Les flavan-3-ols et leurs polymères, les proanthocyanidines, appartiennent à une famille de flavonoïdes appelée les tannins condensés. Ces composés polyphénoliques jouent un rôle essentiel dans la qualité phytosanitaire des baies de raisin ainsi que dans les propriétés organoleptiques du vin (flaveur, astringence et couleur). La connaissance des mécanismes qui régissent leur biosynthèse est donc primordiale afin de mieux comprendre la mise en place de la typicité d’un vin. Ce mémoire est consacré à l’étude de l’une des enzymes responsables de la synthèse des flavan-3-ols : la leucoanthocyanidine réductase 1 de Vitis vinifera (VvLAR1). Dans une première partie, nous décrivons les conditions d’expression, de purification et de stabilité de l’enzyme recombinante. L’activité enzymatique est démontrée et la configuration 2R,3S des produits réactionnels caractérisée. La seconde partie de ce manuscrit décrit l’étude structurale de l’enzyme. Des monocristaux d’apoenzyme, de complexes binaires (VvLAR1 / NADPH) et d’un complexe ternaire (VvLAR1 / NADPH / (+)-catéchine) ont été obtenus. Les différentes structures permettent de décrire les modifications structurales associées à la fixation du coenzyme puis du produit. Un mécanisme catalytique basé sur les interactions intermoléculaires observées au sein du complexe ternaire est proposé. La troisième partie de ce mémoire est consacrée à la recherche de conditions expérimentales permettant la production et la stabilisation de la leucocyanidine en solution, un des substrats naturels de l’enzyme. Les résultats obtenus permettent une première approche de l’étude des propriétés cinétiques de la VvLAR1. / Flavan-3-ols and their polymerisation products, proanthocyanidins, belong to a flavonoid family named condensed tannins. These polyphenolic compounds play a major role in the protection of grape berries to intruders and in the organoleptic properties of wine (flavour, astringency and colour). Knowledge of the mechanisms which govern their biosynthesis is thus essential to better understand wine typical composition. The present thesis is devoted to the investigation of one of the two enzymes which catalyse the flavan-3-ols formation: leucoanthocyanidin reductase 1 from Vitis vinifera (VvLAR1). In the first part of the manuscript, we describe the expression, purification and stability conditions of the recombinant enzyme. The enzyme activity is demonstrated and the reaction product 2R,3S configuration is characterised. The second part of this report describes the structural studies of the enzyme. Monocrystals of the apoenzyme and of binaries (VvLAR1 / NADPH) and a ternary (VvLAR1 / NADPH / (+)-catechin) complexes were obtained. These different structures allow the description of the structural changes associated with the coenzyme and then the substrate binding. A catalytic mechanism, based on the intermolecular interactions within the ternary complex, is proposed. The last part of the work is devoted to the investigation of the experimental conditions leading to the stability of leucocyanidin in solution, one of the natural substrates of the enzyme. The results obtained allow a first study of the VvLAR1 kinetic properties.

La schizophrénie est une maladie mentale grave qui présente une comorbidité fréquente avec la toxicomanie et avec divers troubles immunitaires. Une méta-analyse réalisée récemment dans notre laboratoire a montré une augmentation d’IL-6 (une cytokine pro-inflammatoire), du récepteur soluble d’IL-2 (un marqueur d’activation du système immunitaire), et d’IL-1RA (une cytokine anti-inflammatoire) dans la schizophrénie, suggérant l’existence d’un syndrome inflammatoire dans cette maladie. La toxicomanie aussi est associée au dérèglement du réseau des cytokines inflammatoires, mais les effets dépendent du type de drogues et ils sont parfois diamétralement opposés. On dispose encore de peu d’informations sur le statut immunitaire et inflammatoire des patients qui ont un double diagnostic de schizophrénie et de toxicomanie. Le but de ce travail était d’explorer l’existence d’un état inflammatoire systémique chez les patients schizophrènes et toxicomanes, et l’influence du traitement avec un médicament antipsychotique atypique, la quétiapine. Les objectifs spécifiques étaient : 1) Mesurer les concentrations plasmatiques des cytokines inflammatoires chez les schizophrènes et toxicomanes avant, pendant et après traitement avec la quétiapine ; et 2) Faire des études de corrélations entre les taux de cytokines, les symptômes cliniques, et la consommation de drogues. Les résultats montrent que comparativement aux contrôles normaux, les patients avec un double diagnostic présentent une augmentation d’IL-6, d’IL-1RA, du sIL-2R et d’IL-8 avant traitement à la quétiapine. Les augmentations des concentrations plasmatiques d’IL-1RA sont particulièrement importantes chez les patients avec double diagnostic, si on les compare à celles publiées chez les schizophrènes sans toxicomanie. Le traitement à la quétiapine n’influence pas les concentrations plasmatiques de ces cytokines, sauf sIL-2R qui augmente davantage au cours du traitement. Des corrélations positives de puissance modérée sont retrouvées entre IL-6 et dépression, IL-6 et alcool, IL-1RA et cognition, IL-8 et dépression, IL-8 et alcool, sIL-2R et cannabis. Notre étude révèle que la réponse inflammatoire est activée chez les schizophrènes et toxicomanes. De plus, la toxicomanie semble jouer un rôle facilitant ou potentialisateur dans les augmentations des taux circulants d’IL-1RA. Les études en cours sur différentes populations de schizophrènes avec ou sans toxicomanie, et chez des toxicomanes non schizophrènes permettront de préciser le rôle des différentes drogues d’abus dans le syndrome inflammatoire chez les schizophrènes, ainsi que les implications de ce syndrome sur le plan clinique et thérapeutique. / Schizophrenia is a psychosis which presents a frequent comorbidity with substance use disorders (SUD) and with various immune alterations. Using meta-analysis, we have demonstrated previously establishment of an inflammatory syndrome in schizophrenia patients, illustrated by elevated circulating levels of IL-6 (a pro-inflammatory cytokine), sIL-2R (marker of immune activation) and IL-1RA (an anti-inflammatory cytokine). SUD is also associated with dysregulation of inflammatory cytokines, but the effects may depend on the type of substance of abuse. The goal of this project was: 1) To measure plasma concentrations of inflammatory cytokines in schizophrenia patients with comorbid SUD, before, during and after treatment with an atypical antipsychotic, quetiapine; and 2) To perform correlation studies between plasma concentrations of inflammatory cytokines and clinical symptoms, including positive and negative symptoms, cognition, depression and substance use. Relative to normal controls, patients with a dual diagnosis showed increased plasma concentrations of IL-6, IL-1RA, sIL-2R, and IL-8 at baseline, IL-1RA increases being the most important. Quetiapine treatment did not influence plasma cytokine concentrations, except sIL-2R which increased further. Moderate positive correlations were found between IL-6 and depression, IL-6 and alcohol, IL-1RA and cognition, IL-8 and depression, IL-8 and alcohol and between sIL-2R and cannabis. This study demonstrates that the immune and inflammatory response is activated in schizophrenia patients with comorbid SUD. Furthermore, SUD may play a facilitating or potentiating role in the increases in peripheral levels of IL-1RA. Ongoing studies in different patient populations with schizophrenia with or without SUD, and patients with SUD alone will help elucidate the role of different substances of abuse in the inflammatory syndrome in schizophrenia, as well as the clinical and therapeutic relevance of this syndrome.

O relaxamento vascular induzido pelo óxido nítrico (NO) está prejudicado em aorta de ratos hipertensos renais (2R-1C). A nossa hipótese é de que o menor efeito do NO na aorta de ratos 2R-1C pode estar relacionada com a maior degradação do NO e/ou modificação das cavéolas no músculo liso vascular (MLV), considerando que o NO pode ser degradado rapidamente e que as cavéolas parecem ser importantes para a redução da concentração citosólica de Ca2+ ([Ca2+]c). O presente trabalho teve por objetivo estudar as alterações nos mecanismos vasodilatadores do NO em aorta de ratos hipertensos renais 2R-1C. Inicialmente, estudamos a influência do estresse oxidativo sobre o efeito do NO liberado dos doadores [Ru(NH.NHq)(terpy)NO+]3+ (TERPY) e nitroprussiato de sódio (NPS) em aorta de ratos normotensos (2R) e 2R-1C. Verificamos que o relaxamento foi menor na aorta dos ratos 2R-1C do que de 2R para o TERPY e NPS e que nas células do MLV da aorta de 2R-1C o efeito do TERPY em reduzir a [Ca2+]c também foi menor. Porém, o tratamento das aortas de ratos 2R-1C com antioxidante normalizou o relaxamento para ambos doadores e o efeito do TERPY sobre a [Ca2+]c. A concentração basal de superóxido (O2-) nas aortas dos ratos 2R-1C é maior do que em 2R e foi reduzida pelos antioxidantes. A concentração de NO basal e liberada do TERPY é menor em aortas de ratos 2R-1C. Estudamos a influência das cavéolas sobre o efeito do TERPY e NPS, em aorta de ratos 2R e 2R-1C. Somente em aortas de ratos 2R, a desorganização das cavéolas com ciclodextrina inibiu o relaxamento dos doadores de NO utilizados e a redução da [Ca2+]c para o TERPY. O número de cavéolas é menor tanto nas células do MLV como nas células endoteliais da aorta de ratos 2R-1C. Estudamos ainda o efeito do TERPY sobre a pressão arterial de ratos 2R e 2R-1C acordados. O TERPY possui efeito hipotensor somente nos ratos 2R-1C e este efeito foi mais prolongado do que o efeito hipotensor com NPS. O NPS teve efeito hipotensor tanto em ratos 2R como 2R-1C, porém este efeito foi maior em 2R-1C. Os resultados obtidos neste estudo indicam que a elevada concentração de O2- e o menor número de cavéolas encontrados na aorta dos ratos 2R-1C, devem contribuir de forma importante para o menor relaxamento da aorta de ratos 2R-1C. / The vascular relaxation induced by nitric oxide (NO) donors is impaired in aortas from renal hypertensive rats (2K-1C). Our hypothesis was that the lower NO effect in aortas from 2K-1C rats could be related with the higher degradation of NO and/or caveolae changes in vascular smooth muscle cells (VSMCs), considering that NO can be rapidly degraded and caveolae seems to play important role in the reduction of cytosolic Ca2+ concentration [Ca2+]c. The present study aimed to investigate the alterations on aorta relaxation induced by NO in 2K-1C rat aorta. At first, we studied the influence of oxidative stress on the effect of NO released from the NO donors [Ru(NH.NHq)(terpy)NO+]3+ (TERPY) and sodium nitroprusside (SNP) in aortas from normotensive (2K) and 2K-1C rats. The relaxation induced by both NO donors was impaired in aortas from 2K-1C rats and the reduction on [Ca2+]c induced by TERPY was also impaired in 2K-1C VSMCs. However, in aortas treated with antioxidants the relaxation to both NO donors and the reduction on [Ca2+]c to TERPY were normalized. The basal concentration of superoxide (O2-) was greater in 2K-1C than in 2K, which was reduced by the antioxidants. The basal cytosolic NO concentration ([NO]c) and the NO released from TERPY were lower in aortas from 2K-1C rats. We studied the influence of caveolae on the effects of NO released from the NO donors, in aortas from 2K and 2K-1C rats. We verified that caveolae disassemble with ciclodextrin impaired the relaxation to NO donors and the reduction on [Ca2+]c to TERPY only in aortas from 2K rats. The number of caveolae is reduced in aortic VSMCs and in the endothelial cells from 2K-1C rats. We studied the effect of TERPY on arterial pressure from 2K and 2K-1C rats. TERPY reduced the arterial pressure only in 2K-1C rats, which effect was longer than that produced by SNP. The hypotensive effect of SNP was greater in 2K-1C than in 2K rats. Taken together, our results indicate that the higher concentration of O2- and the reduced number of caveolae on aortas from 2K-1C rats could contribute to impaired aorta relaxation of 2K-1C rats.

La schizophrénie est une maladie mentale grave qui présente une comorbidité fréquente avec la toxicomanie et avec divers troubles immunitaires. Une méta-analyse réalisée récemment dans notre laboratoire a montré une augmentation d’IL-6 (une cytokine pro-inflammatoire), du récepteur soluble d’IL-2 (un marqueur d’activation du système immunitaire), et d’IL-1RA (une cytokine anti-inflammatoire) dans la schizophrénie, suggérant l’existence d’un syndrome inflammatoire dans cette maladie. La toxicomanie aussi est associée au dérèglement du réseau des cytokines inflammatoires, mais les effets dépendent du type de drogues et ils sont parfois diamétralement opposés. On dispose encore de peu d’informations sur le statut immunitaire et inflammatoire des patients qui ont un double diagnostic de schizophrénie et de toxicomanie. Le but de ce travail était d’explorer l’existence d’un état inflammatoire systémique chez les patients schizophrènes et toxicomanes, et l’influence du traitement avec un médicament antipsychotique atypique, la quétiapine. Les objectifs spécifiques étaient : 1) Mesurer les concentrations plasmatiques des cytokines inflammatoires chez les schizophrènes et toxicomanes avant, pendant et après traitement avec la quétiapine ; et 2) Faire des études de corrélations entre les taux de cytokines, les symptômes cliniques, et la consommation de drogues. Les résultats montrent que comparativement aux contrôles normaux, les patients avec un double diagnostic présentent une augmentation d’IL-6, d’IL-1RA, du sIL-2R et d’IL-8 avant traitement à la quétiapine. Les augmentations des concentrations plasmatiques d’IL-1RA sont particulièrement importantes chez les patients avec double diagnostic, si on les compare à celles publiées chez les schizophrènes sans toxicomanie. Le traitement à la quétiapine n’influence pas les concentrations plasmatiques de ces cytokines, sauf sIL-2R qui augmente davantage au cours du traitement. Des corrélations positives de puissance modérée sont retrouvées entre IL-6 et dépression, IL-6 et alcool, IL-1RA et cognition, IL-8 et dépression, IL-8 et alcool, sIL-2R et cannabis. Notre étude révèle que la réponse inflammatoire est activée chez les schizophrènes et toxicomanes. De plus, la toxicomanie semble jouer un rôle facilitant ou potentialisateur dans les augmentations des taux circulants d’IL-1RA. Les études en cours sur différentes populations de schizophrènes avec ou sans toxicomanie, et chez des toxicomanes non schizophrènes permettront de préciser le rôle des différentes drogues d’abus dans le syndrome inflammatoire chez les schizophrènes, ainsi que les implications de ce syndrome sur le plan clinique et thérapeutique. / Schizophrenia is a psychosis which presents a frequent comorbidity with substance use disorders (SUD) and with various immune alterations. Using meta-analysis, we have demonstrated previously establishment of an inflammatory syndrome in schizophrenia patients, illustrated by elevated circulating levels of IL-6 (a pro-inflammatory cytokine), sIL-2R (marker of immune activation) and IL-1RA (an anti-inflammatory cytokine). SUD is also associated with dysregulation of inflammatory cytokines, but the effects may depend on the type of substance of abuse. The goal of this project was: 1) To measure plasma concentrations of inflammatory cytokines in schizophrenia patients with comorbid SUD, before, during and after treatment with an atypical antipsychotic, quetiapine; and 2) To perform correlation studies between plasma concentrations of inflammatory cytokines and clinical symptoms, including positive and negative symptoms, cognition, depression and substance use. Relative to normal controls, patients with a dual diagnosis showed increased plasma concentrations of IL-6, IL-1RA, sIL-2R, and IL-8 at baseline, IL-1RA increases being the most important. Quetiapine treatment did not influence plasma cytokine concentrations, except sIL-2R which increased further. Moderate positive correlations were found between IL-6 and depression, IL-6 and alcohol, IL-1RA and cognition, IL-8 and depression, IL-8 and alcohol and between sIL-2R and cannabis. This study demonstrates that the immune and inflammatory response is activated in schizophrenia patients with comorbid SUD. Furthermore, SUD may play a facilitating or potentiating role in the increases in peripheral levels of IL-1RA. Ongoing studies in different patient populations with schizophrenia with or without SUD, and patients with SUD alone will help elucidate the role of different substances of abuse in the inflammatory syndrome in schizophrenia, as well as the clinical and therapeutic relevance of this syndrome.

O relaxamento vascular induzido pelo óxido nítrico (NO) está prejudicado em aorta de ratos hipertensos renais (2R-1C). A nossa hipótese é de que o menor efeito do NO na aorta de ratos 2R-1C pode estar relacionada com a maior degradação do NO e/ou modificação das cavéolas no músculo liso vascular (MLV), considerando que o NO pode ser degradado rapidamente e que as cavéolas parecem ser importantes para a redução da concentração citosólica de Ca2+ ([Ca2+]c). O presente trabalho teve por objetivo estudar as alterações nos mecanismos vasodilatadores do NO em aorta de ratos hipertensos renais 2R-1C. Inicialmente, estudamos a influência do estresse oxidativo sobre o efeito do NO liberado dos doadores [Ru(NH.NHq)(terpy)NO+]3+ (TERPY) e nitroprussiato de sódio (NPS) em aorta de ratos normotensos (2R) e 2R-1C. Verificamos que o relaxamento foi menor na aorta dos ratos 2R-1C do que de 2R para o TERPY e NPS e que nas células do MLV da aorta de 2R-1C o efeito do TERPY em reduzir a [Ca2+]c também foi menor. Porém, o tratamento das aortas de ratos 2R-1C com antioxidante normalizou o relaxamento para ambos doadores e o efeito do TERPY sobre a [Ca2+]c. A concentração basal de superóxido (O2-) nas aortas dos ratos 2R-1C é maior do que em 2R e foi reduzida pelos antioxidantes. A concentração de NO basal e liberada do TERPY é menor em aortas de ratos 2R-1C. Estudamos a influência das cavéolas sobre o efeito do TERPY e NPS, em aorta de ratos 2R e 2R-1C. Somente em aortas de ratos 2R, a desorganização das cavéolas com ciclodextrina inibiu o relaxamento dos doadores de NO utilizados e a redução da [Ca2+]c para o TERPY. O número de cavéolas é menor tanto nas células do MLV como nas células endoteliais da aorta de ratos 2R-1C. Estudamos ainda o efeito do TERPY sobre a pressão arterial de ratos 2R e 2R-1C acordados. O TERPY possui efeito hipotensor somente nos ratos 2R-1C e este efeito foi mais prolongado do que o efeito hipotensor com NPS. O NPS teve efeito hipotensor tanto em ratos 2R como 2R-1C, porém este efeito foi maior em 2R-1C. Os resultados obtidos neste estudo indicam que a elevada concentração de O2- e o menor número de cavéolas encontrados na aorta dos ratos 2R-1C, devem contribuir de forma importante para o menor relaxamento da aorta de ratos 2R-1C. / The vascular relaxation induced by nitric oxide (NO) donors is impaired in aortas from renal hypertensive rats (2K-1C). Our hypothesis was that the lower NO effect in aortas from 2K-1C rats could be related with the higher degradation of NO and/or caveolae changes in vascular smooth muscle cells (VSMCs), considering that NO can be rapidly degraded and caveolae seems to play important role in the reduction of cytosolic Ca2+ concentration [Ca2+]c. The present study aimed to investigate the alterations on aorta relaxation induced by NO in 2K-1C rat aorta. At first, we studied the influence of oxidative stress on the effect of NO released from the NO donors [Ru(NH.NHq)(terpy)NO+]3+ (TERPY) and sodium nitroprusside (SNP) in aortas from normotensive (2K) and 2K-1C rats. The relaxation induced by both NO donors was impaired in aortas from 2K-1C rats and the reduction on [Ca2+]c induced by TERPY was also impaired in 2K-1C VSMCs. However, in aortas treated with antioxidants the relaxation to both NO donors and the reduction on [Ca2+]c to TERPY were normalized. The basal concentration of superoxide (O2-) was greater in 2K-1C than in 2K, which was reduced by the antioxidants. The basal cytosolic NO concentration ([NO]c) and the NO released from TERPY were lower in aortas from 2K-1C rats. We studied the influence of caveolae on the effects of NO released from the NO donors, in aortas from 2K and 2K-1C rats. We verified that caveolae disassemble with ciclodextrin impaired the relaxation to NO donors and the reduction on [Ca2+]c to TERPY only in aortas from 2K rats. The number of caveolae is reduced in aortic VSMCs and in the endothelial cells from 2K-1C rats. We studied the effect of TERPY on arterial pressure from 2K and 2K-1C rats. TERPY reduced the arterial pressure only in 2K-1C rats, which effect was longer than that produced by SNP. The hypotensive effect of SNP was greater in 2K-1C than in 2K rats. Taken together, our results indicate that the higher concentration of O2- and the reduced number of caveolae on aortas from 2K-1C rats could contribute to impaired aorta relaxation of 2K-1C rats.

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Diplomová práce obsahuje stručný teoretický základ pro designéra/ku A/D převodníku v technologii CMOS a přehled architektur A/D převodníků používaných v automobilovém průmyslu. Volba vhodné architektury pro konkrétní aplikaci byla zásadním úkolem zpra- covaným v semestrálním projektu předcházejícím tuto práci a je rovněž součástí této práce. Analýza v Matlabu, ze které by mělo vyplynout, je-li třeba zahrnout do architek- tury podblok Sample and Hold, je také součástí práce. Klíčovou částí práce je dokumen- tace návrhu jednotlivých podbloků A/D převodníku – operačního zesilovače, kompará- toru a R-2R D/A převodníku – a ověření jejich funkčnosti. V závěru práce je ověřena funkčnost A/D převodníku jako celku.

Cette thèse traite le problème d'intégration hardware optimale de contrôleurs linéaires à taille de mot finie, dédiés aux applications MEMS. Le plus grand défi est d'assurer des performances de contrôle satisfaisantes avec un minimum de ressources logiques. Afin d'y parvenir, deux optimisations distinctes mais complémentaires peuvent être entreprises: en théorie de contrôle et en arithmétique binaire. Seule cette dernière est considérée dans ce travail.Comme cette arithmétique cible des applications MEMS, elle doit faire preuve de vitesse afin de prendre en charge la dynamique rapide des MEMS, à faible consommation de puissance pour un contrôle intégré, hautement re-configurabe pour un ajustement facile des performances de contrôle, et facilement prédictible pour fournir une idée précise sur les ressources logiques nécessaires avant l'implémentation même.L'exploration d'un certain nombre d'arithmétiques binaires a montré que l'arithmétique radix-2r est celle qui répond au mieux aux exigences précitées. Elle a été pleinement exploitée afin de concevoir des circuits de multiplication efficaces, qui sont au fait, le véritable moteur des systèmes linéaires.L'arithmétique radix-2r a été appliquée à l'intégration hardware de deux structures linéaires à taille de mot finie: un contrôleur PID variant dans le temps et à un contrôleur LQG invariant dans le temps,avec un filtre de Kalman. Le contrôleur PID a montré une nette supériorité sur ses homologues existants. Quant au contrôleur LQG, une réduction très importante des ressources logiques a été obtenue par rapport à sa forme initiale non optimisée / This thesis addresses the problem of optimal hardware-realization of finite-word-length(FWL) linear controllers dedicated to MEMS applications. The biggest challenge is to ensuresatisfactory control performances with a minimal hardware. To come up, two distinct butcomplementary optimizations can be undertaken: in control theory and in binary arithmetic. Only thelatter is involved in this work.Because MEMS applications are targeted, the binary arithmetic must be fast enough to cope withthe rapid dynamic of MEMS; power-efficient for an embedded control; highly scalable for an easyadjustment of the control performances; and easily predictable to provide a precise idea on therequired logic resources before the implementation.The exploration of a number of binary arithmetics showed that radix-2r is the best candidate that fitsthe aforementioned requirements. It has been fully exploited to designing efficient multiplier cores,which are the real engine of the linear systems.The radix-2r arithmetic was applied to the hardware integration of two FWL structures: a linear timevariant PID controller and a linear time invariant LQG controller with a Kalman filter. Both controllersshowed a clear superiority over their existing counterparts, or in comparison to their initial forms.