A capacidade dos vírus em inibir a resposta imune inata é uma condição que os permite manterem-se na natureza. O vírus parainfluenza 5 (PIV5), por exemplo, expressa a proteína V, a qual é descrita como uma inibidora da sinalização de interferon (IFN), assim antagonizando seu efeito antiviral. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos do bloqueio do receptor de IFN-I no crescimento de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) in vitro e elucidar as relações entre a replicação viral e a resposta de IFN-I pela célula infectada. Para isso, foi modificada uma linhagem celular de bovinos (CRIB) que expressa de forma permanente a proteína V do PIV5. Esta linhagem celular foi denominada CRIB/V. Foram, então, realizados ensaios de penetração, tamanhos de placas virais e curvas de crescimento usando as amostras de BoHV-1 e BoHV-5 em células CRIB e CRIB/V. A análise com BoHV-1 não mostrou diferenças significativas nas cinéticas de penetração e crescimento. Entretanto os tamanhos de placa foram maiores em CRIB/V do que em CRIB. Para o BoHV-5, a penetração foi um pouco mais rápida em CRIB/V. Mesmo que os títulos finais não tenham sido diferentes nas duas células, o BoHV-5 alcançou títulos mais altos em CRIB/V do que em CRIB em períodos iniciais da curva de crescimento em CRIB/V em comparação a CRIB. Além disso, a média do tamanho de placa para BoHV-5 foi maior em CRIB/V do que nas células CRIB. Diferentemente das observações com BoHV-1, nossos resultados sugerem que o bloqueio do receptor de IFN-I pela proteína V facilitou a penetração, liberação e disseminação célula-célula do BoHV-5 nas células bovinas, suprimindo uma resposta antiviral, pelo menos, durante os estágios iniciais da infecção. / The ability of viruses to inhibit innate immune responses dictates a possibility to maintain in nature. For instance, Parainfluenza virus 5 (PIV5) expresses the V protein, which is described to inhibit type I interferon (IFN-I) signaling , then, antagonizing its antiviral effects. The aim of this work was to study the effect of blocking the IFN-I receptor signaling by this V protein on the growth properties of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) in vitro. A plasmid expressing the V protein of PIV5 was transfected into CRIB cells. We performed penetration kinetics, measured viral plaque sizes and determined one step growth curves using BoHV-1 and BoHV-5 strains in both CRIB and CRIB/V cells. The analysis on BoHV-1 showed no significant difference in penetration and growth kinetics. However the BoHV-5 viral plaques were bigger in CRIB/V than CRIB. The penetration of BoHV-5 in CRIB/V cells was slightly faster than in CRIB cells. Even though the final titers did not differ in both cells, BoHV-5 reached higher titers in CRIB/V than in CRIB at earlier time points of its growth. Moreover, the mean plaque size caused by BoHV-5 in CRIB/V cells was spectacularly bigger in CRIB/V than in CRIB cells. Unlike the observations with BoHV-1, our results suggest that blocking the signaling via the IFN-I receptor by the V protein facilitated penetration, release and cell-to-cell spread of BoHV-5 in bovine cells, counteracting an antiviral response, at least, during the early stages of infection.

Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são importantes patógenos que podem afetar os tratos respiratório e genital e o sistema nervoso central de bovinos. Visando iniciar um estudo sobre a distribuição destes vírus em sêmen de bovinos no Brasil, foi realizada a detecção de BoHV-1 e 5 em amostras de sêmen através de duas reações em cadeia da polimerase do tipo nested (nPCRs) espécie-específicas. Foram testadas 53 amostras de sêmen fresco e 23 amostras de sêmen em palheta coletados de touros de dois estados brasileiros. DNA de BoHV-5 foi detectado em todas as amostras e 34 dessas também foram positivas para BoHV-1. Em cinco amostras de sêmen fresco e em 13 amostras de sêmen em palheta foi possível isolar BoHV-1 e/ou BoHV-5 infeccioso. Demonstramos, assim, que ambos os tipos virais foram detectados em amostras de sêmen de bovinos brasileiros, destacando a importância de se monitorar a presença desses agentes em sêmen de touros, para reduzir o risco de transmissão dessas viroses. Além disso, com o objetivo de contribuir com o controle destas infecções no território brasileiro, nesse estudo também se propôs a construção de um vírus recombinante com deleção do gene UL49.5, que codifica uma proteína de evasão imune, a partir de uma amostra de BoHV-5 gE-, gI- e US9-. Para isso, foi construído um cassete de deleção contendo o gene UL49.5 mutado que foi co-transfectado com DNA viral em células eucarióticas de bovinos. Até o momento não foi possível isolar vírus recombinantes, entretanto, vários parâmetros de transfecção foram aqui otimizados, o que facilitará a futura obtenção deste recombinante. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are important pathogens of the respiratory and genital tract of cattle and may also affect the central nervous system. Aiming begin the study of the distribution of these viruses in semen of Brazilian bulls, it was performed here the detection of BoHV-1 and 5 in semen samples by two species-specific nested polymerase chain reactions (nPCRs). Fifty three fresh semen samples and 23 frozen semen samples from two Brazilian states were tested. DNA of BoHV-5 was detected in all samples and 34 of these were positive for BoHV-1 as well. In addition, in 5 fresh semen samples and 13 frozen semen samples infectious BoHV-1 and /or BoHV-5 was isolated. Thus, we demonstrated that both viruses are detected in Brazilian semen samples, highlighting the importance of search for these agents in bull semen to reduce the risk of transmitting these viruses. Moreover, in order to contribute with control of these infections in Brazilian territory, this study also aims to make a recombinant virus with a deletion in the UL49.5 gene, which codes for an immune evasion protein, in a BoHV-5 gE-, gI- and US9- sample. To achieve this, a deletion cassette with a mutated UL49.5 gene was built and co-transfected with viral DNA in eukaryotic bovine cells. Hitherto no recombinant virus was isolated; however, many transfection parameters were optimized, favoring the achievement of the recombinant.

Infecções pelos herpesvírus bovinos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) têm sido sistematicamente detectadas em rebanhos bovinos brasileiros. Entretanto, por causa da alta similaridade antigênica entre estes dois vírus e a falta de testes sorológicos específicos, a prevalência de cada um deles é atualmente desconhecida. Com o objetivo de detectar e diferenciar infecções latentes causadas por BoHV-1 e/ou BoHV-5, gânglios trigêmeos de 200 bovinos foram coletados e analisados para a presença de DNA viral. As amostras foram coletadas em um frigorífico localizado no município de Capão do Leão, Rio Grande do Sul. Uma PCR semi quantitativa foi desenvolvida, otimizada e utilizada para detectar o DNA viral em gânglios. Para diferenciar entre infecções por BoHV-1 e BoHV-5, duas nested PCR tipo-específicas foram desenvolvidas e utilizadas. Além disto, as amostras de soros obtidas foram submetidas a testes de neutralização viral (VN) para detecção de anticorpos. O DNA de BoHV-1 e/ou BoHV-5 foi detectado em 87% dos animais. Os resultados das nested PCRs revelaram que 82,8% dos animais positivos estavam latentemente infectados com BoHV-1 e 93,1%, com BoHV-5. Além disto, foi detectada uma alta proporção de animais co-infectados com os dois vírus (75,9 %). Por outro lado, os resultados das VN mostraram que somente 49,5% dos animais apresentaram anticorpos anti-virais. Este é o primeiro estudo que utiliza testes moleculares para detectar infecções latentes por BoHV-1 e/ou BoHV-5 em gânglios de um grande número de animais e mostra uma alta proporção de co-infecções por estes dois vírus em bovinos. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) infections have been consistently detected in Brazilian bovine herds. However, mainly because of their high antigenic similarity and the lack of specific serologic tests for both viruses, the prevalence of each of these viruses is currently unknown. Aiming the detection and differentiation of latent infections caused by BoHV-1 and/or BoHV-5, we collected trigeminal ganglia of 200 bovines and analyzed them for the presence of viral DNA. The samples were collected in an abattoir located in Capão do Leão, Rio Grande do Sul. A semi quantitative PCR was developed, optimized and used to detect the viral DNA in ganglia. To differentiate between BoHV-1 and BoHV-5 infections, two type-specific nested PCR were developed and performed. In addition, for the detection of anti-viral antibodies, serum samples were submitted to the virus neutralizing test (VNT). DNA of BoHV-1 and/or BoHV-5 was detected in 87% of the animals. The results of the nested PCRs reveled that 82.8% of the bovines were latently infected with BoHV-1 and 93.1%, with BoHV-5. Moreover, we detected a high proportion of co-infected animals (75.9 %). On the other hand, the results of the VNT indicated that only 49.5% of the animals had anti-viral antibodies. This is the first study that applies molecular tests to detect latent infection by either BoHV-1 and/or BoHV-5 in ganglia of a high number of animals and shows such a high proportion of coinfections of these two viruses in bovines.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-06-07T14:07:30Z No. of bitstreams: 1 Juceli de Souza Oliveira.pdf: 1137843 bytes, checksum: 9a49dc75826e1357551a46adec897f65 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T14:07:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juceli de Souza Oliveira.pdf: 1137843 bytes, checksum: 9a49dc75826e1357551a46adec897f65 (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / In cattle, diseases of the central nervous system (CNS) cause serious economic losses, owing to the high mortality of animals that these diseases cause. Considering that Brazil is the largest beef exporters, it is necessary to strengthen the epidemiological surveillance of SCN diseases, performing the differential diagnosis of encephalitis and encephalopathy to provide epidemiological information to agriculture defense agencies and the National Rabies Control Program and Other Brain Diseases (PNCRH). Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5), the causative agent of bovine herpetic meningoencephalitis is one of the most important agents to be included. The objective of this work is to review the main neurological diseases of cattle in northeastern Brazil and report the occurrence of cases of necrotizing meningoencephalitis associated BoHV-5, between the years 2011-2012, in the state of Pernambuco. The clinical signs consisted of circling, blindness, nasal and ocular discharge, head pressing, muscle tremors, incoordination, and permanent lateral recumbence followed by death. At necropsy no significant changes were observed. After cutting the brain previously fixed in formaldehyde solution, softened grayish areas of granular appearance and cavitations in the cerebral cortex, midbrain, hippocampus, thalamus, basal ganglia and cerebellum were observed. Microscopically there was nonsuppurative meningitis and diffuse encephalitis with perivascular cuffs, mononuclear or undifferentiated cells and neuronal necrosis. In areas of polioencefalomalacia there was neuronophagia and the presence of Gitter cells. In the samples submitted to PCR there was amplification of DNA from BoHV-5. / Em bovinos, as doenças do sistema nervoso central (SNC) provocam sérios prejuízos econômicos, tendo em vista a elevada mortalidade de animais que provocam. Considerando que o Brasil situa-se entre os maiores exportadores de carne bovina, torna-se necessário o fortalecimento do sistema de vigilância epidemiológica das doenças do SCN, realizando o diagnóstico diferencial das encefalites e encefalopatias a fim de fornecer informações epidemiológicas para os órgãos de defesa agropecuária e ao Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros e Outras Encefalopatias (PNCRH). Dentre os agentes a serem incluídos, destaca-se os herpesvírus bovino 5 (BoHV-5), agente causador da meningoencefalite herpética bovina. O objetivo dessa dissertação é revisar as principais doenças neurológicas de bovinos no nordeste do Brasil e relatar a ocorrência em duas propriedades rurais no Estado de Pernambuco, de casos de meningoencefalite necrosante associada BoHV-5, que resultou na morte de 5 bovinos entre os anos de 2011-2012. Os sinais clínicos observados consistiram em andar em círculos, cegueira, pressão da cabeça contra objetos, tremores musculares, incoordenação, depressão acentuada e decúbito lateral permanente seguido de morte. À necropsia não foram observadas alterações significativas. Ao corte do encéfalo, após a fixação em formol, foram observadas áreas de aspecto granular ao corte, com coloração acinzentada, amolecidas e cavitações no córtex cerebral, mesencéfalo, hipocampo, tálamo, núcleos da base e cerebelo. Microscopicamente havia meningite não supurativa e encefalite difusa com a presença de manguitos perivasculares, de células mononucleares indiferenciadas e necrose neuronal. Nas áreas de polioencefalomalacia havia neuronofagia e a presença de células Gitter. Nas amostras submetidas à PCR houve amplificação do DNA de BoHV-5.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-11-12T17:12:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1291733 bytes, checksum: e4cfacdbab2bf88dacbcaac2e6ee8e4a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-12T17:12:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1291733 bytes, checksum: e4cfacdbab2bf88dacbcaac2e6ee8e4a (MD5) Previous issue date: 2018-07-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) pertence a ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae e gênero Varicellovirus. É o agente causador da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (IBR). Apresenta dominância cosmopolita e alta disseminação em rebanhos bovinos de todo o mundo, acarretando prejuízos econômicos associados aos problemas produtivos e reprodutivos. O objetivo desta pesquisa foi estudar a interação do BoHV-1 com o útero, ovários e tubas uterinas, além de investigar a presença e a capacidade de penetração do BoHV-1 em complexos cumulus-ovócitos de vacas não vacinadas contra o BoHV-1, por meio da imunomarcação viral utilizando a microscopia confocal de varredura a laser. Coletou-se amostras de sangue e os órgãos genitais de 75 vacas abatidas em frigorífico e avaliou-se a imunomarcação viral nos tecidos uterino, tubárico e ovariano. Total de 719 COCs foram divididos em dois grupos: COCs derivados de vacas soropositivas e de vacas soronegativas e processados para a microscopia confocal de varredura a laser. Além disso, este estudo investigou a capacidade de penetração do BoHV-1 nos ovócitos de vacas soronegativas. Para tal, os ovócitos foram divididos em dois grupos: Grupo I: COCs (n=312) e ovócitos desnudados (n=296) infectados experimentalmente com BoHV-1 e incubados durante uma hora a 38,5°C e 5% de CO 2 . O controle negativo formado por COCs (273) e ovócitos desnudados (n=310) foram submetidos ao mesmo protocolo, exceto a exposição ao BoHV-1 que não foi realizada. Grupo II: COCs (n=425) e ovócitos desnudados (n=405) foram submetidos ao mesmo protocolo de co-incubação com o BoHV-1, porém durante 24 horas. O controle negativo deste grupo foi formado por 398 COCs e 425 ovócitos desnudados submetidos ao mesmo protocolo exceto a exposição ao BoHV-1. Os resultados gerados nesta tese apresentam um grande significado para a área de reprodução animal. Os achados sugerem novos esclarecimentos sobre a infecção do BoHV-1 nos tecidos reprodutivos. As partículas virais do BoHV-1 foram detectadas no útero de 100% das vacas soropositivas (P<0,01). As tubas uterinas apresentaram o BoHV-1 em 73,2% e os ovários em 58,5% (P>0,05). Não foi observada a presença do vírus em nenhum órgão genital dos 34 animais soronegativos. Nenhum COC (n=276) proveniente de vacas soronegativas apresentou o vírus. No entanto, foi evidenciada a presença do BoHV-1 no citoplasma das células do cumulus em alta porcentagem de COCs (n=158) dos 443 COCs aspirados de vacas soropositivas. Em relação aos ovócitos com e sem a presença das células do cumulus, co- incubados com o BoHV-1, o vírus foi evidenciado no seu interior após 24 horas. Conclui- se que, aparentemente, este estudo é o primeiro a relatar a detecção de BoHV-1 no útero em 100% das vacas soropositivas, o que sugere que este órgão atua como uma fonte de infecção fetal e esteja implicado em desempenhar um papel no abortamento. A detecção do BoHV-1 nas células do cumulus de vacas soropositivas, sugere que vacas infectadas naturalmente e assintomáticas podem apresentar os COCs infectados pelo vírus. Ademais, este estudo é o primeiro a detectar o BoHV-1 no interior de ovócitos bovinos apresentando a zona pelúcida intacta. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) belongs to the Herpesvirales order, Herpesviridae family, Alphaherpesvirinae subfamily and Varicellovirus genus. It is the causative agent of Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR). Its cosmopolitan distribution and high dissemination in cattle herds around the world lead to economic losses related to productive and reproductive disorders. This research aimed to study the interaction of BoHV-1 in the uterus, oviducts, and ovarian tissues, also to investigate the ability of virus penetration in cumulus-oocyte complexes (COCs) from cows unvaccinated against BoHV-1 by immunofluorescence using confocal laser scanning microscopy. Blood samples and genital organs were collected from 75 cows to assess viral immunolabeling in the uterus, oviducts, and ovarian tissues. A total of 719 COCs were divided into two groups: COCs derivate from seropositive cows and those from seronegative cows. Then, the samples were processed for confocal microscopy analysis. Moreover, this study investigated the penetration capacity of BoHV-1 in oocytes from seronegative cows. Subsequently, oocytes were divided into two groups: Group I: COCs and denuded oocytes experimentally infected with BoHV-1 and incubated for 1 h at 38.5 °C and 5% CO 2 . The negative control group were formed by COCs (n = 273) and denuded oocytes (n = 310), which were subjected to the same protocol except for exposure to BoHV-1. Group II: COCs (n = 425) and denuded oocytes (n = 405) were subjected to the same co- incubation protocol with BoHV-1, but for 24 h. The negative control of this group consisted of 398 COCs and 425 denuded oocytes that were subjected to the same protocol except exposure to BoHV-1. The results generated in this thesis have a great significance for the field of animal reproduction. The findings suggest new insights regarding the BoHV-1 infection in reproductive tissue. The virus was detected in the uterus in 100% of seropositive cows (P<0.01), 73.2% of oviduct samples and 58.5% of ovarian tissue samples (P>0.05). No genital organ samples from the 34 seronegative animals had virus presence. None of 276 COCs from the seronegative cows presented BoHV-1. However, BoHV-1 was present in the cytoplasm of cumulus cells from 158 out of 443 COCs recovered from seropositive cows. The virus was detected after 24h co-incubation with the BoHV-1within oocytes (with or without the presence of cumulus cells). In conclusion, the virus detection of 100% in the uterine samples suggests this organ as a fetal infection source to be implicated in playing a role in abortion. The detection of BoHV-1 in the COCs of seropositive cows suggests that COCs from naturally infected and asymptomatic cows may be infected with BoHV-1. Moreover, this study appears to be the first to detect BoHV-1 within COCs and denuded oocytes exhibiting intact ZP, co-incubated with the virus for 24 h.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) is an alphaherpesvirus associated with meningoencephalitis, an important disease of cattle in South America. Differential modified live vaccines that allow differentiation between vaccinated and naturally infected animals have been used in programs for control and eradication of porcine and bovine herpesvirus infections in several countries. Like in other alphaherpesviruses, the enzyme thymidine kinase (TK) and the glycoprotein E (gE) are related with pathogenicity and virulence of BoHV-5. Thus, the present study aimed to produce and characterize BoHV-5 viruses defective in TK and gE genes out of a Brazilian wild-type strain (SV507/99). In the first part of this study, several BoHV-5 clones resistant to brivudin (BVDU), a nucleoside analog which select TK-deficient virus, were selected. One such clone (BoHV-5/R-27) demonstrated to be genetically stable in vitro, and displayed the same kinetics of replication, plaque size and morphology in cell monolayers compared to the parental strain. Moreover, BoHV-5/R-27 was shown to be attenuated for rabbits since no clinical signs were observed after intranasal inoculation. These results demonstrate that BoHV-5 is sensitive to BVDU; BVDU-resistant mutants can be selected, and the BoHV-5/R-27 resistant virus retained its ability to replicate in tissue culture and was attenuated for rabbits. In the second part of the study, three recombinants BoHV-5 strains defective in gE, TK and both genes were constructed using the strain SV507/99 as a background and were characterized in vitro. Homologous recombination in cell culture was used to delete and substitute the entire or part of the coding regions of gE and TK for the green fluorescent protein (GFP) and betagalactosidase (β-gal) genes, respectively. The absence of gE and TK genes was confirmed by immunoblotting and PCR, respectively. In vitro characterization of the recombinant viruses (BoHV-5 gEΔ, BoHV-5 TKΔ and BoHV-5 gE/TKΔ) demonstrated that the deletions did not affect their kinetics of replication when compared to the parental strain. However, recombinants BoHV-5 gEΔ and BoHV-5 gE/TKΔ produced smaller plaques than BoHV-5 TKΔ and SV507/99. This study demonstrated the viability of the recombinant BoHV-5 viruses, which can be further used in pathogenesis studies and for vaccine development as well. The third part of this study evaluated the immunogenicity in cattle of two inactivated oil-adjuvanted vaccines containing SV507/99 or BoHV-5 gE/TKΔ infected cell cultures. For this, forty calves (20 animals/group) were vaccinated on days 0 and 22 post-vaccination (pv) and serum samples collected at different time points pv were tested for neutralizing antibodies against the homologous BoHV-5 strain and against several heterologous BoHV-5 and bovine herpesvírus type 1 (BoHV-1) isolates. All vaccinated animals seroconverted after the second vaccination (mean titers of 17.5 for the SV507/99 group and 24.1 for the BoHV-5 gE/TKΔ group), and the neutralizing antibody titers remained up to day 116 pv, showing a gradual reduction. Cross-serology with heterologous BoHV-5 and BoHV-1 isolates indicated that both vaccinated groups reacted similarly to the same virus, but with higher magnitude against BoHV-5 isolates. These results demonstrated that the inactivated vaccine using the BoHV-5 gE/TKΔ recombinant induced a satisfactory serological response. Based on the fact that gE can be used as a negative serological marker, this strains can be an alternative as a differential vaccine. In summary, the presented results describe the production and characterization of BoHV-5 strains defective for two genes associated with virulence. The recombinant strains can be used in pathogenesis studies and constitute potential candidate for differential vaccines. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é um alfaherpesvírus associado com meningoencefalite, uma doença de grande importância em bovinos na América do Sul. Vacinas atenuadas por manipulação genética e contendo marcadores antigênicos que permitem a diferenciação sorológica entre animais vacinados e infectados naturalmente têm sido utilizadas com sucesso no controle e erradicação de infecções por herpesvírus suínos e bovinos em vários países. Como em outros alfaherpesvirus, a enzima timidina quinase (TK) e glicoproteína E (gE) estão relacionados com a patogenicidade e virulência do BoHV-5. Assim, o presente trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar cepas do BoHV-5 defectivas na TK e gE a partir de uma amostra brasileira (SV507/99). Na primeira parte do estudo foram selecionadas variantes resistentes a brivudin (BVDU), um análogo de nucleosídeo que seleciona vírus defectivos na atividade TK. Um clone viral resistente ao BVDU (BoHV-5/R-27) demonstrou ser geneticamente estável in vitro, replicou com a mesma cinética e produziu placas com diâmetro e morfologia similares às da cepa parental. A atenuação do variante BoHV-5/R-27 foi confirmada pela inoculação intranasal em coelhos, nos quais não produziu enfermidade. Os resultados demonstram que variantes do BoHV-5 resistentes ao BVDU podem ser selecionados e que mantém a capacidade de replicar em cultivo celular e são atenuados para coelhos. Na segunda parte do trabalho, três cepas recombinantes do BoHV-5 defectivas nos genes da gE, TK e ambos foram construídas a partir da cepa parental SV507/99 e caracterizadas in vitro. A técnica de recombinação homóloga foi utilizada para substituir integral ou parcialmente a região codificante dos genes da gE e TK pelos genes da proteína verde fluorescente (GFP) ou betagalactosidase (β-gal), respectivamente. A deleção das sequências da gE e TK foram confirmadas por immunoblotting e PCR, respectivamente. A caracterização in vitro das cepas recombinantes (BoHV-5 gEΔ; BoHV-5 TKΔ e BoHV-5 gE/TKΔ) demonstrou que as deleções não alteraram a capacidade de replicação em cultivo celular, embora as cepas BoHV-5 gEΔ e BoHV-5 gE/TKΔ produzissem placas menores do que a cepas BoHV-5 TKΔ e parental. Desta maneira, demonstrou-se que os vírus recombinantes são biologicamente viáveis, podendo ser utilizados em estudo de patogenia ou como candidatos a cepas vacinais. Na terceira parte do estudo foi avaliada a imunogenicidade em bovinos de duas formulações vacinais inativadas oleosas, produzidas a partir de cultivos celulares infectados com a cepa parental (SV507/99) ou recombinante BoHV-5 gE/TKΔ. Para isso, quarenta bovinos (20 animais por grupo) foram vacinados nos dias 0 e 22 pós-vacinação (pv) e amostras de soro, coletadas a diferentes intervalos pós-vacinação, foram testadas para anticorpos neutralizantes contra a cepa homóloga e frente a diferentes isolados de BoHV-5 e herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1). Todos os animais vacinados soroconverteram após a segunda dose da vacina (títulos médio de 17,5 para o grupo SV507/99 e 24,1 para o grupo BoHV-5 gE/TKΔ) e os níveis de anticorpos neutralizantes foram detectados até o final do experimento (dia 116 pv), porém com redução gradual. A sorologia cruzada com amostras heterólogas do BoHV-5 e BoHV-1 indicou que ambos os grupos reagiram em níveis similares frente ao mesmo vírus, no entanto, com maior magnitude contra amostras de BoHV-5. Os resultados demonstram que a vacina experimental composta por antígenos do BoHV-5 gE/TKΔ recombinante induziu resposta sorológica em níveis semelhantes ao induzida pela vacina produzida a partir do vírus parental. Dessa forma, e considerando-se a gE como marcador sorológico negativo, essa cepa recombinante se constitui em uma alternativa para possível vacina diferencial. Em resumo, os resultados apresentam a obtenção e caracterização de cepas recombinantes do BoHV-5 defectivas em dois genes associados com virulência. Essas cepas podem ser utilizadas em estudos de patogênese e, sobretudo, se constituem em candidatos potenciais para a formulação de vacinas diferenciais.

As alterações inflamatórias que afetam a cavidade oral e a gengiva dos felinos são frequentemente observadas na rotina médica e constituem verdadeiro desafio diagnóstico e terapêutico ao clínico. Denomina-se complexo gengivite-estomatitefaringite felina (CGEF) como sendo uma síndrome onde a apresentação clínica comum é a inflamação grave da gengiva e mucosa oral. A etiopatogênese desta doença não está totalmente elucidada mas acredita-se que seja multifatorial. As viroses têm sido implicadas como agentes etiológicos na patogenia da gengivite-estomatite crônica felina, entretanto, o mecanismo pelo qual as infecções virais participam no desenvolvimento da doença gengival nos animais afetados permanece indeterminado. A hipótese do presente estudo é de que a depleção imunológica induzida pelo lentivírus felino (FIV) aumenta o risco de ocorrência do FCV e do FHV-1 e da estomatite-gengivite em gatos. Para tanto, foram realizados 2 experimentos: o primeiro (A) foi delineado para avaliar a ocorrência do FCV e do FHV-1 na cavidade oral de 58 gatos naturalmente infectados pelo FIV ou não, com e sem gengivite, por meio da reação de polimerização em cadeia (PCR), assim como correlacionar esses achados com as subpopulações de linfócitos T CD4+, CD8+ e da razão CD4+:CD8+ e o segundo (B) foi desenvolvido para avaliar a correlação do FCV e das subpopulações de linfócitos T CD4+ com os diferentes graus de estomatite-gengivite em 35 gatos naturalmente infectados pelo FIV ou não, divididos em 2 grupos. No experimento A, pôde-se determinar que apenas o FCV está relacionado à inflamação gengival, sendo detectado em 88,9% dos gatos com gengivite. Além disso, a infecção pelo FIV promoveu aumento significativo do número de linfócitos T CD8+ (p=0,004) e diminuição da razão CD4+:CD8+ (p<0,001). No experimento B, identificou-se que a infecção pelo FIV está associada à ocorrência da infecção pelo FCV (p=0,011), à presença de gengivite (p=0,022) e ao grau de gengivite (p<0,001), sendo que os gatos infectados pelo FIV foram os que apresentaram graus mais graves de gengivite. Portanto, no grupo dos animais infectados pelo FIV pôde-se observar maior ocorrência do FCV e presença de gengivite. Adicionalmente, o grau de gengivite está diretamente associado à infecção pelo FCV (p<0,001), onde os animais positivos para este vírus apresentaram graus mais graves de gengivite. Pelo presente estudo, pôde-se concluir que a ocorrência da infecção pelo FCV está diretamente associada ao CGEF em felinos e que a ocorrência do FCV foi significativa em animais que apresentaram graus mais graves de gengivite. Além disso, os gatos que apresentaram graus mais graves de gengivite, foram os que apresentaram menores valores de linfócitos T CD4+ e maior ocorrência de infecção pelo FCV. Contudo, não é possível saber se a co-infecção pelo FIV e FCV foi responsável pelo agravamento da gengivite e da condição imunológica dos gatos ou se a disfunção do sistema imune causada pelo FIV predispôs a infecção pelo FCV, levando a piora das lesões orais. / The inflammation that affects the oral cavity and the gingiva of felines are frequently observed in the medical practice and constitute a true diagnosis and therapy challenge to the physician. This condition is referred to as feline gingivitis-stomatitis-pharyngitis complex (FGSC) and it is a syndrome in which the common clinical profile is a severe gingival and oral mucosa inflammation. The etiopathogenesis of this disease is not completely elucidated but it is believed to be multifactorial. The viruses have been involved as etiologic agents in the feline chronic gingivitis-stomatitis pathogeny, however, the mechanism through which the viral infections participate in the development of the gingival disease of the infected animals remains undetermined. The present studys hypothesis is that the immunedepletion induced by the feline lentivirus (FIV) increases the risk of development of FCV and FHV-1, and stomatitis-gingivitis in cats. In order to do so, two experiments were conducted: the first one (A) was designed to evaluate the occurrence of FCV and FHV-1 in the oral cavity of 58 cats naturally infected by FIV or not, with and without gingivitis, through polymerase chain reaction (PCR), and to correlate this findings with the subpopulations of lymphocytes T CD4+, CD8+ and the ratio of CD4+:CD8+; the second one (B) was developed to evaluate the correlation of the FCV and of the subpopulations of lymphocytes T CD4+ with the different degrees of stomatitis-gingivitis in 35 cats naturally infected by the FIV or not, divided into two groups. In the experiment A, it was possible to determine that only the FCV is related to gingivitis, being detected in 88.9% of the cats with gingivitis. Moreover, the FIV infection promoted a significant increase in the number of lymphocytes T CD8+ (p=0.004) and a decrease of the ratio CD4+:CD8+ (p<0.001). In the experiment B, the FIV infection is associated to the occurrence of gingivitis due to the FCV (p=0.011), to the presence of gingivitis (p=0.022), and to the degree of gingivitis (p<0.001), being that the FIV infected cats were the ones that presented the more severe degrees of gingivitis. Therefore, in the group of animals infected by the FIV it was possible to observe a greater occurrence of FCV and the presence of gingivitis. Additionally, the degree of gingivitis is directly related to the FCV infection (p<0.001), where the animals that tested positive for this virus presented more severe degree of gingivitis. From the present study, it was possible to conclude that the occurrence of infection due to the FCV is directly related to FGSC in felines and that the occurrence of FCV was significant in animals that presented more severe degrees of gingivitis. Moreover, the cats that presented more severe degrees of gingivitis were the ones that presented lower values of lymphocytes T CD4+ and greater occurrence of FCV infection. However, it is not possible to know whether the co-infection due to the FIV and the FCV was responsible for the worsening of the gingivitis and of the immune condition of the cats, or if the immune system dysfunction caused by the FIV predisposed the FCV infection, leading to the aggravation of the oral lesions.

O objetivo geral desta pesquisa foi avaliar a resposta imune (RI) humoral e celular de bezerros recém-nascidos mediante imunização passiva e ativa, usando como modelo o Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) e o Herpesvírus Bovino tipo-1 (BoHV-1). Esta pesquisa foi dividida em duas etapas e seus dados estão apresentados em dois capítulos. Capítulo 1- Acompanhou-se a imunização passiva de bezerros do nascimento até os seis meses de idade e a influência da vacinação materna no período pré-parto nessa resposta. Os animais foram distribuídos em dois grupos experimentais que receberam colostro de mães não imunizadas (G1, n=4) e (G2, n=6) de mães imunizadas no período pré-parto para o BVDV e BoHV-1. A colostragem foi feita pela administração de seis litros de colostro nas primeiras doze horas de vida, distribuídas em duas mamadas. Nesta etapa foi possível verificar: (1) a presença de títulos de ACs neutralizantes apenas no grupo de bezerros que receberam colostro de mães imunizadas, obtendo soroconversão após a mamada de colostro em 2/6 (33%) bezerros para o BVDV e 6/6 (100%) para o BoHV-1; (2) manutenção dos títulos de ACs protetores até os três meses de vida. Em relação a RI celular: (3) observou-se maior proporção de células T auxiliares CD4+ (P=0,05) no grupo de bezerros que receberam colostro de mães imunizadas no período pré-parto; (4) o leucograma dos bezerros demonstrou respostas inflamatórias em alguns momentos desta pesquisa, mais intensa nos animais que ingeriram colostro proveniente de mães nãoimunizadas. Capítulo 2- Acompanhou-se a imunização de bezerros para BVDV e BoHV-1 aos seis meses de idade. Dez bezerros foram distribuídos em dois grupos de bezerros não vacinados (VAC-, n=5) e vacinados para o BVDV e BoHV-1 (VAC+, n=5), as análises foram realizadas antes da imunização aos 180 dias (T0), após a 1°dose aos 210 dias (T1) e após a 2° dose aos 240 dias (T2). Os resultados obtidos para avaliação da RI humoral foram: (1) soroconversão de 2/5 (40%) animais no momento T1 e 3/5 (60%) no T2 para o BVDV; (2) soroconversão em 2/5 (40%) no T1 e 5/5 (100%) no T2 para o BoHV-1. Para a RI celular observou-se: (3) maior expressão de CD25+ pelas subpopulações de linfócitos T gama-delta WC1+ no VAC+, observando-se diferença estatística no momento T1 (P=0,0016). Com base nos resultados obtidos nas duas etapas experimentais desta pesquisa pode-se concluir que a vacinação materna é uma estratégia para melhorar a qualidade do colostro e as repostas imunes humoral e celular dos bezerros para BVDV e BoHV-1; a duração da imunidade materna considerando-se níveis protetores de Acs foi de três meses; os componentes do colostro influenciaram na resposta inflamatória dos bezerros à exposição natural aos patógenos; a vacinação dos bezerros aos seis meses de idade estimulou a resposta imune humoral para BoHV-1 e parcial para BVDV. / The aim of this research was to evaluate the humoral and cellular immune response (IR) of newborn calves by active and passive immunization, using by model the Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) and Bovine Herpesvirus type-1 (BoHV-1). This research was divided in two stages and the datas are presented in two chapters. Chapter 1: Was followed the passive immunization of calves from birth until six months old and the maternal vaccination influence on pre-partum period on this response. The animals were divided in two experimental groups that received colostrum from unvaccinated mothers (G1, n = 4) and (G2, n=6) from immunized mothers in the pre-partum period to BVDV and BoHV-1. The calves received six liters of colostrums on the first twelve hours of life, divided in two feedings. At this stage was verified: (1) the presence of neutralizing titers antibodies (Abs) only in group of calves that received colostrum from immunized mothers, getting seroconversion after feeding in 2/6 (33%) of calves for BVDV and 6/6 (100%) for BoHV-1, (2) maintenance of Abs titers protectors up to three months of life. In relation to immune cellular response: (3) was observed higher proportion of helper T cells CD4+ (P = 0.05) in the group of calves that received colostrum from immunized mothers during pre-partum; (4) the leukogram of calves showed inflammatory responses in some moments of this research, more intense in animals that ingested colostrums from non-immunized mothers. Chapter 2: Was followed the immunization of calves for BVDV and BoHV-1 at six months old. Ten calves were divided in two groups of calves non-vaccinated (VAC-, n = 5) and vaccinated for BVDV and BoHV-1 (VAC +, n = 5). The analyzes were performed before immunization at 180 days (T0), after the 1st dose at 210 days (T1) and after the 2nd dose at 240 days (T2). The results for evaluation of immune humoral response were: (1) seroconversion 2/5 (40%) animals at the T1 moment and 3/5 (60%) of T2 for BVDV, (2) soroconversion on 2/5 (40 %) in the T1 to 5/5 (100%) at T2 for BoHV-1. For the immune cellular response was observed: (3) increased expression of CD25+ subpopulations of T lymphocytes by gamma-delta WC1+ in VAC+, observing statistical difference in T1 moment (P = 0.0016). Based on the results obtained in the two experimental stages of this research can be concluded that maternal vaccination is a strategy to improve the quality of colostrum and humoral and cellular immune response of calves to BVDV and BoHV-1, the duration of maternal immunity considering protective levels of Abs was three months. The components of colostrum influence the inflammatory response of calves to natural exposure to pathogens. The vaccination of calves at six months old stimulated the humoral immune response to BoHV-1 and partial for BVDV.

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: José Paes de Oliveira Filho / Banca: Clarice Weis Arns / Resumo: O herpesvírus canino (HVC-1) causa doença infecto-contagiosa que acomete cães em todo o mundo. É considerado o responsável por causar problemas reprodutivos, respiratórios, oculares, alterações neurológicas podendo levar à morte neonatos e adultos imunossuprimidos. Assim, o presente trabalho teve como objetivos isolar o HVC-1 a partir de amostras biológicas, padronizar uma técnica diagnóstica para detecção do herpesvírus canino, verificar a presença de cães infectados no estado de São Paulo e comparar 3 modificações na técnica de diluição limitante em relação à quantificação molecular pela qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction). Para isso, foram coletadas 139 amostras sangue, fragmentos de órgãos de 12 neonatos que foram a óbito e 5 amostras de suabes de secreção genital, de animais provenientes de canis e domicílios. Após a obtenção do DNA das amostras colhidas, foram submetidas à qPCR e snPCR (seminested Polymerase Chain Reaction) para o teste de detecção do HVC-1. Foi encontrada positividade em nove foram amostras de sangue e em fragmentos de órgãos de um animal, as amostras de secreções genitais foram todas negativas. O isolamento viral foi realizado a partir de fragmento de rim. As células infectadas apresentaram efeitos citopáticos compatíveis com as do HVC-1. As amostras positivas foram sequenciadas apresentando identidade de 100% com o HVC-1 (Genbank ™: X75765). As técnicas moleculares para a detecção do agente mostraram-se sensíveis e específicas, tanto a snPCR como a qPCR. Nessas técnicas foi possível detectar até 15,35 cópias/ μL de DNA de amostras de sangue e 1,15 cópias/μg de tecido. O uso de técnicas moleculares possibilitou a detecção de infecções ativas por HVC-1 com ótimo limiar de detecção. No entanto, mais estudos são necessários para conhecer a epidemiologia da infecção do HVC-1 na população canina no Brasil / Abstract: The canine herpesvirus (CHV-1) causes contagious disease affecting dogs worldwide. It is considered the responsible for cause reproductive problems, respiratory, eyes, neurologic changes may lead to death newborns and immunocompromised adults. Therefore, our study aimed to isolate CHV-1 from biological samples, standardize a diagnostic techniques for the detection of canine herpesvirus, verify the presence of infected dogs in São Paulo state and compare three modifications in the technique of limiting dilution in relation to molecular quantification to qPCR (by quantitative PCR to determine the viral titer). Thus, we collected 139 blood samples, organ's fragments from 12 neonates death and 5 genital secretions samples with swabs of animals from kennels and households. After obtaining the DNA from samples were accomplished the qPCR (quantitative PCR) and snPCR (seminested PCR) assay for detection of CHV-1. It was found positivity in nine blood sample and organ's fragments of an animal, the genital secretions samples were all negative. The viral isolation was performed from kidney. The infected cells showed cytopathic effects compatible with the CHV-1. Positive samples were sequenced showed 100% identity with the CHV-1 (Genbank™: X75765). The molecular techniques for detection agent were sensitive and specific, both the snPCR as the qPCR. In these techniques was enabled to detect DNA 15.35 copies/mL of blood samples and 1.15 copies/μg of tissue. The use of molecular techniques allowed the detection active infections of of HCV-1 with optimal detection limit. More studies are needed to understand the infection epidemiology of CHV-1 in the canine population in Brazil / Mestre

O presente trabalho teve como objetivo otimizar ensaios sorológicos para serem utilizados na pesquisa de anticorpos dirigidos ao Herpesvírus humano tipo 8 (HHV-8) e com eles explorar grupos de risco para adquirir, transmitir e desenvolver doença relacionada à esta infecção, como o sarcoma de Kaposi (SK). Tomando como base a literatura disponível, as condições do laboratório e a experiência profissional acumulada na Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, foram selecionados e utilizados os ensaios de imunofluorescência indireta (IFI) e Western blot (WB) para a pesquisa de anticorpos dirigidos a antígenos (Ag) de fase latente (LANA) e lítica da infecção por HHV-8. Para a padronização dos testes sorológicos foram utilizadas amostras de soro de 44 pacientes com SK e 21 controles sadios do Laboratório, e para o cálculo de prevalência de infecção HHV-8 em diferentes populações de São Paulo, soros de 3 grupos de indivíduos: - 477 pacientes infectados pelo HIV/AIDS sem SK; - 683 pacientes institucionalizados com deficiência mental e/ou física; - 736 profissionais da área da saúde, sadios. Foram empregados na preparação das lâminas de IFI e nas tiras de WB respectivamente, as células BCBL-1 latentemente infectadas pelo HHV-8 ou estimuladas com forbol éster e o antígeno viral bruto obtido de sobrenadante de lisado das mesmas células. Os resultados obtidos na padronização da IFI-LANA mostraram baixa especificidade do ensaio devendo ser acompanhado pelo teste confirmatório de WB-LANA. Por outro lado, a IFI-Lítico se mostrou altamente sensível e específica, prescindindo do teste confirmatório de WB-Lítico. Este último, devido à complexidade de componentes antigênicos aliado aos diferentes perfis de reatividade de anticorpos encontrados em soros controle positivo e negativo, não se mostrou útil para ser empregado no presente trabalho. Levando em consideração os resultados obtidos na IFI-LANA confirmados pelo WB-LANA e na IFI-Lítico, foi possível determinar a prevalência de infecção HHV-8 no grupo de pacientes infectados pelo HIV/AIDS sem SK que foi de 19,3%, sendo detectados 4,8% de soros positivos para Ag LANA e 17% para Ag Lítico. Neste grupo de pacientes, houve associação estatisticamente significante entre sorologia HHV-8 positiva, sexo masculino e prática homossexual. Baixas prevalências de anticorpos foram detectadas nos pacientes institucionalizados com deficiência mental e/ou física (1,6%) e nos profissionais da área da saúde (1,1%). Anticorpos dirigidos a Ag LANA foram encontrados em 0,6% e 0,95% dos casos, e para Ag Líticos em 1,0% e 0,3% dos casos, respectivamente. Os resultados obtidos mostram que São Paulo não é região endêmica desta infecção viral e que pacientes institucionalizados e profissionais da área da saúde não são grupos de alto risco para adquirir e transmitir o HHV-8; nenhum caso de SK foi relatado neste grupo de indivíduos na ocasião da coleta das amostras de soro. Quanto ao grupo de pacientes infectados pelo HIV/AIDS sem SK, embora 19,3% deles tenham resultado sorologia HHV-8 positiva sendo a maioria para Ag de fase lítica de replicação viral, apenas 2% desenvolveram SK em estudo longitudinal de 5 anos. A explicação encontrada para o baixo número de casos de SK nesta população de indivíduos foi a introdução em 1994, de terapia anti-retroviral em São Paulo, que mudou o curso da infecção HIV e das doenças à ela associadas. Enfim, foi possível implantar ensaios sorológicos de pesquisa de anticorpos específicos, que juntos, apresentam alta sensibilidade e especificidade e que podem ser empregados em levantamentos epidemiológicos e no diagnóstico de infecção HHV-8. / The objective of the present study was to optimize serologic assays to be employed in the search for antibodies against human herpesvirus type 8 (HHV-8) and use them to survey groups at risk to acquire, transmit and develop disease related to this infection, such as Kaposi’s sarcoma (KS). On the basis of the available literature and of the Laboratory conditions and professional experience accumulated in the Immunology Section of the Adolfo Lutz Institute of São Paulo, we selected and used indirect immunofluorescence assay (IFA) and Western blot (WB) for the search of antibodies against antigens (Ag) of the latent (LANA) and lytic phase of HHV-8 infection. Serum samples from 44 patients with KS and from 21 healthy controls from the laboratory were used for the standardization of the serologic tests, and sera from the following 3 groups of individuals were used to calculate the prevalence of HHV-8 infection in different São Paulo populations:- 477 patients infected with HIV/AIDS without KS; - 683 institutionalized patients with mental and/or physical deficiency; - 736 healthy professionals from the health area. For the preparation of IFA slides and WB strips, we respectively used BCBL-1 cells latently infected with HHV-8 or stimulated with phorbol ester and the crude antigen obtained from the supernatant of a lysate of the same cells. The results obtained in the standardization of the IFA-LANA showed low specificity of the assay, which needed to be accompanied by the confirmatory WB-LANA test. In contrast, the IFA-Lytic proved to be highly sensitive and specific, requiring no confirmatory WB-Lytic test. The latter, due to the complexity of the antigenic components joined to the different reactive profiles of the antibodies detected in positive and negative control sera, was not found to be useful for the present study. Considering the results obtained by IFA-LANA confirmed by WB-LANA and those obtained by IFA-Lytic, it was possible to determine the prevalence of HHV-8 infection in the group of HIV-AIDS patients without KS, which was 19.3%, with the detection of 4.8% sera positive for LANA Ag and 17% positive for Lytic Ag. In this group of patients there was a statistically significant association between HHV-8-positive serology, male sex and homosexual practice. Low antibody prevalences were detected in institutionalized patients with mental and/or physical deficiency (1.6%) and in health professionals (1.1%). Antibodies against LANA Ag were detected in 0.6% and 0.95% of cases, and antibodies against Lytic Ag in 1.0% and 0.3% of cases, respectively. The results obtained show that São Paulo is not an endemic region for this viral infection and that institutionalized patients and health professionals are not groups at high risk to acquire and transmit HHV-8; no case of KS was reported by these groups on the occasion of the collection of serum samples. With respect to the patients infected with HIV/AIDS without KS, although 19.3% of them showed HHV-8-positive serology, in most cases for Ag of the lytic phase of viral replication, only 2% developed KS in a 5 year longitudinal study. The small number of KS cases detected in this population is explained by the introduction in 1994 of antiretroviral therapy in São Paulo, which changed the course of HIV infection and of the diseases associated with it. In conclusion, it was possible to set up serologic assays for the detection of specific antibodies which, considered jointly, presented high sensitivity and specificity and which could be used in epidemiologic surveys and in the diagnosis of HHV-8 infection.