Diversos agentes virais são causadores de meningites e meningoencefalites. Neste estudo, técnicas moleculares foram utilizadas para detecção de HEV, HHV e HAdV em amostras de líquor colhidas de janeiro de 2005 a março de 2007. Dos três métodos de extração de DNA e RNA testados, o kit DNA Qiablood Qiagen® se mostrou o mais sensível e específico. A nested PCR detectou HEV em 28% das amostras, HSV em 4%, HHV-3 em 1%; HHV-4 em 0,3%, HHV-5 em 0,3%, HHV-6 em 0,7% e HAdV em 13%. Através da PCR em tempo real os HEV foram detectados em 23,3% e HSV em 5,1%. Por neutralização, somente duas amostras foram sorotipadas (Echovirus 6 e Coxsackievirus B). Os HEV detectados foram então seqüenciados para a determinação do sorotipo. Os sorotipos Echovirus 18 (53%) e Coxsackievirus B5 (26%) foram os mais freqüentes. As técnicas de biologia molecular aplicadas na detecção de HEV, HHV e HAdV no líquor trazem grandes vantagens ao diagnóstico de doenças do SNC graças à rapidez no diagnóstico, alta sensibilidade e especificidade. / Several viruses are etiological agents of meningitis and meningoencephalitis. In this study, molecular techniques were used for the detection of HEV, HHV and HAdV in liquor samples, collected from January 2005 to March 2007. Among the three methods tested for the extraction of DNA and RNA, the DNA Qiablood kit - Qiagen® was the most sensible and specific. HEV (28%), HSV (4%), HHV-3 (1%), HHV-4 (0.3%), HHV-5 (0.3%), HHV-6 (0.7%) and HAdV (13%) were detected by Nested PCR in the samples. By real time PCR, HEV were detected in 23.3% and HSV in 5.1%. Only two HEV could be serotyped by neutralization (Echovirus 6 and Coxsackievirus B). All detected HEV were then sequenced to determine the serotype. The serotypes echovirus 18 (53%) and Coxsackievirus B5 (26%) were the most frequent. Molecular biology techniques applied in the detection of HEV, HAdV and HHV in CSF bring major benefits to the diagnosis of meningitis thanks to the rapid diagnosis, high sensibility and specificity.

Este trabalho teve por objetivo avaliar as alterações respiratórias e neurológicas resultantes da infecção por via intranasal das diferentes estirpes nacionais do herpesvírus equino tipo 1 (EHV-1) em hamsters comparando sua susceptibilidade com estudos sobre infecção do EHV-1 em camundongos e equinos. Para isso, hamsters sírios machos, três semanas de idade, foram infectados por via intranasal com as estirpes do EHV-1 obtidas a partir de fetos abortados e potro neonato infectados (A4/72, A9/92, A3/97 e Iso/72). Os animais foram pesados e examinados diariamente em busca de sinais clínicos e neurológicos. Conforme os sintomas neurológicos apareceram, grupos de cinco hamsters foram eutanasiados por overdose de isoflurano na primeira etapa do projeto, e, de cetamina/xilazina por via intraperitoneal na segunda etapa. Na necropsia, sistema nervoso central (SNC), pulmão, fígado, baço e timo foram coletados para isolamento viral em cultura de células E-dermal e para análise histopatológica. Na segunda etapa do projeto, a lavagem broncoalveolar (LBA) com 3 ml de PBS por hamsters foi realizada para determinar a resposta inflamatória pulmonar através da contagem total e diferencial de leucócitos. Similar aos experimentos com camundongos, hamsters desafiados com as estirpes virais A4/72 e A9/92 apresentaram manifestações clínicas severas no terceiro dia pós-inoculação (dpi), tais como perda de peso aguda, dispnéia, desidratação, decúbito e morte. Observou-se também sinais neurológicos como hiperexcitabilidade, paralisia, espasmos, perda de propriocepção, andar em círculos e convulsões. Ao contrário dos camundongos, que não desenvolveram a doença; hamsters inoculados com as estirpes virais A3/97 e Iso/72 manifestaram sintomas respiratórios e neurológicos agudos entre quarto e quinto dpi, sendo as alterações respiratórias as mais evidentes, principalmente hemoptise e conjuntivite. O isolamento do vírus a partir do SNC foi positivo em todos os animais infectados; no entanto, todas as amostras de pulmões foram positivas apenas nos grupos infectado pelas estirpes virais A9/92 e A4/72. Todas as estirpes do EHV-1 foram isoladas a partir do baço, no entanto, a partir do timo foram isoladas apenas as estirpes A9/92 e A4/72, e, de fígado somente a estirpe viral Iso/72 não foi isolada. No LBA, a contagem total de leucócitos não demonstrou diferenças de valores significativas entre os grupos experimentais, sendo apenas evidente a presença de eritrócitos, macrófagos e neutrófilos na maioria dos esfregaços dos hamsters infectados. Porém, na contagem diferencial de leucócitos observou-se um aumento significativo de neutrófilo com consequente diminuição significativa de macrófagos nos hamsters infectados pelas estirpes virais A3/97, Iso/72 e A4/72 quando comparados ao grupo controle. Os hamsters infectados pela estirpe viral A9/92 mantiveram valores próximos aos do grupo controle. Ao avaliar microscopicamente o SNC, fígado e pulmão dos hamsters infectados foi observado infiltrado inflamatório, necrose e manguito perivascular em SNC; leucocitose e necrose no parênquima hepático com discreta pericolangite e proliferação de ducto biliar; e em pulmão observou inflamação, necrose, edema e hemorragia em bronquíolos e alvéolos. Concluindo, os resultados apontaram o hamster como a espécie mais susceptível à infecção pelo EHV-1 servindo como um modelo experimental complementar para estudos de doenças respiratória e neurológica provocadas por este agente em equinos / This study aimed to evaluate the respiratory and neurological disorders resulting from intranasal infection with different national strains of equine herpesvirus type 1 (EHV-1) in hamsters comparing their susceptibility to studies about EHV-1 infection in mice and horses. Therefore, male Syrian hamsters, three weeks of age, were infected via intransal with EHV-1 strains obtained from aborted fetuses and neonatal foal infected (A4/72, A9/92, A3/97 and Iso/72). The animals were weighed and examined daily for clinical search and neurological signs. As neurological symptoms appeared five hamsters groups were euthanized by isoflurane overdose in the first stage of the project, and ketamine/xylazine via intraperitoneal in the second stage. At necropsy, central nervous system (CNS), lung, liver, spleen and thymus were collected for virus isolation in E-dermal cell culture and histopathological analysis. In the second stage of the project, bronchoalveolar lavage (BAL) with 3 ml of PBS per hamsters was performed to determine the pulmonary inflammatory response through the total and differential leukocyte count. Similar to the experiments with mice, hamsters challenged with viral strains A4/72 and A9/92 had severe clinical manifestations in the third day post-inoculation (dpi), such as acute weight loss, dyspnea, dehydration, recumbency, and death. It was also observed neurological signs such as hyperexcitability, paralysis, spasms, loss of proprioception, circling and convulsions. Unlike mice, which did not develop disease; hamsters inoculated with viral strains A3/97 and Iso/72 showed acute respiratory and neurological symptoms between fourth and fifth dpi, and the most evident respiratory distress was hemoptysis and conjunctivitis. The virus isolation from CNS was positive in all infected animals; however, all lung samples were positive only in groups infected by A9/92 and A4/72 viral strains. All EHV-1 strains were recovered from spleen, however, only A9/92 and A4/72 viral strains were recovered from thymus, but only Iso/72 viral strain was not recovered from liver. BAL total leukocyte count showed no significant differences in values between the experimental groups but the presence of erythrocytes, macrophages and neutrophils were evident in most smears of infected hamsters. However, in the leukocyte differential count it was observed a significant increase in neutrophils with consequent significant reduction of macrophages in hamsters infected by viral strains A3/97, Iso/72 and A9/92 when compared with the control group. Hamsters infected with the A9/92 viral strain maintained values similar to the control group. When evaluating microscopically the CNS, liver and lungs of infected hamsters it was observed inflammatory infiltrate, necrosis and perivascular cuff in CNS; leukocytosis and necrosis in the liver parenchyma with discrete pericholangitis and bile duct proliferation; and inflammation, necrosis, edema and hemorrhage in the bronchioles and alveoli. Concluding, the results showed the hamster as the most susceptible species to EHV-1 infection serving as a complementary experimental model for studies of respiratory and neurological diseases caused by this agent in horses

A infecção de trato respiratório superior em gatos é uma afecção muito frequente em indivíduos que vivem em abrigos, com elevada morbidade e em alguns casos, fatal. O herpesvírus felino tipo1 (FHV-1) e a Chlamydophila felis estão entre os principais causadores. O FHV-1 ocasiona quadros de espirros, secreção nasal e alterações oculares como conjuntivite. A C. felis é responsável pelos piores casos de conjuntivite e apresenta um plasmídeo críptico como possível fator de virulência. A presença dos retrovírus da leucemia felina (FeLV) e/ou imunodeficiência dos felinos (FIV) debilita a função do sistema imunológico, causando imunossupressão e consequentemente aumento no índice de morbidade e mortalidade. Neste trabalho foram avaliados quatro abrigos, três gatis particulares não-comercias (um localizado em Osasco/SP e outros dois São Paulo/SP). Os gatis possuiam alta densidade populacional e a procedência dos gatos alojados era desconhecida. A detecção de FHV-1, como de C. felis e de três genes do plasmídeo criptico foram realizadas por PCR em amostras de mucosa oral e de conjuntiva ocular de ambos os olhos obtidas com swabs de algodão, secos e estéreis. Amostras de sangue foram coletadas para a detecção do FIV e FeLV por meio de teste imunoenzimático. O sintomas clínicos dos animais foram classificados de 1 a 4, sendo 4 atribuído àqueles que apresentavam pior sintomatologia. A ocorrência de FIV e FeLV no 1° gatil foi de 4,63% e 3,70%, no 2° gatil foi de 0% e 6,45%, enquanto que no 3° gatil foi 75% e 0% respectivamente, estes vírus não foram detectados no 4° gatil. FHV-1 foi observado em 61,11% dos gatos no 1° gatil; 90,32% no 2° gatil, 100% no 3° gatil e em 89,74% dos animais do 4° gatil. No 1° gatil, 7,41% das amostras apresentavam C. felis, no 2° gatil, 58,06%; no 4° gatil, 23,08%; enquanto que no 3° gatil o agente não foi detectado. Dentre as amostras positivas para C. felis, os genes do plasmídeo críptico foram detectados; no 1o gatil o gene 1 estava presente em 62,50% das amostras, o gene 2 e 3 em 75%, para o 2° gatil obteve-se 61,11% de positividade para os genes 1 e 2 e 55,56% para o gene 3; no 4° gatil o gene 1 e 3 estavam presentes em 77,78% das amostras, o gene 2 em 55,56%. Os óbitos relatados no período do estudo foram de animais classificados com sintomas 3 ou 4 e positivos para C. felis e para o plasmídeo críptico. No presente trabalho foi observada uma elevada ocorrência de C. felis e de seu plasmídeo críptico, apesar da baixa ocorrência de FIV e FeLV nos gatis. / The infection of upper respiratory disease in cats is very common in individuals that living in shelters, with high morbidity, and in some cases, fatal. The feline herpesvirus type 1 (FHV- 1) and Chlamydophila felis are agents the main causes. The FHV- 1 causes sneezing, nasal discharge and ocular abnormalities such as conjunctivitis. The C. felis is responsible for the worst cases of conjunctivitis and features a cryptic plasmid as a possible virulence factor. The presence of the feline leukemia virus (FeLV) and/or vírus of feline immunodeficiency (FIV) weaken the function of the immune system, causing immunosuppression and therefore increased morbidity and mortality. This study evaluated four shelters, three catteries private non-commercial (one located in Osasco/SP and two in São Paulo/SP). Catteries possessed high population density and cats housed origin was unknown. The detection of FHV- 1 as three genes of the C. felis and cryptic plasmid was performed by PCR in oral mucosa and the ocular conjunctiva of both eyes obtained with cotton swabs, dried and sterile. Blood samples were collected for the detection of FeLV and FIV by enzyme immunoassay. The clinical symptoms of animals were classified from 1 to 4 , with 4 assigned to worst symptoms. The presence of the FIV and FeLV was in the first cattery 4.63% and 3.70%, in the second cattery was 0% and 6.45%, while in the third cattery was 75% and 0%, respectively, these viruses do not were detected in the 4th cattery. FHV- 1 was observed in 61.11 % of the cats in the first cattery; 90.32 % in the second cattery 100 % in the third and 89.74% of the animals of the fourth cattery. In the first cattery, 7.41% of the samples had C. felis, the second cattery, 58.06 %, in the fourth cattery, 23.08%, while the third cattery the agent was not detected. Among the samples positive for C. felis genes were detected cryptic plasmid; in the first cattery, the first gene was present in 62.50%, gene 2 and 3 in 75% of the samples; for the second cattery was obtained 61.11 % positive for 1 and 2 genes and 55.56 % to the third gene; in fourth cattery the first and the third genes were present at 77.78% of the samples in the second gene was in 55.56%. The deaths reported during the study period were classified in animals with symptoms 3 or 4 and positive for C. felis and the cryptic plasmid. In this study we observed a high incidence of C. felis and the cryptic plasmid, despite the low occurrence of FIV and FeLV in catteries.

Introdução: O câncer gástrico (CG) foi recentemente categorizado em subtipos moleculares, os quais incluem os tumores Epstein-Barr (EBV)-positivo e com instabilidade de microssatélites (MSI). Esta distinção pode nos fornecer informações prognósticas e identificar alvos terapêuticos, tais como o PD-L1. Objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar a presença de EBV, MSI e expressão de PD-L1 no CG e suas associações com características clinicopatológicas e prognósticas. Métodos: Foram avaliados retrospectivamente 287 pacientes com CG submetidos à gastrectomia D2 com intenção curativa entre 2009 e 2016, através da técnica de tissue microarray. As proteínas de reparo do DNA (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) e o PD-L1 foram avaliados por imuno-histoquímica. O EBV foi avaliado por hibridação in situ. Resultados: Identificou-se a presença de EBV e MSI em 10,5% e 27% dos CGs, respectivamente. A maioria dos CGs com MSI apresentou perda simultânea da expressão de MLH1 e PMS2 (60%). O CG EBV-positivo associou-se ao sexo masculino (p=0,032), localização proximal (p < 0,001), tipo indeterminado de Lauren (p < 0,001), histologia pouco diferenciada (p=0,043) e infiltrado inflamatório acentuado (p < 0,001). Os tumores com MSI foram associados à idade mais avançada (p=0,002), gastrectomia subtotal (p=0,004), pN0 (p=0,024) e ao estágio pTNM menos avançado (p=0,020). Observou-se a imunoexpressão de PD-L1 em 8,8% dos casos, com expressão predominante no CG EBV-positivo (p < 0,001). O CG com MSI apresentou melhor sobrevida livre de doença (p=0,006) e sobrevida global (p=0,049) comparado ao EBV-negativo/microssatélite estável (MSS). Na análise multivariada, o status MSI/MSS permaneceu como fator de risco independente associado à recidiva da doença. Conclusão: O CG EBV-positivo apresentou aumento da expressão de PD-L1, enquanto o CG com MSI relacionou-se à melhor sobrevida. Ambos os subgrupos representam entidades distintas de CG e sua identificação é viável por técnicas diagnósticas convencionais. A caracterização destes subtipos de CG possibilita a aplicação de terapias direcionadas e permite ampliar o poder prognóstico dos atuais sistemas de classificação e estadiamento / Introduction: Gastric cancer (GC) has recently been categorized in molecular subtypes, which include Epstein-Barr (EBV)-positive and microsatellite instable (MSI) tumors. This distinction provides prognostic information and identifies therapeutic targets, such as PD-L1. Objective: The aim of this study was to evaluate the presence of EBV, MSI and PD-L1 expression in GC and their associations with clinicopathological characteristics and prognosis. Methods: We retrospectively evaluated 287 patients with GC who underwent D2-gastrectomy with curative intent from 2009 to 2016 through tissue microarray technique. DNA mismatch repair proteins (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) and PD-L1 were assessed by immunohistochemistry. EBV was detected by in situ hybridization. Results: The presence of EBV and MSI was identified in 10.5% and 27% of GCs, respectively. Most MSI GCs showed simultaneous loss of MLH1 and PMS2 expression (60%). EBV positivity was related to male (p=0.032), proximal location (p < 0.001), undetermined Lauren type (p < 0.001), poorly differentiated histology (p=0.043) and intense inflammatory infiltrate (p < 0.001). MSI-tumors were associated with older age (p=0.002), subtotal gastrectomy (p=0.004), pN0 (p=0.024) and more initial pTNM stage (p=0.020). PD-L1 immunoexpression was observed in 8.8% of cases, with predominant expression in EBV-positive GC (p < 0.001). MSI correlated with better disease-free survival (p=0.006) and overall survival (p=0.049) compared to the EBV-negative/microsatellite stable (MSS). In the multivariate analysis, the MSI/MSS status remained as independent risk factor associated with disease recurrence. Conclusion: EBV-positive GCs had increased PD-L1 expression, while MSI GC had better survival outcome. Both subgroups are distinct GC entities and their recognition is feasible by conventional diagnostic techniques. The characterization of these GC subtypes enables the application of targeted therapies and allows to extend the prognostic power of current classification and staging systems

Este trabalho teve por objetivo avaliar as alterações respiratórias e neurológicas resultantes da infecção por via intranasal das diferentes estirpes nacionais do herpesvírus equino tipo 1 (EHV-1) em hamsters comparando sua susceptibilidade com estudos sobre infecção do EHV-1 em camundongos e equinos. Para isso, hamsters sírios machos, três semanas de idade, foram infectados por via intranasal com as estirpes do EHV-1 obtidas a partir de fetos abortados e potro neonato infectados (A4/72, A9/92, A3/97 e Iso/72). Os animais foram pesados e examinados diariamente em busca de sinais clínicos e neurológicos. Conforme os sintomas neurológicos apareceram, grupos de cinco hamsters foram eutanasiados por overdose de isoflurano na primeira etapa do projeto, e, de cetamina/xilazina por via intraperitoneal na segunda etapa. Na necropsia, sistema nervoso central (SNC), pulmão, fígado, baço e timo foram coletados para isolamento viral em cultura de células E-dermal e para análise histopatológica. Na segunda etapa do projeto, a lavagem broncoalveolar (LBA) com 3 ml de PBS por hamsters foi realizada para determinar a resposta inflamatória pulmonar através da contagem total e diferencial de leucócitos. Similar aos experimentos com camundongos, hamsters desafiados com as estirpes virais A4/72 e A9/92 apresentaram manifestações clínicas severas no terceiro dia pós-inoculação (dpi), tais como perda de peso aguda, dispnéia, desidratação, decúbito e morte. Observou-se também sinais neurológicos como hiperexcitabilidade, paralisia, espasmos, perda de propriocepção, andar em círculos e convulsões. Ao contrário dos camundongos, que não desenvolveram a doença; hamsters inoculados com as estirpes virais A3/97 e Iso/72 manifestaram sintomas respiratórios e neurológicos agudos entre quarto e quinto dpi, sendo as alterações respiratórias as mais evidentes, principalmente hemoptise e conjuntivite. O isolamento do vírus a partir do SNC foi positivo em todos os animais infectados; no entanto, todas as amostras de pulmões foram positivas apenas nos grupos infectado pelas estirpes virais A9/92 e A4/72. Todas as estirpes do EHV-1 foram isoladas a partir do baço, no entanto, a partir do timo foram isoladas apenas as estirpes A9/92 e A4/72, e, de fígado somente a estirpe viral Iso/72 não foi isolada. No LBA, a contagem total de leucócitos não demonstrou diferenças de valores significativas entre os grupos experimentais, sendo apenas evidente a presença de eritrócitos, macrófagos e neutrófilos na maioria dos esfregaços dos hamsters infectados. Porém, na contagem diferencial de leucócitos observou-se um aumento significativo de neutrófilo com consequente diminuição significativa de macrófagos nos hamsters infectados pelas estirpes virais A3/97, Iso/72 e A4/72 quando comparados ao grupo controle. Os hamsters infectados pela estirpe viral A9/92 mantiveram valores próximos aos do grupo controle. Ao avaliar microscopicamente o SNC, fígado e pulmão dos hamsters infectados foi observado infiltrado inflamatório, necrose e manguito perivascular em SNC; leucocitose e necrose no parênquima hepático com discreta pericolangite e proliferação de ducto biliar; e em pulmão observou inflamação, necrose, edema e hemorragia em bronquíolos e alvéolos. Concluindo, os resultados apontaram o hamster como a espécie mais susceptível à infecção pelo EHV-1 servindo como um modelo experimental complementar para estudos de doenças respiratória e neurológica provocadas por este agente em equinos / This study aimed to evaluate the respiratory and neurological disorders resulting from intranasal infection with different national strains of equine herpesvirus type 1 (EHV-1) in hamsters comparing their susceptibility to studies about EHV-1 infection in mice and horses. Therefore, male Syrian hamsters, three weeks of age, were infected via intransal with EHV-1 strains obtained from aborted fetuses and neonatal foal infected (A4/72, A9/92, A3/97 and Iso/72). The animals were weighed and examined daily for clinical search and neurological signs. As neurological symptoms appeared five hamsters groups were euthanized by isoflurane overdose in the first stage of the project, and ketamine/xylazine via intraperitoneal in the second stage. At necropsy, central nervous system (CNS), lung, liver, spleen and thymus were collected for virus isolation in E-dermal cell culture and histopathological analysis. In the second stage of the project, bronchoalveolar lavage (BAL) with 3 ml of PBS per hamsters was performed to determine the pulmonary inflammatory response through the total and differential leukocyte count. Similar to the experiments with mice, hamsters challenged with viral strains A4/72 and A9/92 had severe clinical manifestations in the third day post-inoculation (dpi), such as acute weight loss, dyspnea, dehydration, recumbency, and death. It was also observed neurological signs such as hyperexcitability, paralysis, spasms, loss of proprioception, circling and convulsions. Unlike mice, which did not develop disease; hamsters inoculated with viral strains A3/97 and Iso/72 showed acute respiratory and neurological symptoms between fourth and fifth dpi, and the most evident respiratory distress was hemoptysis and conjunctivitis. The virus isolation from CNS was positive in all infected animals; however, all lung samples were positive only in groups infected by A9/92 and A4/72 viral strains. All EHV-1 strains were recovered from spleen, however, only A9/92 and A4/72 viral strains were recovered from thymus, but only Iso/72 viral strain was not recovered from liver. BAL total leukocyte count showed no significant differences in values between the experimental groups but the presence of erythrocytes, macrophages and neutrophils were evident in most smears of infected hamsters. However, in the leukocyte differential count it was observed a significant increase in neutrophils with consequent significant reduction of macrophages in hamsters infected by viral strains A3/97, Iso/72 and A9/92 when compared with the control group. Hamsters infected with the A9/92 viral strain maintained values similar to the control group. When evaluating microscopically the CNS, liver and lungs of infected hamsters it was observed inflammatory infiltrate, necrosis and perivascular cuff in CNS; leukocytosis and necrosis in the liver parenchyma with discrete pericholangitis and bile duct proliferation; and inflammation, necrosis, edema and hemorrhage in the bronchioles and alveoli. Concluding, the results showed the hamster as the most susceptible species to EHV-1 infection serving as a complementary experimental model for studies of respiratory and neurological diseases caused by this agent in horses

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bovine herpesvirus types 1 and 5 (BoHV-1, BoHV-5) are genetically and antigenic related viruses and have been associated with important economic losses to the cattle industry. The aim of this Thesis was to perform the molecular identification of BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The first part describes the identification of 40 herpesviruses isolated from different clinical specimens and syndromes in central-southern Brazil, Argentina and Uruguay (1987 2006). The differentiation between BoHV-1 and BoHV-5 was performed by examining the size of the amplification product of a glycoprotein C gene-based PCR, designed for a low homology region of the gene. BoHV-1 isolates (n=16) were identified in cases of respiratory disease (n=3), vulvovaginitis and/or balanoposthitis (n=3), in semen of healthy bulls (n=5) and in cases of neurological disease (n=5). Samples identified as BoHV-5 (n=24) were isolated predominantly from cases of neurological disease (n=21), but also from semen of healthy bulls (n=2) and from a spleen of a calf with systemic disease (n=1). These results show that both BoHV-1 and BoHV-5 are not strictly associated with their respective diseases; yet are frequently involved in clinical conditions otherwise attributed to the other virus type. These findings also reinforce the need of correctly identifying the herpesvirus isolates as to better understand their pathogenesis and epidemiology. In the second part, it is reported the characterization of five Brazilian BoHV-1 isolates associated with neurological disease, an unusual finding. All five samples were isolated from the brain of cattle presenting neurological disease, yet histological evidences of meningoencephalitis were not observed in three cases. The isolated viruses were identified as BoHV-1 by a glycoprotein C gene-based PCR able to differentiate BoHV-1 from BoHV-5. The identity of the isolates was confirmed by nucleotide sequencing of the amplicons and by restriction analysis of PCR products from another gC region. Monoclonal antibody binding and cross-neutralization assays with BoHV-1 and BoHV-5 antisera showed a typical BoHV-1 antigenic profile. Inoculation of rabbits with these five BoHV-1 isolates did not result in neurological disease, contrasting with fatal meningoencephalitis produced by BoHV-5. Thus, the involvement of BoHV-1 in neurological disease of cattle is more frequent than previously reported, indicating the need for fast and precise means of differentiating it from BoHV-5. Likewise, the potential role of BoHV-1 in neurological disease in cattle should be further investigated. / Os herpesvírus bovino tipos 1 e 5 (BoHV-1, BoHV-5) são agentes geneticamente e antigenicamente relacionados que causam grandes prejuízos econômicos à bovinocultura. O objetivo desta tese foi o de realizar a identificação e diferenciação molecular de isolados de BoHV-1 e BoHV-5. Na primeira parte, foi relatada a identificação de 40 amostras de BoHV isoladas de diferentes casos clínicos na região Centro-Sul do Brasil, Argentina e Uruguai entre 1987 e 2006. A diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 foi realizada pelo uso de um PCR para uma região de baixa homologia do gene da glicoproteína C, o que permitiu a diferenciação entre os tipos virais pelo tamanho do amplicon. As amostras identificadas como BoHV-1 (n=16) foram isoladas de doença respiratória (n=3), balanopostite e/ou vulvovaginite (n=3), do sêmen de touros saudáveis (n=5) e de casos doença neurológica (n=5). As amostras identificadas como BoHV-5 (n=24) foram, em sua maioria, isoladas de doença neurológica (n=21), mas também do sêmen de touros saudáveis (n=2) e do baço de um bezerro com doença sistêmica (n=1). Esses resultados demonstram que tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 não estão estritamente associados às suas respectivas síndromes clínicas e que podem estar envolvidos em casos clínicos classicamente atribuídos ao outro tipo viral. Esses achados também reforçam a necessidade da correta identificação dos isolados de herpesvírus para um melhor conhecimento da sua patogenia e epidemiologia. Na segunda parte do trabalho, foram caracterizados cinco isolados de BoHV-1 provenientes de casos de doença neurológica. Esses vírus foram isolados do encéfalo de bovinos que apresentavam sinais neurológicos. Entretanto, evidências histológicas de meningoencefalite não foram observadas em três dos cinco casos. Os isolados foram identificados como BoHV-1 pela utilização de um PCR direcionado para o gene da gC. A identidade dos isolados foi confirmada pelo sequenciamento do amplicon e também por um segundo PCR para outra região do gene da gC, seguido de análise de restrição enzimática do amplicon. A caracterização antigênica com anticorpos monoclonais e testes de soroneutralização cruzada demostraram um perfil típico de BoHV-1. Esses cinco isolados também foram inoculados em coelhos, nos quais não produziram doença neurológica. Esses resultados demostram que o envolvimento de BoHV-1 em doença neurológica em bovinos é mais frequente do que o relatado anteriormente, evidenciando a necessidade de uma precisa diferenciação entre os tipos virais.

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

Submitted by NATÁLIA AUGUSTO BENEDETTI null (benedetti@fmb.unesp.br) on 2016-04-06T23:09:36Z No. of bitstreams: 1 dissertação final abril 2016.docx: 4301870 bytes, checksum: 5ef2edd34f4c9f2caef591ab8900f625 (MD5) / Rejected by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Por favor, corrija o formato do arquivo e realize uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2016-04-07T18:21:01Z (GMT) / Submitted by NATÁLIA AUGUSTO BENEDETTI null (benedetti@fmb.unesp.br) on 2016-04-12T15:26:01Z No. of bitstreams: 1 dissertação final abril 2016.pdf: 1048311 bytes, checksum: 20ef19de54a6fc1bc779302643956cce (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-04-13T13:10:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 benedeti_na_me_bot.pdf: 1048311 bytes, checksum: 20ef19de54a6fc1bc779302643956cce (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-13T13:10:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 benedeti_na_me_bot.pdf: 1048311 bytes, checksum: 20ef19de54a6fc1bc779302643956cce (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / O Sistema de Vigilância Sanitária da Itália detectou 445 casos de hepatite B e 69 de hepatite C, relacionados aos tratamentos de beleza. Fato esse alarmante, pois, os cuidados com a aparência, têm levado a população a buscar os padrões de beleza estabelecidos pela mídia. Destacando-se que os salões de beleza no Brasil estão cada vez mais comuns com a atuação dos profissionais de manicure e pedicure. Entretanto, os produtos cosméticos necessitam de uma avaliação da qualidade sanitária, ou seja, testes que indicam a quantidade de micro-organismos viáveis em cada amostra. Pois, evidências mostram a sobrevivência dos Trichophytonrubrum, Trichopyton mentagrophytes, Candida albicans, Candida parapsilosis no esmalte de unha. Todavia, a composição e a fabricação do esmalte são pouco conhecidas, devido várias etapas estarem envolvidas na produção dos esmaltes de unhas comuns. Objetivo: Avaliar a ação dos solventes presentes no esmalte de unha, o acetato de etila e o acetato de butila, sobre o herpes vírus bovino tipo 5. Método: Realizou ensaios da atividade antiviral nas diferentes fases do ciclo replicativo com os solventes, acetato de etila e o acetato de butila. Resultados: No pré-tratamento, não houve replicação viral no acetato de etila a partir da diluição 10-6 e no acetato de butila 10-5 . No póstratamento não houve replicação viral no acetato de etila a partir da diluição 10-7 e no acetato de butila 10-5 e na inativação viral, tanto o acetato de etila como o butila, após 48 e 72 horas, todas as diluições apresentaram replicação viral, 10-1 a 10-10 . Discussão: Apesar de não identificar na literatura relatos específicos sobre solventes acetato de etila e acetato de butila na atividade antiviral, o presente estudo evidenciou que apesar de pouca diferença entre as diluições sequenciais desses solventes, houve replicação viral em diluições mais concentradas de vírus e de solventes. A limitação do estudo, com o uso do esmalte de unha, se deu pelo fato deste produto não ser diluído em meio de cultura para células em sua totalidade, além de conter substâncias muito voláteis que secam o produto rapidamente. Conclusão: Concluiu-se que houve replicação viral nas diferentes diluições, em maior concentração de solvente e maior número de vírus. Para diminuir o risco de contaminação cruzada da população pela disseminação de micro-organismos, mostra a necessidade dos órgãos fiscalizadores atuarem mais nesses estabelecimentos, educando e verificando a rotina do trabalho desses profissionais. / The Health Surveillance System in Italy detected 445 cases of hepatitis B and 69 hepatitis C related to beauty treatments. These alarming facts, for care of the appearance have led people to look for the beauty standards set by the media. If highlighting the beauty salons in Brazil is becoming more common with the activities of manicure and pedicure professionals. However, cosmetic products require a quality assessment of the health, is tests which indicate the amount of viable microorganisms in each sample. For evidence shows the survival of Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans, Candida parapsilosis in nail polish. However, the enamel composition and manufacturing are little known due several steps are involved in the production of common nail enamels. Objective: To evaluate the action of solvents present in nail enamel, ethyl acetate and butyl acetate, about herpesvirus bovine type 5. Method: The antiviral activity test performed at different stages of the replicative cycle of the solvents, ethyl acetate and butyl acetate. Results: In the pre-treatment, there was no viral replication in the ethyl acetate dilution from 10-6 to 10-5 in butyl acetate. In the post-treatment there was no viral replication in ethyl acetate from the dilution 10-7 and 10-5 butyl acetate and viral inactivation, both the ethyl acetate and the butyl after 48 and 72 hours, all dilutions they showed viral replication, 10-1 to 10-10 . Discussion: Although not identify the specific reports literature solvents ethyl acetate and butyl acetate in antiviral activity, this study showed that despite little difference between serial dilutions of these solvents, there viral replication in more concentrated dilutions of virus and solvents. A limitation of the study, using the nail polish, was due to the fact that this product is not be diluted in culture medium to cells in its entirety, and contain highly volatile substances that dry the product quickly. Conclusion: We conclude that there was viral replication in the different dilutions, higher solvent concentration and a higher number of viruses. To reduce the risk of cross-contamination of the population by the spread of micro-organisms, it shows the need for regulatory agencies act more in these establishments, educating and checking the routine work of these professionals.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / We herein report an evaluation of the attenuation and protection conferred by genital vaccination of heifers with a bovine herpesvirus type 1 strain (BoHV-1) defective in the glycoprotein E (SV265gE-). A group of six seronegative heifers was vaccinated with SV265gE- in the submucosa of the vulva (group IV; 106.9TCID50); four heifers were vaccinated intramuscularly (group IM; 107.6TCID50) and four heifers remained as nonvaccinated controls. Heifers vaccinated IV developed mild and transient local edema and hyperemia and shed low amounts of virus for a few days after vaccination, yet a sentinel heifer maintained in close contact did not seroconvert. Attempts to reactivate the vaccine virus in two IV vaccinated heifers by intravenous administration of dexamethasone (0.5 mg.kg-1) at day 65 post-vaccination (pv) failed since no virus shedding, recrudescence of genital signs or seroconversion were observed. At day 65 pv, all vaccinated and control heifers were challenged by genital inoculation of a highly virulent BoHV-1.2 isolate (SV-56/90, 107.4TCID50/animal). After challenge, virus shedding was detected in genital secretions of control animals for 8.2 days (8 9 days); in the IM group for 6.2 days (5 8 days) and during 5.2 days (5 6 days) in the IV group. Control non-vaccinated heifers developed moderate (2/4) or severe (2/4) vulvovaginitis lasting 9 to 14 days ( 11.2 days). The disease was characterized by vulvar edema, vulvovestibular congestion, small vesicles progressing to coalescence and erosions, fibrinonecrotic plaques and fibrinopurulent exsudate. IM vaccinated heifers developed mild (1/3) or moderate (3/4) genital lesions, lasting 10 to 13 days ( 11.5 days); and IV vaccinated heifers developed mild and transient (3/4) or mild to moderate genital signs (1/4), lasting 4 to 8 days ( 5.5 days). Clinical examination of the animals after challenge revealed that vaccination by both routes conferred some degree of protection, yet IV vaccination was clearly more effective in reducing the duration of virus shedding, the severity and duration of clinical disease. Taken together, these results demonstrate that SV265gE- is sufficiently attenuated upon IV vaccination in a low-titer dosis, is not reactivated after corticosteroid treatment and lastly, and more importantly, confers local protection upon challenge with a high titer of a virulent heterologous BoHV-1 isolate. Thus, this immunization strategy may be considered for the prevention of BoHV-1-associated genital disease in the field. / O presente estudo relata a avaliação da atenuação e proteção conferida pela vacinação intravaginal de bezerras com uma cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) defectiva na glicoproteína E (SV265gE-). Um grupo de seis bezerras foi vacinado com a cepa SV265gE- na submucosa da vulva (grupo IV; 106,9TCID50); quatro bezerras foram vacinadas pela via intramuscular (grupo IM; 107,6TCID50) e quatro bezerras permaneceram como controles não-vacinadas. As bezerras vacinadas pela via IV apresentaram edema e hiperemia leve e transitório na vulva; excretaram pequenas quantidades de vírus nas secreções, mas não transmitiram o vírus a uma bezerra sentinela mantida em contato. A tentativa de reativar o vírus vacinal em duas bezerras vacinadas IV pela administração intravenosa de dexametasona (0.5 mg.kg-1) no dia 65 pós-vacinação (pv) não resultou em excreção viral, recrudescência clínica ou soroconversão. No dia 65 pv, as bezerras vacinadas e as controles foram desafiadas pela inoculação genital da cepa SV-56/90 do BoHV-1.2 (107,4TCID50/animal). Após o desafio, o vírus foi detectado nas secreções das bezerras controles por 8 a 9 dias ( 8,2 dias); nas bezerras do grupo IM por 5 a 8 dias ( 6,2) e nas do grupo IV por 5 a 6 dias ( 5,2 dias). As bezerras controle desenvolveram vulvovaginite moderada (2/4) ou severa (2/4) com duração média de 11,2 dias (9 14). A enfermidade caracterizou-se por edema vulvar, congestão vulvovestibular, formação de pequenas vesículas, pústulas, que progrediram até coalescerem, erosões, placas fibrinonecróticas recobertas com exsudato fibrinopurulento. As bezerras do grupo IM desenvolveram vulvovaginite leve (1/3) ou moderada (3/4), com duração média de 11,5 dias (10 13 dias); enquanto as bezerras do grupo IV desenvolveram sinais genitais leves e transitórios (3/4) ou moderados (1/4), com duração média de 5,5 dias (4 8). A avaliação clínica pós-desafio demonstrou que a vacinação pelas duas vias (IM e IV) conferiu proteção, mas a vacinação IV foi mais efetiva na redução do tempo de excreção viral e na redução da severidade e duração dos sinais clínicos. Assim, esses resultados demonstram que a cepa SV265gE- é suficientemente atenuada para vacinação IV em dose baixa, não é reativada pela administração de dexametasona e, principalmente, confere proteção adequada frente a desafio genital com uma dose alta de uma cepa heteróloga altamente virulenta. Portanto, essa estratégia de imunização pode ser considerada para a prevenção das perdas reprodutivas causadas pela infecção genital pelo BoHV-1.

The biology and epidemiology of bovine herpesvirus 2 (BoHV-2), the agent of bovine herpetic mammillitis (BHM), remain largely unknown. Thus, the present study aimed at addressing selected aspects of BoHV-2 epidemiology and pathogenesis in sheep and guinea pigs. A serological survey for BoHV-2 antibodies in 2.213 samples from cattle > 24-months-old from 136 counties of seven different mesoregions of Rio Grande do Sul (RS) revealed an overall prevalence of 24.5% (543/2.213). These results demonstrate that BoHV-2 infection is widespread among cattle in RS, and potentially involved in cases of mammillitis frequently described in dairy cows. A second experiment was conducted to characterize the latent BoHV-2 infection in a sheep model. Lactating ewes inoculated with BoHV-2 in the skin of the udder shed virus for up to five days, developed mammillitis and seroconverted. However, attempts to reactivate latent infection by dexamethasone (Dx) administration at day 40 post infection (pi) failed. Nevertheless, viral DNA was detected by PCR in several nerve ganglia and/or regional lymph nodes (LNs) of all animals at day 40 post-reactivation (pr). Lambs previously inoculated with BoHV-2 in the nose also harbored latent viral DNA in trigeminal ganglia, tonsils and regional LNs. These results demonstrated that BoHV-2 establishes latent infection in nerve ganglia and in regional lymphoid tissues, yet virus reactivation is not easily achieved by standard protocols used for other alphaherpesvirus. A third experiment was conducted to evaluate guinea pigs (Cavia porcellus) as an experimental model to study the biology of BoHV-2 infection. Weanling (30-40 daysold) guinea pigs inoculated into the genital area and over the skin of the udder and teats with a viral suspension developed moderate to severe clinical signs, noticeably more pronounced in the genital area. Infectious virus was recovered from swabs collected between days 3 and 7 from genital area (8/12) and less frequently (1/12) from teat skin. All animals seroconverted to BoHV-2 developing neutralizing titers from 16 to 128 at day 30 pi. Histological examination of skin biopsies collected from genital lesions showed intranuclear inclusion bodies and perivascular infiltrates composed by lymphocytes and plasmocytes. PCR examination of tissues collected from animals euthanized at day 35 pi revealed the presence of latent viral DNA in nerve ganglia and LNs. Dx administration at day 35 pi was followed by mild recrudescence of genital disease in some animals, yet virus isolation and/or seroconversion which are usually taken as indicators of virus reactivation were not observed. These results show that guinea pigs may be used as models to study BoHV-2 acute and latent infection and confirm that BoHV-2 reactivation is not easily achieved by using the standard protocols for other alphaherpesviruses. Taken together, these results demonstrate that both sheep and guinea pigs are suitable animal models for BoHV-2 infection. / A biologia e a epidemiologia da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 2 (BoHV-2), agente da mamilite herpérica bovina, são pouco conhecidas. Com isso, o presente estudo teve como objetivos elucidar alguns aspectos da epidemiologia e estudar a patogenia da infecção pelo BoHV-2 em ovinos e cobaias. Um estudo sorológico pesquisando anticorpos para o BoHV-2 em 2.213 amostras de bovinos com mais de 2 anos, provenientes de 136 municípios distribuídos em 7 mesoregiões do Rio Grande do Sul (RS), determinou uma soroprevalência de 24,5% (543/2.213). Os resultados demonstram que o BoHV-2 está disseminado no rebanho bovino no RS, com potencial envolvimento em casos de mamilite freqüentemente relatados em rebanhos leiteiros. Um segundo experimento visou caracterizar a infecção latente em ovinos, propostos como modelo experimental. Ovelhas lactantes inoculadas com o BoHV-2 na pele do úbere excretaram o vírus por até 5 dias, desenvolveram mamilite e soroconverteram. Entretanto, a tentativa de reativar a infecção latente pela administração de dexametasona (Dx) no dia 40 pós-infecção (pi) não resultou em reativação. Não obstante, o DNA viral latente foi detectado por PCR em gânglios neurais e/ou em diversos linfonodos (LNs) de todos os animais no dia 40 pós reativação (pr). Cordeiros que haviam sido inoculados com o BoHV-2 pela via nasal igualmente albergavam o DNA viral latente nos gânglios trigêmeos, tonsilas e LNs regionais. Esses resultados demonstram que o BoHV-2 estabelece infecção latente em gânglios neurais e tecidos linfóides regionais, embora a reativação viral não seja facilmente obtida com os protocolos usados em outros alfaherpesvírus. Um terceiro experimento foi realizado para validar cobaias (Cavia porcellus) como modelo experimental para estudo da biologia da infecção com o BoHV-2. Cobaias lactentes (30- 40 dias) inoculadas com o BoHV-2 nas regiões genital e intra-dérmico no tetos e úbere desenvolveram sinais clínicos moderados a severos, notadamente mais pronunciados na região genital. O vírus foi isolado de suabes coletados entre os dias 3 e 7 pi da região genital (8/12) e em menor freqüência da região dos tetos (1/12). Todos os animais soroconverteram para o BoHV-2, apresentando títulos de anticorpos neutralizantes entre 16 e 128 no dia 30 p.i. A análise histológica de biópsias de pele coletada de lesões revelou corpúsculos de inclusão e infiltrado linfocitário e plasmocitário perivascular. PCR realizada com DNA total extraído dos tecidos coletados no dia 35 pi revelou a presença de DNA viral latente em gânglios neurais lombo-sacrais e LNs regionais. A administração de Dx no dia 35 pi cursou com recrudescência clínica na região genital, porém não foram detectados excreção viral nem soroconversão, indicadores de reativação da infecção latente. Estes resultados demonstram que cobaias podem ser usados como modelo para a infecção aguda e latente pelo BoHV- 2, e confirmam que a reativação viral não é facilmente obtida pelo uso de protocolos usuais para outros alfaherpesvírus. Em conjunto, os resultados demonstram a utilidade de ovinos e cobaias como modelo experimental para a infecção pelo BoHV-2.