Les métaux micro ou nanoporeux sont très attrayants notamment pour leur grande surface spécifique. Le désalliage dans un bain de métal liquide permet une dissolution sélective d'une espèce chimique (l'élément soluble) à partir d'un alliage d'origine (le précurseur) composé de l'élément soluble et d'un élément cible (qui deviendra nano/micro poreux) non soluble dans le bain de métal liquide. Quand le précurseur est plongé dans le bain de métal liquide, à son contact, l'élément soluble va se dissoudre dans le bain tandis que l'élément cible va en parallèle se réorganiser spontanément afin de former une structure poreuse. Quand l'échantillon est retiré du bain, il est sous la forme d'une structure bi-continue composée de deux phases : l'une étant la structure poreuse composée de l'élément cible et l'autre est une phase dans laquelle est présente l'élément du bain avec l'élément sacrificiel en solution solide. Cette phase peut être dissoute par une attaque chimique afin d’obtenir le métal nano/micro poreux. Les objectifs principaux de cette thèse sont l'élaboration et la caractérisation microstructurale et mécanique de 3 différents types de matériaux par désalliage dans un bain de métal liquide : des composites métal-métal (FeCr-Mg), des métaux poreux (FeCr) et des composites métal-polymère (FeCr-matrice époxy). Le dernier objectif est l'évaluation des possibilités d'utiliser la technique de désalliage dans un bain de métal liquide dans un contexte industriel. L'étude de la microstructure est basée sur des observations 3D faites par tomographie aux rayons X et des analyses 2D réalisées en microscopie électronique (SEM, EDX, EBSD). Pour mieux comprendre le désalliage, le procédé a été suivi in situ en tomographie aux rayons X et diffraction. Enfin, les propriétés mécaniques ont été évaluées par nanoindentation et compression. / Nanoporous metals have attracted considerable attention for their excellent functional properties. The first developed technique used to prepare such nanoporous noble metals is dealloying in aqueous solution. Porous structures with less noble metals such as Ti or Fe are highly desired for various applications including energy-harvesting devices. The less noble metals, unstable in aqueous solution, are oxidized immediately when they contact water at a given potential so aqueous dealloying is only possible for noble metals. To overcome this limitation, a new dealloying method using a metallic melt instead of aqueous solution was developed. Liquid metal dealloying is a selective dissolution phenomenon of a mono-phase alloy solid precursor: one component (referred as soluble component) being soluble in the metallic melt while the other (referred as targeted component) is not. When the solid precursor contacts the metallic melt, only atoms of the soluble component dissolve into the melt inducing a spontaneously organized bi-continuous structure (targeted+sacrificial phases), at a microstructure level. This sacrificial phase can finally be removed by chemical etching to obtain the final nanoporous materials. Because this is a water-free process, it has enabled the preparation of nanoporous structures in less noble metals such as Ti, Si, Fe, Nb, Co and Cr. The objectives of this study are the fabrication and the microstructure and mechanical characterization of 3 different types of materials by dealloying process : (i) metal/metal composites (FeCr-Mg), (ii) porous metal (FeCr) (iii) metal/polymer composites (FeCr-epoxy resin). The last objective is the evaluation of the possibilities to apply liquid metal dealloying in an industrial context. The microstructure study was based on 3D observation by X-ray tomography and 2D analysis with electron microscopy (SEM, SEM-EDX, SEM-EBSD). To have a better understanding of the dealloying, the process was followed in situ by X-ray tomography and X-ray diffraction. Finally the mechanical properties were evaluated by nanoindentation and compression.

Στο τομέα της νανοϊατρικής ένας από τους σημαντικότερους στόχους είναι η ανάπτυξη φαρμακευτικών νανοφορέων που θα μεταφέρουν και θα αποδεσμεύουν εκλεκτικά το φάρμακο στον πάσχοντα ιστό. Η χορήγηση δοξορουβικίνης (Dox), για παράδειγμα, εμφανίζει σημαντικά προβλήματα έλλειψης εκλεκτικότητας και συστημικής τοξικότητας. Μία πιθανή προσέγγιση για την περισσότερο εκλεκτική χορήγηση της Dox στους καρκινικούς όγκους είναι η χορήγηση της μετά τον εγκλεισμό της σε μαγνητικά στοχευόμενους νανοφορείς. Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ειδίκευσης ήταν η μελέτη μαγνητικών νανοφορέων με βάση συμπολυμερή πολύ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολύ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(MAA-g-EGMA) με διαφορετικά χαρακτηριστικά πολυμερικού κελύφους και ο προσδιορισμός εκείνων των χαρακτηριστικών που προσδίδουν στους νανοφορείς βέλτιστη συμπεριφορά. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η σταθερότητα των μαγνητικών νανοφορέων με διαφορετικό μήκος αλυσίδων πολύ(αιθυλενογλυκόλης) και διαφορετική πυκνότητα αρνητικού φορτίου σε διάφορα μέσα όπως υδατικά διαλύματα χλωριούχου νατρίου (ΝαCl), ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS), δοξορουβικίνης καθώς επίσης και σε υδατικά διαλύματα διαφόρων τιμών pH. Μελετήθηκε επίσης η φόρτωση του φαρμάκου σε αυτούς καθώς επίσης και η αποδέσμευση του από τους συγκεκριμένους νανοφορείς σε διάφορα μέσα (νερό, υδατικό διάλυμα PBS και διάλυμα αλβουμίνης σε PBS). Οι νανοφορείς παρασκευάστηκαν μέσω πρόσδεσης του συμπολυμερούς πολυ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολυ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(MAA-g-EGMA) στην επιφάνεια νανοκρυσταλλιτών Fe2O3 κατά τη διάρκεια ανάπτυξής τους. Η μελέτη της σταθερότητας έγινε με τη μέθοδο της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Η μελέτη της φόρτωσης και της αποδέσμευσης του φαρμάκου στους και από τους νανοφορείς έγινε με τη μέθοδο της φασματοφωτομετρίας φθορισμού. Στο πρώτο κεφάλαιο παρουσιάζονται συνοπτικά τα διάφορα είδη νανοφορέων, οι ιδιότητες καθώς και οι εφαρμογές αυτών. Γίνεται επίσης μια σύντομη βιβλιογραφική ανασκόπηση σε ότι αφορά τη φόρτωση και αποδέσμευση φαρμάκων από νανοφορείς. Το δεύτερο κεφάλαιο είναι αφιερωμένο στις τεχνικές και τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν στα πλάισια της συγκεκριμένης εργασίας καθώς επίσης και των πειραματικών διαδικασιών.Τέλος, το τρίτο κεφάλαιο αφορά στην παράθεση και τον σχολιασμό των αποτελεσμάτων,τα οποία μπορούν να συνοψιστούν στα εξής συμπεράσματα:  Οι μαγνητικοί νανοφορείς με βάση συμπολυμερή πολύ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολύ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(MAA-g-EGMA) έχουν ικανοποιητικά 7 χαρακτηριστικά μεγέθους και ζ δυναμικού για παρατεταμένη παραμονή στην κυκλοφορία μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, γεγονός που αποτελεί προϋπόθεση για την εφαρμογή τους ως συστήματα εκλεκτικής μεταφοράς (στόχευσης) αντικαρκινικών φαρμάκων.  Οι υψηλές τιμές φόρτωσης της δοξορουβικίνης στους νανοφορείς με υψηλή πυκνότητα ανιονικών φορτίων, λόγω ισχυρότερων ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων με το θετικά φορτισμένο φάρμακο αποτελεί σημαντικό πλεονέκτημα των νανοφορέων αυτών σαν συστήματα χορήγησης δοξορουβικίνης.  Η αύξηση του ρυθμού αποδέσμευσης της δοξορουβικίνης από τους νανοφορείς σε διαλύματα αλβουμίνης με ελάττωση του pH είναι σημαντική καθώς παρέχει τη δυνατότητα μιας σχετικά εκλεκτικής διάθεσης του φαρμάκου στους καρκινικούς όγκους όπου επικρατούν συνθήκες χαμηλότερου από το το φυσιολογικό pH. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα που λήφθηκαν δικαιολογούν την περαιτέρω μελέτη των μαγνητικών νανοφορέων δοξορουμπικίνης για την καταλληλότητά τους ως φορείς στοχευμένης χορήγησης του φαρμάκου σε καρκινικούς όγκους. / In the field of nanomedicine, one of the most important targets is the development of functional nanoassemblies which will deliver and release selectively the drug to the suffering tissue. For example, the administration of doxorubicin (Dox) displays lack of selectivity and systemic toxicity issues. A possible approach towards a more selective delivery of Dox to the target tissue is its encapsulation at magnetically targeted nanoparticles. The present postgraduate thesis’ aim was the study of magnetic nanocarriers based on copolymers of poly(methacrylic acid)- graft -poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(MAA -g- EGMA)) with different structural characteristics and the determination of those characteristics, that impart to the nanocarriers the optimal performance. Specifically, the stability of magnetic nanoparticles, with different chain length of poly(ethyleneglycol) and different density of negative charges, was studied at various media such as NaCl, pH and Dox concentration. The drug loading in the nanocarriers was also studied, as well as its release by the specific nanocarriers at various media (distilled water, PBS and albumin solution in PBS). The nanoparticles were prepared via a self-assembly process of the polymers [poly(methacrylic acid)-graft-poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(MAA-g-EGMA)] on the surface of the growing iron oxide nanocrystallites. The stability studies were performed with the use of DLS technique. The study of the drug loading and release from the nanoparticles was followed using the fluorescence spectroscopy. In the first chapter, the various types of nanoparticles, their properties, as well as their applications are presented briefly. Additionally, a short literature review with regard to the loading and release of drugs from nanoparticles is presented. The second chapter refers to the techniques and methods that were utilized in the context of the present thesis, as well as to the experimental procedures. Finally, in the third chapter the experimental results are presented and discussed. Based on the results of this study:  The magnetic nanocarriers based on copolymers poly(methacrylic acid)- graft -poly(ethyleneglycolmethacrylate) (p(MAA -g- EGMA)) have satisfying characteristics of size and z potential for long blood residence time after an intravenous injection, which is a prerequisite for their application as controlled (targeted) delivery systems for anticancer drugs. The high values of doxorubicin loading without stability loss is an important advantage.  The increase in the release rate of doxorubicin by the nanocarriers in albumin solutions with low pH (5-6) is important, since it facilitates a relatively selective release of the drug in cancer tumors which display lower pH than that of the normal tissues. In conclusion, the results of the research justify the further in-vitro study of the suitability of the magnetic doxorubicin nanocarriers as selective delivery systems of the drug to the cancer tumors.

Σκοπός: Τα επιστημονικά δεδομένα για το κλινικό όφελος που μπορεί να έχει η στρατηγική καθυστέρησης της αγγειοπλαστικής των στεφανιαίων αρτηριών μετά τη χορήγηση δόσης φόρτισης κλοπιδογρέλης παραμένουν ασαφή. Συγκρίναμε σε ασθενείς με σταθερή ή ασταθή στηθάγχη, οι οποίοι δεν λάμβαναν προηγουμένως κλοπιδογρέλη, την αγγειοπλαστική που πραγματοποιείται με καθυστέρηση 2 ωρών, μετά τη στεφανιογραφία και τη χορήγηση δόσης φόρτισης κλοπιδογρέλης 900 mg, με την αγγειοπλαστική που πραγματοποιείται αμέσως μετά τον καθετηριασμό και τη λήψη των 900 mg κλοπιδογρέλης. Μέθοδοι: Στα πλαίσια τυχαιοποιημένης προοπτικής μελέτης, 199 ασθενείς υποβλήθηκαν είτε σε άμεση αγγειοπλαστική (ομάδα Α, n=103), είτε σε καθυστερημένη επέμβαση (ομάδα Β ή ομάδα προθεραπείας, n=96). Μετρήθηκαν οι βασικές τιμές, οι τιμές αμέσως πριν την αγγειοπλαστική, στις 6-8 ώρες και στις 24 ώρες μετά την επέμβαση, της καρδιακής τροπονίνης Ι (cTnI) , της κινάσης της κρεατίνης MB (CK-MB) και της μυοσφαιρίνης, οι οποίες είναι δείκτες μυοκαρδιακής νέκρωσης, καθώς και οι τιμές της υψηλής ευαισθησίας C αντιδρώσας πρωτεΐνης (hs-CRP) και της διαλυτής P-σελεκτίνης (sPS), οι οποίες είναι δείκτες φλεγμονώδους αντίδρασης και ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων αντίστοιχα. Το σύνθετο κύριο καταληκτικό σημείο της μελέτης ήταν ο συνδυασμός καρδιαγγειακού θανάτου, περιεπεμβατικού εμφράγματος του μυοκαρδίου (ΕΜ), αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου (ΑΕΕ) και επείγουσας επαναγγείωσης, εντός 30 ημερών από την αγγειοπλαστική. Ως περιεπεμβατικό ΕΜ ορίσθηκε το κλινικώς προφανές έμφραγμα και/ή η τριπλάσια της ανώτερης φυσιολογικής τιμής (ΑΦΤ) τουλάχιστον αύξηση της cTnI. Ως δευτερεύοντα καταληκτικά σημεία θεωρήθηκαν οποιαδήποτε περιεπεμβατική αύξηση της CK-MB μεγαλύτερη του τριπλασίου της ΑΦΤ, οποιαδήποτε περιεπεμβατική αύξηση των δεικτών μυοκαρδιακής νέκρωσης μεγαλύτερη της ΑΦΤ, η μη βέλτιστη ροή στο αγγείο μετά την επέμβαση (ροή κατά TIMI <3), οποιαδήποτε μείζων αιμορραγία κατά ΤΙΜΙ, η θρομβοκυττοπενία με αριθμό αιμοπεταλίων <70.000/ml και οποιαδήποτε αύξηση της hs-CRP και της sPS. Αποτελέσματα : Το σύνθετο κύριο καταληκτικό σημείο συνέβη στο 12,6% της ομάδας άμεσης αγγειοπλαστικής έναντι του 15,6% των ασθενών της ομάδας της προθεραπείας (p=0,34). Δύο ασθενείς της ομάδας Α απεβίωσαν εντός 24ώρου από την επέμβαση, ενώ ουδείς απεβίωσε στην ομάδα της καθυστερημένης αγγειοπλαστικής (p=0,49). Το συχνότερο μεμονωμένο κύριο καταληκτικό σημείο ήταν το περιεπεμβατικό έμφραγμα (12,6% έναντι 14,6%, p=0,42). ΑΕΕ συνέβη σε έναν ασθενή της ομάδας της προθεραπείας και σε κανέναν της ομάδας της άμεσης αγγειοπλαστικής. Επείγουσα επαναγγείωση χρειάσθηκε ένας ασθενής της ομάδας Β και κανείς της ομάδας Α . Η hs-CRP αυξήθηκε μετά την αγγειοπλαστική και στις δύο ομάδες (p<0,0001), χωρίς να υπάρχει διαφορά στις τιμές της μεταξύ των δύο ομάδων (p=0,5). Οι αρχικές τιμές της sPS δεν διέφεραν μεταξύ των δύο ομάδων (p=0,5), και επίσης δεν υπήρχε μεταβολή στις τιμές της sPS μετά την αγγειοπλαστική. Μείζων αιμορραγία καταγράφηκε στο 2,9% των ασθενών της ομάδας της άμεσης αγγειοπλαστικής και στο 3,1% των ασθενών της ομάδας της προθεραπείας (p=0,9). Kαμία στατιστικά σημαντική διαφορά δεν υπήρξε επίσης στα υπόλοιπα δευτερεύοντα καταληκτικά σημεία μεταξύ των δύο ομάδων. Συμπέρασμα: Σε ασθενείς με σταθερή ή ασταθή στηθάγχη, οι οποίοι δεν λάμβαναν προηγουμένως κλοπιδογρέλη και υποβλήθηκαν σε αγγειοπλαστική των στεφανιαίων αρτηριών, η στρατηγική καθυστέρησης της αγγειοπλαστικής για 2 ώρες μετά τη χορήγηση υψηλής δόσης φόρτισης κλοπιδογρέλης 900 mg, δεν φαίνεται να προσφέρει επιπλέον κλινικό όφελος, συγκριτικά με την άμεση αγγειοπλαστική. / Aim: Εvidence that the strategy of delaying percutaneous coronary intervention (PCI) after clopidogrel loading is beneficial remains inconclusive. We compared the delayed for 2 hours PCI with the ad-hoc PCI, after loading with 900 mg of clopidogrel, in clopidogrel-naive patients with stable or unstable angina who had already underwent coronary angiography and were subjected to PCI. Methods: In a prospective randomized study 199 patients underwent either ad-hoc PCI (group A, n=103) or delayed PCI ( pretreatment group, group B, n=96). Cardiac troponin I (cTnI), creatine kinase-MB (CK-MB), myoglobin which are biomarkers of myocardial injury, high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), a marker of inflammatory status and soluble P-selectin (sPS), a marker of platelets activation were measured baseline, just before PCI, 6-8 hours after PCI and 24 hours later. Combined primary end point was the composite of cardiovascular death, periprocedural myocardial infarction (MI), stroke and urgent revascularization within 30 days after PCI. Periprocedural MI was defined as any clinical apparent MI and/or the increase of cTnI >3 times above the upper limit of normal (ULN). Secondary endpoints were considered any periprocedural increase of CK-MB above x3 ULN, any periprocedural increase of myocardial injury biomarkers above ULN, TIMI flow <3 after PCI, any major bleeding (TIMI criteria), thrombocytopenia with platelet count <70,000/mL and any elevation of hs-CRP and sPS. Results: The combined primary end point occurred in 12.6% of ad-hoc PCI group versus 15.6% of pretreatment group patients (p=0.34). There were 2 deaths in group A, which occurred within 24 hours post-PCI and no death in the delayed PCI group (p=0.49). Among the components of the combined primary end point, periprocedural MI was the most frequently encountered event (12.6% versus 14.6%, p=0.42). Stroke occurred in one patient of the pretreatment group, and in no patient of the ad-hoc PCI group. Urgent revascularization was performed in one patient of group B and in no patient of group A. High sensitivity CRP increased in both groups after PCI (p<0.0001) without difference between groups (p=0.5). Baseline sPS levels did not differ between the 2 groups (p=0.5) and there was no significant change of sPS over time. Major bleeding occurred in 2.9% ad-hoc PCI group versus 3.1% pretreatment group patients (p=0.9). There was also no difference in any other secondary end point between the two groups. Conclusion: In clopidogrel-naive patients with stable or unstable angina, a strategy of delaying PCI for 2 hours after high-dose clopidogrel loading of 900 mg does not seem to confer any benefit compared to ad-hoc PCI.

Curcumin (CURC) was incorporated in liposomes as free drug or after formation of hydropropyl-β- or hydroxypropyl-γ-cyclodextrin (HPβCD or HPγCD) complexes prepared by co-precipitation and characterized by X-ray diffractometry. Liposomes encapsulating CURC as free drug or CD-complexes (hybrid formulations) were prepared by the dehydration–rehydration vesicle (DRV) method followed by extrusion, and characterized for size, zeta-potential and CURC loading. CURC stability (at 0.01 and 0.05 mg/mL) in 80% (v/v) fetal bovine serum (FBS) was evaluated at 37 oC. Results demonstrate that HPβCD stabilizes CURC more than HPCD, but liposome encapsulation provides substantially more protection, than CDs. CURC stabilization is similar, when encapsulated as free compound or CD-complex. However, the last method increases CURC loading by 23 times (depending on the lipid composition of liposomes and the CD used), resulting in higher solubility. The stability profile of CURC in serum depends on the composition of liposomes and CURC concentration, since at lower concentrations larger CURC fractions are protected due to protein binding. Compared to the corresponding CD complexes, hybrid formulations provide intermediate CURC solubility (comparable to HPβCD) but profoundly higher stabilization. After identifying that CURC formulations are active against B16 melanoma cells (in vitro), the optimal concentrations of CURC and doxorubicin (DOX) combinations (which provided highest anticancer activity [in vitro]) were identified. In a second step, combination hybrid-liposomal formulations of CURC and DOX were prepared, as a technique to deliver the specific combination of the two drugs to cancer cells following in vivo administration (since the two drugs have different pharmacokinetics and would not reach cancer cells at the same ratio if administered as free drugs). Additionally the effect of ceramide incorporation in the liposomal membrane on the anticancer activity of the later combination-formulations was investigated. The liposomal CURC-DOX combination formulations demonstrated significantly enhanced anticancer activity, compared to liposomes with DOX only. As confirmed by FACS analysis and uptake studies, this enhanced effect was due to increased uptake of DOX by the cells, in the presence of CURC (which was not seen when free compounds were used). Although a positive effect of ceramide addition in liposomal-DOX anticancer activity was demonstrated, in agreement with previous studies, ceramide addition did not result in further increase of the anticancer activity of the CURC-DOX combination formulations, when tested by MTT assay. However, mechanistic studies revealed that the CURC-DOX formulations resulted in higher percentage of early apoptotic cells, compared to the ceramide-DOX formulations which resulted mainly in late-apoptotic cells. When all CURC-DOX and Ceramide were combined in the same formulation, the percentages of early and late apoptotic cells were additive. / Η Κουρκουμίνη (CURC) ενσωματώθηκε σε λιποσώματα ως ελεύθερο μόριο ή ως σύμπλοκο εγκλεισμού με υδροξυπροπυλο-β-κυκλοδεξτρίνη ή υδροξυπροπυλο-γ-κυκλοδεξτρίνη (HPβCDorHPCD); Τα σύμπλοκα παρασκευάστηκαν με την τεχνική της συγκαταβύθισης και χαρακτηρίστηκαν με ακτίνες-Χ. Συμβατικά λιποσώματα (που ενσωματώνουν την CURC ωε ελεύθερο μόριο) και υβριδικά, που την εγκλωβίζουν ως σύμπλοκο-εγκλεισμού, παρασκευάστηκαν με την τεχνική DRV και εξώθηση διαμέσου μεμβρανών, και αφού χαρακτηρίστηκαν φυσικοχημικά (φόρτωση CURC, μέση διάμετρος, πολυδιασπορά και ζ-δυναμικό), μελετήθηκε η σταθερότητα της CURC (σε συγκέντρωση 0.01 and 0.05 mg/mL), όταν τα παρασκευάσματα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα και ορρό (80% ο/ο FCS) στους 37 oC. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η HPβCD σταθεροποιεί την CURC περισσότερο από ότι η HPCD, αλλά η ενσωμάτωση σε λιποσώματα προσφέρει σημαντικά μεγαλύτερη σταθεροποίηση από ότι οι CDs (είτε όταν εγκλωβίζετε ως ελεύθερο μόριο ή ως CD-σύμπλοκο). Όμως η τελευταία μέθοδος πετυχαίνει αύξηση της φόρτωσης έως και κατά 23 φορές (ανάλογα με τη λιπιδική σύσταση και το σύμπλοκο που χρησιμοποιείται), με αποτέλεσμα να αυξάνει σημαντικά η διαλυτότητα της CURC. Η σταθερότητα της CURC παρουσία ορρού συνδέεται με την λιπιδική σύσταση των λιποσωμάτων και τη συγκέντρωση της CURC, αφού σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις μεγαλύτερο κλάσμα της CURCfractions προστατεύεται λόγο σύνδεσης στις πρωτεΐνες. Σε σύγκριση με τα σύμπλοκα εγκλεισμού, οι υβριδικές λιποσωμικές μορφές προσφέρουν ενδιάμεση διαλυτότητα στην CURC (συγκρίσιμη με αυτήν της HPβCD) αλλά σημαντικά αυξημένη σταθερότητα. Μετά την απόδειξη ότι οι μορφές της CURC είναι δραστικές κατά κυττάρων μελανώματος B16 (invitro), εντοπίστηκαν οι βέλτιστες συγκεντρώσεις συνδυασμών CURC και δοξορουβικίνης (DOX) που προσφέρουν βέλτιστη αντικαρκινική δράση [invitro]. Σε δεύτερο βήμα, παρασκευάστηκαν υβριδικές λιποσωμικές μορφές συνδυασμών CURC -DOX, ως τεχνική χορήγησης συνδυασμών που θα φθάσουν στα καρκινικά κύτταρα στις αρχικές συγκεντρώσεις (κάτι που δεν θα συμβεί εάν χορηγηθούν ως ξεχωριστά φάρμακα λόγο της διαφορετικής κινητικής τους). Επιπρόσθετα μελετήθηκε η επίδραση της ενσωμάτωσης ceramideς στην λιποσωμική μεμβράνη στην αντικαρκινική δράση των μορφών. Οι μορφές συνδυασμού CURC-DOX έδειξαν αυξημένη αντικαρκινική δράση σε σύγκριση με λιποσώματα που είχαν μόνο DOX (κάτι που δεν παρατηρήθηκε όταν χρησιμοποιήθηκαν ελεύθερα τα δύο μόρια). Όπως επιβεβαιώθηκε με FACSanalysis και με πειράματα κυτταρικής πρόσληψης, αυτή η αυξημένη δράση των μορφών συνδυασμού οφείλετε σε αύξηση της πρόσληψης DOX από τα κύτταρα, παρουσία CURC (πάλι δεν συνέβηκε όταν χρησιμοποιήθηκε ελεύθερη CURC). Εάν και παρατηρήθηκε αυξημένη δραστικότητα λιποσωμικής -DOX όταν τα λιποσώματα είχαν ceramides στη σύσταση τους, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, η προσθήκη, ceramideς δεν είχε θετικό αποτέλεσμα στη δραστικότητα των μορφών συνδυασμού CURC-DOX όταν μετρήθηκε με την τεχνική MTT. Εντούτοις, μηχανιστικές μελέτες έδειξαν ότι οι μορφές συνδυασμού CURC-DOX έδωσαν αυξημένο ποσοστό κυττάρων που είναι σε αρχικά στάδια απόπτωσης, σε σχέση με τα λιποσωματα DOX με ceramides που έδωσαν μεγαλύτερα ποσοστά κυττάρων σε τελικά στάδια απόπτωσης. Στις μορφές που συνδύαζαν τα πάντα, CURC-DOX και Ceramides τα ποσοστά κυττάρων σε πρώιμη και προχωρημένη απόπτωση ήταν αθροιστικά.

Εστιάζοντας στα αποτελέσματα προσφάτων μελετών, οι οποίες είχαν ως θέμα τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ της χημικής δομής και της αντιλευχαιμικής δράσης, προκύπτει ότι το στεροειδικό τμήμα των ενώσεων που περιέχουν αλκυλιωτικούς παράγοντες, δεν αποτελεί μόνο τον βιολογικό φορέα των αλκυλιωτικών παραγόντων. Ο σχεδιασμός και η μελέτη παρόμοιων ενώσεων, οι οποίες έφεραν στη θέση 7 του στεροειδικού σκελετού μία αλλυλική κετόνη, παρουσίασαν μία σημαντικά αυξημένη αντιλευχαιμική δραστικότητα συγκριτικά με παράγωγα που περιείχαν στο μόριό τους έναν απλό στεροειδικό σκελετό. Προκειμένου να διερευνηθεί κατά πόσο η βελτίωση της αντιλευχαιμικής οφειλόταν στην εισαγωγή της 7-κετόνης ή του Δ5-7-κετο στεροειδικού συστήματος, αναγάγαμε το διπλό δεσμό στη θέση 5 του στεροειδούς. Τα 5α-7-κετο στεροειδικά παράγωγα που προέκυψαν κατά την αναγωγή του διπλού δεσμού χρησιμοποιήθηκαν αρχικά για τη σύνθεση των στεροειδικών εστέρων της χλωραμβουκίλης και του φαινυλοξικού οξέος και ακολούθως μελετήθηκε η in vivo αντιλευχαιμική τους δράση έναντι της λευχαιμίας Ρ388. Τέλος, η αναγωγή του διπλού δεσμού αποδείχθηκε να έχει αρνητική επίδραση στην αντιλευχαιμική δράση, αφού η συγκριτική μελέτη με τα πρωτότυπα μόρια έδειξε πως οι πολύ δραστικοί Δ5-7-κετο στεροειδικοί εστέρες με την αναγωγή του διπλού δεσμού μετατράπηκαν σε ενώσεις με αμελητέα αντιλευχαιμική δράση. / Recent structure-antileukemic activity studies showed that the steroidal part of complex molecules containing DNA alkylators does not play only the role of the “biological carrier”. New such compounds designed to possess an allylic 7-ketone showed enhanced antileukemic potency compared with derivatives with a simple steroidal skeleton. In order to investigate whether the enhancement of the antileukemic potency is attributed to the introduction of the 7-ketone or to the Δ5-7-keto conjugated steroidal system we decided to reduce the Δ5 double bond. The 5α-7-keto-steroidal skeletons synthesized were tethered to chlorambucil and phenyl acetic acid’s nitrogen mustard and studied against leukemia P338 in vivo. The reduction of the double bond had a negative impact on the antileukemic potency since the comparative study of the novel derivatives showed that a series of very potent Δ5-7-keto-steroidal esters were converted by this modification to compounds with marginally accepted activity.

Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης ανήκει στην υπερ-οικογένεια των ιοντικών διάυλων ενεργοποιούμενων μέσω προσδέτη (ligand-gated ion channels). Οι υπομονάδες των υποδοχέων που ανήκουν στην οικογένεια αυτή, φέρουν στο αμινοτελικό τους άκρο τη χαρακτηριστική κυστεϊνική θηλιά (Cys-loop) μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης, οι οποίες συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό. Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι μεγάλες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες και χωρίζονται σε δυο κατηγορίες, τους νευρικούς και τους μυϊκούς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, καθώς και σε μη-νευρικούς ιστούς, όπως τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Επιπλέον, χωρίζονται σε δύο υποκατηγορίες, τους ετεροπενταμερείς, όπως είναι η (α4)x(β2)y, και τους ομοπενταμερείς, όπως η (α7)5. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών και εμφανίζουν στοιχειομετρία (α1)2β1γδ (στα έμβρυα) ή (α1)2β1εδ (στους ενήλικες). Ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης σε σχέση με τα υπόλοιπα μέλη της υπερ-οικογένειας, είναι ο καλύτερα μελετημένος ως προς τα χαρακτηριστικά και τη λειτουργία του. Ένας από τους κύριους παράγοντες που συνέβαλε στον εκτεταμένο χαρακτηρισμό του μυϊκού υποδοχέα είναι η δυνατότητα απομόνωσης, σε μεγάλες ποσότητες και σε λειτουργική μορφή, υποδοχέων της ακετυλοχολίνης παρόμοιων με αυτούς της νευρομυϊκής σύναψης από τα ηλεκτρικά όργανα των ψαριών Torpedo και Electrophorus. Οι πρώτες πληροφορίες για την τρισδιάστατη δομή του υποδοχέα δόθηκαν από ένα μοντέλο ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, από υποδοχέα που απομονώθηκε από το ηλεκτρικό όργανο του ψαριού Torpedo marmorata. Στη συνέχεια, η λύση της δομής ενός ομολόγου του εξωκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα, της acetylcholine binding protein (AChBP) από το σαλιγκάρι Lymnaea stagnalis έφερε και τις πρώτες πληροφορίες υψηλής ανάλυσης. Η AChBP είναι μια υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη, η οποία σχηματίζει σταθερά ομοπενταμερή, με ομολογία 20%-24% με το εξωκυτταρικό τμήμα των υπομονάδων του υποδοχέα. Πρόσφατα, η λύση της δομής της εξωκυτταρικής περιοχής της α1 υπομονάδας του υποδοχέα ποντικού, στην οποία είχε προσδεθεί ο ανταγωνιστής της ακετυλοχολίνης α-μπουγκαροτοξίνη, προσέφερε επιπλέον πληροφορίες για τα χαρακτηριστικά του υποδοχέα, όπως είναι η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR) και η συντηρημένη Cys-loop περιοχή. Παρόλα αυτά δεν έχουν δημοσιευτεί υψηλής ανάλυσης πληροφορίες για τη δομή του ανθρώπινου υποδοχέα. Επιπλέον από το φυσιολογικό ρόλο του μυϊκού υποδοχέα, ο οποίος είναι άμεσα υπεύθυνος για τη διαβίβαση της ώσης στη νευρομυϊκή σύναψη, παράλληλα ο υποδοχέας αυτός αποτελεί και στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, στα οποία ανήκει και το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στη νόσο αυτή, αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα προκαλούν μείωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη με συνέπεια να παρεμποδίζεται η δράση της ακετυλοχολίνης. Αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης εντοπίζονται στο 80%-90% των μυασθενών και η παρουσία τους θεωρείται ο κύριος παθογόνος παράγοντας για τη μυασθένεια. Ο σημαντικός ρόλος λοιπόν του υποδοχέα σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, τον καθιστά αντικείμενο εντατικής έρευνας. Η λεπτομερής ανάλυση της δομής και της λειτουργίας του θα μπορούσε να συμβάλλει στην κατανόηση της δομής και της λειτουργίας των υπόλοιπων υποδοχέων-μελών της υπερ-οικογένειας καθώς επίσης και στην εξιχνίαση του αυτοάνοσου μηχανισμού της μυασθένειας. Ωστόσο, το μεγάλο μέγεθος του μορίου του υποδοχέα, ο υδρόφοβος χαρακτήρας του και η αδυναμία απομόνωσής του από φυσικές πηγές, δυσχεραίνει την πραγματοποίηση δομικών μελετών. Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο να προκύψουν πρωτεϊνικά μόρια με δομή η οποία να πλησιάζει αρκετά τη φυσική διαμόρφωση του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης και σε ποσότητες ικανές ώστε να είναι εφικτές οι δομικές μελέτες τους. Προηγούμενα, είχαν εκφραστεί στο εργαστήριό μας οι εξωκυτταρικές περιοχές (ΕΚΠ) των υπομονάδων α1, β1, γ και ε (α1ΕΚΠ, β1ΕΚΠ, γΕΚΠ και εΕΚΠ) του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα, χρησιμοποιώντας ως σύστημα έκφρασης το ζυμομύκητα Pichia pastoris. Οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, απομονώθηκαν σε διαλυτή και γλυκοζυλιωμένη μορφή, αναγνωρίζονταν από μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της κάθε υπομονάδας, αλλά και από αντισώματα προερχόμενα από ορούς μυασθενών. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα δεν ήταν ικανοποιητικά για δομικές μελέτες. Παρόλα αυτά, οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς για μια καινούρια αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, η οποία έγκειται στην ειδική αφαίρεση των αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, χρησιμοποιώντας τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες ως ανοσοπροσροφητές. Η χρήση της α1ΕΚΠ του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητή, είχε ως αποτέλεσμα την αφαίρεση μεγάλου ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα με τη χρήση των εξωκυτταρικών τμημάτων των υπομονάδων β1, γ και ε ως ανοσοπροσροφητές. Ωστόσο, με τον τρόπο αυτό δεν επιτυγχάνεται πλήρης απομάκρυνση των παθογόνων αυτοαντισωμάτων. Η παρούσα εργασία είχε στόχο τη βελτίωση της δομής, της διαλυτότητας και των επιπέδων έκφρασης των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, έτσι ώστε να είναι κατάλληλες για δομικές μελέτες και κυρίως για να συμβάλλουν στις προσπάθειες βελτίωσης της αντιγονοειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια. Ειδικότερα, το πρώτο μέρος αφορά μελέτες σχετικές με την έκφραση της γΕΚΠ, η οποία σχημάτιζε ολιγομερή και είχε πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Σχεδιάστηκαν λοιπόν 4 μεταλλάγματα, με την προοπτική να προκύψουν πιο διαλυτά και υδρόφιλα μόρια. Οι μεταλλάξεις που σχεδιάστηκαν αφορούσαν στην αντικατάσταση συγκεκριμένων κυστεϊνών, που θα μπορούσαν να σχηματίζουν ακατάλληλους ένδο- ή δια-μοριακούς δεσμούς (μέσω δισουλφιδικών δεσμών), καθώς επίσης και στην αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής με την αντίστοιχη, πιο υδρόφιλη της AChBP. Στα δύο μεταλλάγματα που έφεραν τη Cys-loop περιοχή της AChBP, παρατηρήθηκε δραματική βελτίωση στα επίπεδα έκφρασης και στη διαλυτότητα των μορίων, ενώ ακόμη προσεγγίστηκε το αναμενόμενο μοριακό μέγεθος, όπως φανέρωσαν τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης καθώς και οι μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός. Όταν τα δύο βελτιωμένα μεταλλάγματα χρησιμοποιήθηκαν ως ανοσοπροσροφητές για την αντιγονοειδική θεραπεία που προαναφέρθηκε, παρουσίασαν βελτιωμένη ικανότητα πρόσδεσης αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, συγκριτικά με την αγρίου τύπου γΕΚΠ. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι η υδρόφοβη Cys-loop περιοχή της αγρίου τύπου γΕΚΠ συμβάλλει σημαντικά στη δημιουργία συσσωματωμάτων κατά την έκφραση της ΕΚΠ και για το λόγο αυτό ακολούθησε η αντικατάσταση αυτής της περιοχής και στις υπόλοιπες ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα. Προκειμένου να βελτιωθεί περαιτέρω η αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες να συνεκφραστούν όλες οι ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, με σκοπό να δημιουργηθούν σύμπλοκα που διαθέτουν και τις διεπιφάνειες μεταξύ των ΕΚΠ του υποδοχέα, οι οποίες πιστεύεται ότι είναι και αυτές ανοσογόνες. Στις προσπάθειες αυτές χρησιμοποιήθηκαν οι μεταλλαγμένες ΕΚΠ των υπομονάδων που φέρουν τη Cys-loop περιοχή της AChBP. Οι αρχικές συνεκφράσεις των ΕΚΠ όλων των υπομονάδων του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ήταν ανεπιτυχείς όσον αφορά στη δημιουργία συμπλόκων. Προκειμένου λοιπόν, να πραγματοποιηθεί ο συνδυασμός όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων και η δημιουργία ενός λειτουργικού μορίου, το επόμενο βήμα ήταν η σύνδεση των υπομονάδων με ένα πεπτιδικό συνδέτη επαναλαμβανόμενων αμινοξέων. Ο συνδέτης που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από οκτώ επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)8. Αρχικά κατασκευάστηκαν όλα τα ζεύγη (συγκαταμερή) που χρειάζονται, για να επακολουθήσουν πολλαπλά στάδια υποκλωνοποιήσεων, προκειμένου να σχηματιστεί το πενταμερές. Όλα τα συγκαταμερή παρουσίασαν το αναμενόμενο μοριακό βάρος όπως φάνηκε από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE), γεγονός που σημαίνει ότι ο συνδέτης δεν πρωτεολύεται και είναι ικανός να συγκρατεί τις υπομονάδες ενωμένες. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης που παρουσίασαν τα συγκαταμερή ήταν ικανοποιητικά και όλα τα συγκαταμερή που έφεραν την α1ΕΚΠ διατήρησαν την ικανότητα να προσδένουν σημασμένη α-μπουγκαροτοξίνη, η οποία προσδένεται ειδικά στην α1ΕΚΠ με υψηλή συγγένεια. Ωστόσο, τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης, φανέρωσαν ότι όλα τα συγκαταμερή εκλούονται δίνοντας ένα ευρύ φάσμα μοριακών βαρών, από μονομερή μέχρι ολιγομερή και συσσωματώματα. Τέλος, η α1ΕΚΠ-(AGS)8-γΕΚΠ παρουσίασε αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης 125Ι-α-Βgt συγκριτικά με την γΕΚΠ-(AGS)8-α1ΕΚΠ, γεγονός που σημαίνει ότι η σειρά με την οποία συνδέονται οι υπομονάδες, παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση των μορίων. Στην προσπάθεια βελτίωσης της διαμόρφωσης και των χαρακτηριστικών των συγκαταμερών, έγινε χρήση ενός μεγαλύτερου συνδέτη, αποτελούμενου από έντεκα επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)11, ωστόσο δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα τελικά προϊόντα έκφρασης. Όσον αφορά στη χρήση των συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα συγκαταμερή διατήρησαν πλήρως την ικανότητα να προσδένουν αυτοαντισώματα από τους ορούς των μυασθενών, αν και δε βελτίωναν περαιτέρω την ικανότητα ανοσοπροσρόφησης των επιμέρους ΕΚΠ. Συμπερασματικά λοιπόν, καταλήγουμε ότι η αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής των ΕΚΠ των υπομονάδων με την αντίστοιχη, υδρόφιλη περιοχή του ομολόγου AChBP, οδηγεί στη δημιουργία μορίων με βελτιωμένα χαρακτηριστικά, όπως είναι τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα των μορίων. Τα μόρια αυτά μπορούν στη συνέχεια να συνδεθούν με ένα πεπτιδικό συνδέτη και να παραχθούν συγκαταμερή με σωστή διαμόρφωση, τα οποία διατηρούν τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τους, όπως είναι η πρόσδεση σημασμένης α-μπουγκαροτοξίνης και η πρόσδεση αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν την πεποίθηση ότι είναι εφικτή η κατασκευή του ετεροπενταμερούς του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα που θα αποτελείται μόνο από τις ΕΚΠ των υπομονάδων του. / The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) belongs to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGIC), also known as the Cys-loop receptor family. The subunits of the receptors belonging to this superfamily carry at their N-terminal domain characteristic, highly conserved Cys-loop region, a string of 13 amino acids linked by a disulfide bond. AChRs are large, transmembrane glycoproteins, which are composed of five homologous subunits, arranged around a central ion channel and they are divided into two subgroups, the neuronal and the muscle type. The neuronal receptors are expressed mainly in the central and the peripheral nervous system, as well as in non-neuronal tissues, such as epithelial and immune cells. Moreover, the neuronal receptors are further subdivided into two categories, the heteropentamers, such as (α4)x(β2)y, and the homopentamers, such as (α7)5. The muscle AChRs are located on the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction and have the subunit composition α2βγδ (embryonic) or α2βεδ (adult). The muscle AChR is the best studied model from the superfamily of the LGICs, as far as its characteristics and function are concerned. One of the major reasons which contributed to its extensive characterization is the ability to isolate, in great amounts and in a functional form, AChRs similar to these of the neuromuscular junction from the electric organs of the fishes Torpedo and Electrophorus. An electron microscopy model of the Torpedo marmorata, purified from the electric organ of the electric ray, provided the first information about the three-dimensional structure of the AChR. The first high resolution insight was provided by the solved crystal structure of the AChBP from the snail Lymnaea stagnalis, a homologue of the extracellular domain (ECD) of the AChR. The AChBP is a soluble protein, which forms stable homopentamers and shares high homology with the ECDs of the AChR (20%-24%). Recently, the solved crystal structure of a mutated mouse α1ECD bound to α-bungarotoxin provided further information for a number of receptor-specific elements, including the main immunogenic region (MIR) and the Cys-loop. Nevertheless, high resolution information about the three-dimensional structure of the human AChR has not been reported so far. In addition to the physiological role of the muscle AChR, which is responsible for mediating the neuromuscular transmission, the muscle AChR is the target for a number of acquired and hereditary diseases, including the autoimmune disease myasthenia gravis (MG). In MG, autoantibodies against the AChR cause loss of the available and functional AChRs in the neuromuscular junction, and as a consequence, the action of acetylcholine is blocked. Autoantibodies against AChR are found in nearly 80%-90% of patients with generalized MG and are considered the main pathogenic factor in MG. The important pathophysiological roles of the AChRs made them subject to intensive research. The detailed analysis of the structure and function of the AChR could contribute to the understanding of the structure and function of the rest of the members of the superfamily, as well as to the comprehension of the pathogenic mechanism of MG. However, the fact that the AChR is a big, hydrophobic molecule, difficult to purify from natural sources, make the accomplishment of structural studies hard. It is necessary to generate recombinant molecules with conformation similar to that of the native AChR, in efficient amounts, in order to perform structural studies. We have previously expressed the human muscle AChR α1, β1, γ and ε ECDs using the yeast Pichia pastoris. These recombinant proteins were purified in a soluble and glycosylated form, recognizable by both monoclonal antibodies and a considerable percentage of anti-subunit antibodies in positive sera from MG patients. However, both the expression yield and the solubility of these proteins were not satisfactory for structural studies. Nevertheless, they were successfully used for a novel, antigen-specific therapeutic approach against MG, regarding the specific removal of the autoantibodies from MG sera, using these proteins as immunoadsorbents. The use of the human α1ECD as an immunoadsorbent resulted in the removal of a great percentage of autoantibodies from sera derived from MG patients. The results were similar when the β1, γ and ε ECDs were used as immunoadsorbents. However, the complete removal of the pathogenic autoantibodies from the MG sera was not achieved. We aimed at the improvement of the structure, solubility and expression yield of the ECDs of the muscle AChR, in order to render them suitable for structural studies and mainly to use them for the amelioration of the antigen-specific therapeutic approach against MG. For this, we selected the γECD, which formed oligomers and displayed a low expression yield and constructed four mutants of the protein. The mutations were concerning the replacement of certain cysteines, which could form inappropriate intra- or inter-molecular bonding and thus aggregation, as well as the substitution of the hydrophobic Cys-loop region by its counterpart, more hydrophilic AChBP Cys-loop. The two mutants which carried the Cys-loop of the AChBP displayed a dramatic improvement at the expression yield and solubility, while they approached the expected molecular size, according to the results from gel filtration and dynamic light scattering. When these two improved mutants were used as immunoadsorbents, they exhibited an increased ability to bind autoantibodies from MG sera, compared with the wild type γECD. These results indicate that the hydrophobic Cys-loop region of the γECD importantly contributes to the formation of aggregates during the expression of the ECD, and consequently followed the replacement of this region at the rest ECDs of the muscle AChR. In order to further ameliorate the antigen-specific therapeutic approach against MG, we carried out efforts to co-express all of the ECDs of the muscle AChR, targeting to create complexes which would carry the interfaces between the ECDs, which are thought to be also immunogenic. At these efforts, the mutant forms of the ECDs which carried the Cys-loop of the AChBP were used. These initial co-expressions of the ECDs were not successful, with the respect to the creation of complexes. In order to combine the ECDs of all the subunits and construct a functional molecule, the next step was the binding of these ECDs with a linker of repeated amino acids. The linker that was used, was consisted of eight repeated triplets of the amino acids alanine-glycine-serine (AGS)8. At the beginning were constructed the pairs (concatamers) which were needed in order to follow subclonings, preparative to form the pentamer. All of the concatamers displayed the expected molecular weight, according the results of the SDS-PAGE. This fact suggests that the linker does not undergo proteolysis, and thus is capable of retaining the subunits conjoint. Furthermore, the expression yield of the concatamers was satisfactory and they retained their ability to bind radiolabelled α-bungarotoxin, which is specifically binds to the α1ECD with high affinity. However, the results from the gel filtration indicated that all the concatamers eluted in a broad spectrum of molecular weights, from monomers to oligomers. In an effort to improve the conformation and the characteristics of the concatamers, a bigger linker which was consisted of eleven repeated triplets of the amino acids alanine-glycine-serine (AGS)11 was used, but the final products where shown to be similar. With respect to the use of the concatamers at the therapeutic approach against MG, the results showed that all the concatamers retain the ability to bind autoantibodies from MG sera, although there was no further improvement in the immunoadsorbing ability of the single ECDs. Conclusively, the substitution of the hydrophobic Cys-loop of the ECDs by the corresponding, more hydrophilic of the AChBP, results in the construction of molecules with improved characteristics, such as the expression yield and the solubility. The molecules are able to be linked together and form concatamers with the appropriate conformation, retaining their functionality, such as the binding of radiolabelled α-bungarotoxin and autoantibodies from MG sera. These results demonstrate that it is feasible to construct the heteropentamer of the human muscle AChR, which will consist only of the ECDs.

L’utilisation des microalgues dans les filières bioénergies est une thématique qui connait un développement remarquable ces dernières années. Si dans une perspective d’exploitation de masse, elles permettent de répondre plus favorablement aux contraintes qui pèsent sur l’exploitation des biocarburants de première et de deuxième génération, elles se heurtent également à la question de la demande en éléments nutritifs mais aussi à un bilan énergétique défavorable. En conséquence, il apparait difficile de répondre à une exigence de durabilité attendue pour ce nouveau gisement. Ce travail de thèse s’est intéressé à une solution permettant à la fois de recycler les éléments nutritifs présents dans la biomasse et de fournir de l’énergie au système de production voire de transformation : la digestion anaérobie. Les travaux se sont particulièrement focalisés sur l’intégration de la production de microalgues et de la méthanisation au travers de la conversion énergétique de cette biomasse et de la mobilisation des éléments nutritifs vers la culture à l’échelle du laboratoire et à l’échelle pilote. Après avoir identifié les contraintes associées à la biodégradabilité anaérobie des microalgues et les stratégies d’optimisation, nous avons mis en évidence que le potentiel énergétique est contraint par la qualité propre des cellules et une capacité de résistance à la dégradation biologique. L’application de stratégies d’optimisation de cette étape de conversion via l’utilisation de prétraitement thermique a montré qu’il est possible d’augmenter les rendements de production d’énergie et d’éléments minéraux mobilisables vers la culture. L’utilisation d’un écosystème naturel microalgue-bactérie destiné à la production en milieu ouvert et qui utilise un digestat synthétique comme milieu de culture a révélé le rôle déterminant de la flore bactérienne associée en interaction avec les microalgues. Ces résultats ont été évalués dans un système de production à l’échelle pilote préindustrielle en conditions extérieures, conçu et opéré spécifiquement pour répondre à cette problématique. Les caractéristiques propres du bassin de culture déterminent le comportement hydrodynamique du milieu et le comportement physique et écologique de la population phytoplanctonique mobilisée. L’étude de la dynamique des communautés microbiennes, eucaryotes et procaryotes, confirme le potentiel de résilience et de production d’un écosystème complexe soumis aux contraintes de son environnement. Les résultats de ces travaux ouvrent des perspectives de gestion et d’optimisation des procédés intégrant l’algoculture et la méthanisation qui peuvent répondre plus largement à des problématiques environnementales et de production de molécules d’intérêt au-delà des filières énergétiques. / In recent years, there has been an explosion of interest in the use of microalgae as a source of bioenergy. Mass cultivation of microalgae for bioenergy production promises several advantages compared to first and second generation biofuels. However, similar difficulties in terms of nutrient requirements and an unfavourable energy balance are faced. As a consequence, achieving the sustainable levels of microalgal culture required to implement this strategy in the longer term appears problematic. The work presented in this thesis focuses on anaerobic digestion; a solution which allows both recycling of nutrients and supply of energy to the production and downstream processes. In particular, the studies presented here have been directed towards the integration of microalgal culture and methanisation, at both the laboratory and pilot scale. The guiding principle used is conversion of biomass and provision of nutrients to the culture. We first identified the constraints and potential strategies associated with the aerobic biodegradability of microalgae. Next, we demonstrated that the energetic potential of cells is limited by their quality as well as their level of resistance to biological degradation. We have shown that it is possible to optimise the conversion step, increasing energy yields and nutrient mineralisation via a strategy of thermal pretreatment The use of a natural microalgae-bacteria ecosystem which uses a synthetic digestate as culture media, revealed a key role for bacterial flora interacting with microalgae. These results were further tested in a pilot-level production system specifically designed to address these questions. The evidence suggests that the characteristics of the culture pond determine both the hydrodynamic behaviour of the culture and the physical and ecological behaviour of the phytoplanktonic population. A study of the dynamics of the microbial, eukaryotic and prokaryotic communities suggests the presence of a resilient and complex ecosystem, which is influenced by variations in its environment. The results of this work provide opportunities for management and optimisation of processes integrating microalgae cultivation and methanisation beyond bioenergy production, for example liquid wastes treatment and production of high-value byproducts.

Doctor of Philosophy / Department of Secondary Education / Diane McGrath / The primary purpose of this study was to determine if a semi-automated reasoning tool that provides a set of searchable cases would improve a student’s understanding of the more difficult concepts in an object-oriented programming course. Also investigated were the relationships between the dependent variable student performance with independent variables of motivation, background knowledge, and student attitudes towards the semi-automated reasoning tool. Subjects for the study were randomly assigned from two sections of an introductory object-oriented programming course at an NCAA, Division II university in the Midwest region of the United States. Posttests were used to measure the effects of the semi-automated reasoning tool on learner competency. Background knowledge was collected through student transcripts. Motivation and student attitudes data were collected from surveys. All data were collected during the Spring 2005 semester. Data were analyzed at the p < .05 level of significance using a Wilcoxon Signed Ranks test, mixed-design ANOVA, Mann-Whitney U test, Spearman rho correlations, and thematic analysis as well as other statistical techniques. Results of the study indicated a significant difference between the group who used the semi-automated reasoning tool on complex questions and the group who did not. No significant difference was indicated between the groups on simple questions. A strong positive correlation was indicated between background knowledge and the total test scores for both content areas tested. Results of the correlational analysis between motivation and learner competencies indicated that the type of motivation, be it intrinsic or extrinsic, plays a minimal role in how students performed in this online course. Finally, students overwhelmingly felt that the semi-automated reasoning tool was an effective instructional-support tool. Results of this study suggested recommendations for practice as well as for further research. Recommendations for practice include the need for effective use of course management systems, supporting complex content through examples, using performance on background coursework when considering an online course covering complex topics, providing a case-based instructional aid for complex topics, and minimizing the economic costs in using a case-based instructional aid. Recommendations for future research include more research on relationships between background coursework and online courses, effects of a case-based instructional aid on face-to-face courses, development of overarching examples containing content from multiple computer science courses, improvements to the CBJava framework, and extending the framework to other disciplines.

Les travaux de cette thèse concernent des études fondamentales liées à la rhéologie et dynamique des chaines aux interfaces/interphases dans des structures polymères multi- micro et nano-couches obtenues par le procédé de coextrusion. Des couples de matériaux modèles présentant une compatibilisation physique et/ou chimique aux interfaces ont été étudiés. L’objectif ultime consiste en la compréhension des phénomènes multi-physiques et multi-échelles mis en jeu lors de l’élaboration du confinement de ces matériaux. Dans un premier temps, l'influence de «l'interphase diffuse» sur le comportement rhéologique aux échelles micro- et nanométriques a été étudiée. Malgré le caractère compatible du système PVDF/PMMA, ce travail met en évidence que les chaines macromolécules des deux polymères présentent une certaine hétérogénéité locale dans la dynamique spatiale, allant de l’échelle des segments jusqu’à la conformation globale des chaînes. L’étude par spectroscopie diélectrique, montre que cette hétérogénéité est dépendante de la composition de l'interphase. Cette dernière est gouvernée à son tour par la diffusion mutuelle des chaines aux interfaces. Les résultats obtenus ont été analysés et modélisés en se basant sur les concepts de la dynamique moléculaire. La deuxième partie de cette étude porte en l’étude de l’effet d’une interphase diffuse (et ou réactive) sur les propriétés microstructurales, rhéologique et en particulier sur la dynamique moléculaire dans les multi- micro et nano-couches confinés. Les systèmes élaborés ont été analysés à différentes échelles par différents moyens spectroscopiques. L’effet du confinement sur la structure cristalline est mis en exergue. Ces systèmes ont été étudiés sous sollicitations en cisaillement et en élongation en viscoélasticité linéaire (VEL) et non-linéaire (VENL). Des modélisations ont été alors possible et elles étaient établies en se basant sur les mécanismes physiques et physico-chimiques mis en jeu. En concomitance avec cette seconde partie, nous avons démontré que la formation du copolymère greffé au niveau de cette interphase réactive présente une influence sur la dynamique moléculaire aux échelles micro- et nanométriques. Par conséquent, un nouveau processus de relaxation interfaciale diélectrique est démontré. Sa signature est dépendante du temps ouvert à la réaction ainsi que du nombre de couches. Le dernier volet de la thèse a porté sur l'effet du l’ultra-confinement sur les propriétés microstructurales, la dynamique et les propriétés diélectriques à l’état fondu et solide. En outre, des moyens type 2D-WAXS/SAXS, spectroscopie diélectrique multifréquences ont été déployés pour mener à bien ces travaux. Enfin, les résultats de cette thèse présentent une première approche pour le contrôle des propriétés d’interphases dans les structures multinanocouches. Les applications visées sont principalement la plastronique, l’énergie ou l’emballage alimentaire à propriétés Ultra-barrière. / Interphase developed at the polymer–polymer interface crucially determines the overall macroscopic properties of multilayered polymers from coextrusion. A better understanding of the interfacial properties involving rheology and dynamics is essential for establishing the processing-structure-property relationship. Therefore, this thesis is focused on a fundamental study of the role of interphase in rheology and dynamics of multicomponent polymers, towards tailoring the interface/interphase in multilayered structures from coexrusion process. The work proceeded from the diffuse interphase in compatible multilayered systems to the reactive interphase in reactive counterparts. Starting with a preliminary study on a model compatible system of PVDF/PMMA blends, we firstly revealed their blending phenomena and physics, involving dynamic heterogeneity in segmental and terminal scales, and locally structural heterogeneity due to the nanoscale interphase. Particularly, the local heterogeneity significantly altered the thermorheological and dynamic behaviours. Based on the findings with blends, we were able to further clarify the effects of interdiffusion and diffuse interphase formation on the structure, rheology and dynamics in compatible multilayered PVDF/PMMA systems fabricated by forced-assembly multilayer coextrusion. The remarkable changes in the rheological and dynamic behaviors of these compatible multilayers were explained in terms of the physical picture for interdiffusion mechanism and physics of diffuse interphase occurring in coextrusion process. Secondly, we incorporated in situ interfacial chemical reaction to multilayered systems based on PVDF-g-MAH/PA6 in comparison to PVDF/PA6 pair, thereby allowing us to probe the generated reactive interphase with graft copolymers from bilayer to multi nanolayers. Influence of interfacial reaction and formed interphase on the resulting macroscopic rheological behaviors and microscopic dynamics were preliminarily elaborated using a stacked model bilayer of PVDF-g-MAH/PA6, by taking into account the factors involving interfacial morphology development, copolymer architecture and reaction extent/time, etc. Based on this preliminary investigation, we further probed the role of interfacial reaction and reactive intephase formation in the coextruded multilayered structures alternating of PVDF-g-MAH/PA6 with the layer thickness varying from micro- to nanoscale. Therein, we investigated systematically the layer architecture/structure, morphology, dielectric properties, charge transport dynamics, and especially the uniaxial extensional rheology of the reactive multilayered polymers in the presence of reactive interphase. Findings obtained in this thesis are aimed at a better understanding of the interfacial properties including rheology, dynamics and dielectric properties, towards controlling the interface/interphase and confinement in multilayered polymers from coextrusion and for their advanced applications.

L’objectif de cette thèse est le développement de matériaux polymères injectables innovants issus de ressources renouvelables et répondant aux exigences techniques automobiles. Pour cela nous nous sommes intéressés à des mélanges de polymères modèles : le polyamide 12 et l’amidon plastifié. Nos travaux ont donc porté sur l’optimisation des propriétés de ces mélanges, via le contrôle de la morphologie. Ainsi deux stratégies ont été envisagées : la compatibilisation du mélange grâce à deux agents réactifs et la modification des paramètres de mise en œuvre. Ces deux stratégies se sont révélées être efficace pour l’amélioration des propriétés des mélanges. Enfin à partir de cette étude sur les polymères modèles, des matériaux issus de ressources renouvelables ont été formulés. De même une étape de compatibilisation à partir d’une résine époxy a été envisagée permettant au final d’obtenir des matériaux ayant des propriétés optimisées. / The main objective of this work is the development of innovative materials from renewable resources for the automotive industry. Polymer blends of polyamide 12 and plasticized starch prepared through internal mixer and extruder processes, were studied as model blends. In order to improve the final properties of the blends, two strategies were considered: the compatibilization via two reactive agents and the modification of the process parameters. These strategies were proved to be truly effective to improve the properties of the blends. Finally, materials from renewable resources were processed. As well a compatibilization step thanks to a solid epoxy resin were considered to obtain materials with improved properties.