L’adénovirus possède plusieurs caractéristiques faisant de ce virus un candidat de choix pour la construction de vecteurs utiles dans les études de génomique fonctionnelle. Dans la majorité de ces applications, on a recours à un vecteur adénoviral de première génération délété de sa région E1. L’utilisation de vecteurs adénoviraux comprend deux maillons faibles : la construction du vecteur et la production subséquente de ce dernier. Le développement de méthodes alternatives est donc nécessaire pour renforcer ces deux maillons, permettant ainsi une utilisation étendue de ces vecteurs. Ce développement va s’articuler sur deux axes : l’ingénierie du vecteur de transfert pour la construction de l’adénovirus recombinant et l’ingénierie d’une lignée cellulaire pour la production du vecteur. En utilisant un vecteur de transfert adénoviral co-exprimant, à partir d’un promoteur régulable à la tétracycline, la protéase de l’adénovirus et une protéine de fluorescence verte (GFP) par l’intermédiaire d’un site d’entrée ribosomal interne (IRES), notre groupe a établi que la sélection positive, via l’expression ectopique de la protéase, est un processus efficace pour la création de librairie d’adénovirus recombinants. Par contre, la diversité atteinte dans ce premier système est relativement faible, environ 1 adénovirus recombinant par 1 000 cellules. Le travail effectué dans le cadre de cette thèse vise à construire un nouveau transfert de vecteur dans lequel l’expression de la protéase sera indépendante de celle du transgène permettant ainsi d’optimiser l’expression de la protéase. Ce travail d’optimisation a permis de réduire le phénomène de transcomplémentation du virus parental ce qui a fait grimper la diversité à 1 virus recombinant par 75 cellules. Ce système a été mis à l’épreuve en générerant une librairie adénovirale antisens dirigée contre la GFP. La diversité de cette librairie a été suffisante pour sélectionner un antisens réduisant de 75% l’expression de la GFP. L’amplification de ce vecteur adénoviral de première génération doit se faire dans une lignée cellulaire exprimant la région E1 telle que les cellules 293. Par contre, un adénovirus de première génération se répliquant dans les cellules 293 peut échanger, par recombinaison homologue, son transgène avec la région E1 de la cellule créant ainsi un adénovirus recombinant réplicatif (RCA), compromettant ainsi la pureté des stocks. Notre groupe a déjà breveté une lignée cellulaire A549 (BMAdE1) exprimant la région E1, mais qui ne peut pas recombiner avec le transgène du virus. Par contre, le niveau de réplication de l’adénovirus dans les BMAdE1 est sous-optimal, à peine 15-30% du niveau obtenu dans les cellules 293. Le travail fait dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence qu’une expression insuffisante d’E1B-55K était responsable de la mauvaise réplication du virus dans les BMAdE1. Nous avons produit de nouveaux clones à partir de la lignée parentale via une transduction avec un vecteur lentiviral exprimant E1B-55K. Nous avons confirmé que certains clones exprimaient une plus grande quantité d’E1B-55K et que ces clones amplifiaient de manière plus efficace un vecteur adénoviral de première génération. Ce clone a par la suite été adapté à la culture en suspension sans sérum. / The adenovirus has numerous interesting characteristics making this particular virus an ideal candidate for the construction of vector for conducting studies in functional genomics. The vast majority of those applications rely on a so-called “first-generation vector” in which the E1 region is replaced by a transgene. Despite all their advantages, there are 2 weak links associated with first-generation vector: the efficient construction of the actual vector and its production. Therefore, the development of alternative methods for construction and production is necessary to ensure their usefulness. The development will involve 2 axes: the reengineering of the transfer vector for the construction of recombinant adenovirus and the reengineering of the cell line capable of producing the vector. Using a transfer vector co-expressing the adenoviral protease (PS) gene and GFP by using an IRES under the control of a tetracycline-regulated promoter, our laboratory previously established the proof of concept that positive selection of recombinant adenovirus through ectopic expression of the PS gene was an efficient approach to generate adenoviral libraries. However, the diversity achieved was quite low, around 1 recombinant adenovirus per 1,000 cells. The goal of this thesis was to design a new transfer vector in which the PS expression was independent from the expression of the transgene in order to be able to optimize its expression independently. We also improved library diversity by lowering the amount of PS in order to reduce the the trans-complementation from the transfer vector. Using this method, at least 1 recombinant adenovirus per 75 cells was generated with 100% of the plaques being recombinant. This system was successfully used to generate an antisense library targeting GFP. The diversity of the library was high enough to allow the selection of an antisense that inhibited 75% of GFP expression. Amplification of those first-generation recombinant adenoviruses must take place in an E1-expressing cell such as 293 cells. However, when replicating in 293 cells, the recombinant adenovirus can exchange their transgene with the E1 region of the cell by homologous recombination, which results in the generation of a fully replicative adenovirus (RCA), a situation that compromises the purity of the viral preparation. Our laboratory has previously patented an A549 cell line expressing the E1 region and producing RCA-free recombinant adenovirus (BMAdE1). However, the replication of E1-deleted adenovirus in BMAdE1 cells was sub-optimal, in the range of 15-30% the level obtained in 293 cells. The work done in this thesis establishes that the low level of E1B-55K could be responsible for the lower productivity of BMAdE1 cells. Thus, we have derived new clones following lentiviral transduction in order to increase E1B-55K expression. Western blot confirmed that some clones expressed more E1B-55K than BMAdE1, and this correlated with a more robust replication of a recombinant adenovirus in those clones. This newly optimized BMAdE1 cell line was adapted to serum-free suspension culture.

L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés. / Hepatitis C infection is a worldwide health problem since the risk to develop a persistent infection is relatively elevated (40 to 60%) and nearly half of the infected patients do not respond to the classical anti-HCV therapy based on a combination of PEG-IFNα and ribavirin. Viral persistence is based on powerful evasion strategies of the host’s innate immune system. In our study, we characterized antiviral response in primary human normal and chronically HCV-infected hepatocytes, a cutting-edge in our field due to the difficulty to isolate this particular cell type. In order to better define the antiviral response in freshly isolated human primary hepatocytes, we stimulated these cells with extracellular and intracellular dsRNA to trigger TLR3/TRIF and RIG-I-MDA5/CARDIF-mediated antiviral signaling pathways. By using qRT-PCR and microarray analysis, we report that both detection pathways are functional in normal human hepatocytes, their activation leading to the expression of both common (IFIT1, OASL, ISG15 and CXCL10) and specific genes (IL28A, IL28B and IL29), these last ones being a signature of the intracellular dsRNA-mediated pathway. HCV NS3/4A plays a key role in the viral polyprotein processing and upon viral RNA detection by interfering with the host’s antiviral signalling cascades. We report that major antiviral genes induction following activation of RIG-I mediated pathway are severely impaired in ectopically NS3/4A expressing normal hepatocytes due to CARDIF cleavage, but can be restored by specific NS3/4A inhibitor BILN2061. Our microarray analysis also revealed a role for NS3/4A following TRL3-mediated pathway activation on regulation of apoptosis and programmed cell death, which could be linked to strategies for the virus to persist in its host. Despite HCV strategies to circumvent the host’s immune defense system, we observed significant upregulation of ISGs and chemokines in liver biopsies and corresponding isolated hepatocytes from chronically HCV-infected patients. However, no type I and III interferon, neither key-antiviral genes (e.g., CCL5) were detected, underlying an ongoing –but inefficient- antiviral response unable to eradicate the virus. Moreover, we obtained significant inverse correlations between ISGs mRNAs and viral RNA in addition to CARDIF decrease, clearly unravelling efficient viral interfering strategies in a context of chronic HCV infection. This sustained -albeit incomplete- hepatic innate immune response is certainly associated to the failure of the classical IFN-based therapy in half of the infected patients and to the chronic inflammation causing liver damages and eventually leading to hepatocarcinoma which is often observed at late stage of the disease.

Les virus exploitent la machinerie cellulaire de l’hôte de façon très variée et plusieurs types vont même jusqu’à incorporer certaines protéines cellulaires. Nous avons récemment effectué la première analyse protéomique du virion mature de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1), ce qui nous a permis de déterminer que jusqu’à 49 protéines cellulaires différentes se retrouvaient dans ce virus (Loret, S. et al. (2008). "Comprehensive characterization of extracellular herpes simplex virus type 1 virions." J Virol 82(17): 8605-18.). Afin de déterminer leur importance dans le cycle de réplication d’HSV-1, nous avons mis au point un système de criblage nous permettant de quantifier le virus produit et relâché dans le milieu extracellulaire en utilisant un virus marqué à la GFP ainsi que des petits ARN interférents (pARNi) ciblant spécifiquement ces protéines cellulaires. Cette approche nous a permis de démontrer que 17 des protéines identifiées précédemment jouaient un rôle critique dans la réplication d’HSV-1, suggérant ainsi que leur incorporation dans le virus n’est pas aléatoire. Nous avons ensuite examiné le rôle d’une de ces protéines, DDX3X (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), une protéine multifonctionnelle connue pour son implication dans les cycles de réplication de plusieurs virus humains. À l’aide de pARNi ainsi que de différentes lignées cellulaires, dont une lignée DDX3X thermosensible, nous avons démontré que l’inhibition de DDX3X résultait en une diminution du nombre de capsides intracellulaires et induisait une importante diminution de l’expression des gènes viraux. Nous avons aussi démontré que la fraction de DDX3X incorporée dans le virion contribuait activement au cycle infectieux d’HSV-1. Ces résultats confirment l’intérêt de notre approche afin d’étudier les interactions hôte-pathogène en plus de démontrer la contribution des protéines cellulaires incorporées à HSV-1 dans l’infection virale. / Viruses exploit the cellular machineries in many ways and several viruses specifically incorporate host proteins. To understand their biological relevance, we recently performed the first comprehensive characterization of the mature herpes simplex virus type 1 (HSV-1) in which up to 49 distinct cellular proteins were identified by mass spectrometry. In the present study, we sought to identify which of these cellular factors are critical for the HSV-1 life cycle. To this end, we performed a functional screen using small interfering RNA (siRNA) and a GFP-tagged virus, which indicated that at least 17 of the virion-incorporated host proteins alter HSV-1 proliferation in cell culture. Interestingly, these include several Rab GTPases and other intracellular transport components as well as proteins involved in signal transduction, gene regulation and immunity. Among them, the DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked protein (DDX3X) is a multifunctional molecule previously linked to several other viruses. Its relevance for HSV-1 was further confirmed with different siRNA reagents and cell lines, including a DDX3X thermosensitive cell line. We found that DDX3X inactivation reduced intracellular capsid abundance via a strong inhibition of viral gene expression. We also report evidence that the pool of DDX3X present in the mature virions actively contributes to HSV-1 life cycle. Altogether, this highlights a powerful and biologically relevant approach to characterize host-pathogen interactions and points to the important contribution host proteins within mature viral particles.

The aims of this study were to identify Chloroviruses in two different Ontario freshwaters and to determine if the seasonal abundance patterns of Chloroviruses in different environments are similar. Gene fragments nearly identical to cultivated Chloroviruses were obtained from Lake Ontario and a nearby pond at the University of Toronto Mississauga (UTM) and novel Chlorovirus gene fragments were obtained from Lake Ontario. Quantification of these two Chlorovirus genes over several seasons revealed the presence of persistent viruses with different seasonal dynamics suggesting that different Chloroviruses replicate by infecting different hosts. Additionally, patterns of seasonal abundance and timings of peak abundances for individual viruses differed between Lake Ontario and the UTM pond, demonstrating the critical role of the environment in Chlorovirus dynamics. The observation of different Chloroviruses with different seasonal dynamics allows speculation that these viruses and their hosts stably coexist in Ontario freshwater environments.

The aims of this study were to identify Chloroviruses in two different Ontario freshwaters and to determine if the seasonal abundance patterns of Chloroviruses in different environments are similar. Gene fragments nearly identical to cultivated Chloroviruses were obtained from Lake Ontario and a nearby pond at the University of Toronto Mississauga (UTM) and novel Chlorovirus gene fragments were obtained from Lake Ontario. Quantification of these two Chlorovirus genes over several seasons revealed the presence of persistent viruses with different seasonal dynamics suggesting that different Chloroviruses replicate by infecting different hosts. Additionally, patterns of seasonal abundance and timings of peak abundances for individual viruses differed between Lake Ontario and the UTM pond, demonstrating the critical role of the environment in Chlorovirus dynamics. The observation of different Chloroviruses with different seasonal dynamics allows speculation that these viruses and their hosts stably coexist in Ontario freshwater environments.

Measles is one of the most contagious diseases known to mankind. Despite the availability of a safe and effective vaccine, approximately 164,000 measles-related deaths were recorded in 2008. The inherent restricted host tropism of MV means that the development of authentic rodent models will be a valuable research tool in testing new vaccines and antivirals. In addition to the receptor requirement, mouse innate immunity has been shown to inhibit MV growth. In this thesis, the contributions of several key components of the mouse innate immune system on the inhibition of MV replication were examined. The transcription factor interferon regulatory factor 3 (IRF3), which normally plays a key role in mediating innate immune signaling, contributed relatively little in inhibiting MV replication both in vitro and in vivo. In contrast, the JAK/STAT pathway and the double-stranded RNA inducible protein kinase, PKR, played more important roles in controlling virus replication. The resurgence of measles in areas where the virus was once thought to be eradicated makes the development of anti-MV treatments essential. Concurrent to the development of an animal model to better study its pathogenesis, we wanted to look at the effect of MV inhibitors on its replication. The MV fusion inhibitor, carbobenzoxy-D-phenylalanine-L-phenylalanine-glycine (ZfFG), was developed in the past to study fusion; however, its mechanism of action has not yet been elucidated. To examine this, spontaneous ZfFG-resistant mutants were generated and characterized. Mutations were found in the HRB region of the fusion (F) protein, and when these were modeled using published paramyxovirus F crystal structures, data suggested that ZfFG targeted a small pocket present between the head and stalk regions of its pre-fusion conformation. An authentic mouse model of measles developed from findings in this study may allow for in vivo efficacy testing of ZfFG in the future.

Measles is one of the most contagious diseases known to mankind. Despite the availability of a safe and effective vaccine, approximately 164,000 measles-related deaths were recorded in 2008. The inherent restricted host tropism of MV means that the development of authentic rodent models will be a valuable research tool in testing new vaccines and antivirals. In addition to the receptor requirement, mouse innate immunity has been shown to inhibit MV growth. In this thesis, the contributions of several key components of the mouse innate immune system on the inhibition of MV replication were examined. The transcription factor interferon regulatory factor 3 (IRF3), which normally plays a key role in mediating innate immune signaling, contributed relatively little in inhibiting MV replication both in vitro and in vivo. In contrast, the JAK/STAT pathway and the double-stranded RNA inducible protein kinase, PKR, played more important roles in controlling virus replication. The resurgence of measles in areas where the virus was once thought to be eradicated makes the development of anti-MV treatments essential. Concurrent to the development of an animal model to better study its pathogenesis, we wanted to look at the effect of MV inhibitors on its replication. The MV fusion inhibitor, carbobenzoxy-D-phenylalanine-L-phenylalanine-glycine (ZfFG), was developed in the past to study fusion; however, its mechanism of action has not yet been elucidated. To examine this, spontaneous ZfFG-resistant mutants were generated and characterized. Mutations were found in the HRB region of the fusion (F) protein, and when these were modeled using published paramyxovirus F crystal structures, data suggested that ZfFG targeted a small pocket present between the head and stalk regions of its pre-fusion conformation. An authentic mouse model of measles developed from findings in this study may allow for in vivo efficacy testing of ZfFG in the future.

La protéine core du virus de l’hépatite C (VHC) serait responsable des principaux effets pathogènes du VHC, dont le développement de fibrose, stéatose, cirrhose et carcinome hépatocellulaire. Un cadre de lecture alternatif existe dans le gène de core, permettant la synthèse d’une autre protéine appelée ARFP (pour alternatate reading frame protein) ou protéine F (pour frameshift), dont le rôle reste encore mal compris. La présence de la protéine F lors de l’étude des fonctions biologiques de core ne pouvant être exclue, il est possible que certains rôles attribués à core reflètent en réalité l’activité de la protéine F. Afin de déterminer les fonctions biologiques de la protéine F dans les hépatocytes et son influence dans la pathogenèse associée au VHC, nous avons généré des lignées transgéniques de poissons zébrés (Danio rerio) dans lesquelles l’expression de deux versions de la protéine F (AF11opti et AUG26opti) a été ciblée au foie par l’utilisation du promoteur de la liver fatty acid binding protein (L-FABP). Le phénotype des poissons transgéniques de génération F2 a été analysé au niveau morphologique, histologique et microscopique afin de rechercher des signes de pathologie hépatique. Nos résultats ont démontré l’implication de la protéine F dans le développement de stéatose hépatique chez les deux lignées transgéniques, mais aucun signe de fibrose ou d’oncogenèse n’a été détecté. L’identification des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’accumulation lipidique induite par la protéine F pourrait permettre de mieux comprendre son rôle dans la pathogenèse du VHC, et mener au développement de nouvelles stratégies antivirales. / Hepatitis C virus (HCV) core protein is thought to be responsible for the major pathogenic effects of HCV, including the development of fibrosis, steatosis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. An alternate translational open reading frame exists in the core gene that allows the synthesis of another protein called ARFP (alternate reading frame protein) or F protein (frameshift), the role of which remains poorly understood. Since we cannot exclude the presence of F protein in most studies of core biological functions, it is possible that the roles attributed to core reflect the activity of ARFP. To determine the biological functions of F protein in hepatocytes and their influence on HCV-associated pathogenesis, we generated transgenic lines of zebrafish (Danio rerio) in which the liver fatty acid binding protein (L-FABP) promoter was used to direct liver-specific expression of two forms of ARFP (AF11opti and AUG26opti). The phenotype of F2 transgenic zebrafish was analyzed for morphological, histological and microscopic signs of liver-associated pathology. Our results demonstrated the implication of the HCV F protein in the development of hepatic steatosis in transgenic zebrafish liver but not fibrosis or oncogenesis. Identification of the cellular and molecular mechanisms underlying F protein-induced lipid accumulation will lead to a better understanding of the role of ARFP in HCV-associated pathology, which could lead to the development of novel antiviral strategies.

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