλους GPCRs. Η έκφραση του PAR1 όπως μελετήθηκε με RT-PCR, σε δείγματα ασθενών που χειρουργήθηκαν για κακοήθεις όγκους στους πνεύμονες, ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα καρκινικού ιστού. Η υψηλότερη έκφραση του PAR1 ανιχνεύθηκε στον ασθενή με μελάνωμα και στον ασθενή του υψηλότερου σταδίου. Φυσικά ο αριθμός των ασθενών που μελετήθηκαν δεν αρκεί για εξαγωγή συμπερασμάτων, αλλά τα παραπάνω αποτελέσματα συμφωνούν με τα γνωστά ως σήμερα ευρήματα για τον PAR1. Παραμένει να διευκρινιστεί η σημασία της αυξημένης έκφρασης του PAR1 σε ασθενείς με κακοήθεις όγκους στους πνεύμονες, αφού πρώτα επιβεβαιωθεί αυτή η αυξημένη έκφραση σε μεγαλύτερο αριθμό ασθενών. / From the onset of studies of PAR1, it has been concluded that this receptor is closely related to cancer. This relationship has been established after various experiments in cancer cell lines and in experimental animal models. The purposes of the present study can be summarized as follows: To explore the expression of PAR1 in cell lines established from human solid tumors and specifically PC3 and LNCaP from prostate cancer and MDA-231 and MCF-7 from breast cancer. To explore the suppression of PAR1 to the above cell lines in cell division. To determine if the activation of PAR1 to the above cell lines leads to MAPK phosphorylation. And ultimatilly, to explore the expression of PAR1 in patients that have been operated for tumor in lungs in Patras University Hospitall by Dr. D. Dougenis and colleagues. It was found that PAR1 is strongly expressed in highly metastatic cell lines PC3 and MDA-231, opposite to the cells LNCaP and MCF-7 that have lower metastatic capacity. The finding for the breast cancer cells MDA-231 and MCF-7 was according to published results (Kamath et al., 2001). PAR1 selective antagonist SCH 79797, reduced cell survival and DNA synthesis to all the above mentioned cell lines, independently of PAR1 expression. These non-specific results contributed to the recent fact that these antagonists were not PAR1 selective finally. Thrombin caused more than 100% induction of DNA synthesis in PC3 cells and had no effect in MDA-231 cells in accordance with published results that thrombin reduces the metastatic capacity of MDA-231 cells (Kamath et al., 2001). This effect of thrombin in PC3 cells, is mediated by activation of PAR1 as it was shown with the use of the selective agonist peptide SFLLRN. The activation of PAR1 by thrombin in PC3 cells leads to MAPK activation as it was shown by Western analysis. Furthrmore, preliminary experiments indicate that MAPK phosphorylation after PAR1 activation may be result of EGFR transactivation. In the sample tissues from patients, PAR1 expression was detected in all cancers with different ODs. The number of the samples is not enough to lead to conclusions, but there are some important observations. The highest level of PAR1 expression as was detected by RT-PCR were found to the sample tissues of the patient diagnosed for melanoma and of the patient with the most advanced stage of lung cancer. More patients shoulde be examined and more experiments to be done in order to proceed to conclusions for the significance of PAR1 in lung cancer.

Τα αστροκυττώματα αποτελούν το συχνότερο τύπο πρωτοπαθών όγκων του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και παραδοσιακά θεωρούνται ότι σχετίζονται με ιδιαίτερα δυσμενή πρόγνωση. Η Συστημική προσέγγιση της καρκινογένεσης, εστιάζοντας στην αποκρυπτογράφηση του τρόπου λειτουργίας και δυναμικής αλληλεπίδρασης πολύπλοκων παθοβιολογικών δικτύων, προσφέρει σήμερα καινούριες ερευνητικές προοπτικές και πιθανές εναλλακτικές, περισσότερο αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές. Οι οιστρογονικοί υποδοχείς και οι συν – ρυθμιστές της μεταγραφής συνιστούν κομβικά σημεία “συνομιλίας” (cross – talk) πολύπλοκων μοριακών οδών του κυττάρου, διαμεσολαβώντας πλήθος κυτταρικών λειτουργιών φυσιολογικά αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις, ανάμεσα στις οποίες και ο καρκίνος. Οι παράγοντες EZH2 και SOX2 θεωρούνται μόρια κλειδιά του ρυθμιστικού μεταγραφικού κυκλώματος που χαρακτηρίζει το stemness. Η αποσαφήνιση της συμπεριφοράς του συγκεκριμένου αυτού δικτύου στα διάφορα νεοπλάσματα και ρόλος του σε σχέση με την απόκτηση ιδιότητας καρκινικού stem κυττάρου, θεωρείται καθοριστικής σημασίας στην προσπάθεια ερμηνείας του φαινομένου του καρκίνου ως πολύπλοκο προσαρμόσιμο σύστημα, που θα αναδείξει εναλλακτικούς θεραπευτικούς στόχους και θα επιτρέψει περισσότερο αποτελεσματικές σε σχέση με τις υπάρχουσες παρεμβάσεις. Σκοπός. Υπό το πρίσμα της Συστημικής προσέγγισης της κατανόησης της κακοήθους ανάπτυξης και εξέλιξης των αστροκυτταρικών όγκων, η παρούσα μελέτη διερεύνησε τα επίπεδα έκφρασης του Οιστρογονικού υποδοχέα β (ERβ), και των συν – ρυθμιστών AIB1, TIF2 and PELP1, όπως και την έκφραση των παραγόντων EZH2 και SOX2 σε αστροκυττώματα grade II ως IV και τη συσχέτιση μεταξύ του προφίλ έκφρασης των συγκεκριμένων παραγόντων, με κλινικοπαθολογικά δεδομένα. Υλικό και μέθοδος. Η έκφραση των πρωτεϊνών ERβ, AIB1, TIF2, PELP1, EZH2 και SOX2 εκτιμήθηκε σε 86 περιπτώσεις αστροκυτταρικών όγκων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Είκοσι grade II αστροκυττώματα, 22 grade III αναπλαστικά αστροκυττώματα και 46 grade IV πλειόμορφα γλοιοβλαστώματα (GBM) συμπεριλήφθησαν στη συγκεκριμένη μελέτη. Η μέθοδος με χρήση συστήματος ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, CA, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, CA, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των ERβ (Biogenex, CA, USA), AIB1 (BD Biosciences, Ca, USA), TIF2 (BD Biosciences, Ca, USA), PELP-1/MNAR (Novus Biologicals, CO, USA) EZH2 (Novocastra, UK) και SOX2 (R&D Systems, Inc.) χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Σε κάθε περιστατικό και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση. Αντιπροσωπευτικές περιοχές επιλέχθηκαν κατόπιν σάρωσης του πλακιδίου σε οπτικό πεδίο μικρής μεγέθυνσης (Χ100), ενώ η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 17.0, Chicago, IL, USA). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα. Σημαντική μείωση των επιπέδων του ERβ παρατηρήθηκε παράλληλα με την αύξηση του grade. Επιπλέον, η υψηλή ERβ έκφραση αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος θετικός προγνωστικός παράγοντας της συνολικής επιβίωσης κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση. Η έκφραση των AIB1, TIF2 και PELP1, δε συσχετίσθηκε με αυτή του ERβ, και ακολούθησε αντιστρόφως ανοδική τάση, παράλληλα με την αύξηση του grade. Η στατιστική ανάλυση περαιτέρω, ανέδειξε μία σημαντική αύξηση τόσο των επιπέδων EZH2 όσο και SOX2 στα grade III και IV σε σχέση με τα grade II αστροκυττώματα. Ισχυρή συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση των δύο δεικτών σε όλες τις κατά grade υποομάδες. Η Kaplan-Meier ανάλυση έδειξε ότι, η υψηλή EZH2 και SOX2 πρωτεϊνική έκφραση συνιστούν αρνητικό παράγοντα πρόγνωσης τόσο στο σύνολο των ασθενών όσο και κατόπιν διαστρωμάτωσης κατά grade. Τέλος, η πολυπαραγοντική Cox ανάλυση συνυπολογίζοντας την ηλικία, το φύλο, το grade και την έκφραση των δύο πρωτεϊνών έδειξε ότι μόνο η υψηλή EZH2 έκφραση μαζί με το υψηλό grade, αποτελούν ανεξάρτητους παράγοντες δυσμενούς πρόγνωσης. Συμπεράσματα. Οι παράγοντες ERβ, AIB1, TIF2 και PELP1 ενέχονται στους παθογενετικούς μηχανισμούς ανάπτυξης και εξέλιξης των αστροκυτταρικών όγκων, με τον ERβ να διαδραματίζει προστατευτικό ρόλο και τους AIB1, TIF2 και PELP1 να εμφανίζουν ογκο – προαγωγό δράση. Το ογκογενετικό δυναμικό των παραγόντων AIB1, TIF2 και PELP1 φαίνεται πως διαμεσολαβείται μέσω ανεξάρτητων του οιστρογονικού υποδοχέα μηχανισμών. Η έκφραση του ERβ, διαχωρίζοντας κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς ιδίου grade, θα μπορούσε να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο κατά τη λήψη εξατομικευμένων κλινικών αποφάσεων. Οι παράγοντες EZH2 και SOX2, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως εν δυνάμει δείκτες καρκινικών stem κυττάρων σε αστροκυτταρικούς όγκους, να βοηθήσουν τη βελτιστοποίηση τόσο διαγνωστικών όσο και προγνωστικών διαδικασιών στην κλινική πράξη, και να κατευθύνουν την ανάπτυξη εξατομικευμένων στρατηγικών θεραπείας. / Astrocytic tumors are the most common primary neoplasms of the central nervous system (CNS) and have traditionally been associated with disappointing clinical outcomes. The current challenge is to develop more efficacious and targeted therapeutic paradigms, exploiting the knowledge derived from the systems approach of understanding the complex networks underlying tumor formation and progression. Estrogen receptor beta (ERβ) and co-regulators of transcription AIB1, TIF2 and PELP1, are key components of complex cellular networks and integrate diverse signaling afferents with transcription programs controlling various physiological cellular processes and a variety of disease states including cancer. SOX2 and EZH2 represent crucial components of the reciprocal regulatory circuit that controls stemness. Elucidating the behavior of this particular network in cancer and its role in the formation of putative cancer stem cells is considered essential for the understanding of cancer as an adaptive complex system and subsequently allowing the discovery of more successful therapeutic designs. Purpose. In the context of the systems approach of comprehending tumorigenesis in astrocytomas, we sought to investigate the expression of ERβ and co – regulatory proteins AIB1, TIF1 and PELP1, as well as parallel expression of SOX2 and EZH2 in astrocytomas of various grades, and correlate the protein expression profiles with clinicopathological parameters and patients’ prognosis. Materials and methods. Expression of ERβ, AIB1, TIF2, PELP1, EZH2 and SOX2 was evaluated in 86 cases of astrocytic tumors, using Immunohistochemistry, on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Twenty grade II astrocytomas, 22 grade III anaplastic astrocytomas and 46 grade IV glioblastomas multiforme (GBM) were included in this study. Polymer based technique (Envision, Dako, CA, USA) or MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, CA, USA) and primary antibodies against ERβ1 (Biogenex, CA, USA), AIB1 (BD Biosciences, Ca, USA), TIF2 (BD Biosciences, Ca, USA), PELP-1/MNAR (Novus Biologicals, CO, USA) EZH2 (Novocastra, UK) and SOX2 (R&D Systems, Inc.) were used. In each case, the percentage of cells exhibiting positive staining was determined. Representative areas were selected at low power (x100) magnification. Cell counts were performed at a 400X magnification. Data were analyzed using the SPSS statistical package (SPSS©, Release 17.0, Chicago, IL, USA). The level of significance was set at p-value <0.05. Results. ERβ levels were significantly decreased with the progression of tumors’ grade. High expression of ERβ was an independent favorable prognostic factor on multivariate analysis. Expression of AIB1, TIF2 and PELP1, was not correlated to ERβ expression and followed an opposite trend, with increasing levels in grade III and IV relative to grade II tumors. Univariate survival analysis revealed that high AIB1, TIF2 and PELP1 expression was associated with worse prognosis. Statistical analysis further revealed significantly higher expression of EZH2 and SOX2 in high grade III and IV astrocytomas, compared to low grade II astrocytomas. Strong correlation between EZH2 and SOX2 was also detected within all subgroups according to grade. Kaplan-Meier showed that EZH2 and SOX2 high expression was predictive of worse overall survival in the whole cohort as well as after subgroup analysis by grade. Finally, multivariate Cox analysis that included age, gender, grade, and expression of both proteins, revealed that high EZH2 together with higher grade were strong negative prognostic factors. Conclusions. ERβ, AIB1, TIF2 and PELP1 appear to play an important role in the pathogenesis of astrocytic tumors, with ERβ exhibiting a protective effect, whereas AIB1, TIF2 and PELP1 facilitate malignant progression. AIB1, TIF2 και PELP1 contribution in tumor progression is speculated to be achieved through ERβ independent pathways. Moreover, the expression status of ERβ, by distinguish patient subpopulations with different prognosis within the same grade, could be a useful tool accommodating personalized clinical decision-making. EZH2 and SOX2 may serve as potential cancer stem cell markers in astrocytomas and as such help optimizing diagnostic and prognostic assessments and devising novel individually tailored treatment strategies.

Η υπερθερμία αποτελεί μια επικουρική μέθοδο θεραπείας του καρκίνου και η βιοϊατρική έρευνα τις τελευταίες δεκαετίες, με σκοπό την εκμετάλλευση και την ανάδειξη των ιδιοτήτων της μεθόδου, στοχεύει στην εφαρμογή της στην κλινική πράξη. Μία προσπάθεια με παρόμοιο σκοπό γίνεται τα τελευταία χρόνια στο Εργαστήριο Μικροκυμάτων και Οπτικών Ινών (ΕΜΟΙ) της σχολής Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Μηχανικών Υπολογιστών (ΗΜΜΥ) του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου, όπου έχει σχεδιαστεί και κατασκευαστεί ένα σύστημα υπερθερμίας. Το προτεινόμενο σύστημα ενσωματώθηκε σε ένα τρισδιάστατο σύστημα παθητικής μικροκυματικής ραδιομετρικής απεικόνισης (ΜiRaIS) για διαγνωστικές εφαρμογές εγκεφάλου, το οποίο μελετήθηκε και κατασκευάστηκε στα πλαίσια διδακτορικής διατριβής στο ίδιο εργαστήριο της σχολής ΗΜΜΥ. Στην παρούσα διπλωματική εργασία γίνεται η θεωρητική και πειραματική μελέτη του προτεινόμενου συστήματος της υπερθερμίας. Η αρχή λειτουργίας του είναι όμοια με αυτή του MiRaIS και βασίζεται στη χρήση μια ελλειψοειδούς αγώγιμης κοιλότητας για εστίαση της ακτινοβολίας επιλεκτικά στους ιστούς που χρήζουν θεραπείας. Ο ανακλαστήρας για εστίαση, που κατασκευάστηκε και χρησιμοποιήθηκε στην πειραματική διαδικασία, βελτιώνει την εργονομία του συστήματος, διατηρώντας παράλληλα της ιδιότητες εστίασης του πρωτότυπου ελλειψοειδούς. Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας πραγματοποιήθηκε θεωρητική μελέτη και μοντελοποίηση της διάταξης με σκοπό τη βελτίωση των ιδιοτήτων εστίασής της, καθώς και πειραματικές μετρήσεις του συνολικού συστήματος υπερθερμίας-μικροκυματικής ραδιομετρίας. Στη θεωρητική μελέτη, με χρήση του λογισμικού xFDTD που βασίζεται στη μέθοδο των πεπερασμένων διαφορών στο πεδίο του χρόνου, ερευνώνται δυο μέθοδοι για τη βελτίωση των ιδιοτήτων εστίασης του συστήματος (βάθος διείσδυσης της ακτινοβολίας, χωρική διακριτική ικανότητα) με τη χρήση διηλεκτρικών υλικών. Τα υλικά αυτά τοποθετούνται στο εσωτερικό του ελλειψοειδούς καθώς και γύρω από το μοντέλο κεφαλιού ως στρώματα προσαρμογής για την επίτευξη βηματικής αλλαγής της διηλεκτρικής σταθεράς στη διεπιφάνεια αέρα-μοντέλο ανθρώπινου κεφαλιού. Στην πρώτη προσέγγιση, το εσωτερικό του ελλειψοειδούς ανακλαστήρα γεμίζει με διηλεκτρικό υλικό χαμηλών απωλειών, με τα αποτελέσματα να δείχνουν σημαντική βελτίωση της χωρικής διακριτικής ικανότητας του συστήματος. Στη δεύτερη προσέγγιση του προβλήματος, χρησιμοποιείται ένα ημισφαίριο από διηλεκτρικό γύρω από το μοντέλο κεφαλιού, με τα αποτελέσματα να δείχνουν την αντίστοιχη βελτίωση της χωρικής διακριτικής ικανότητας και παράλληλα σημαντική μείωση των ανεπιθύμητων περιοχών εστίασης της ενέργειας. Η πειραματική διάταξη τοποθετήθηκε σε ανηχοϊκό θάλαμο, όπου και πραγματοποιήθηκαν όλες οι μετρήσεις. Παράλληλα με τα πειράματα υπερθερμίας, μελετήθηκε η δυνατότητα εφαρμογής της μεθόδου της μικροκυματικής ραδιομετρίας με τη γεωμετρία του προτεινόμενου συστήματος. Η μέθοδος της μικροκυματικής ραδιομετρίας θα μπορούσε να παρέχει τον έλεγχο της θερμοκρασίας της ακτινοβολούμενης περιοχής κατά τη διάρκεια των συνεδριών της υπερθερμίας. Στις πειραματικές διαδικασίες που ακολουθήθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν ομοιώματα νερού, τα οποία στη φάση της υπερθερμίας υπέδειξαν τις περιοχές εστίασης της ενέργειας για τη συχνότητα ακτινοβολίας, ενώ στη φάση της μικροκυματικής ραδιομετρίας βοήθησαν στη μελέτη της θερμοκρασιακής διακριτικής ικανότητας του συστήματος. Επίσης, διενεργήθηκαν μετρήσεις με στρώματα προσαρμογής από διηλεκτρικά υλικά, τα οποία τοποθετούνταν γύρω από το αντικείμενο ενδιαφέροντος, για την πληρέστερη κατανόηση της επίδρασης των υλικών αυτών στις ιδιότητες εστίασης του συστήματος και για την επιβεβαίωση των αντίστοιχων θεωρητικών αποτελεσμάτων. / The application of hyperthermia process has been widely used in clinical research and efforts are being made for its implementation in clinical practice, as many researchers have used this method as an adjunct treatment procedure for cancer. During the past two decades, a great deal of research has been carried out, with the aim of developing effective techniques for hyperthermia treatment, primarily using RF, microwave, and ultrasound energy. A similar effort is carried out in the Laboratory of Microwaves and Fiber Optics (MFOL), School of Electrical and Computer Engineering, National Technical University of Athens (NTUA), where a proposed hyperthermia system has been designed and constructed. A system for deep brain hyperthermia treatment, designed to also provide passive measurements of temperature and/or conductivity variations inside the human body, is presented in this paper. The proposed system comprises both therapeutic and diagnostic modules, operating in a totally contactless way, based on the use of an ellipsoidal beamformer to achieve focusing on the areas under treatment and monitoring. The radiometry monitoring module, the Three Dimensional Passive Microwave Radiometry Imaging System (MiRaIS), has been studied, designed and constructed in the framework of a PhD thesis in the same laboratory of MFOL. In the present thesis, the proposed system is theoretically and experimentally studied. The operation principal is based on the use of an ellipsoidal conductive wall cavity for focusing the emitted radiation on the tissues that should accept treatment. The ellipsoidal cavity, which was constructed and used in the experimentation procedure, is newly developed and improves the system’s ergonomy retaining at the same time the focusing properties of the prototype system. In the framework of the present study, theoretical modelling and experimentation of the proposed system was carried out in order to examine and improve its focusing attributes. In the theoretical study, two methods for the improvement of the system’s focusing properties (e.g. penetration depth of the electromagnetic field, spatial sensitivity) using dielectric materials are tested with the use of a commercially available software tool, xFDTD (x-Finite Difference Time Domain). The materials are placed inside the ellipsoidal or used as matching layers around the head model for the achievement of a stepped change of the refraction index on the air-human head model interface. In the first approach, the ellipsoidal volume is filled with a low loss dielectric material in order to improve the system’s spatial sensitivity. In the second approach, a hemi-sphere also filled with a dielectric material is placed around the human head model and the results revealed the improvement of the system’s spatial sensitivity and the reduction of the undesirable auxiliary energy-absorbing areas. The experiments were performed inside an anechoic chamber providing maximum accuracy by avoiding any external interference. Along with the hyperthermia experiments, the implementation of the microwave radiometry process was also tested with the proposed system. Microwave radiometry could provide the temperature monitoring of the radiated area during the hyperthermia sessions. In the experimental procedures water phantoms were used, which during hyperthermia indicated the energy-absorbing areas at the irradiation frequency, and during microwave radiometry revealed the system’s temperature sensitivity. Also, measurements were conducted using dielectric matching layers, placed around the medium of interest, in order to fully understand the effect of those materials on the system’s focusing properties as well as to confirm the respective theoretical results. Taking into consideration the present study and the advantage of the non invasive character of the proposed brain hyperthermia system, it is concluded that further research is required in order to explore its potentials at becoming a part of the standard treatment protocol of brain malignancy in the future.

Η υπερθερμία αποτελεί μια επικουρική μέθοδο θεραπείας του καρκίνου και η βιοϊατρική έρευνα τις τελευταίες δεκαετίες, με σκοπό την εκμετάλλευση και την ανάδειξη των ιδιοτήτων της μεθόδου, στοχεύει στην εφαρμογή της στην κλινική πράξη. Μια προσπάθεια με παρόμοιο σκοπό γίνεται τα τελευταία χρόνια στο Εργαστήριο Μικροκυμάτων και Οπτικών Ινών (ΕΜΟΙ) της σχολής Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Μηχανικών Υπολογιστών (ΗΜΜΥ) του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου, όπου έχει σχεδιαστεί και κατασκευαστεί ένα μικροκυματικό σύστημα υπερθερμίας. Το προτεινόμενο σύστημα ενσωματώθηκε σε ένα τρισδιάστατο σύστημα παθητικής μικροκυματικής ραδιομετρικής απεικόνισης (ΜiRaIS), το οποίο παρέχει τη δυνατότητα παρακολούθησης των μεταβολών της θερμοκρασίας και της αγωγιμότητας της υπό εξέταση περιοχής σε πραγματικό χρόνο και μελετήθηκε και κατασκευάστηκε στα πλαίσια παλαιότερης διδακτορικής διατριβής στο ίδιο εργαστήριο της σχολής ΗΜΜΥ. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή γίνεται η θεωρητική και πειραματική μελέτη του προτεινόμενου συστήματος υπερθερμίας. Η αρχή λειτουργίας του συστήματος είναι όμοια με εκείνη του MiRaIS και βασίζεται στη χρήση μιας ελλειψοειδούς αγώγιμης κοιλότητας για εστίαση της ακτινοβολίας επιλεκτικά στους ιστούς που χρήζουν θεραπείας. Ο ανακλαστήρας για εστίαση που κατασκευάστηκε και χρησιμοποιήθηκε στην πειραματική διαδικασία, βελτιώνει την εργονομία του συστήματος, διατηρώντας παράλληλα της ιδιότητες εστίασης του πρωτότυπου ελλειψοειδούς. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε αρχικά η θεωρητική μελέτη και μοντελοποίηση της διάταξης με σκοπό την εξακρίβωση των ιδιοτήτων εστίασης του συστήματος και στη συνέχεια επιχειρήθηκε η βελτίωση των ιδιοτήτων αυτών με χρήση διατάξεων διηελκτρικών υλικών, καθώς και πειραματικές μετρήσεις του συνολικού συστήματος υπερθερμίας-μικροκυματικής ραδιομετρίας. Η θεωρητική ηλεκτρομαγνητική μελέτη του συστήματος έγινε με τη χρήση ενός εμπορικά διαθέσιμου υπολογιστικού πακέτου προσομοίωσης (XFdtd, Remcom Inc.), το οποίο χρησιμοποιεί τη μέθοδο των πεπερασμένων διαφορών στο πεδίο του χρόνου για την επίλυση ηλεκτρομαγνητικών προβλημάτων. Ερευνώνται τρεις διατάξεις διηλεκτρικών υλικών με σκοπό τη βελτίωση των ιδιοτήτων εστίασης του συστήματος, οι οποίες επικεντρώνονται στη μελέτη του βάθους διείσδυσης της ακτινοβολίας και της χωρικής διακριτικής ικανότητας. Τα υλικά τοποθετούνται είτε στο εσωτερικό του ελλειψοειδούς είτε γύρω από το μοντέλο κεφαλιού ως στρώματα προσαρμογής, με σκοπό την επίτευξη βηματικής αλλαγής της διηλεκτρικής σταθεράς στη διεπιφάνεια αέρα-μοντέλο ανθρώπινου κεφαλιού. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν τα πλεονεκτήματα από τη χρήση των διηλεκτρικών υλικών, καθώς παρουσιάζεται βελτίωση και στις δυο παραμέτρους των ιδιοτήτων εστίασης, ανάλογα με τη διάταξη που χρησιμοποιείται, τη θέση του μοντέλου κεφαλιού στο εσωτερικό του συστήματος και τη συχνότητα λειτουργίας. Για τη διενέργεια των πειραμάτων, η πειραματική διάταξη τοποθετήθηκε σε ανηχοϊκό θάλαμο, ο οποίος εξασφαλίζει την απομόνωσή της από τον περιβάλλοντα χώρο. Στις πειραματικές διαδικασίες που ακολουθήθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν ομοιώματα, τα οποία στη φάση της υπερθερμίας υπέδειξαν τις περιοχές εστίασης της ενέργειας για την εκάστοτε συχνότητα ακτινοβολίας, ενώ στη φάση της μικροκυματικής ραδιομετρίας βοήθησαν στη μελέτη της θερμοκρασιακής διακριτικής ικανότητας του συστήματος. Η μέθοδος της μικροκυματικής ραδιομετρίας χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση των μεταβολών της θερμοκρασίας της ακτινοβολούμενης περιοχής κατά τη διάρκεια των συνεδριών της υπερθερμίας. Επίσης, κατά τη διάρκεια των πειραμάτων πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις με στρώματα προσαρμογής από διηλεκτρικά υλικά, τα οποία τοποθετήθηκαν γύρω από το αντικείμενο ενδιαφέροντος και βοήθησαν στην πληρέστερη κατανόηση της επίδρασης της παρουσίας τους στις ιδιότητες εστίασης του συστήματος και στην επιβεβαίωση των αντίστοιχων θεωρητικών αποτελεσμάτων. / The application of hyperthermia process has been widely used in clinical research and efforts are being made for its implementation in clinical practice, as many researchers have used this method as an adjunct treatment procedure for cancer. During the past two decades, a great deal of research has been carried out, with the aim of developing effective techniques for hyperthermia treatment, primarily using RF, microwave and ultrasound energy. A similar effort is carried out in the Laboratory of Microwaves and Fiber Optics (MFOL), School of Electrical and Computer Engineering, National Technical University of Athens (NTUA), where a proposed hyperthermia system has been designed and constructed. A system for deep brain hyperthermia treatment, designed to also provide passive measurements of temperature and/or conductivity variations inside the human body, is presented in the present PhD thesis. The proposed system comprises both therapeutic and diagnostic modules, operating in a totally contactless way, based on the use of an ellipsoidal beamformer to achieve focusing on the areas under treatment and monitoring. The radiometry monitoring module, the Three Dimensional Passive Microwave Radiometry Imaging System (MiRaIS), has been studied, designed and constructed in the framework of a previous PhD thesis in the same laboratory of MFOL. In the present thesis, the proposed system is theoretically and experimentally studied. The operation principal is based on the use of an ellipsoidal conductive wall cavity for focusing the emitted radiation on the tissues that should accept treatment. The ellipsoidal cavity, which was constructed and used in the experimentation procedure, is newly developed and improves the system’s ergonomics retaining at the same time the focusing properties of the prototype system. In the framework of the present work, theoretical modeling and experimentation of the proposed system is carried out in order to examine and improve its focusing attributes. In the theoretical study, three setups are investigated for the improvement of the system’s focusing properties (e.g. penetration depth of the electromagnetic field, spatial sensitivity) using dielectric materials. The research is carried out with the use of a commercially available software tool, XFdtd (Remcom Inc.). The materials are placed inside the ellipsoidal or used as matching layers around the head model for the achievement of a stepped change of the refraction index on the air-human head model interface. The results revealed the possible advantages of using matching dielectric materials, as improvement on the focusing properties of the system is clearly observed, depending on the setup used, the position of the head model inside the system and the operating frequency. The experiments were performed inside an anechoic chamber providing maximum accuracy by avoiding all possible EMC/EMI issues. Along with the hyperthermia experiments, the implementation of the microwave radiometry process was also tested with the proposed system. Microwave radiometry could provide the temperature monitoring of the radiated area during the hyperthermia sessions. In the experimental procedures water phantoms were used, which during hyperthermia indicated the energy absorbing areas at the irradiation frequency, while during microwave radiometry revealed the system’s temperature sensitivity. Also, measurements were conducted using dielectric matching layers, placed around the medium of interest, in order to fully understand the effect of those materials on the system’s focusing properties as well as to confirm the respective theoretical results. Taking into consideration the present study and the advantage of the non invasive character of the proposed brain hyperthermia system, it is concluded that further research is required in order to explore its potentials at becoming a part of the standard treatment protocol of brain malignancy in the future.

Τα τελικά προϊόντα προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (AGEs: Advanced Glycation Endproducts) παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των διαβητικών αγγειακών επιπλοκών. Το καλύτερα χαρακτηριζόμενο είναι η N-καρβοξυμεθυλ-λυσίνη (CML). Τα AGEs προκαλούν σημαντικές επιδράσεις στα αγγεία με την πρόσδεσή τους σε ειδικούς υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, όπως τον RAGE (Receptor for Advanced Glycation Endproducts). Διαλυτές μορφές του RAGE (sRAGE) εμφανίζονται στο ανθρώπινο αίμα και δρουν ως παγίδα αιχμαλωτίζοντας τους φλεγμονώδεις προσδέτες του RAGE εξωκυττάρια, προστατεύοντας με αυτό τον τρόπο τα κύτταρα από τη βλάβη που προάγεται από τα AGEs. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να μελετηθούν τα επίπεδα του sRAGE, η πρωτεϊνική έκφραση του RAGE, καθώς και τα επίπεδα CML σε σχέση με διάφορες κλινικές και βιοχημικές παραμέτρους σε παιδιά, εφήβους και νεαρούς ενήλικες με ΣΔ1. Τα επίπεδα sRAGE και CML προσδιορίστηκαν με ELISA και η πρωτεϊνική έκφραση του RAGE στα μονοπύρηνα του περιφερικού αίματος με ανοσοαποτύπωση κατά Western σε 74 παιδιά, εφήβους και νεαρούς ενήλικες με ΣΔ1 (13± 4 χρονών) και 43 μάρτυρες αντίστοιχης ηλικίας, φύλου και σταδίου Tanner. Σ’ αυτή την εργασία τα αυξημένα επίπεδα sRAGE στα παιδιά με ΣΔ1 και πιο ειδικά, σ’ αυτά ηλικίας κάτω από 13 ετών και με διάρκεια διαβήτη κάτω από 5 έτη, μπορεί να είναι ένα προσωρινό προστατευτικό μέτρο ενάντια στην κυτταρική βλάβη και πιθανόν να είναι επαρκές για να εξουδετερώσει επαρκώς τα κυκλοφορούντα CML, εμποδίζοντας έτσι τις διαβητικές αγγειακές επιπλοκές. Επίσης, μια ήπια αύξηση της LDL θα μπορούσε να είναι ένα ερέθισμα για την αύξηση του sRAGE, οδηγώντας στη δέσμευση του CML και τελικά τη μείωση των επιπέδων CML στην κυκλοφορία. Τα μειωμένα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης του RAGE 55 kd (υποδοχέα πλήρους μήκους) μπορεί να αντανακλούν την αυξημένη έκφραση του sRAGE στους ασθενείς με ΣΔ1 συνολικά λόγω της αποκοπής του RAGE με μεταλλοπρωτεϊνάσες. Με την παρουσία κάποιου παράγοντα κινδύνου, όπως αύξηση ηλικίας, περιμέτρου κοιλίας, BMI, συστολικής ή διαστολικής αρτηριακής πίεσης ή επιδείνωση λιπιδαιμικού προφίλ αυξάνεται η πρωτεϊνική έκφραση της ισομορφής αυτής, ενώ φαίνεται αντίστοιχα να μειώνονται τα επίπεδα του sRAGE. Φαίνεται τελικά ότι συνολικά στα παιδιά, τους εφήβους και τους νεαρούς ενήλικες με ΣΔ1 υπάρχει μια υποκλινική διαταραχή του άξονα sRAGE-RAGE-CML, η οποία δύναται να μετατραπεί σε κλινικά εμφανείς αγγειακές βλάβες, αν προστεθούν περαιτέρω επιβαρυντικοί παράγοντες. / The binding of Advanced Glycation Endproducts (AGEs) to their receptor (RAGE) plays a major role in the development of diabetic vascular complications. This work is based on the relation between circulating soluble RAGE (sRAGE) levels in children, adolescents and young adults with IDDM and RAGE protein expression in association with N-(carboxymethyl)lysine (CML), a major antigenic AGEs component. Circulating sRAGE and CML levels were determined by ELISA and RAGE protein expression was evaluated in peripheral blood mononuclear cells by western immunoblotting in 74 children, adolescents and young adults with IDDM (134 years old) and 43 age, sex and Tanner stage-matched controls. Serum sRAGE levels were significantly higher in IDDM than in controls, inversely correlated to diabetes duration and directly correlated to LDL levels. Furthermore, circulating CML levels were not significantly different between IDDM and controls. Also, the protein expression of the RAGE isoforms 55 kd (full-length), 64 kd and 100 kd, measured by western immunoblotting, was significantly lower in IDDM than in controls, whereas RAGE 37 kd levels were not significantly different between IDDM and controls. Finally, when there was a risk factor, such as increased age, poor lipid profile, increased BMI or waist circumference or increased systolic or diastolic pressure, then it seemed that isoforms RAGE 55, 64 and 100 kd were increased. Isoform RAGE 64 kd could be RAGE-v5, a splice variant which resulted in a change of amino acid sequence in the extracellular ligand-binding domain of RAGE. Isoform RAGE 37 kd seemed to be Δ8-RAGE, a soluble splice variant with probably protective function, which had been found increased in patients with increased HDL. Finally, isoform RAGE 100 kd seemed to be some other splice variant in peripheral mononuclear cells. In conclusion, increased serum levels of sRAGE seen in IDDM children may be a temporary protective measure against cell damage and may be sufficient to efficiently eliminate excessive circulating CML. Moreover, the lower protein expression of the full-length RAGE in IDDM may also reflect the increased sRAGE expression in patients due to RAGE cleavage by metalloproteases. Consequently, in IDDM children, adolescents and young adults there may be a subclinical perturbation of the sRAGE-RAGE-CML axis, which could lead to future clinical vascular damage if additional risk factors are added over time.