Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This dissertation reports the standardization of a monoclonal antibody (MAb)-based immunoenzymatic test (ELISA) for detection of antibodies to bovine herpesvírus types 1 and/or 5 (BoHV-1 and BoHV-5). The initial steps involved the determination of the most suitable MAb, the appropriate dilutions of viral antigen and test sera; and the cut-off value of the assay. After standardization, the ELISA was validated by testing 506 cattle serum samples previously tested for neutralizing antibodies to BoHV-1 and BoHV-5 by virus neutralizing (VN) assay. Comparing to the VN for BoHV-1 antibodies, the ELISA presented sensitivity and specificity of 96.6% and 98.3%, respectively. Positive and negative predictive values were 97.6%, the concordance between the tests was 97.6% and the coefficient of correlation k (kappa) was 0.95, demonstrating an excellent correlation. Comparing to the VN for BoHV-5 antibodies, the ELISA presented 94.3% of sensitivity, 97.9% of specificity, 97.1% of positive predictive value, 95.9% negative predictive value, concordance of 96.4% and kappa coefficient of 0.92. These results demonstrate that the ELISA presents suitable specificity and sensitivity to be used for individual and herd serological diagnosis of BoHV-1 and BoHV-5, thus, representing an alternative for VN assays and imported ELISA kits. / Essa dissertação relata a padronização de um teste imunoenzimático do tipo ELISA, com base em anticorpo monoclonal (AcM), para a detecção de anticorpos séricos que reagem contra herpesvírus bovino tipos 1 e/ou 5 (BoHV-1, BoHV-5). Inicialmente, determinou-se o AcM mais adequado para a sensibilização das placas, as diluições apropriadas do antígeno e dos soros-teste e o ponto de corte do ensaio. Após a padronização, o ensaio foi validado testando-se 506 amostras de soro bovino, previamente testadas para anticorpos neutralizantes contra o BoHV-1 e/ou BoHV-5 pela técnica de soroneutralização (SN). Comparando-se com os resultados da SN frente ao BoHV-1, o teste de ELISA apresentou sensibilidade e especificidade de 96,6% e 98,3%, respectivamente. Os valores preditivos positivo e negativo foram de 97,6%, a concordância foi de 97,6% e o índice de correlação (kappa) entre os testes foi de 0,95, o que indica uma excelente concordância. Comparando-se com os resultados da SN frente ao BoHV-5, o ELISA apresentou 94,3% de sensibilidade; 97,9% de especificidade; 97,1% de valor preditivo positivo e 95,9% de valor preditivo negativo. Para o BoHV-5, a concordância entre os testes foi de 96,4% e o índice de correlação foi de 0,92, também excelente. Esses resultados demonstram que o teste padronizado apresenta sensibilidade e especificidade adequados para o diagnóstico sorológico das infecções pelo BoHV-1 e BoHV-5 em nível individual e de rebanho. Dessa forma, o ensaio pode se constituir em alternativa para o teste de SN e para os kits de ELISA importados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aimed at reproducting and characterizing the virological and clinico-pathological aspects of acute and latent genital infection by bovine herpesvirus type 1.2 (BoHV-1.2) in heifers. Four heifers were inoculated intravaginally with a Brazilian BoHV-1.2 isolate (SV-56/90) recovered from an outbreak of balanoposthitis. Virus inoculation (108.1TCID50/animal) resulted in efficient virus replication in the genital mucosa and the development of moderate to severe vulvovaginitis. The inoculated heifers shed virus in genital secretions in titers up to 107.3TCID50/mL until day 10 post infection (pi). Hyperemia, edema of vulvar and vestibular mucosa, vesicles, pustules and scabs were observed between days 1 and 10 pi. The vesicles and pustules increased in size and eventually coalesced and became covered with a mucopurulent and fibrinous exsudate. These signs increased in severity up to days 5 8 pi and progressively subsided thereafter. Dexamethasone administration at day 55 pi resulted in virus shedding in vaginal secretions of all heifers for up to 10 days. Virus reactivation was accompanied by genital signs resembling those observed during acute infection, yet less severe. Examination of the lumbar sacral ganglia and lymph nodes by PCR at day 36 postreactivation revealed the presence of latent viral DNA in the pudendal (4/4), genito-femoral, sciatic and rectal caudal (3/4) and obturator nerve ganglia (1/4); and in the sacral (3/4), deep inguinal, pre femoral, supramammary (2/4) and medial iliac lymph nodes (1/4). These results demonstrate that BoHV-1.2 DNA persists in sacral ganglia and regional lymph nodes during latency, and help in understanding the pathogenesis of acute and latent genital infection by BoHV-1.2. / O presente estudo teve como objetivos reproduzir e caracterizar os aspectos virológicos e clinico-patológicos da infecção genital aguda e latente pelo herpesvírus bovino tipo 1.2 (BoHV-1.2) em bezerras. Quatro bezerras foram inoculadas no trato genital com um isolado brasileiro de BoHV-1.2 (SV-56/90) oriundo de um surto de balanopostite. A inoculação do vírus (108,1TCID50/animal) resultou em replicação viral eficiente na mucosa genital e no desenvolvimento de vulvovaginite moderada a severa. As bezerras inoculadas excretaram vírus nas secreções genitais em títulos de até 107,3TCID50/mL por até 10 dias pós-inoculação (pi). Hiperemia, edema das mucosas vulvar e vestibular, vesículas, pústulas e crostas foram observados entre os dias 1° e 10° dia pi. As vesículas e pústulas aumentaram de diâmetro, eventualmente coalesceram e tornaram-se recobertas com um exsudato mucopurulento e fibrinoso. Os sinais aumentaram em severidade do 5° ao 8° dia pi e regrediram a partir de então. Administração de dexametasona dia 55 pi resultou em excreção viral nas secreções vaginais por até 10 dias. A reativação viral foi acompanhada de sinais genitais semelhantes aos observados durante a infecção aguda, porém com menor severidade. A análise dos gânglios lombo-sacral e linfonodos regionais por PCR no dia 36 pós-reativação demonstrou a presença de DNA viral latente nos gânglios pudendo (4/4), genito-femural, ciático, retalcaudal (3/4) e obturador (1/4); e nos linfonodos sacral (3/4), inguinal profundo, pré-femural, supramamário (2/4) e ilíaco medial (1/4). Esses resultados demonstram que o DNA do BoHV-1.2 persiste nos gânglios sacrais e em linfonodos regionais durante a latência, e contribuem para o conhecimento da patogenia da infecção genital aguda e latente pelo BoHV-1.2.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 258964 bytes, checksum: 135e6be4766beec15d819dd30575f517 (MD5) Previous issue date: 2006-07-28 / Bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) is the etiological agent of the bovine meningoencephalitis that presents high morbidity in young bovine. Due to the similarity in the morphology of the virion, cytopathic effect in cell culture and antigenic properties, the BoHV-5 was classified erroneously as BoHV-1 in the past. BoHV-1 is responsible for respiratory and genital diseases, however the disease caused by BoHV-5 presents neurological clinical signs. This virus has been considered a variant of the same agent (BoHV-1) with neuropathogenic characteristics. Comparative studies among isolates of BoHV-5 revealed 97% of proteic similarity. However, the amino-terminal region of the most abundant glycoprotein of the viral envelope, the gC, differs substantially. This glycoprotein is involved in the initial interactions of the virus with the cellular surface besides of presenting as target for antibodies with neutralizing activities. This study aimed at to select an isolate of BoHV-5, among 5 isolates collected in outbreaks in different properties in Brazil, presenting higher antigenicity in vaccinated animals. Vaccines were formulated using isolates ISO9898292, SV507, SV163, 1807 and EVI145 and administered to 5 groups of 10 sheeps, which have received two intramuscular doses on days 0 and 21. Collections of blood were accomplished for analysis of production of antibodies by virus-neutralization and attendance of possible clinical signs to the 63rd day after the first vaccination. Antibodies titers averages ranged from 6,85 and 14,92 on the day 0 before the first vaccination. Antibody peak were on day 14, ranged from 4,50 (isolated ISO9898292) to 138,63 (isolated SV163). A second peak was observed 14 days after the booster ranged from 7,77 (ISO9898292) to 1017,54 (1807). In the 42nd day after the booster, it was observed titers variation from 3,84 (ISO9898292) to 305,97 (1807). The discrepancy among titers of antibody of each group of animals suggests a smaller antigenicity of isolated ISO9898292 in relation to the others, demonstrating a possible variation among the isolates, what results in antigenic differences. All isolates, with exception to ISO9898292, were effective in the induction of antibodies. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é o agente etiológico da menigoencefalite bovina que apresenta alta morbidade em bovinos jovens. Devido à similaridade na morfologia do virion, efeito citopático na cultura de células e propriedades antigênicas, o BoHV-5 foi classificado erroneamente como herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1). Este vírus é responsável por doenças respiratórias e genitais, porém a doença causada pelo BoHV-5 apresenta sinais clínicos neurológicos, com isso o vírus foi considerado uma variante do mesmo agente com características de neuropatogenicidade. Estudos comparativos entre isolados de BoHV-5 revelaram 97% de similaridade protéica. No entanto, a região amino terminal da glicoproteína mais abundante do envelope viral, a gC, difere substancialmente. Esta glicoproteína está envolvida nas interações iniciais do vírus com a superfície celular, além de se apresentar como alvo para anticorpos com atividades neutralizantes. Este estudo objetivou selecionar um isolado do vírus BoHV-5, entre 5 isolados coletados em surtos da doença em diferentes propriedades, que confira maior antigenicidade em animais vacinados. As vacinas foram formuladas com os isolados ISO9898292, SV507, SV163, 1807 e EVI145 e administradas a 5 grupos de 10 ovelhas, as quais receberam duas doses vacinais por via intramuscular nos dias 0 e 21. Foram realizadas coletas de sangue para análise de produção de anticorpos por virusneutralização e acompanhamento de possíveis sinais clínicos até o 63º dia após a primo-vacinação. Foram observados dois picos na curva de anticorpos, o primeiro no dia 14, após a vacinação, onde os títulos de anticorpos variaram entre 4,50 (isolado ISO9898292) a 138,62 (isolado SV163). O segundo pico foi observado 14 dias após a revacinação onde os títulos variaram entre 7,77 (ISO9898292) a 1017,54 (1807). No 42º dia após a revacinação observou-se variação de título entre 3,84 (ISO9898292) a 305,97 (1807). A discrepância entre as médias de título de anticorpo de cada grupo de animais sugere uma menor antigenicidade do isolado ISO9898292 em relação aos demais, demonstrando uma possível variação entre os isolados, o que resulta em diferenças antigênicas. Todos os isolados, com exceção ao ISO9898292, mostraram-se eficazes na indução de anticorpos.

Orientador: Ione Corrêa / Resumo: O Sistema de Vigilância Sanitária da Itália detectou 445 casos de hepatite B e 69 de hepatite C, relacionados aos tratamentos de beleza. Fato esse alarmante, pois, os cuidados com a aparência, têm levado a população a buscar os padrões de beleza estabelecidos pela mídia. Destacando-se que os salões de beleza no Brasil estão cada vez mais comuns com a atuação dos profissionais de manicure e pedicure. Entretanto, os produtos cosméticos necessitam de uma avaliação da qualidade sanitária, ou seja, testes que indicam a quantidade de micro-organismos viáveis em cada amostra. Pois, evidências mostram a sobrevivência dos Trichophytonrubrum, Trichopyton mentagrophytes, Candida albicans, Candida parapsilosis no esmalte de unha. Todavia, a composição e a fabricação do esmalte são pouco conhecidas, devido várias etapas estarem envolvidas na produção dos esmaltes de unhas comuns. Objetivo: Avaliar a ação dos solventes presentes no esmalte de unha, o acetato de etila e o acetato de butila, sobre o herpes vírus bovino tipo 5. Método: Realizou ensaios da atividade antiviral nas diferentes fases do ciclo replicativo com os solventes, acetato de etila e o acetato de butila. Resultados: No pré-tratamento, não houve replicação viral no acetato de etila a partir da diluição 10-6 e no acetato de butila 10-5 . No póstratamento não houve replicação viral no acetato de etila a partir da diluição 10-7 e no acetato de butila 10-5 e na inativação viral, tanto o acetato de etila como o butila, após 48 e ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Health Surveillance System in Italy detected 445 cases of hepatitis B and 69 hepatitis C related to beauty treatments. These alarming facts, for care of the appearance have led people to look for the beauty standards set by the media. If highlighting the beauty salons in Brazil is becoming more common with the activities of manicure and pedicure professionals. However, cosmetic products require a quality assessment of the health, is tests which indicate the amount of viable microorganisms in each sample. For evidence shows the survival of Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans, Candida parapsilosis in nail polish. However, the enamel composition and manufacturing are little known due several steps are involved in the production of common nail enamels. Objective: To evaluate the action of solvents present in nail enamel, ethyl acetate and butyl acetate, about herpesvirus bovine type 5. Method: The antiviral activity test performed at different stages of the replicative cycle of the solvents, ethyl acetate and butyl acetate. Results: In the pre-treatment, there was no viral replication in the ethyl acetate dilution from 10-6 to 10-5 in butyl acetate. In the post-treatment there was no viral replication in ethyl acetate from the dilution 10-7 and 10-5 butyl acetate and viral inactivation, both the ethyl acetate and the butyl after 48 and 72 hours, all dilutions they showed viral replication, 10-1 to 10-10 . Discussion: Although not identify the sp... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Coorientadora: Katia Denise Saraica Bresciani / Banca: Roberto Gameiro de Carvalho / Banca: Ana Carolina Borsanelli / Banca: Andréa Fontes Garcia / Banca: Jamila Cristina Baptistella / Resumo: O Brasil é o segundo maior produtor mundial de carne bovina. Entretanto diversas patologias podem acometer o rebanho bovino e causar significativas perdas econômicas. Diante deste cenário, a infecção por Herpesvirus bovino 5 (BHV5) possui grande importância epidemiológica neste setor, sendo o BHV5 conhecido pelo desenvolvimento de meningoencefalite. Esse vírus possui como características a rápida replicação lítica em cultura de células e a capacidade de estabelecer latência nos gânglios sensoriais do hospedeiro. Assim, essa cepa viral está relacionada à habilidade do BHV5 de invadir, replicar-se no sistema nervoso central (SNC) e causar enfermidade neurológica. É de conhecimento científico que infecções virais estimulam ou inibem a resposta imunológica com objetivo de impedir a replicação e disseminação viral. Entretanto, pouco se sabe sobre o desenvolvimento da resposta imunológica do BHV5 no curso da infecção aguda ou latente. Assim, muitos conceitos sobre a patogênese do BHV5 acabam sendo extrapolados do Herpesvirus bovino 1 (BHV1). Diante deste contexto, faz-se necessário a busca pelo conhecimento da relação entre os vírus e as células de defesa do hospedeiro. Esses achados irão contribuir para um melhor entendimento da patogênese da doença, bem como para o possível desenvolvimento de vacinas mais específicas e eficazes. / Abstract: Brazil is the second largest producer of beef in the world. However several pathologies can affect the bovine herd and cause significant economic losses. In view of this scenario, bovine herpesvirus 5 infection (BHV5) is of great epidemiological importance in this sector, and BHV5 is known for the development of meningoencephalitis. This virus is characterized by rapid lytic replication in cell culture and the ability to establish latency in host sensory ganglia. Thus, this viral strain is related to the ability of BHV5 to invade, replicate in the central nervous system (CNS) and cause neurological disease. It is scientifically known that viral infections stimulate or inhibit the immune response in order to prevent viral replication and dissemination. However little is known about the development of the BHV5 immune response in the course of acute or latent infection. Thus, many concepts about the pathogenesis of BHV5 end up being extrapolated from bovine herpesvirus 1 (BHV1). In this context, it is necessary to search for knowledge about the relationship between viruses and host defense cells. These findings will contribute to a better understanding of the pathogenesis of the disease, as well as to the development of more specific and effective vaccines. / Doutor

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

Introdução: O câncer gástrico (CG) foi recentemente categorizado em subtipos moleculares, os quais incluem os tumores Epstein-Barr (EBV)-positivo e com instabilidade de microssatélites (MSI). Esta distinção pode nos fornecer informações prognósticas e identificar alvos terapêuticos, tais como o PD-L1. Objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar a presença de EBV, MSI e expressão de PD-L1 no CG e suas associações com características clinicopatológicas e prognósticas. Métodos: Foram avaliados retrospectivamente 287 pacientes com CG submetidos à gastrectomia D2 com intenção curativa entre 2009 e 2016, através da técnica de tissue microarray. As proteínas de reparo do DNA (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) e o PD-L1 foram avaliados por imuno-histoquímica. O EBV foi avaliado por hibridação in situ. Resultados: Identificou-se a presença de EBV e MSI em 10,5% e 27% dos CGs, respectivamente. A maioria dos CGs com MSI apresentou perda simultânea da expressão de MLH1 e PMS2 (60%). O CG EBV-positivo associou-se ao sexo masculino (p=0,032), localização proximal (p < 0,001), tipo indeterminado de Lauren (p < 0,001), histologia pouco diferenciada (p=0,043) e infiltrado inflamatório acentuado (p < 0,001). Os tumores com MSI foram associados à idade mais avançada (p=0,002), gastrectomia subtotal (p=0,004), pN0 (p=0,024) e ao estágio pTNM menos avançado (p=0,020). Observou-se a imunoexpressão de PD-L1 em 8,8% dos casos, com expressão predominante no CG EBV-positivo (p < 0,001). O CG com MSI apresentou melhor sobrevida livre de doença (p=0,006) e sobrevida global (p=0,049) comparado ao EBV-negativo/microssatélite estável (MSS). Na análise multivariada, o status MSI/MSS permaneceu como fator de risco independente associado à recidiva da doença. Conclusão: O CG EBV-positivo apresentou aumento da expressão de PD-L1, enquanto o CG com MSI relacionou-se à melhor sobrevida. Ambos os subgrupos representam entidades distintas de CG e sua identificação é viável por técnicas diagnósticas convencionais. A caracterização destes subtipos de CG possibilita a aplicação de terapias direcionadas e permite ampliar o poder prognóstico dos atuais sistemas de classificação e estadiamento / Introduction: Gastric cancer (GC) has recently been categorized in molecular subtypes, which include Epstein-Barr (EBV)-positive and microsatellite instable (MSI) tumors. This distinction provides prognostic information and identifies therapeutic targets, such as PD-L1. Objective: The aim of this study was to evaluate the presence of EBV, MSI and PD-L1 expression in GC and their associations with clinicopathological characteristics and prognosis. Methods: We retrospectively evaluated 287 patients with GC who underwent D2-gastrectomy with curative intent from 2009 to 2016 through tissue microarray technique. DNA mismatch repair proteins (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) and PD-L1 were assessed by immunohistochemistry. EBV was detected by in situ hybridization. Results: The presence of EBV and MSI was identified in 10.5% and 27% of GCs, respectively. Most MSI GCs showed simultaneous loss of MLH1 and PMS2 expression (60%). EBV positivity was related to male (p=0.032), proximal location (p < 0.001), undetermined Lauren type (p < 0.001), poorly differentiated histology (p=0.043) and intense inflammatory infiltrate (p < 0.001). MSI-tumors were associated with older age (p=0.002), subtotal gastrectomy (p=0.004), pN0 (p=0.024) and more initial pTNM stage (p=0.020). PD-L1 immunoexpression was observed in 8.8% of cases, with predominant expression in EBV-positive GC (p < 0.001). MSI correlated with better disease-free survival (p=0.006) and overall survival (p=0.049) compared to the EBV-negative/microsatellite stable (MSS). In the multivariate analysis, the MSI/MSS status remained as independent risk factor associated with disease recurrence. Conclusion: EBV-positive GCs had increased PD-L1 expression, while MSI GC had better survival outcome. Both subgroups are distinct GC entities and their recognition is feasible by conventional diagnostic techniques. The characterization of these GC subtypes enables the application of targeted therapies and allows to extend the prognostic power of current classification and staging systems

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

A infecção de trato respiratório superior em gatos é uma afecção muito frequente em indivíduos que vivem em abrigos, com elevada morbidade e em alguns casos, fatal. O herpesvírus felino tipo1 (FHV-1) e a Chlamydophila felis estão entre os principais causadores. O FHV-1 ocasiona quadros de espirros, secreção nasal e alterações oculares como conjuntivite. A C. felis é responsável pelos piores casos de conjuntivite e apresenta um plasmídeo críptico como possível fator de virulência. A presença dos retrovírus da leucemia felina (FeLV) e/ou imunodeficiência dos felinos (FIV) debilita a função do sistema imunológico, causando imunossupressão e consequentemente aumento no índice de morbidade e mortalidade. Neste trabalho foram avaliados quatro abrigos, três gatis particulares não-comercias (um localizado em Osasco/SP e outros dois São Paulo/SP). Os gatis possuiam alta densidade populacional e a procedência dos gatos alojados era desconhecida. A detecção de FHV-1, como de C. felis e de três genes do plasmídeo criptico foram realizadas por PCR em amostras de mucosa oral e de conjuntiva ocular de ambos os olhos obtidas com swabs de algodão, secos e estéreis. Amostras de sangue foram coletadas para a detecção do FIV e FeLV por meio de teste imunoenzimático. O sintomas clínicos dos animais foram classificados de 1 a 4, sendo 4 atribuído àqueles que apresentavam pior sintomatologia. A ocorrência de FIV e FeLV no 1° gatil foi de 4,63% e 3,70%, no 2° gatil foi de 0% e 6,45%, enquanto que no 3° gatil foi 75% e 0% respectivamente, estes vírus não foram detectados no 4° gatil. FHV-1 foi observado em 61,11% dos gatos no 1° gatil; 90,32% no 2° gatil, 100% no 3° gatil e em 89,74% dos animais do 4° gatil. No 1° gatil, 7,41% das amostras apresentavam C. felis, no 2° gatil, 58,06%; no 4° gatil, 23,08%; enquanto que no 3° gatil o agente não foi detectado. Dentre as amostras positivas para C. felis, os genes do plasmídeo críptico foram detectados; no 1o gatil o gene 1 estava presente em 62,50% das amostras, o gene 2 e 3 em 75%, para o 2° gatil obteve-se 61,11% de positividade para os genes 1 e 2 e 55,56% para o gene 3; no 4° gatil o gene 1 e 3 estavam presentes em 77,78% das amostras, o gene 2 em 55,56%. Os óbitos relatados no período do estudo foram de animais classificados com sintomas 3 ou 4 e positivos para C. felis e para o plasmídeo críptico. No presente trabalho foi observada uma elevada ocorrência de C. felis e de seu plasmídeo críptico, apesar da baixa ocorrência de FIV e FeLV nos gatis. / The infection of upper respiratory disease in cats is very common in individuals that living in shelters, with high morbidity, and in some cases, fatal. The feline herpesvirus type 1 (FHV- 1) and Chlamydophila felis are agents the main causes. The FHV- 1 causes sneezing, nasal discharge and ocular abnormalities such as conjunctivitis. The C. felis is responsible for the worst cases of conjunctivitis and features a cryptic plasmid as a possible virulence factor. The presence of the feline leukemia virus (FeLV) and/or vírus of feline immunodeficiency (FIV) weaken the function of the immune system, causing immunosuppression and therefore increased morbidity and mortality. This study evaluated four shelters, three catteries private non-commercial (one located in Osasco/SP and two in São Paulo/SP). Catteries possessed high population density and cats housed origin was unknown. The detection of FHV- 1 as three genes of the C. felis and cryptic plasmid was performed by PCR in oral mucosa and the ocular conjunctiva of both eyes obtained with cotton swabs, dried and sterile. Blood samples were collected for the detection of FeLV and FIV by enzyme immunoassay. The clinical symptoms of animals were classified from 1 to 4 , with 4 assigned to worst symptoms. The presence of the FIV and FeLV was in the first cattery 4.63% and 3.70%, in the second cattery was 0% and 6.45%, while in the third cattery was 75% and 0%, respectively, these viruses do not were detected in the 4th cattery. FHV- 1 was observed in 61.11 % of the cats in the first cattery; 90.32 % in the second cattery 100 % in the third and 89.74% of the animals of the fourth cattery. In the first cattery, 7.41% of the samples had C. felis, the second cattery, 58.06 %, in the fourth cattery, 23.08%, while the third cattery the agent was not detected. Among the samples positive for C. felis genes were detected cryptic plasmid; in the first cattery, the first gene was present in 62.50%, gene 2 and 3 in 75% of the samples; for the second cattery was obtained 61.11 % positive for 1 and 2 genes and 55.56 % to the third gene; in fourth cattery the first and the third genes were present at 77.78% of the samples in the second gene was in 55.56%. The deaths reported during the study period were classified in animals with symptoms 3 or 4 and positive for C. felis and the cryptic plasmid. In this study we observed a high incidence of C. felis and the cryptic plasmid, despite the low occurrence of FIV and FeLV in catteries.

Análise: Estudos recentes têm sugerido que os herpesvírus podem estar envolvidos na ocorrência e progressão de diferentes formas de doença periodontal. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de herpesvírus HHV-6 em biópsias gengivais de pacientes afetados por periodontite crônica e verificar a variabilidade genética das amostras positivas para HHV-6 (HHV-6 A e HHV-6 B). Como controle, biópsias gengivais de sujeitos periodontalmente saudáveis foram analisadas. Materiais e Métodos: Biópsias gengivais foram colhidas de 60 voluntários: 30 casos afetados por periodontite crônica e 30 casos periodontalmente saudáveis. Cada caso contribuiu com 1 biópsia envolvendo o epitélio e tecido conjuntivo da bolsa periodontal contendo profundidade a 5mm e apresentando sangramento à sondagem após o exame clínico; a outra biópsia controle foi concedida de local com profundidade clínica de sondagem a 3mm não apresentando sangramento. Para extração e purificação do DNA viral foi utilizado o kit da Invitrogen® (Charges Switch®g DNA Mini Tissue kit). O DNA extraído foi amplificado utilizando as técnicas de PCR e nested-PCR. Os produtos amplificados foram seqüenciados utilizando o kit Big Dye Terminator (Applied Biosystems). As seqüencias obtidas foram alinhadas com o auxílio do Programa Sequence Navigator e comparadas com amostras padrão do gene bank. Resultados: Após a análise de 60 amostras, seqüências de DNA de HHV-6 foram detectadas em locais periodontalmente saudáveis 4/30 (13,3 %), e em locais com doença periodontal 2/30 (6,7 %); seis produtos positivos da nested-PCR foram seqüenciados e apresentaram homologia para a variante B. Conclusões: O presente estudo demonstrou que o tecido gengival pode agir como reservatório para HHV-6. Nossos dados sugerem que estudos adicionais sejam realizados a fim de consolidar uma associação entre os subtipos de herpesvírus investigados com a doença periodontal destrutiva. / Analysis: Recent studies have suggested that the herpesvirus may be involved in the occurrence and progression of different forms of periodontal disease. Objectives: The purpose of this study was to investigate the HHV-6 herpesvirus presence in gingival biopsies of patients affected by chronic periodontitis and to ascertain the positive samples genetic variability for HHV-6 (HHV-6A and HHV-6B). As a control, biopsies of gingival periodontally healthy subjects were examined. Materials and Methods: gingival biopsies were taken from 60 volunteers: 30 cases affected by chronic periodontitis and 30 cases periodontally healthy. Each case contributed with 1 biopsy involving the epithelium and connective tissue of periodontal pocket depth containing 5mm and stating the bleeding on probing after the clinical examination; the other control biopsy was granted from local with clinical survey depth of 3mm showed no bleeding. For extraction and purification of viral DNA was used the Invitrogen® kit (Charges Switch ® g Mini Tissue DNA kit). The extracted DNA was amplified using the techniques of PCR and nested-PCR. The amplified products were sequenced using the Big Dye Terminator kit (Applied Biosystems). The sequences obtained were aligned with the aid of the Sequence Navigator Program and compared with standard samples of gene bank. Results: After the analysis of 60 samples, DNA sequences of HHV-6 were found in places periodontally healthy 4/30 (13,3%), and in places with periodontal disease 2/30 (6,7%); six positive products of nested-PCR were sequenced and showed homology for variant B. Conclusions: This study has demonstrated that the gingival tissue may act as a reservoir for HHV-6. Our data suggest that additional studies must be conducted to consolidate an association between subtypes of herpesvirus investigated and the destructive periodontal disease.